ES2417153T3 - Polímeros recombinantes no estructurados y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de aumento de la semivida en suero de una proteina, que comprende: fusionar dicha proteina con uno o mas polimeros recombinantes no estructurados (URP), en el que el URP comprende al menos aproximadamente 200 aminoacidos contiguos, y en el que (a) la suma de los residuos de glicina (G), aspartato (D), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) y prolina (P) contenidos en el URP constituye mas de aproximadamente el 80% de los aminoacidos totales del URP; y (b) al menos el 50% de los aminoacidos del URP no estan presentes en la estructura secundaria como se ha determinado por el algoritmo de Chou-Fasman; y en el que dicho URP es sustancialmente incapaz de unirse no especificamente a una proteina del suero; y (c) el URP tiene una puntuacion de epitope T igual a o inferior a -4.

Description

Polimeros recombinantes no estructurados y usos de los mismos

5 REFERENCIA CRUZADA ANTECEDENTES DE LA INVENCION

[0001] Se ha documentado bien que las propiedades de proteinas, en particular eliminacion del plasma e

10 inmunogenicidad, pueden mejorarse uniendo polimeros hidrofilos a estas proteinas (Kochendoerfer, G. (2003) Expert Opin Biol Ther, 3: 1253-61), (Greenwald, R. B. y col. (2003) Adv Drug Deliv Rev, 55: 217-50), (Harris, J. M. y col. (2003) Nat Rev Drug Discov, 2: 214-21). Ejemplos de proteinas modificadas con polimeros que han sido autorizada por la FDA para el tratamiento de pacientes son Adagen, Oncaspar, PEG-Intron, Pegasys, Somavert y Neulasta. Muchas mas proteinas modificadas con polimeros estan en ensayos clinicos. Estos polimeros ejercen su

15 efecto aumentando el radio hidrodinamico (tambien llamado radio de Stoke) de la proteina modificada con respecto a la proteina sin modificar, que reduce la tasa de eliminacion por filtracion del rifon (Yang, K. y col. (2003) Protein Eng, 16: 761-70). Ademas, la union del polimero puede reducir la interaccion de la proteina modificada con otras proteinas, celulas o superficies. En particular, la union del polimero puede reducir interacciones entre la proteina modificada y anticuerpos y otros componentes del sistema inmunitario, reduciendo asi la formacion de una

20 respuesta inmunitaria del huesped a la proteina modificada. Es de particular interes la modificacion de proteinas por PEGilacion, es decir, uniendo polimeros lineales o ramificados de polietilenglicol. Se mostro inmunogenicidad reducida tras la PEGilacion, por ejemplo, para fenilalanina amoniaco liasa (Gamez, A. y col. (2005) Mol Ther, 11: 986-9), anticuerpos (Deckert, P. M. y col. (2000) Int J Cancer, 87: 382-90.), estafilocinasa (Collen, D. y col. (2000) Circulation, 102: 1766-72) y hemoglobina (Jin, C. y col. (2004) Protein Pept Lett, 11: 353-60). Normalmente, tales

25 polimeros se conjugan con la proteina de interes mediante una etapa de modificacion quimica despues de que se haya purificado la proteina sin modificar. [0002] Pueden unirse diversos polimeros a proteinas. Son de particular interes polimeros hidrofilos que tienen conformaciones flexibles y se hidratan bien en disoluciones acuosas. Un polimero frecuentemente usado es

30 polietilenglicol (PEG). Estos polimeros tienden a tener grandes radios hidrodinamicos con respecto a su peso molecular (Kubetzko, S. y col. (2005) Mol Pharmacol, 68: 1439-54). Los polimeros unidos tienen a tener interacciones limitadas con la proteina a la que se han unido y asi la proteina modificada con polimero retiene sus funciones relevantes.

35 [0003] La conjugacion quimica de polimeros con proteinas requiere complejos procedimientos de multiples etapas. Normalmente, el componente de proteina necesita producirse y purificarse antes de la etapa de conjugacion quimica. La etapa de conjugacion puede producir la formacion de mezclas de productos que necesitan separarse, conduciendo a una perdida significativa de producto. Alternativamente, tales mezclas pueden usarse como producto farmaceutico final. Algunos ejemplos son productos de interferon-alfa PEGilados actualmente comercializados que

40 se usan como mezclas (Wang, B. L. y col. (1998) J Submicrosc Cytol Pathol, 30: 503-9; Dhalluin, C. y col. (2005) Bioconjug Chem, 16: 504-17). Tales mezclas son dificiles de fabricar y caracterizar y contienen isomeros con actividad reducida o no terapeutica. [0004] Se han descrito procedimientos que permiten la adicion especifica para sitio de polimeros como PEG.

45 Ejemplos son la PEGilacion selectiva en un unico sitio de glicosilacion de la proteina diana o la PEGilacion selectiva de un aminoacido no natural que ha sido manipulado en las proteinas diana. En algunos casos ha sido posible PEGilar selectivamente el extremo N de una proteina, a la vez que se evita la PEGilacion de cadenas laterales de lisina en la proteina diana controlando cuidadosamente las condiciones de reaccion. Todavia otro enfoque para la PEGilacion especifica para sitio de proteinas diana es la introduccion de residuos de cisteina que permiten la

50 conjugacion selectiva. Todos estos procedimientos tienen limitaciones significativas. La PEGilacion selectiva del extremo N requiere un cuidado control del procedimiento y las reacciones secundarias son dificiles de eliminar. La introduccion de cisteinas para la PEGilacion puede interferir con la produccion y/o purificacion de proteinas. La introduccion especifica de aminoacidos no naturales requiere organismos huesped especificos para la produccion de proteinas. Otra limitacion de la PEGilacion es que el PEG se fabrica normalmente como una mezcla de polimeros

55 con longitud similar, pero no uniforme. Las mismas limitaciones son inherentes en muchos otros polimeros quimicos. [0005] La conjugacion quimica usando polimeros multifuncionales que permitirian la sintesis de productos con modulos de multiples proteinas es incluso mas compleja que la conjugacion de polimeros de un dominio de una sola proteina.

[0006] Recientemente se ha observado que algunas proteinas de organismos patogenos contienen secuencias de peptidos repetitivas que parece que conducen a una semivida en suero relativamente larga de las proteinas que contienen estas secuencias (Alvarez, P. y col. (2004) J Biol Chem, 279: 3375-81). Se ha demostrado 5 que secuencias oligomericas que se basan en tales secuencias repetitivas derivadas de patogeno pueden fusionarse con otras proteinas produciendo elevada semivida en suero. Sin embargo, estos oligomeros derivados de patogeno tienen varias deficiencias. Las secuencias derivadas de patogeno tienden a ser inmunogenicas. Se ha descrito que las secuencias pueden modificarse para reducir su inmunogenicidad. Sin embargo, no se ha informado de intentos para eliminar epitopes de linfocitos T de las secuencias que contribuyen a la formacion de reacciones

10 inmunitarias. Ademas, las secuencias derivadas de patogeno no se han optimizado para aplicaciones farmacologicas que requieren secuencias con buena solubilidad y una afinidad muy baja por otras proteinas diana.

[0007] Asi, hay una necesidad significativa de composiciones y procedimientos que permitirian que se combinaran modulos de multiples polimeros y modulos de multiples proteinas en productos de multiples dominios

15 definidos.

RESUMEN DE LA INVENCION

[0008] La presente divulgacion describe un polimero recombinante no estructurado (URP) que comprende al

20 menos 40 aminoacidos contiguos, en el que dicho URP es sustancialmente incapaz de unirse no especificamente a una proteina del suero, y en el que (a) la suma de los residuos de glicina (G), aspartato (D), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) y prolina (P) contenidos en el URP constituye mas de aproximadamente el 80% de los aminoacidos totales del URP; y/o (b) al menos el 50% de los aminoacidos carecen de estructura secundaria como se ha determinado por el algoritmo de Chou-Fasman. En un realizacion relacionada se describe un polimero

25 recombinante no estructurado (URP) que comprende al menos 40 aminoacidos contiguos, en el que dicho URP tiene una semivida de degradacion en suero in vivo superior a aproximadamente 24 horas, y en el que (a) la suma de los residuos de glicina (G), aspartato (D), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) y prolina (P) contenidos en el URP constituye mas de aproximadamente el 80% de los aminoacidos totales del URP; y/o (b) al menos el 50% de los aminoacidos carecen de estructura secundaria como se ha determinado por el algoritmo de Chou-Fasman. El

30 URP objeto puede comprender una secuencia de aminoacidos no naturales. Si se desea, el URP se selecciona para la incorporacion en una proteina heterologa, y en el que tras la incorporacion del URP en una proteina heterologa, dicha proteina heterologa presenta una semivida de secrecion en suero prolongada y/o mayor solubilidad con respecto a la proteina correspondiente que es deficiente en dicho URP. La semivida puede prolongarse dos veces, tres veces, cinco veces, diez veces o mas. En algunos aspectos, la incorporacion del URP en una proteina

35 heterologa produce al menos un aumento de 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o mas en el peso molecular aparente de la proteina como se aproxima por cromatografia de exclusion por tamafo. En algunos aspectos, los URP tienen una puntuacion de epitope T inferior a -3,5 (por ejemplo, -4 o menos, -5 o menos). En algunos aspectos, los URP pueden contener predominantemente residuos hidrofilos. Si se desea, al menos el 50% de los aminoacidos del URP carecen de estructura secundaria como se ha determinado por el algoritmo de Chou-Fasman. Los residuos

40 de glicina contenidos en el URP pueden constituir al menos aproximadamente el 50% de los aminoacidos totales del URP. En algun aspecto, un tipo cualquiera de los aminoacidos solos seleccionados del grupo constituido por glicina (G), aspartato (D), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) y prolina (P) contenidos en el URP constituye mas de aproximadamente el 20%, 30%, 40%, 50%, 60% o mas de los aminoacidos totales del URP. En algunos aspectos, el URP comprende mas de aproximadamente 100, 150, 200 o mas aminoacidos contiguos.

45 [0009] En el presente documento tambien se describe una proteina que comprende uno o mas de los URP objeto, en la que los URP objeto son heterologos con respecto a la proteina. La longitud total de los URP en agregacion puede superar aproximadamente 40, 50, 60, 100, 150, 200 o mas aminoacidos. La proteina puede comprender uno o mas modulos funcionales seleccionados del grupo constituido por modulo efector, modulo de

50 union, modulo del extremo N, modulo del extremo C y cualquier combinacion de los mismos. Si se desea, la proteina objeto comprende una pluralidad de modulos de union, en los que los modulos de union individuales presentan especificidades de union por las mismas dianas o dianas diferentes. El modulo de union puede comprender un andamiaje que contiene disulfuro formado por apareamiento entre andamiajes de cisteinas. El modulo de union pueden unirse a una molecula diana, diana que esta seleccionada del grupo constituido por proteina de la superficie

55 celular, proteina secretasa, proteina citosolica y proteina nuclear. La diana puede ser un canal de iones y/o GPCR. Si se desea, el modulo efector puede ser una toxina. La proteina que contiene el URP objeto normalmente una semivida de secrecion en suero prolongada de al menos 2, 3, 4, 5, 10 o mas veces con respecto a una proteina correspondiente que es deficiente en dicho URP.

[0010] En el presente documento tambien se describe una proteina que se produce no naturalmente que comprende al menos 3 unidades de repeticion de secuencias de aminoacidos, comprendiendo cada una de las unidades de repeticion al menos 6 aminoacidos, en la que la mayoria de los segmentos que comprenden aproximadamente 6 a aproximadamente 15 aminoacidos contiguos de las al menos 3 unidades de repeticion estan 5 presentes en una o mas proteinas humanas nativas. En un aspecto, la mayoria de los segmentos, o cada segmento que comprende aproximadamente 9 a aproximadamente 15 aminoacidos contiguos dentro de las unidades de repeticion, estan presentes en una o mas proteinas humanas nativas. Los segmentos pueden comprender aproximadamente 9 a aproximadamente 15 aminoacidos. Las tres unidades de repeticion pueden compartir homologia de secuencias sustancial, por ejemplo, compartir identidad de secuencias superior a aproximadamente el

10 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o el 100% cuando se alinean. Tal proteina no natural tambien puede comprender uno o mas modulos seleccionados del grupo constituido por modulos de union, modulos efectores, modulos de multimerizacion, modulos del extremo C y modulos del extremo N. Si se desea, la proteina no natural puede comprender unidades de repeticion individuales que tienen el polimero recombinante no estructurado (URP) objeto.

15 [0011] En el presente documento tambien se describen polinucleotidos recombinantes que comprenden secuencias codificantes que codifican los URP objeto, proteinas que contienen URP, microproteinas y toxinas. Tambien se proporcionan vectores que contienen los polinucleotidos objeto, celulas huesped que alojan los vectores, paquetes geneticos que visualizan los URP objeto, proteinas que contienen URP, toxinas y cualquier otra entidad proteinacea desvelada en el presente documento. En el presente documento tambien se describen

20 bibliotecas de seleccion de vectores de expresion de la presente invencion.

[0012] En el presente documento tambien se describe un procedimiento de produccion de una proteina que comprende un polimero recombinante no estructurado (URP). El procedimiento implica (i) proporcionar una celula huesped que comprende un polinucleotido recombinante que codifica la proteina, comprendiendo dicha proteina uno 25 o mas URP, comprendiendo dicho URP al menos 40 aminoacidos contiguos, en el que dicho URP es sustancialmente incapaz de unirse no especificamente a una proteina del suero, y en el que (a) la suma de los residuos de glicina (G), aspartato (D), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) y prolina (P) contenidos en el URP constituye mas de aproximadamente el 80% de los aminoacidos totales del URP; y/o (b) al menos el 50% de los aminoacidos carecen de estructura secundaria como se ha determinado por el algoritmo de Chou-Fasman; y (ii)

30 cultivar dicha celula huesped en un medio de cultivo adecuado en condiciones para efectuar la expresion de dicha proteina de dicho polinucleotido. Celulas huesped adecuadas son celulas eucariotas (por ejemplo, celulas CHO) y procariotas.

[0013] La presente invencion proporciona un procedimiento de aumento de la semivida en suero de una

35 proteina que comprende: fusionar dicha proteina con uno o mas polimeros recombinantes no estructurados (URP), en el que el URP comprende al menos aproximadamente 200 aminoacidos contiguos, y en el que (a) la suma de los residuos de glicina (G), aspartato (D), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) y prolina (P) contenidos en el URP constituye mas de aproximadamente el 80% de los aminoacidos totales del URP; y (b) al menos el 50% de los aminoacidos no estan presentes en la estructura secundaria como se ha determinado por el algoritmo de Chou

40 Fasman; y en el que dicho URP es sustancialmente incapaz de unirse no especificamente a una proteina del suero. El URP tiene una puntuacion de epitope T igual o inferior a -4.

[0014] En el presente documento tambien se describe un procedimiento de deteccion de la presencia o ausencia de una interaccion especifica entre una proteina diana y una exogena que se visualiza sobre un paquete 45 genetico, en el que dicha proteina comprende uno o mas polimeros recombinantes no estructurados (URP), comprendiendo el procedimiento: (a) proporcionar un paquete genetico que visualiza una proteina que comprende uno o mas polimeros recombinantes no estructurados (URP); (b) poner en contacto el paquete genetico con la diana en condiciones adecuadas para producir un complejo de proteina-diana estable; y (c) detectar la formacion del complejo de proteina-diana estable sobre el paquete genetico, detectando asi la presencia de una interaccion

50 especifica. El procedimiento puede comprender ademas obtener una secuencia de nucleotidos del paquete genetico que codifica la proteina exogena. En algunos aspectos, la presencia o ausencia de una interaccion especifica es entre el URP y una diana que comprende una proteina del suero. En algunos aspectos, la presencia o ausencia de una interaccion especifica es entre el URP y una diana que comprende una proteasa del suero.

55 [0015] En el presente documento tambien se describe un paquete genetico que visualiza una microproteina, en el que dicha microproteina retiene la capacidad de union a su diana nativa. En algunos aspectos, la microproteina presenta capacidad de union hacia al menos una familia del canal de iones seleccionado del grupo constituido por un canal de sodio, de potasio de calcio, de acetilcolina y de cloro. Si se desea, la microproteina es una microproteina de union a canales de iones, y se modifica de forma que (a) la microproteina se une a una familia diferente del canal

con respecto a la microproteina sin modificar correspondiente; (b) la microproteina se une a una subfamilia diferente de la misma familia del canal con respecto a la microproteina sin modificar correspondiente; (c) la microproteina se une a una especie diferente de la misma subfamilia de canal con respecto a la microproteina sin modificar correspondiente; (d) la microproteina se une a un sitio diferente sobre el mismo canal con respecto a la 5 microproteina sin modificar correspondiente; y/o (e) la microproteina se une al mismo sitio del mismo canal pero da un efecto biologico diferente con respecto a la microproteina sin modificar correspondiente. En algun aspecto, la microproteina es una toxina. Tambien se describe una biblioteca de paquetes geneticos que visualiza las microproteinas y/o toxinas objeto. Si se desea, el paquete genetico visualiza una toxina proteinacea que retiene en parte o por completo su espectro de toxicidad. La toxina puede derivarse de una proteina de una sola toxina, o

10 derivarse de una familia de toxinas. En el presente documento tambien se describe una biblioteca de paquetes geneticos en la que la biblioteca visualiza una familia de toxinas, en la que la familia retiene en parte o por completo su espectro de toxicidad nativo.

[0016] En el presente documento tambien se describe una proteina que comprende una pluralidad de

15 dominios de union a canales de iones, en la que dominios individuales son dominios de microproteina que han sido modificados de forma que (a) los dominios de microproteina se unan a una familia diferente del canal con respecto a los dominios de microproteina sin modificar correspondientes; (b) los dominios de microproteina se unen a una subfamilia diferente de la misma familia del canal con respecto a los dominios de microproteina sin modificar correspondientes; (c) los dominios de microproteina se unen a una especie diferente de la misma subfamilia con

20 respecto a los dominios de microproteina sin modificar correspondientes; (d) los dominios de microproteina se unen a un sitio diferente sobre el mismo canal con respecto a los dominios de microproteina sin modificar correspondientes; (e) los dominios de microproteina se unen al mismo sitio del mismo canal, pero dan un efecto biologico diferente con respecto a los dominios de microproteina sin modificar correspondientes; y/o (f) los dominios de microproteina se unen al mismo sitio del mismo canal y dan el mismo efecto biologico con respecto a los

25 dominios de microproteina sin modificar correspondientes.

[0017] En el presente documento tambien se describe un procedimiento de obtencion de una microproteina con propiedad deseada, que comprende: (a) proporcionar una biblioteca objeto; y (b) cribar la biblioteca de seleccion para obtener al menos una visualizacion de fago de una microproteina con la propiedad deseada. Tambien se

30 proporcionan polinucleotidos, vectores, paquetes geneticos, celulas huesped para su uso en uno cualquiera de los procedimientos desvelados.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

35 [0018] Las novedosas caracteristicas de la invencion se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Un mejor entendimiento de las caracteristicas y ventajas de la presente invencion se obtendran por referencia a la siguiente descripcion detallada que expone realizaciones ilustrativas, en las que los principios de la invencion se utilizan, y los dibujos adjuntos de los que:

40 [0019] La FIG. 1 muestra los componentes modulares de una MURP. Modulos union, modulos efectores y modulos de multimerizacion se representan como circulos. Modulos de URP, modulos del extremo N y del extremo C se muestran como rectangulos.

[0020] La FIG. 2 muestra ejemplos de arquitecturas modulares de MURP. Modulos de union (BM) en una 45 MURP pueden tener especificidades diana identicas o diferentes.

[0021] La FIG. 3 muestra que una proteina de repeticion que se basa en una secuencia humana puede contener secuencias de aminoacidos novedosas, que pueden contener epitopes de linfocitos T. Estas secuencias novedosas se forman en el empalme entre unidades de repeticion vecinas.

50 [0022] La FIG. 4 ilustra el disefo de una secuencia de URP que es una proteina de repeticion basada en tres secuencias de donante humano D1, D2, y D3. La unidad de repeticion de este URP se eligio de forma que incluso secuencias 9-meras que atraviesan el empalme entre unidades vecinas pudieran encontrarse en al menos una de las secuencias de donante humano.

55 [0023] FIG. 5 Ejemplo de una secuencia de URP que es una proteina de repeticion basada en las secuencias de tres proteinas humanas. La porcion inferior de la figura ilustra que todas las subsecuencias 9-meras en el URP se producen en al menos una de las proteinas de donante humano.

[0024] FIG. 6 Ejemplo basado en secuencia de URP basada en los residuos del dominio POU humano 146

182.

[0025] La FIG. 7 muestra la ventaja de separar modulos con secuencias ricas en informacion insertando

5 modulos de URP entre tales secuencias. El lado izquierdo de la figura muestra que la fusion directa de los modulos A y B conduce a secuencias novedosas en la region de empalme. Estas secuencias de empalme pueden ser epitopes. La mitad derecha de la figura muestra que la insercion de un modulo de URP entre el modulo A y B previene la formacion de tales secuencias de empalme que contienen secuencias parciales de los modulos A y B. En su lugar, los extremos de los modulos A y B dan secuencias de empalme que contienen secuencias de URP y

10 asi se predice que tienen baja inmunogenicidad.

[0026] La FIG. 8 muestra construcciones de administracion de farmaco que se basan en URP. Las moleculas de farmaco representadas como hexagonos estan quimicamente conjugadas con la MURP.

15 [0027] La FIG. 9 muestra y MURP que contiene un sitio sensible a proteasas. El modulo de URP se disefa de forma que bloquee la funcion del modulo efector. La escision con proteasa elimina una parte del modulo de URP y produce elevada actividad de la funcion efectora.

[0028] La FIG. 10 muestra como un modulo de URP puede actuar de ligador entre un modulo de union y un

20 modulo efector. El modulo de union pueden unirse a una diana y como consecuencia aumenta la concentracion local de modulo efector en la proximidad de la diana.

[0029] La FIG. 11 muestra un procedimiento para construir genes que codifican secuencias de URP de bibliotecas de modulos de URP cortos. La biblioteca de modulos de URP puede insertarse en un vector de relleno

25 que contiene proteina verde fluorescente (GFP) como indicador para facilitar la identificacion de secuencias de URP con alta expresion. La figura ilustra que los genes que codifican secuencias de URP largas pueden construirse por dimerizacion iterativa.

[0030] La FIG. 12 muestra MURP que contienen multiples modulos de union para receptores de muerte. Los

30 receptores de muerte son desencadenados por la trimerizacion y asi MURP que contienen al menos tres elementos de union para un receptor de muerte particularmente potente en inducir muerte celular. La porcion inferior de la figura ilustra que puede aumentarse la especificidad de la MURP por tejido enfermo afadiendo uno o mas modulos de union con especificidad por tejido tumoral.

35 [0031] La FIG. 13 muestra una MURP que comprende cuatro modulos de union (rectangulos) con especificidad por un antigeno de tumor con un modulo efector como interleucina 2.

[0032] La FIG. 14 muestra el diagrama de flujo para la construccion de modulos de URP con 288 residuos. Los modulos de URP se construyeron como proteinas de fusion con GFP. Las bibliotecas de modulos de URP con

40 36 aminoacidos se construyeron primero, seguido de dimerizacion iterativa para dar modulos de URP con 288 aminoacidos (rPEG H288 y rPEG J288).

[0033] FIG. 15 Secuencia de aminoacidos y de nucleotidos de un modulo de URP con 288 aminoacidos (rPEG J288).

45 [0034] FIG. 16 Secuencia de aminoacidos y de nucleotidos de un modulo de URP con 288 aminoacidos (rPEG H288).

[0035] FIG. 17 Secuencia de aminoacidos de una region de secuencia rica en serina de la proteina humana 50 dentina sialofosfoproteina.

[0036] La FIG. 18 muestra un derivado de liberacion prolongada de una MURP. La proteina contiene dos residuos de cisteina que pueden formar un debil puente SS. La proteina puede fabricarse con el puente SS intacto. Puede formularse e inyectarse en pacientes en forma reducida. Despues de la inyeccion se oxidara en proximidad al

55 sitio de inyeccion y como resultado puede formar un polimero de alto peso molecular con difusividad muy limitada. La MURP activa puede filtrarse lentamente del sitio de inyeccion por proteolisis limitada o reduccion limitada del enlace SS de reticulacion.

[0037] La FIG. 19 muestra una forma de liberacion prolongada de una MURP. La MURP tiene difusividad muy

limitada en el sitio de inyeccion y puede liberarse del sitio de inyeccion por proteolisis limitada.

[0038] La FIG. 20 muestra una forma de liberacion prolongada de una MURP que contiene una secuencia rica en histidina. La MURP puede formularse e inyectarse en combinacion con perlas insolubles que contienen niquel 5 inmovilizado. La MURP se une a las perlas de niquel en el sitio de inyeccion y es lentamente liberada en la circulacion.

[0039] La FIG. 21 muestra MURP que contienen modulos de multimerizacion. La parte superior de la figura muestra una MURP que contiene una secuencia de dimerizacion. Como resultado, forma un dimero que duplica

10 eficazmente su peso molecular. El centro de la figura muestra tres disefos de MURP que comprenden dos secuencias de multimerizacion. Tales MURP pueden formar multimeros con peso molecular eficaz muy alto. La parte inferior de la figura ilustro una MURP que contiene multiples secuencias de RGD que son conocidas por unirse a receptores de la superficie celular y asi conferir semivida.

15 [0040] La FIG. 22 muestra una variedad de MURP que se disefan para bloquear o modular la funcion de canales de iones. Los circulos indican modulos de union con especificidad por canales de iones. Estos modulos de union pueden derivarse o ser identicos a toxinas naturales con afinidad por receptores de canales de iones. La figura ilustra que otros dominios de union pueden afadirse a cualquier lado de los modulos especificos para union a canales de iones, confiriendo asi a las MURP eficacia o especificidad elevada por un tipo de celula particular.

20 [0041] La FIG. 23 muestra varios disefos de MURP para semivida elevada. El peso molecular eficaz elevado puede lograrse aumentando la longitud de cadena (A), multimerizacion quimica (B), afadiendo multiples copias de modulos de union a una molecula separada por sitios de no union (C), construccion de multimeros quimicos similares a C (D, E), que incluyen secuencias de multimerizacion (F).

25 [0042] La FIG. 24 muestra MURP que pueden formarse por conjugacion quimica de modulos de union con una secuencia de URP recombinante. La secuencia de URP se disefa para contener multiples residuos de lisina (K) como sitios de conjugacion.

30 [0043] La FIG. 25 muestra el disefo de una biblioteca de modulos de union a 2SS. Las secuencias contienen una secuencia de 1SS constante en el centro que esta flanqueada por secuencias aleatorias que contienen residuos de cisteina a distancia variable del nucleo de 1SS.

[0044] La FIG. 26 muestra el disefo de una biblioteca de modulos de union a 2SS. Las secuencias contienen 35 una secuencia de 1SS constante en el centro que esta flanqueada por secuencias aleatorias que contienen residuos de cisteina a distancia variable del nucleo de 1SS.

[0045] La FIG. 27 muestra el disefo de una biblioteca de dimeros de modulos de union 1SS. Inicialmente, una coleccion de modulos de union 1SS se amplifica por dos reacciones de PCR. Los productos de PCR resultantes se 40 combinan y generan dimeros en una posterior etapa de PCR.

[0046] La FIG. 28 muestra los analisis de Western de una proteina de fusion que contiene la secuencia de URP de 288 aminoacidos rPEG J288 despues de la incubacion de hasta 3 dias en 50% de suero de raton.

45 [0047] La FIG. 29 muestra los resultados de una prueba de ensayo de union para anticuerpos preexistentes contra una secuencia de URP de 288 aminoacidos.

[0048] La FIG. 30 muestra la union de MURP que contienen un (monomero), dos (dimero), cuatro (tetramero)

o cero (rPEG36) modulos de union con especificidad por VEGF que se recubrio para placas de microtitulacion.

50 [0049] La FIG. 31 muestra la secuencia de aminoacidos de una MURP con especificidad por EpCAM. La secuencia contiene cuatro modulos de union con afinidad por EpCAM (subrayado). La secuencia contiene una secuencia de Flag del extremo N que contiene los dos unicos residuos de lisina de la secuencia entera.

55 [0050] La FIG. 32 muestra el disefo de bibliotecas de adicion de 1SS. Modulos 1SS aleatorios pueden afadirse al extremo N o C de un modulo de union preseleccionado o simultaneamente a ambos lados.

[0051] La FIG. 33 muestra el alineamiento de secuencias relacionadas con toxina de tres dedos. La figura tambien muestra una estructura 3D que se resolvio por RMN.

[0052] La FIG. 34 muestra el disefo de una biblioteca basada en la toxina de tres dedos. Los residuos designados X se aleatorizaron. Se indica la eleccion de codon para cada posicion al azar.

5 [0053] La FIG. 35 muestra el alineamiento de secuencias relacionadas con plexina.

[0054] La FIG. 36 muestra el disefo de una biblioteca basada en plexina. Los residuos designados X se aleatorizaron. Se indica la eleccion de codon para cada posicion al azar.

10 [0055] FIG. 37 Secuencias de modulos de union relacionados con plexina con especificidad por DR4, ErbB2 y HGFR.

[0056] La FIG. 38 muestra un ensayo de union para dominios de union basados en microproteina con especificidad por VEGF.

15 [0057] La FIG. 39 muestra secuencias de modulos de union de 2SS y 3SS que se aislaron de bibliotecas de elaboracion con especificidad por VEGF. La parte superior de la proteina muestra analisis de gel de PAGE de las proteinas purificadas por calor-lisis.

20 [0058] La FIG. 40 muestra etapas de clonacion para construir la secuencia de URP rPEG J72.

[0059] La FIG. 41 muestra la construccion de una biblioteca de modulos de URP con 36 aminoacidos llamada rPEG J36. La region que codifica rPEG J36 se ensamblo ligando tres segmentos mas cortos que codifican rPEG J12 y un modulo tapon.

25 [0060] La FIG. 42 muestra la secuencia de nucleotidos y la traduccion del vector de relleno pCW0051. La region de relleno esta flanqueada por sitios BsaI y BbsI y contiene multiples codones de terminacion.

[0061] La FIG. 43 muestra un gel de PAGE de la purificacion del URP rPEG J288 fusionado con GFP. El 30 carril 2 muestra el lisado celular; carril 3: producto purificado por IMAC; carril 4: producto purificado por anti-Flag.

[0062] FIG. 44 Secuencia de aminoacidos de proteinas de fusion entre rPEG J288 y los dominios efectores humanos interferon alfa, G-CSF y hormona de crecimiento humana.

35 [0063] La FIG. 45 muestra el analisis Western de expresion de proteinas de fusion entre rPEG J288 y hormona de crecimiento humana (carriles 1 y 2), interferon alfa (carriles 3 y 4) y GFP (carriles 5 y 6). Se analizo tanto material soluble como insoluble para cada proteina.

[0064] La FIG. 46 muestra el disefo de MURP basado en la toxina OSK1. La figura muestra que secuencias 40 de URP y/o modulos de union pueden afadirse a cualquier lado de OSK1

[0065] La FIG. 47 representa a modo de ejemplo formatos de producto que comprenden los URP objeto.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

45 [0066] Aunque en el presente documento se han mostrado y descrito realizaciones preferidas de la presente invencion, sera obvio para aquellos expertos en la materia que tales realizaciones solo se proporcionan a modo de ejemplo. Numerosas variaciones, cambios y sustituciones se les ocurriran ahora a aquellos expertos en la materia sin apartarse de la invencion. Debe entenderse que pueden emplearse diversas alternativas a las realizaciones de la

50 invencion descritas en el presente documento en la practica de la invencion. Se pretende que las siguientes reivindicaciones definan el alcance de la invencion y que asi se cubran procedimientos y estructuras dentro del alcance de estas reivindicaciones y sus equivalentes.

Tecnicas generales:

55 [0067] La practica de la presente invencion emplea, a menos que se indique lo contrario, tecnicas convencionales de inmunologia, bioquimica, quimica, biologia molecular, microbiologia, biologia celular, genomica y ADN recombinante, que estan dentro de la habilidad en la tecnica. Vease Sambrook, Fritsch y Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a edicion (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel y col. eds., (1987)); las series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR

2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames y G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow y Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, y ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, ed. (1987)).

5 Definiciones:

[0068] Como se usa en la memoria descriptiva y reivindicaciones, la forma singular quot;unquot;, quot;unaquot;, quot;elquot; y quot;laquot; incluyen referencias plurales, a menos que el contexto dicte claramente de otro modo. Por ejemplo, el termino quot;una celulaquot; incluye una pluralidad de celulas, que incluye mezclas de las mismas.

10 [0069] Los terminos quot;polipeptidoquot;, quot;peptidoquot;, quot;secuencia de aminoacidosquot; y quot;proteinaquot; se usan indistintamente en el presente documento para referirse a polimeros de aminoacidos de cualquier longitud. El polimero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoacidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoacidos. Los terminos tambien engloban un polimero de aminoacidos que ha sido modificado, por ejemplo, formacion de enlaces

15 disulfuro, glicosilacion, lipidacion, acetilacion, fosforilacion, o cualquier otra manipulacion tal como conjugacion con un componente de marca. Como se usa en el presente documento, el termino quot;aminoacidoquot; se refiere tanto a aminoacidos naturales y/o no naturales como a sinteticos que incluyen, pero no se limitan a, glicina y tanto los isomeros opticos D como L, y analogos de aminoacidos y peptidomimeticos. Se usan codigos de una sola letra o de tres letras convencionales para designar los aminoacidos.

20 [0070] Una quot;secuencia repetitivaquot; se refiere a una secuencia de aminoacidos que puede describirse como un oligomero de secuencias de peptidos de repeticion, que forman repeticiones directas, o repeticiones inversas o repeticiones alternantes de motivos de multiples secuencias. Estas secuencias de oligomeros de repeticion pueden ser identicas u homologas entre si, pero tambien pueden ser motivos repetidos multiples. Las secuencias repetitivas

25 se caracterizan por un contenido de informacion muy bajo. Una secuencia repetitiva no es una caracteristica requerida de un URP y en algunos casos una secuencia no repetitiva sera de hecho preferida.

[0071] Los aminoacidos pueden caracterizarse basandose en su hidrofobia. Se han desarrollado varias escalas. Un ejemplo es una escala desarrollada por Levitt, M y col. (vease Levitt, M (1976) J Mol Biol 104, 59, n°

30 3233, que se enumera en Hopp, TP y col. (1981) Proc Natl Acad Sci U S A 78, 3824, n° 3232). Ejemplos de quot;aminoacidos hidrofilosquot; son arginina, lisina, treonina, alanina, asparagina y glutamina. Son de particular interes los aminoacidos hidrofilos aspartato, glutamato y serina, y glicina. Ejemplos de quot;aminoacidos hidrofobosquot; son triptofano, tirosina, fenilalanina, metionina, leucina, isoleucina y valina.

35 [0072] El termino quot;conformacion desnaturalizadaquot; describe el estado de un peptido en disolucion que se caracteriza por una gran libertad conformacional del esqueleto del peptido. La mayoria de los peptidos y proteinas adoptan una conformacion desnaturalizada en presencia de altas concentraciones de desnaturalizantes o a temperaturas elevadas. Los peptidos en conformacion desnaturalizada tienen espectros de CD caracteristicos y se caracterizan generalmente por una falta de interacciones de largo intervalo como se ha determinado por, por

40 ejemplo, RMN. Conformacion desnaturalizada y conformacion no plegada se usaran sinonimamente.

[0073] Los terminos quot;secuencias de proteinas no estructuradas (UNP)quot; y polimero recombinante no estructuradoquot; (URP) se usan en el presente documento indistintamente. Los terminos se refieren a secuencias de aminoacidos que comparten caracteristicas comunes con secuencias de peptidos desnaturalizadas, por ejemplo,

45 que presentan un comportamiento tipico similar a secuencias de peptidos desnaturalizadas, bajo condiciones fisiologicas, como se detalla en el presente documento. Las secuencias de URP carecen de una estructura terciaria definida y tienen estructura limitada o no secundaria como se detecta, por ejemplo, por el algoritmo de Chou-Fasman.

50 [0074] Como se usa en el presente documento, el termino quot;proteinas de la superficie celularquot; se refiere a los componentes de la membrana plasmatica de una celula. Engloba proteinas de la membrana integrales y perifericas, glicoproteinas, polisacaridos y lipidos que constituyen la membrana plasmatica. Una proteina de la membrana integral es una proteina transmembrana que se extiende a traves de la bicapa de lipidos de la membrana plasmatica de una celula. Una proteina de la membrana integral tipica consiste en al menos un segmento que atraviesa la

55 membrana que generalmente comprende residuos de aminoacidos hidrofobos. Las proteinas de la membrana periferica no se extienden en el interior hidrofobo de la bicapa de lipidos y estan unidas a la superficie de la membrana mediante interaccion covalente o no covalente directamente o indirectamente con otros componentes de la membrana.

[0075] Los terminos quot;membranaquot;, quot;citosolicaquot;, quot;nuclearquot; y quot;secretadaquot; como se aplican a proteinas celulares especifican la localizacion extracelular y/o subcelular en la que la proteina celular esta principalmente, predominantemente o preferencialmente localizada.

5 [0076] Los quot;receptores de la superficie celularquot; representan un subconjunto de proteinas de la membrana, que pueden unirse a sus ligandos respectivos. Los receptores de la superficie celular son moleculas ancladas sobre o insertadas en la membrana plasmatica de la celula. Constituyen una gran familia de proteinas, glicoproteinas, polisacaridos y lipidos, que sirven no solo de constituyentes estructurales de la membrana plasmatica, sino tambien de elementos reguladores que gobiernan una variedad de funciones biologicas.

10 [0077] El termino quot;moduloquot; se refiere a una parte de una proteina que se diferencia fisicamente o funcionalmente de otras porciones de la proteina o peptido. Un modulo puede comprender uno o mas dominios. En general, un modulo o dominio puede ser una unica estructura tridimensional estable, independientemente del tamafo. La estructura terciaria de un dominio tipico es estable en disolucion y sigue igual si un miembro tal se aisla

15 o se fusiona covalentemente con otros dominios. Un dominio tiene generalmente una estructura terciaria particular formada por relaciones espaciales de elementos de la estructura secundaria, tales como hojas beta, helices alfa y bucles no estructurados. En dominios de la familia de las microproteinas, los puentes disulfuro son generalmente los elementos primarios que determinan la estructura terciaria. En algunos casos, los dominios son modulos que pueden conferir una actividad funcional especifica, tal como avidez (sitios de multiple union a la misma diana), multi

20 especificidad (sitios de union para diferentes dianas), semivida (usando un dominio, peptido ciclico o peptido lineal) que se une a una proteina del suero como albumina de suero humano (HSA) o a IgG (hIgG1, 2, 3 o 4) o a globulos rojos. Los dominios funcionalmente definidos tienen una funcion (funciones) biologica(s) distinta(s). El dominio de union a ligando de un receptor es, por ejemplo, el dominio que se une a ligando. Un dominio de union a antigeno se refiere a la parte de una unidad de union a antigeno o un anticuerpo que se une al antigeno. Los dominios

25 funcionalmente definidos no necesitan codificarse por secuencias de aminoacidos contiguas. Los dominios funcionalmente definidos pueden contener uno o mas dominios fisicamente definidos. Los receptores, por ejemplo, se dividen generalmente en el dominio de union a ligando extracelular, un dominio transmembrana y un dominio efector intracelular. Un quot;dominio de anclaje a membranaquot; se refiere a la porcion de una proteina que media en la asociacion a membrana. Generalmente, el dominio de anclaje a membrana esta compuesto por residuos de

30 aminoacidos hidrofobos. Alternativamente, el dominio de anclaje a membrana puede contener aminoacidos modificados, por ejemplo, aminoacidos que estan unidos a una cadena de acido graso, que a su vez ancla la proteina a una membrana.

[0078] quot;Que no se produce naturalmentequot; como se aplica a una proteina significa que la proteina contiene al

35 menos un aminoacido que es diferente de la proteina natural o nativa correspondiente. Pueden determinarse secuencias no naturales realizando busqueda con BLAST usando, por ejemplo, la menor probabilidad de suma minima en la que la ventana de comparacion es la longitud de la secuencia de interes (la buscada) y cuando se compara con la base de datos no redundante (quot;nrquot;) de Genbank usando BLAST 2.0. El algoritmo BLAST 2.0, que se describe en Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. El software para realizar analisis con

40 BLAST esta publicamente disponible del Centro nacional para informacion biotecnologica.

[0079] Una quot;celula huespedquot; incluye una celula individual o cultivo celular que puede ser o ha sido un receptor para los vectores objeto. Celulas huesped incluyen progenie de una unica celula huesped. La progenie puede no ser necesariamente completamente identica (en morfologia o en genomica del complemento de ADN total) a la celula

45 parental original debido a mutacion natural, accidental o intencionada. Una celula huesped incluye celulas transfectadas in vivo con un vector descrito en el presente documento.

[0080] Como se usa en el presente documento, el termino quot;aisladoquot; significa separado de constituyentes, celulares y de otro modo, en los que el polinucleotido, peptido, polipeptido, proteina, anticuerpo, o fragmentos de los 50 mismos, estan normalmente asociados en la naturaleza. Como es evidente para aquellos expertos en la materia, un polinucleotido, peptido, polipeptido, proteina, anticuerpo, o fragmentos de los mismos, que no se produce naturalmente no requiere quot;aislamientoquot; para distinguirlo de su homologo que se produce naturalmente. Ademas, un polinucleotido, peptido, polipeptido, proteina, anticuerpo, o fragmentos de los mismos, quot;concentradoquot;, quot;separadoquot; o quot;diluidoquot; es diferenciable de su homologo que se produce naturalmente porque la concentracion o numero de

55 moleculas por volumen es mayor que quot;concentradoquot; o inferior a quot;separadoquot; que el de su homologo que se produce naturalmente.

[0081] quot;Ligadoquot; y quot;fusionadoquot; o quot;fusionquot; se usan indistintamente en el presente documento. Estos terminos se refieren a unir juntos dos o mas elementos o componentes quimicos, por cualquier medio que incluya conjugacion quimica o medios recombinantes. Una quot;fusion en marcoquot; se refiere a la union de dos o mas marcos de lectura abiertos (OFR) para formar un OFR mas largo continuo, de un modo que mantenga el marco de lectura correcto de los OFR originales. Asi, la proteina de fusion recombinante resultante es una proteina individual que contiene dos o mas segmentos que se corresponden con polipeptidos codificados por los OFR originales (segmentos que

5 normalmente no estan asi unidos en la naturaleza.)

[0082] En el contexto de polipeptidos, una quot;secuencia linealquot; o una quot;secuenciaquot; es un orden de aminoacidos en un polipeptido en una direccion del extremo amino a carboxilo en la que los residuos que son vecinos entre si en la secuencia son contiguos en la estructura primaria del polipeptido. Una quot;secuencia parcialquot; es una secuencia lineal

10 de parte de un polipeptido que se sabe que comprende residuos adicionales en una o ambas direcciones.

[0083] quot;Heterologoquot; significa derivado de una entidad genotipicamente distinta del resto de la entidad con la que esta siendo comparada. Por ejemplo, una secuencia rica en glicina eliminada de su secuencia codificante nativa y operativamente ligada a una secuencia codificante distinta de la secuencia nativa es una secuencia rica en glicina 15 heterologa. El termino quot;heterologoquot; como se aplica a un polinucleotido, un polipeptido, significa que el polinucleotido

o polipeptido se deriva de una entidad genotipicamente distinta de la del resto de la entidad con la que esta siendo comparada.

[0084] Los terminos quot;polinucleotidosquot;, quot;acidos nucleicosquot;, quot;nucleotidosquot; y quot;oligonucleotidosquot; se usan

20 indistintamente. Se refieren a una forma polimerica de nucleotidos de cualquier longitud, tanto desoxirribonucleotidos como ribonucleotidos, o analogos de los mismos. Los polinucleotidos pueden tener cualquier estructura tridimensional, y pueden realizar cualquier funcion, conocida o desconocida. Lo siguiente son ejemplos no limitantes de polinucleotidos: regiones codificantes o no codificantes de un gen o fragmento de gen, loci (locus) definidos del analisis de enlace, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosomico, ribozimas,

25 ADNc, polinucleotidos recombinantes, polinucleotidos ramificados, plasmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de acido nucleico y cebadores. Un polinucleotido puede comprender nucleotidos modificados, tales como nucleotidos metilados y analogos de nucleotidos. Si estan presentes, las modificaciones a la estructura del nucleotido pueden conferirse antes o despues del ensamblaje del polimero. La secuencia de nucleotidos puede interrumpirse por componentes de no nucleotido. Un polinucleotido

30 puede modificarse adicionalmente despues de la polimerizacion, tal como por conjugacion con un componente de marca.

[0085] quot;Recombinantequot; como se aplica a un polinucleotido significa que el polinucleotido es el producto de diversas combinaciones de etapas de clonacion, restriccion y/o ligacion, y otros procedimientos que producen una

35 construccion que es distinta de un polinucleotido encontrado en la naturaleza.

[0086] Los terminos quot;genquot; o quot;fragmento genicoquot; se usan indistintamente en el presente documento. Se refieren a un polinucleotido que contiene al menos un marco de lectura abierto que puede codificar una proteina particular despues de ser transcrita y traducida. Un gen o fragmento genico puede ser ADN genomico o ADNc, en tanto que el

40 polinucleotido contenga al menos un marco de lectura abierto que pueda cubrir la region codificante entera o un segmento de la misma. Un quot;gen de fusionquot; es un gen compuesto por al menos dos polinucleotidos heterologos que estan ligados juntos.

[0087] Un quot;vectorquot; es una molecula de acido nucleico, preferentemente auto-replicante, que transfiere una

45 molecula de acido nucleico insertada en y/o entre celulas huesped. El termino incluye vectores que funcionan principalmente para la insercion de ADN o ARN en una celula, replicacion de vectores que funcionan principalmente para la replicacion de ADN o ARN y vectores de expresion que funcionan para la transcripcion y/o traduccion del ADN o ARN. Tambien se incluyen vectores que proporcionan mas de una de las funciones anteriores. Un quot;vector de expresionquot; es un polinucleotido que, cuando se introduce en una celula huesped apropiada, puede transcribirse y

50 traducirse en un polipeptido(s). Un quot;sistema de expresionquot; normalmente connota una celula huesped adecuada que comprende un vector de expresion que puede funcionar para dar un producto de expresion deseado.

[0088] La quot;dianaquot; como se usa en el contexto de MURP es una molecula o estructura bioquimica con la que el modulo de union o el modulo de union ligado a URP puede unirse y en la que el acontecimiento de union produce

55 una actividad biologica deseada. La diana puede ser un ligando de proteina o receptor que es inhibido, activado o que actua de otro modo por la proteina. Ejemplos de dianas son hormonas, citocinas, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, receptores de la superficie celular, cinasas, factores de crecimiento y otras estructuras bioquimicas con actividad biologica.

[0089] Un quot;modulo funcionalquot; puede ser cualquier no URP en un producto de proteina. Asi, un modulo funcional puede ser un modulo de union (BM), un modulo efector (EM), un modulo de multimerizacion (MM), un modulo del extremo C (CM) o un modulo del extremo N (NM). En general, los modulos funcionales se caracterizan por un alto contenido de informacion de su secuencia de aminoacidos, es decir, contienen muchos aminoacidos

5 diferentes y muchos de estos aminoacidos son importantes para la funcion de un modulo funcional. Un modulo funcional normalmente tiene estructura secundaria y terciaria, puede ser un dominio de proteina plegada y puede contener 1, 2, 3, 4, 5 o mas enlaces disulfuro.

[0090] El termino 'microproteinas' se refiere a una clasificacion en la base de datos SCOP. Las microproteinas

10 son normalmente las proteinas mas pequefas con una estructura fija y normalmente, pero no exclusivamente, tienen tan solo 15 aminoacidos con dos disulfuros o hasta 200 aminoacidos con mas de diez disulfuros. Una microproteina puede contener uno o mas dominios de microproteina. Algunos dominios de microproteina o familias de dominios pueden tener multiples estructuras mas o menos estables y multiples estructuras mas o menos similares que son conferidas por diferentes patrones de enlace disulfuro, asi el termino estable se usa de una forma

15 relativa para diferenciar microproteinas de peptidos y dominios de no microproteina. La mayoria de las toxinas de microproteina estan compuestas de un unico dominio, pero las microproteinas del receptor de la superficie de la celula frecuentemente tienen multiples dominios. Las microproteinas pueden ser tan pequefas debido a que su plegamiento se estabiliza tanto por enlaces disulfuro como por iones tales como calcio, magnesio, manganeso, cobre, cinc, hierro, o una variedad de otros iones multivalentes, en lugar de estabilizarse por el nucleo hidrofobo

20 tipico.

[0091] El termino quot;andamiajequot; se refiere a la 'region estructural' o 'motivo de secuencia' de polipeptidos minimo que se usa como secuencia comun conservada en la construccion de bibliotecas de proteinas. Entre los residuos/posiciones fijos o conservados del andamiaje se encuentran posiciones variables e hipervariables. Se 25 proporciona una diversidad de aminoacidos en las regiones variables entre los residuos de andamiaje fijos para proporcionar la union especifica a una molecula diana. Un andamiaje se define normalmente por los residuos conservados que se observan en un alineamiento de una familia de proteinas relacionadas con la secuencia. Los residuos fijos pueden requerirse para plegamiento o estructura, especialmente si las funciones de las proteinas alineadas son diferentes. Una descripcion completa de un andamiaje de microproteina puede incluir el numero,

30 posicion o separacion y patron de union de las cisteinas, ademas de posicion e identidad de cualquier residuo fijo en los bucles, que incluyen sitios de union para iones tales como calcio.

[0092] El quot;plieguequot; de una microproteina se define ampliamente por el patron de enlace de los enlaces disulfuro (es decir, 1-4, 2-6, 3-5). Este patron es una constante topologica y generalmente no es flexible a conversion 35 en otro patron sin no ligar y religar los disulfuros tales como mediante reduccion y oxidacion (agentes redox). En general, proteinas naturales con secuencias relacionadas adoptan los mismos patrones de enlace disulfuro. Los principales determinantes son el patron de distancia de cisteina (CDP) y algunos residuos no cis fijos, ademas de un sitio de union a metal, si esta presente. En algunos casos, el plegamiento de proteinas tambien esta influido por las secuencias de alrededor (es decir, pro-peptidos) y en algunos casos por derivatizacion quimica (por ejemplo,

40 gamma-carboxilacion) de residuos que permiten que la proteina se una a iones metalicos divalentes (es decir, Ca++) que ayuda en su plegamiento. Para la gran mayoria de las microproteinas no se requiere tal ayuda en el plegamiento.

[0093] Sin embargo, proteinas con el mismo patron de union pueden todavia comprender multiples pliegues,

45 basandose en diferencias en la longitud y composicion de los bucles que son suficientemente grandes para que la proteina de una estructura bastante diferente. Un ejemplo son las familias de dominios de conotoxina, ciclotoxina y anato que tienen el mismo DBP, pero un CDP muy diferente, y se considera que son plegamientos diferentes. Determinantes de un pliegue de proteina son cualquier atributo que altere enormemente la estructura con respecto a un pliegue diferente, tal como el numero y patron de union de las cisteinas, la separacion de las cisteinas,

50 diferencias en los motivos de secuencia de los bucles entre cisteinas (especialmente residuos de bucle fijos que es probable que se necesiten para el plegamiento, o en la localizacion o composicion del sitio de union a calcio (u otro metal o co-factor).

[0094] El termino quot;patron de enlaces disulfuroquot; o quot;DBPquot; se refiere al patron de enlace de las cisteinas, que

55 estan numeradas 1-n del extremo N con respecto al extremo C de la proteina. Los patrones de enlaces disulfuro son topologicamente constantes, que significa que solo pueden cambiarse no ligando uno o mas disulfuros tales como usando condiciones redox. Los posibles patrones de 2, 3 y 4 enlaces disulfuro se enumeran mas adelante en los parrafos 0048-0075.

[0095] El termino quot;patron de distancia de cisteinasquot; o quot;CDPquot; se refiere al numero de aminoacidos de no cisteina que separa las cisteinas sobre una cadena de proteina lineal. Se usan varias notaciones: C5C0C3C igual a C5CC3C igual a CxxxxxCCxxxC.

5 [0096] El termino 'Posicion n6' o 'n7=4' se refiere a los bucles entre cisteinas y 'n6' se define como el bucle entre C6 y C7; 'n7=4' significa el bucle entre C7 y C8 tiene 4 aminoacidos de longitud, sin contar las cisteinas

[0097] Resistencia a la degradacion en suero - Las proteinas pueden eliminarse por degradacion en la sangre, que normalmente implica proteasas en el suero o plasma. La resistencia a la degradacion en suero se mide 10 combinando la proteina con suero o plasma humano (o raton, rata, mono, segun sea apropiado), normalmente durante un intervalo de dias (es decir, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 16 dias) a 37 °C. Las muestras para estos momentos de tiempo se ejecutan entonces sobre un ensayo Western y la proteina se detecta con un anticuerpo. El anticuerpo puede ser una marca en la proteina. Si la proteina muestra una unica banda sobre Western, en la que el tamafo de la proteina es identico al de la proteina inyectada, entonces no se ha producido degradacion. El momento de tiempo

15 al que el 50% de la proteina se degrada, como se juzga por Western, es la semivida de degradacion en suero de la proteina

[0098] Union a proteina del suero - Mientras que la MURP tiene normalmente varios modulos que se unen a dianas de la superficie de la celula y/o proteinas del suero, se desea que el URP carezca sustancialmente de 20 actividades involuntarias. El URP debe disefarse para minimizar evitar la interaccion con (union a) proteinas del suero, que incluyen anticuerpos. Pueden cribarse diferentes disefos de URP para la union a proteinas del suero por ELISA, inmovilizando las proteinas del suero y luego afadiendo el URP, incubando, lavando y luego detectando la cantidad de URP unido. Un enfoque es detectar el URP usando un anticuerpo que reconoce una marca que se ha unido a URP. Un enfoque diferente es inmovilizar el URP (tal como mediante una fusion con GFP) y ponerlo en 25 contacto con suero humano, incubando, lavando y luego detectando la cantidad de anticuerpos humanos que siguen unidos al URP usando anticuerpos secundarios como de cabra dirigido contra IgG humana. Usando estos enfoques, los presentes inventores han disefado sus URP que muestran niveles muy bajos de union a proteinas del suero. Sin embargo, en algunas aplicaciones se desea la union a proteinas del suero o proteinas expuestas al suero, por ejemplo, debido a que puede prologar adicionalmente la semivida de secrecion. En tales casos, pueden usarse

30 estos mismos ensayos para disefar URP que se unen a proteinas del suero o proteinas expuestas al suero tales como HSA o IgG. En otros casos, las MURP puedes ser modulos de union dados que contienen peptidos que han sido disefados para unirse a proteinas del suero o proteinas expuestas al suero tales como HSA o IgG.

Polfmeros recombinantes no estructurados (URP):

35 [0099] La presente memoria descriptiva describe el disefo de polimeros recombinantes no estructurados (URP). Los URP objeto son particularmente utiles para generar proteinas recombinantes de valor terapeutico y/o diagnostico. Los URP objeto presentan una o mas de las siguientes caracteristicas.

40 [0100] Los URP objeto comprenden secuencias de aminoacidos que normalmente comparten caracteristicas comunes con secuencias de peptidos desnaturalizadas bajo condiciones fisiologicas. Las secuencias de URP normalmente se comportan como secuencias de peptidos desnaturalizadas bajo condiciones fisiologicas. Las secuencias de URP carecen de estructuras secundarias y terciarias bien definidas bajo condiciones fisiologicas. Se ha establecido una variedad de procedimientos en la tecnica para determinar las estructuras secundarias y terciarias

45 de un polipeptido dado. Por ejemplo, la estructura secundaria de un polipeptido puede determinarse por espectroscopia de CD en la region espectral quot;UV lejanaquot; (190-250 nm). Las estructuras de helice alfa, hoja beta y de bobina al azar dan cada una lugar a una forma y magnitud caracteristica de espectros de CD. La estructura secundaria tambien puede determinarse mediante ciertos programas informaticos o algoritmos tales como el algoritmo de Chou-Fasman (Chou, P. Y. y col. (1974) Biochemistry, 13: 222-45). Para una secuencia de URP dada,

50 el algoritmo puede predecir si existe o no alguna estructura secundaria o absolutamente ninguna estructura secundaria. En general, las secuencias de URP tendran espectros que se asemejan a proteinas desnaturalizadas debido a su bajo grado de estructura secundaria y terciaria. Si se desea, las secuencias de URP pueden disefarse para tener conformaciones predominantemente desnaturalizadas bajo condiciones fisiologicas. Las secuencias de URP normalmente tienen un alto grado de flexibilidad conformacional bajo condiciones fisiologicas y tienden a tener

55 grandes radios hidrodinamicos (radio de Stokes) en comparacion con proteinas globulares de peso molecular similar. Como se usa en el presente documento, condiciones fisiologicas se refiere a un conjunto de condiciones que incluyen temperatura, concentracion de sales, pH que imitan a aquellas condiciones de un sujeto vivo. Se han establecido una multitud de condiciones fisiologicamente relevantes para su uso en ensayos in vitro. Generalmente, un tampon fisiologico contiene una concentracion fisiologica de sal y ajustado a un pH neutro que oscila de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,8, y preferentemente de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,5. Una variedad de tampones fisiologicos se enumera en Sambrook y col. (1989), arriba, y de ahi que no se detalle en el presente documento. La temperatura fisiologicamente relevante oscila de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 38 °C, y preferentemente de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 37 °C.

5 [0101] Los URP objeto pueden ser secuencias con baja inmunogenicidad. La baja inmunogenicidad puede ser un resultado directo de la flexibilidad conformacional de las secuencias de URP. Muchos anticuerpos reconocen los llamados epitopes conformacionales en antigenos de proteina. Los epitopes conformacionales estan formado por regiones de la superficie de la proteina que estan compuestas de multiples secuencias de aminoacidos discontinuas

10 del antigeno de proteina. El plegamiento preciso de la proteina lleva a estas secuencias a una configuracion especial bien definida que puede ser reconocida por anticuerpos. Los URP preferidos se disefan para evitar la formacion de epitopes conformacionales. Por ejemplo, son de particular interes secuencias de URP que tienen una baja tendencia a adaptarse a conformaciones compactamente plegadas en disolucion acuosa. En particular, la baja inmunogenicidad puede lograrse eligiendo secuencias que resisten al procesamiento de antigenos en celulas

15 presentadoras de antigeno, eligiendo secuencias que no se unen a bien MHC y/o eligiendo secuencias que se derivan de secuencias humanas.

[0102] Los URP objeto pueden ser secuencias con un alto grado de resistencia a proteasas. La resistencia a proteasas tambien puede ser un resultado de la flexibilidad conformacional de las secuencias de URP. La resistencia 20 a proteasas puede disefarse evitando sitios de reconocimiento de proteasas conocidos. Alternativamente, las secuencias resistentes a proteasas pueden seleccionarse por visualizacion de fago o tecnicas relacionadas de bibliotecas de secuencias aleatorias o semialeatorias. Si se desea para aplicaciones especiales, tales como liberacion lenta de una preparacion de proteina de liberacion controlada, pueden construirse sitios de escision por proteasas del suero en un URP. Son de particular interes secuencias de URP con alta estabilidad (por ejemplo, larga

25 semivida en suero, menos propensas a la escision por proteasas presentes en fluido corporal) en sangre.

[0103] El URP objeto tambien puede caracterizarse por el efecto por el cual tras su la incorporacion en una proteina, la proteina presenta una semivida en suero prolongada y/o mayor solubilidad con respecto a la proteina correspondiente que es deficiente en URP. [En la tecnica se conocen procedimientos de determinacion de la

30 semivida en suero (vease, por ejemplo, Alvarez, P. y col. (2004) J Biol Chem, 279: 3375-81). Puede determinarse facilmente si la proteina resultante tiene una semivida en suero prolongada con respecto a la proteina sin modificar poniendo en practica cualquier procedimiento disponible en la materia o ejemplificado en el presente documento.

[0104] El URP objeto puede ser de cualquier longitud necesaria para efectuar (a) la extension de la semivida

35 en suero de una proteina que comprende el URP; pws. opcionalmente (b) un aumento en la solubilidad de la proteina resultante; (c) una elevada resistencia a proteasas; y/o (d) una inmunogenicidad reducida de la proteina resultante que comprende el URP. El URP objeto tiene aproximadamente 200, 300, 400 o mas aminoacidos contiguos. Cuando se incorpora en una proteina, el URP puede fragmentarse de forma que la proteina resultante contenga multiples URP, o multiples fragmentos de URP.

40 [0105] El URP puede tener un punto isoelectrico (pI) de 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5 o incluso 13,0.

[0106] En general, las secuencias de URP son ricas en aminoacidos hidrofilos y contienen un bajo porcentaje

45 de aminoacidos hidrofobos o aromaticos. Residuos hidrofilos adecuados incluyen, pero no se limitan a, glicina, serina, aspartato, glutamato, lisina, arginina y treonina. Los residuos hidrofobos que son menos favorecidos en la construccion de URP incluyen triptofano, fenilalanina, tirosina, leucina, isoleucina, valina y metionina. Las secuencias de URP pueden ser ricas en glicina, pero las secuencias de URP tambien pueden ser ricas en los aminoacidos glutamato, aspartato, serina, treonina, alanina o prolina. Asi, el aminoacido predominante puede ser G, E, D, S, T, A

50 o P. La inclusion de residuos de prolina tiende a reducir la sensibilidad a degradacion proteolitica.

[0107] La inclusion de residuos hidrofilos normalmente aumenta la solubilidad de URP en agua y medios acuosos bajo condiciones fisiologicas. Como resultado de su composicion de aminoacidos, las secuencias de URP tienen una baja tendencia a formar agregados en formulaciones acuosas y la fusion de secuencias de URP a otras

55 proteinas o peptidos tiende a potenciar su solubilidad y reducir su tendencia a formar agregados, que es un mecanismo separado para reducir la inmunogenicidad.

[0108] Las secuencias de URP pueden disefarse para evitar que ciertos aminoacidos confieran propiedades no deseables a la proteina. Por ejemplo, pueden disefarse secuencias de URP que contengan pocos o ninguno de los siguientes aminoacidos: cisteina (para evitar la formacion y oxidacion de disulfuro), metionina (para evitar la oxidacion), asparagina y glutamina (para evitar la desamidacion).

URP ricos en glicina:

5 [0109] En una realizacion, el URP objeto comprende una secuencia rica en glicina (GRS). Por ejemplo, la glicina puede estar presente predominantemente de forma que sean los residuos mas prevalentes presentes en la secuencia de interes. En otro ejemplo, las secuencias de URP pueden disefarse de forma que los residuos de glicina constituyan al menos aproximadamente el 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% de los aminoacidos totales. Los URP tambien puede contener el 100% de glicinas. En otro

10 ejemplo mas, los URP contienen al menos 30% de glicina y la concentracion total de triptofano, fenilalanina, tirosina, valina, leucina e isoleucina es entonces menos del 20%. En otro ejemplo adicional, los URP contienen al menos 40% de glicina y la concentracion total de triptofano, fenilalanina, tirosina, valina, leucina e isoleucina es entonces menos del 10%. En todavia otro ejemplo, los URP contienen al menos aproximadamente 50% de glicina y la concentracion total de triptofano, fenilalanina, tirosina, valina, leucina e isoleucina es entonces menos del 5%.

15 [0110] La longitud de GRS pueden variar entre aproximadamente 5 aminoacidos y 200 aminoacidos o mas. Por ejemplo, la longitud de un GRS contiguo individual puede contener 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90,100, 120, 140, 160, 180, 200, 240, 280, 320 o 400 o mas aminoacidos. La GRS puede comprender residuos de glicina en ambos extremos.

20 [0111] La GRS tambien puede tener un contenido significativo de otros aminoacidos, por ejemplo, Ser, Thr, Ala o Pro. La GRS puede contener una fraccion significativa de aminoacidos negativamente cargados que incluyen, pero no se limitan a, Asp y Glu. La GRS puede contener una fraccion significativa de aminoacidos positivamente cargados que incluyen, pero no se limitan a, Arg o Lys. Si se desea, los URP pueden disefarse para contener solo

25 un unico tipo de aminoacido (es decir, Gly o Glu), algunas veces solo algunos tipos de aminoacidos, por ejemplo, dos a cinco tipos de aminoacidos (por ejemplo, seleccionados de G, E, D, S, T, A y P), a diferencia de proteinas tipicas y ligadores tipicos que generalmente estan compuestos de la mayoria de los veinte tipos de aminoacidos. Los URP pueden contener residuos negativamente cargados (Asp, Glu) en el 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o el 1 por ciento de las posiciones de aminoacidos.

30 [0112] Los URP que contienen GRS son de particular interes debido a, en parte, la elevada libertad conformacional de los peptidos que contienen glicina. Los peptidos desnaturalizados en disolucion tienen un alto grado de libertad conformacional. La mayor parte de esa libertad conformacional se pierde tras la union de dichos peptidos a una diana como un receptor, un anticuerpo o una proteasa. Esta perdida de entropia necesita

35 compensarse por la energia de interaccion entre el peptido y su diana. El grado de libertad conformacional de un peptido desnaturalizado depende de sus secuencias de aminoacidos. Los peptidos que contienen muchos aminoacidos con cadenas laterales pequefas tienden a tener mas libertad conformacional que los peptidos que estan compuestos de aminoacidos con cadenas laterales mayores. Los peptidos que contienen el aminoacido glicina tienen grados particularmente grandes de libertad. Se ha estimado que los enlaces peptidicos que contienen glicina

40 tienen aproximadamente 3,4 veces mas entropia en disolucion con respecto a secuencias que contienen alanina correspondientes (D'Aquino, J. A. y col. (1996) Proteins, 25: 143-56). Este factor aumenta con el numero de residuos de glicina en una secuencia. Como resultado, tales peptidos tienden a perder mas entropia tras la union a dianas, que reduce su capacidad global para interaccionar con otras proteinas, ademas de su capacidad para adoptar estructuras tridimensionales definidas. La gran flexibilidad conformacional de los enlaces peptidicos de glicina

45 tambien es evidente cuando se analizan representaciones de Ramachandran de estructuras de proteina en las que los enlaces peptidicos de glicina ocupan areas que estan raramente ocupadas por otros enlaces peptidicos (Venkatachalam, C. M. y col. (1969) Annu Rev Biochem, 38: 45-82). Stites y col. estudiaron una base de datos de

12.320 residuos de 61 estructuras cristalinas de alta resolucion no homologas para determinar las preferencias conformaciones phi, psi de cada uno de los 20 aminoacidos. Las distribuciones observadas en el estado nativo de 50 proteinas se supone que tambien refleja las distribuciones encontradas en el estado desnaturalizado. Las distribuciones se usaron para aproximar la superficie de energia a cada residuo, permitiendo el calculo de entropias conformaciones relativas para cada residuo con respecto a glicina. En el caso mas extremo, la sustitucion de prolina con glicina, los cambios de entropia conformacional estabilizaran el estado nativo con respecto al estado desnaturalizado -0,82 +/- 0,08 kcal/mol a 20 °C (Stites, W. E. y col. (1995) Protein, 22: 132). Estas observaciones

55 confirman la funcion especial de la glicina entre los 20 aminoacidos naturales.

[0113] En el disefo de los URP objeto pueden usarse secuencias naturales o no naturales. Por ejemplo, una multitud de secuencias naturales que contienen alto contenido de glicina se proporciona en la Tabla 1, Tabla 2, Tabla 3 y Tabla 4. Un experto en la materia puede adoptar una cualquiera de las secuencias como un URP, o modificar las secuencias para lograr las propiedades previstas. Si es de interes la inmunogenicidad para el sujeto huesped, es preferible disefar URP que contengan GRS basandose en secuencias ricas en glicina derivadas del huesped. URP que contienen GRS preferidos son secuencias de proteinas humanas o secuencias que comparten homologia sustancial con las secuencias ricas en glicina correspondientes en las proteinas humanas de referencia.

[0114]

Tabla 1. Analisis estructural de proteinas que contienen secuencias ricas en glicina

Archivo de PDB

Funci6nde la proteina Secuencias ricas en glicina

1K3V

Capside del parvovirus porcino sgggggggggrgagg

1FPV

Virus de la panleucopenia felina tgsgngsgggggggsgg

1IJS

Cepa D de CpV, mutante A300d tgsgngsgggggggsgg

1MVM

Virus de Mvm (cepa I) ggsggggsgggg

Tabla 2: Marcos de lectura abiertos que codifican GRS con 300 o mas residuos de glicina

Acceso Organismo Gly (%) Longitud de GRS Longitud del gen Funci6npredicha

NP 974499 Arabidopsis thaliana 64 509 579 desconocida

ZP 00458077 Burrholderia 66 373 518 lipoproteina putativa cenocepacia XP 477841 Oryza sativa 74 371 422 desconocida MP 910409 Oryza sativa 75 368 400 precursor putativo de

la pared celular NP 610660 Drosophila 66 322 610 elemento transponible melanogaster

Tabla 3. Ejemplosde GRS humana

15

Acceso

Gly (%) Longitud de GRS Longitud del gen Hidrofobia Funci6npredicha

NP 000217

62 135 622 si queratina 9

NP 631961

61 73 592 si isoforma 1 del factor 15

asociado a TBP

NP 476429

65 70 629 si queratina 3

NP 000418

70 66 316 si loricrina, envuelta de la celula

NP 056932

60 66 638 si citoqueratina 2

Tabla 4. Ejemplosadicionales de GRS humana

Acceso

Secuencias Numero de aminoacidos

NP 006228

GPGGGGGPGGGGGPGGGGPGGGGGGGPGGGGGGPGGG 37

NP 787059

GAGGGGGGGGGGGGGSGGGGGGGGAGAGGAGAG 33

NP 009060

GGGSGSGGAGGGSGGGSGSGGGGGGAGGGGGG 32

NP 031393

GDGGGAGGGGGGGGSGGGGSGGGGGGG 27

NP 005850

GSGSGSGGGGGGGGGGGGSGGGGGG 25

NP 061856

GGGRGGRGGGRGGGGRGGGRGGG 22

NP 787059

GAGGGGGGGGGGGGGSGGGGGGGGAGAGGAGAG 33

NP 009060

GGGSGSGGAGGGSGGGSGSGGGGGGAGGGGGG 32

NP 031393

GDGGGAGGGGGGGGSGGGGSGGGGGGG 27

NP 115818

GSGGSGGSGGGPGPGPGGGGG 21

XP 376532

GEGGGGGGEGGGAGGGSG 18

NP 065104

GGGGGGGGDGGG 12

20 GGGSGSGGAGGGSGGGSGSGGGGGGAGGGGGGSSGGGSGTAGGHSG dominio POU, clase 4, factor de transcripcion 1 [Homo sapiens] GPGGGGGPGGGGGPGGGGPGGGGGGGPGGGGGGPGGG

25 2 que contiene dominio YEATS [Homo sapiens]

GGSGAGGGGGGGGGGGSGSGGGGSTGGGGGTAGGG

isoforma 3 de dominio 1B interactivo rico en AT (similar a SWI1); proteina de union a BRG1 ELD/OSA1; Eld (parpado)/proteina Osa [Homo sapiens] 5 GAGGGGGGGGGGGGGSGGGGGGGGAGAGGAGAG

isoforma 2 de dominio 1B interactivo rico en AT (similar a SWI1); proteina de union a BRG1 ELD/OSA1; Eld (parpado)/proteina Osa [Homo sapiens] GAGGGGGGGGGGGGGSGGGGGGGGAGAGGAGAG

10 isoforma 1 de dominio 1B interactivo rico en AT (similar a SWI1); proteina de union a BRG1 ELD/OSA1; Eld (parpado)/proteina Osa [Homo sapiens] GAGGGGGGGGGGGGGSGGGGGGGGAGAGGAGAG

15 proteina A de union al elemento rico en purina; proteina alfa de union a ADN monocatenario rico en purina; proteina PUR-alfa del activador transcripcional [Homo sapiens] GHPGSGSGSGGGGGGGGGGGGSGGGGGGAPGG

factor X1 regulador; factor 1 regulador de accion trans; factor C potenciador; factor RFX regulador del MHC de clase 20 II [Homo sapiens] GGGGSGGGGGGGGGGGGGGSGSTGGGGSGAG

proteina que contiene dominio de bromo alterada en leucemia [Homo sapiens] GGRGRGGRGRGSRGRGGGGTRGRGRGRGGRG

25 proteina desconocida [Homo sapiens] GSGGSGGSGGGPGPGPGGGGGPSGSGSGPG

PREDICHA: proteina hipotetica XP 059256 [Homo sapiens] 30 GGGGGGGGGGGRGGGGRGGGRGGGGEGGG

proteina de dedo de cinc 281; factor de transcripcion de ZNP-99 [Homo sapiens] GGGGTGSSGGSGSGGGGSGGGGGGGSSG

35 isoforma corta de la proteina de union a ARN (autoantigenica, asociada a hnRNP con amarillo letal); proteina de union a ARN (autoantigenica); proteina de union a ARN (letal) [Homo sapiens] GDGGGAGGGGGGGGSGGGGSGGGGGGG

particula de reconocimiento de sefales de 68 kDa [Homo sapiens] 40 GGGGGGGSGGGGGSGGGGSGGGRGAGG

proteina KIAA0265 [Homo sapiens] GGGAAGAGGGGSGAGGGSGSGGRGTG

45 homologo de engrailed 2; Engrailed-2 [Homo sapiens] GAGGGRGGGAGGEGGASGAEGGGGAGG

isoforma larga de proteina de union a ARN (autoantigenica, asociada a hnRNP con amarillo letal), proteina de union a ARN (autoantigenica); proteina de union a ARN (autoantigenica, asociada a hnRNP con amarillo letal) [Homo 50 sapiens] GDGGGAGGGGGGGGSGGGGSGGGGGGG

receptor de androgenos; receptor de dihidrotestosterona [Homo sapiens] GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGEAG

55 caja homeotica D11; caja homeotica 4F; Hox-4.6, raton, homologo de; proteina de caja homeotica Hox-D11 [Homo sapiens] GGGGGGSAGGGSSGGGPGGGGGGAGG

frizzled 8; homologo 8 de frizzled (Drosophila) [Homo sapiens] GGGGGPGGGGGGGPGGGGGPGGGGG

gen asociado al desarrollo ocular [Homo sapiens] 5 GRGGAGSGGAGSGAAGGTGSSGGGG

caja homeotica B3; caja homeotica 2G; proteina de la caja homeotica Hox-B3 [Homo sapiens] GGGGGGGGGGGSGGSGGGGGGGGGG

10 marco de lectura abierto 29 del cromosoma 2 [Homo sapiens] GGSGGGRGGASGPGSGSGGPGGPAG

proteina DKFZP564F0522 [Homo sapiens] GGHHGDRGGGRGGRGGRGGRGGRAG

15 PREDICHA: similar a proteina 2 homologa a even-skipped (EVX-2) de caja homeotica [Homo sapiens] GSRGGGGGGGGGGGGGGGGAGAGGG

familia de genes homologos a ras, miembro U; Ryu GTPasa; homologo Cdc42 sensible a Wnt-1; 2310026M05Rik; 1 20 similar a proteina de union a GTP; GTPasa similar a CDC42 [Homo sapiens] GGRGGRGPGEPGGRGRAGGAEGRG

proteina scratch 2; scratch 2 de represor transcripcional; scratch (homologo de Drosophila) 2, proteina de dedo de cinc [Homo sapiens] 25 GGGGGDAGGSGDAGGAGGRAGRAG

familia A de la proteina nucleolar, miembro 1; proteina GAR1 [Homo sapiens] GGGRGGRGGGRGGGGRGGGRGGG

30 queratina 1; queratina-1; citoqueratina 1; alfa-proteina del pelo [Homo sapiens] GGSGGGGGGSSGGRGSGGGSSGG

proteina hipotetica FLJ31413 [Homo sapiens] GSGPGTGGGGSGSGGGGGGSGGG

35 dominio onecut, miembro 2 de la familia; onecut 2 [Homo sapiens] GARGGGSGGGGGGGGGGGGGGPG

dominio POU, clase 3, factor de transcripcion 2 [Homo sapiens] 40 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDG

PREDICHA: similar a la subunidad 4 del completo THO (Tho4) (ARN y proteina 1 de union a factor de exportacion) (REF1-I) (Ally de AML-1 y LEF-1) (Aly/REF) [Homo sapiens] GGTRGGTRGGTRGGDRGRGRGAG

45 PREDICHA: similar a la subunidad 4 del complejo THO (Tho4) (ARN y proteina 1 de union a factor de exportacion) (REF1-I) (Ally de AML-1 y LEF-1) (Aly/REF) [Homo sapiens] GGTRGGTRGGTRGGDRGRGRGAG

50 dominio POU, clase 3, factor de transcripcion 3 [Homo sapiens] GAGGGGGGGGGGGGGGAGGGGGG

familia A de la proteina nucleolar, miembro 1; proteina GAR1 [Homo sapiens] GGGRGGRGGGRGGGGRGGGRGGG

55 fibrilarina; antigeno de esclerodermia nucleolar de 34 kD; ARN, proteina 1 de interaccion con nucleolar pequefa U3 [Homo sapiens] GRGRGGGGGGGGGGGGGRGGGG

proteina 579 de dedo de cinc [Homo sapiens] GRGRGRGRGRGRGRGRGRGGAG

calpaina, subunidad 1 pequefa; proteinasa neutra activada con calcio; calpaina, polipeptido pequefo; calpaina 4,

5 subunidad pequefa (30 K); proteasa dependiente del calcio, subunidad pequefa [Homo sapiens] GAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG queratina 9 [Homo sapiens] GGGSGGGHSGGSGGGHSGGSGG

10 caja forkhead D1; activador 4 relacionado con forkhead; Forkhead, drosophila, 8 similar a homologo; 8 similar a forkhead (Drosophila) [Homo sapiens] GAGAGGGGGGGGAGGGGSAGSG

PREDICHA: similar a ADNc de RIKEN C230094B15 [Homo sapiens] 15 GGPGTGSGGGGAGTGGGAGGPG GGGGGGGGGAGGAGGAGSAGGG

precursor de cadherina 22, ortologo de cadherina de rata PB [Homo sapiens] GGDGGGSAGGGAGGGSGGGAG

20 factor 1 de transcripcion de union a AT; factor 1 de union a motivo AT [Homo sapiens] GGGGGGSGGGGGGGGGGGGGG

eomesodermina; caja t, cerebro, 2; homologo de eomesodermina (Xenopus laevis) [Homo sapiens] 25 GPGAGAGSGAGGSSGGGGGPG

proteina de transferencia de fosfatidilinositol, 2 asociada a membrana; receptor 3 de interaccion con el dominio del extremo N de PYK2; B alfa 2 de degeneracion retiniana (Drosophila) [Homo sapiens] GGGGGGGGGGGSSGGGGSSGG

30 isoforma 2 del antigeno 8 asociado a espermatozoides; proteina 1 de la membrana de espermatozoides [Homo sapiens] GSGSGPGPGSGPGSGPGHGSG

35 PREDICHA: proteina 27 de motivo de union a ARN [Homo sapiens] GPGPGPGPGPGPGPGPGPGPG

isoforma 1 de la proteina 1 de union a la subunidad gamma de AP1; proteina 1 de union a la subunidad gamma del complejo 1 de gamma-sinergina; proteina relacionada con adaptador [Homo sapiens] 40 GAGSGGGGAAGAGAGSAGGGG

isoforma 2 de la proteina 1 de union a la subunidad gamma de AP1; gamma-sinergina; proteina 1 de union a la subunidad gamma del complejo 1 de proteina relacionada con adaptador [Homo sapiens] GAGSGGGGAAGAGAGSAGGGG

45 repeticion de anquirina y 1 que contiene dominio del motivo alfa esteril; repeticion de anquirina y 1 que contiene dominio SAM [Homo sapiens] GGGGGGGSGGGGGGSGGGGGG

50 isoforma 1 de la proteina 2 de dominio de union a metil-CpG [Homo sapiens] GRGRGRGRGRGRGRGRGRGRG

dominio funcional triple (que interacciona con PTPRF) [Homo sapiens] GGGGGGGSGGSGGGGGSGGGG

55 caja forkhead D3 [Homo sapiens] GGEEGGASGGGPGAGSGSAGG

isoforma 1 del antigeno 8 asociado a espermatozoides; proteina 1 de la membrana de espermatozoides [Homo

sapiens] GSGSGPGPGSGPGSGPGHGSG

isoforma especifica de testiculos de la proteina 2 del dominio de union a metil-CpG [Homo sapiens] 5 GRGRGRGRGRGRGRGRGRGRG

regulador de muerte celular aven; muerte celular programada 12 [Homo sapiens] GGGGGGGGDGGGRRGRGRGRG

10 regulador de transcritos 1 de terminacion; delta helicasa; homologo de la mutacion 1 de Up-Frameshift (S. cerevisiae); factor 1 reductor de ARNm de terminacion; homologo de levadura Upflp [Homo sapiens] GGPGGPGGGGAGGPGGAGAG

isoforma a de la proteina 2 de canales de potasio activados por calcio de pequefa conductancia; canal de potasio 15 activado por Ca2+ de pequefa conductancia sensible a apamina [Homo sapiens] GTGGGGSTGGGGGGGGSGHG

caja 1 de SRY (region Y determinante del sexo); gen 1 de la caja HMG relacionado con SRY [Homo sapiens] GPAGAGGGGGGGGGGGGGGG

20 isoforma 2 del factor de transcripcion 20; proteina de union a elementos sensibles al factor de crecimiento derivado de plaquetas de estromelisina-1; proteina de union a elementos sensibles a PDGF de estromelisina 1; proteina de union a SPRE; factor SPBP nuclear [Homo sapiens] GGTGGSSGSSGSGSGGGRRG

25 isoforma 1 del factor de transcripcion 20; proteina de union a elementos sensibles al factor de crecimiento derivado de plaquetas de estromelisina-1; proteina de union a elementos sensibles a PDGF de estromelisina 1; proteina de union a SPRE; factor SPBP nuclear [Homo sapiens] GGTGGSSGSSGSGSGGGRRG

30 proteina 1 de interaccion con ras [Homo sapiens] GSGTGTTGSSGAGGPGTPGG

isoforma b de cinasa inducible por BMP-2 [Homo sapiens] 35 GGSGGGAAGGGAGGAGAGAG

isoforma a de cinasa inducible por BMP-2 [Homo sapiens] GGSGGGAAGGGAGGAGAGAG

40 caja forkhead C1; activador 3 relacionado con forkhead; Forkhead, drosophila, 7 similar a homologo; 7 similar a forkhead (Drosophila); iridogoniodisgenesis tipo 1 [Homo sapiens] GSSGGGGGGAGAAGGAGGAG

factor p54 de corte y empalme; proteina nuclear de 54 kDa rica en arginina [Homo sapiens] 45 GPGPSGGPGGGGGGGGGGGG

homologo oncogenico del fibrosarcoma musculoaponeurotico de v-maf; protooncogen de fibrosarcoma musculoaponeurotico aviar (MAF); homologo oncogenico del fibrosarcoma musculoaponeurotico de v-maf (aviar) [Homo sapiens]

50 GGGGGGGGGGGGGGAAGAGG

polipeptido de ribonucleoproteina D1 nuclear pequefa 16 kDa; proteina D1 de nucleo de snRNP; autoantigeno Sm-D; polipeptido de ribonucleoproteina D1 nuclear pequefa (16kD) [Homo sapiens] GRGRGRGRGRGRGRGRGRGG

55 proteina hipotetica H41 [Homo sapiens] GSAGGSSGAAGAAGGGAGAG

Residuos de no glicina que contienen URP (NGR):

[0115] Las secuencias de residuos de no glicina en estas GRS pueden seleccionarse para optimizar las propiedades de URP y de ahi las proteinas que contienen los URP deseados. Por ejemplo, pueden optimizarse las secuencias de URP para potenciar la selectividad de la proteina resultante para un tejido particular, tipo de celula 5 especifica o linaje celular. Por ejemplo, pueden incorporarse secuencias de proteinas que no se expresan ubicuamente, sino que se expresan diferencialmente en uno o mas de los tejidos del cuerpo que incluyen corazon, higado, prostata, pulmon, rifon, medula osea, sangre, piel, vejiga, cerebro, musculos, nervios y tejidos seleccionados que son afectados por enfermedades tales como enfermedades infecciosas, enfermedad autoinmunitaria, trastornos renales, neuronales, cardiacos y canceres. Pueden emplearse secuencias 10 representativas de un origen de desarrollo especifico, tales como aquellas expresadas en un embrion o un adulto, durante la formacion de ectodermo, endodermo o mesodermo en un organismo pluricelular. Tambien pueden utilizarse secuencias que participan en un proceso biologico especifico que incluye, pero no se limita a, regulacion del ciclo celular, diferenciacion celular, apoptosis, quimiotaxis, motilidad celular y transposicion citoesqueletica. Tambien pueden utilizarse otras secuencias de proteinas no ubicuamente expresadas para dirigir la proteina

15 resultante a localizaciones subcelulares especificas: matriz extracelular, nucleo, citoplasma, citoesqueleto, plasma y/o estructuras membranosas intracelulares que incluyen, pero no se limitan a, depresiones recubiertas, aparato de Golgi, reticulo endoplasmico, endosoma, lisosoma y mitocondria.

[0116] Se conoce una variedad de estas secuencias especificas de tejido, especificas de tipo de celula,

20 especificas de localizacion subcelular y estan disponibles de numerosas bases de datos de proteinas. Tales secuencias de URP selectivas pueden obtenerse generando bibliotecas de secuencias de URP aleatorias o semialeatorias, inyectandolas en animales o pacientes, y determinando secuencias con la selectividad por tejido deseada en muestras de tejido. La determinacion de secuencias puede realizarse por espectrometria de masas. Usando procedimientos similares pueden seleccionarse secuencias de URP que facilitan la captacion oral, bucal, intestinal,

25 nasal, tecal, peritoneal, pulmonar, rectal o dermica.

[0117] Son de particular interes secuencias de URP que contienen regiones que son relativamente ricas en los aminoacidos positivamente cargados arginina o lisina que favorecen la captacion celular o transporte por las membranas. Pueden disefarse secuencias de URP que contienen una o varias secuencias sensibles a proteasas. 30 Tales secuencias de URP pueden escindirse una vez el producto del procedimiento de la invencion ha alcanzado su localizacion diana. Esta escision puede desencadenar un aumento en la potencia del dominio farmaceuticamente activo (activacion de pro-farmacos) o puede potenciar la union del producto de escision a un receptor. Las secuencias de URP pueden disefarse para llevan un exceso de cargas negativas introduciendo residuos de acido aspartico o acido glutamico. Son de particular interes URP que contienen mas del 5%, mas del 6%, 7%, 8%, 9%, 35 10%, 15%, 30% o mas acido glutamico y menos del 2% de lisina o arginina. Tales URP llevan un exceso de carga negativa y como resultado tienen una tendencia a adoptar conformaciones abiertas debido a la repulsion electrostatica entre cargas negativas individuales del peptido. Un exceso de carga negativa tal conduce a un aumento eficaz en su radio hidrodinamico y como resultado puede conducir a eliminacion renal reducida de tales moleculas. Asi, puede modularse la carga neta eficaz y el radio hidrodinamico de una secuencia de URP

40 controlando la frecuencia y distribucion de aminoacidos negativamente cargados en las secuencias de URP. La mayoria de los tejidos y superficies en un ser humano o animal llevan exceso de cargas negativas. Disefando las secuencias de URP para llevar un exceso de cargas negativas pueden minimizarse las interacciones no especificas entre la proteina resultante que comprende el URP y diversas superficies tales como vasos sanguineos, tejidos sanos o diversos receptores.

45 [0118] Los URP pueden tener una secuencia repetitiva de aminoacidos del formato (motivo) en el que un motivo de secuencia forma una repeticion directa (es decir, ABCABCABCABC) o una repeticion invertida (ABCCBAABCCBA) y el numero de estas repeticiones puede ser 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 50 o mas URP o las repeticiones dentro de URP frecuentemente contienen solo 1, 2, 3, 4, 5 o 6

50 tipos diferentes de aminoacidos. Los URP normalmente consisten en repeticiones de secuencias de aminoacidos humanas que tienen 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 o mas aminoacidos de longitud, pero los URP tambien pueden consistir en secuencias de aminoacidos no humanas que tienen 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 40, 42, 44, 46, 48, 50 aminoacidos de longitud.

55 URP derivados de secuencias humanas:

[0119] Los URP pueden derivarse de secuencias humanas. El genoma humano contiene muchas subsecuencias que son ricas en un aminoacido particular. Son de particular interes aquellas secuencias de aminoacidos que son ricas en un aminoacido hidrofilo como serina, treonina, glutamato, aspartato o glicina. Son de

particular interes aquellas subsecuencias que contienen pocos aminoacidos hidrofobos. Se predice que tales subsecuencias son no estructuradas y altamente solubles en disolucion acuosa. Tales subsecuencias humanas pueden modificarse para mejorar adicionalmente su utilidad. La Figura 17 muestra una secuencia humana a modo de ejemplo que es rica en serina y que puede aislarse como URP objeto. La dentina sialofosfoproteina ejemplificada 5 contiene una subsecuencia de 670 aminoacidos en la que el 64% de los residuos son serina y la mayoria de las otras posiciones son aminoacidos hidrofilos tales como aspartato, asparaginas y glutamato. La secuencia es extremadamente repetitiva y como resultado tiene un bajo contenido de informacion. Pueden usarse directamente subsecuencias de una proteina humana tal. Si se desea, la secuencia puede modificarse de una forma que preserve su caracter global, pero que la haga mas adecuada para aplicaciones farmaceuticas. Ejemplos de secuencias que

10 estan relacionadas con dentina sialofosfoproteina son (SSD)n, (SSDSSN)n, (SSE)n en las que n es entre aproximadamente 4 y 200.

[0120] El uso de secuencias de proteinas humanas es particularmente deseable en el disefo de URP con inmunogenicidad reducida en un sujeto humano. Una etapa clave para provocar una respuesta inmunitaria a una 15 proteina extrafa es la presentacion de fragmentos de peptido de dicha proteina por receptores de MHC de clase II. Estos fragmentos unidos a MHCII pueden luego detectarse por receptores de linfocitos T, que desencadenan la proliferacion de linfocitos T colaboradores e inicia una respuesta inmunitaria. La eliminacion de epitopes de linfocitos T de proteinas farmaceuticas se ha reconocido como un medio para reducir el riesgo de provocacion de una reaccion inmunitaria (Stickler, M. y col. (2003) J Immunol Methods, 281: 95-108). Los receptores de MHCII 20 normalmente interaccionan con un epitope que tiene, por ejemplo, una region de 9 aminoacidos de longitud de los peptidos visualizados. Asi, puede reducirse el riesgo de provocar una respuesta inmunitaria a una proteina en pacientes si todas las subsecuencias o la mayoria de las posibles subsecuencias 9-meras de la proteina pueden encontrarse en proteinas humanas y, si es asi, estas secuencias y repeticiones de estas secuencias no seran reconocidas por el paciente como secuencias extrafas. Pueden incorporarse secuencias humanas en el disefo de 25 secuencias de URP oligomerizando o concatenando secuencias humanas que tienen composiciones de aminoacidos adecuadas. Estas pueden ser repeticiones directas o repeticiones invertidas o mezclas de diferentes repeticiones. Por ejemplo, las secuencias pueden oligomerizarse como se muestra en la Tabla 2. Tales oligomeros tienen un reducido riesgo de ser inmunogenicas. Sin embargo, las secuencias de empalme entre las unidades de monomeros todavia pueden contener epitopes de linfocitos T que pueden desencadenar una reaccion inmunitaria, 30 que se ilustra en la Figura 3. Adicionalmente puede reducirse el riesgo de provocar una respuesta inmunitaria disefando secuencias de URP basadas en multiples secuencias humanas de solapamiento. Este enfoque se ilustra en la Figura 4. La secuencia de URP en la Figura 2 se disefo como un oligomero basado en multiples secuencias humanas de forma que cada subsecuencia 9-mera del oligomero pueda encontrarse en una proteina humana. En estos disefos, cada subsecuencia 9-mera es una secuencia humana. Un ejemplo de una secuencia de URP basada 35 en tres secuencias humanas se muestra en la Figura 5. Tambien es posible disefar secuencias de URP basadas en una unica secuencia humana de forma que todas las posibles subsecuencias 9-meras en las secuencias de URP oligomericas se produzcan en la misma proteina humana. Un ejemplo se muestra en la Figura 6 basandose en el dominio POU que es rico en glicina y prolina. El monomero de repeticion en la secuencia de URP es solo un fragmento de la proteina humana y sus secuencias flanqueantes son identicas a la unidad de repeticion como se

40 ilustra en la Figura 6. Tambien pueden disefarse secuencias de URP no oligomericas basandose en proteinas humanas. Las condiciones primarias son que todas las subsecuencias 9-meras puedan encontrarse en secuencias humanas. La composicion de aminoacidos de las secuencias contienen preferentemente pocos residuos hidrofobos. Son de particular interes secuencias de URP que se disefan basandose en secuencias humanas y que contienen una gran fraccion de residuos de glicina.

45 [0121] Utilizando este esquema o similar puede disefarse una clase de URP que comprenda secuencias de repeticion con baja inmunogenicidad para el huesped de interes. El huesped de interes puede ser cualquier animal, que incluye vertebrados e invertebrados. Huespedes preferidos son mamiferos tales como primates (por ejemplo chimpances y seres humanos), cetaceos (por ejemplo, ballenas y delfines), quiropteros (por ejemplo, murcielagos),

50 perisodactilos (por ejemplo, caballos y rinocerontes), roedores (por ejemplo, ratas), y ciertos tipos de insectivoros tales como musarafas, topos y erizos. Si se selecciona el ser humano como huesped, los URP normalmente contienen multiples copias de las secuencias o unidades de repeticion, en los que la mayoria de los segmentos que comprenden aproximadamente 6 a aproximadamente 15 aminoacidos contiguos estan presentes en una o mas proteinas humanas nativas. Tambien pueden disefarse URP en los que la mayoria de los segmentos que

55 comprenden entre aproximadamente 9 y aproximadamente 15 aminoacidos contiguos se encuentran en una o mas proteinas humanas nativas. Como se usa en el presente documento, la mayoria de los segmentos se refieren a mas de aproximadamente el 50%, preferentemente el 60%, preferentemente el 70%, preferentemente el 80%, preferentemente el 90%, preferentemente el 100%. Si se desea, cada uno de los posibles segmentos entre aproximadamente 6 y 15 aminoacidos, preferentemente entre aproximadamente 9 y 15 aminoacidos dentro de las unidades de repeticion, estan presentes en una o mas proteinas humanas nativas. Los URP pueden comprender multiples unidades o secuencias de repeticion, por ejemplo, teniendo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas unidades de repeticion.

5 Disefo de URP que estan sustancialmente libres de epitopes de linfocitos T humanos:

[0122] Las secuencias de URP pueden disefarse para estar sustancialmente libres de epitopes reconocidos por linfocitos T humanos. Por ejemplo, puede sintetizarse una serie de secuencias semi-aleatorias con composiciones de aminoacidos que favorecen conformaciones no estructuradas desnaturalizadas y evaluar estas 10 secuencias para la presencia de epitopes de linfocitos T humanos y si son secuencias humanas o no. Se han descrito ensayos para epitopes de linfocitos T humanos (Stickler, M. y col. (2003) J Immunol Methods, 281: 95-108). Son de particular interes secuencias de peptidos que pueden oligomerizarse sin generar epitopes de linfocitos T o secuencias no humanas. Esto puede lograrse probando repeticiones directas de estas secuencias para la presencia de epitopes de linfocitos T y para la aparicion de subsecuencias 6 a 15-meras y en particular 9-meras que no son 15 humanas. Una alternativa es evaluar multiples secuencias de peptidos que puedan ensamblarse en unidades de repeticion como se describe en la seccion previa para el ensamblaje de secuencias humanas. Otra alternativa es disefar secuencias de URP que produzcan bajas puntuaciones usando algoritmos de prediccion de epitopes como TEPITOPE (Sturniolo, T. y col. (1999) Nat Biotechnol, 17: 555-61). Otro enfoque para evitar epitopes de linfocitos T es evitar aminoacidos que puedan servir de residuos de anclaje durante la visualizacion de peptidos sobre MHC, tal

20 como M, I, L, V, F. Aminoacidos hidrofobos y aminoacidos positivamente cargados pueden servir frecuentemente de tales residuos de anclaje y el minimizar su frecuencia en una secuencia de URP reduce la probabilidad de generacion de epitopes de linfocitos T y asi provocar una reaccion inmunitaria. Los URP seleccionados contienen generalmente subsecuencias que se encuentran en al menos una proteina humana, y tienen un menor contenido de aminoacidos hidrofobos.

25 [0123] Las secuencias de URP pueden disefarse para optimizar la produccion de proteinas. Esto puede lograrse evitando o minimizando la repetitividad del ADN codificante. Secuencias de URP tales como poli-glicina pueden tener propiedades farmaceuticas muy deseables, pero su fabricacion puede ser dificil debido al alto contenido de GC de secuencias de ADN que codifican GRS y debido a la presencia de secuencias de ADN de

30 repeticion que pueden conducir a recombinacion.

[0124] Como se observa anteriormente, las secuencias de URP pueden disefarse para ser altamente repetitivas al nivel de aminoacidos. Como resultado, las secuencias de URP tienen contenido de informacion muy bajo y pueden reducir el riesgo de provocar una reaccion inmunitaria.

35 [0125] Ejemplos no limitantes de URP que contienen aminoacidos de repeticion son: poli-glicina, poli-acido glutamico, poli-acido aspartico, poli-serina, poli-treonina, (GX)n en la que G es glicina y X es serina, acido aspartico, acido glutamico, treonina o prolina y n es al menos 20, (GGX)n en la que X es serina, acido aspartico, acido glutamico, treonina o prolina y n es al menos 13, (GGGX)n en la que X es serina, acido aspartico, acido glutamico,

40 treonina o prolina y n es al menos 10, (GGGGX)n en la que X es serina, acido aspartico, acido glutamico, treonina o prolina y n es al menos 8, (GxC)n en la que X es serina, acido aspartico, acido glutamico, treonina o prolina, n es al menos 15, y z es entre 1 y 20.

[0126] El numero de estas repeticiones puede ser cualquier numero entre 10 y 100. Los productos de los

45 procedimientos de la invencion pueden contener secuencias de URP que son secuencias semi-aleatorias. Ejemplos son secuencias semi-aleatorias que contienen al menos el 30, 40, 50, 60 o el 70% de glicina en las que las glicinas estan bien dispersas y en las que la concentracion total de triptofano, fenilalanina, tirosina, valina, leucina e isoleucina es entonces menos del 70, 60, 50, 40, 30, 20 o el 10% cuando se combinan. Una secuencia de URP semi-aleatoria preferida contiene al menos el 40% de glicina y la concentracion total de triptofano, fenilalanina,

50 tirosina, valina, leucina e isoleucina es entonces menos del 10%. Una secuencia de URP aleatoria mas preferida contiene al menos el 50% de glicina y la concentracion total de triptofano, fenilalanina, tirosina, valina, leucina e isoleucina es entonces menos del 5%. Pueden disefarse secuencias de URP combinando las secuencias de dos o mas secuencias de URP mas cortas o fragmentos de secuencias de URP. Una combinacion tal permite modular mejor las propiedades farmaceuticas del producto que contiene las secuencias de URP y permite que se reduzca la

55 repetividad de las secuencias de ADN que codifican las secuencias de URP, que pueden mejorar la expresion y reducir la recombinacion de secuencias codificantes de URP.

[0127] Pueden disefarse secuencias de URP y seleccionarse para que posean varias de las siguientes propiedades deseadas: a) alta estabilidad genetica de las secuencias codificantes en el huesped de produccion, b)

alto nivel de expresion, c) baja inmunogenicidad (predicha/calculada), d) alta estabilidad en presencia de proteasas del suero y/u otras proteasas de tejido, e) gran radio hidrodinamico bajo condiciones fisiologicas. Un enfoque a modo de ejemplo para obtener secuencias de URP que cumplen multiples criterios es construir una biblioteca de secuencias candidatas e identificar a partir de la biblioteca las subsecuencias adecuadas. Las bibliotecas pueden 5 comprender secuencias aleatorias y/o semi-aleatorias. Son de particular utilidad bibliotecas de codones, que es una biblioteca de moleculas de ADN que contiene multiples codones para el residuo de aminoacido identico. Puede aplicarse aleatorizacion de codones a posiciones de aminoacidos seleccionadas de un cierto tipo o a la mayoria o a todas las posiciones. Bibliotecas de codones verdaderas solo codifican una secuencia de un solo aminoacido, pero pueden combinarse facilmente con bibliotecas de aminoacidos, que es una poblacion de moleculas de ADN que 10 codifica una mezcla de aminoacidos (relacionados o sin relacionar) en la posicion de residuo. Las bibliotecas de codones permiten la identificacion de genes que tienen repetividad relativamente baja al nivel de ADN, pero que codifican secuencias de aminoacidos altamente repetitivas. Esto es util debido a que secuencias de ADN repetitivas tienden a recombinarse, conduciendo a inestabilidad. Tambien pueden construirse bibliotecas de codones que codifican diversidad de aminoacidos limitada. Tales bibliotecas permiten la introduccion de un numero limitado de 15 aminoacidos en algunas posiciones de la secuencia, mientras que otras posiciones permiten variacion de codones, pero todos los codones codifican el mismo aminoacido. Pueden sintetizarse oligonucleotidos parcialmente aleatorios incorporando mezclas de nucleotidos en la misma posicion durante la sintesis de oligonucleotidos. Tales oligonucleotidos parcialmente aleatorios pueden fusionarse por PCR de solapamiento o enfoques basados en ligacion. En particular, pueden multimerizarse oligonucleotidos semi-aleatorios que codifican secuencias ricas en 20 glicina. Estos oligonucleotidos pueden diferenciarse en longitud y secuencias y uso de codones. Como resultado, se obtiene una biblioteca de secuencias de URP candidatas. Otro procedimiento para generar bibliotecas es sintetizar una secuencia de partida y posteriormente someter dichas secuencias a aleatorizacion parcial. Esto puede hacerse por cultivo del gen que codifica las secuencias de URP en una cepa de mutador o por amplificacion del gen codificante bajo condiciones mutagenicas (Leung, D. y col. (1989) Technique, 1: 11-15). Secuencias de URP con 25 propiedades deseables pueden identificarse a partir de bibliotecas usando una variedad de procedimientos. Las secuencias que tienen un alto grado de estabilidad genetica pueden enriquecerse cultivando la biblioteca en un huesped de produccion. Secuencias que son inestables acumularan mutaciones, que pueden identificarse por secuenciacion de ADN. Variantes de secuencias de URP que pueden expresarse a alto nivel pueden identificarse por cribado o seleccion usando multiples protocolos conocidos para cualquier experto en la materia. Por ejemplo, 30 pueden cultivarse multiples cepas aisladas de una biblioteca y comparar niveles de expresion. Los niveles de expresion pueden medirse por analisis de gel, cromatografia analitica o diversos procedimientos basados en ELISA. La determinacion de los niveles de expresion de variantes de secuencia individuales puede facilitarse fusionando la biblioteca de secuencias de URP candidatas con marcas de secuencia como marca myc, marca His, marca HA. Otro enfoque es fusionar la biblioteca con una enzima u otra proteina indicadora como proteina verde fluorescente. Es de 35 particular interes la fusion de la biblioteca con un marcador de seleccion como beta-lactamasa o kanamicina-acil transferasa. Puede usarse seleccion con antibiotico para enriquecer en variantes con alto nivel de expresion y buena estabilidad genetica. Pueden identificarse variantes con buena resistencia a proteasas cribando secuencias intactas despues de la incubacion con proteasas. Una forma eficaz para identificar secuencias de URP resistentes a proteasas es la visualizacion de fago bacteriano o procedimientos de visualizacion relacionados. Se han descrito 40 multiples sistemas en los que las secuencias que experimentan rapida proteolisis pueden enriquecerse por visualizacion de fago. Estos procedimientos pueden adoptarse facilmente para enriquecer en secuencias resistentes a proteasas. Por ejemplo, puede clonarse una biblioteca de secuencias de URP candidatas entre una marca de afinidad y la proteina pIII del fago M13. La biblioteca puede entonces exponerse a proteasas o muestras biologicas que contienen proteasas como sangre o preparaciones lisosomicas. Las secuencias resistentes a proteasas que 45 contienen fago pueden capturarse despues del tratamiento con proteasas por union a la marca de afinidad. Secuencias que resisten a la degradacion por preparaciones lisosomicas son de particular interes debido a que la degradacion lisosomica es una etapa clave durante la presentacion de antigeno en celulas dendriticas y otras celulas presentadoras de antigeno. La visualizacion de fago puede utilizarse para identificar secuencias de URP candidatas que no se unen a un suero inmune particular con el fin de identificar secuencias de URP con baja 50 inmunogenicidad. Pueden inmunizarse animales con una secuencia de URP candidata o con una biblioteca de secuencias de URP para producir anticuerpos contra las secuencias de URP en la biblioteca. El suero resultante puede entonces usarse para la inmunopurificacion de fagos para eliminar o identificar secuencias que son reconocidas por anticuerpos en el suero inmune resultante. Otros procedimientos como visualizacion bacteriana, visualizacion de levadura, visualizacion ribosomica pueden utilizarse para identificar variantes de secuencias de URP 55 con propiedades deseables. Otro enfoque es la identificacion de secuencias de URP de interes por espectrometria de masas. Por ejemplo, puede incubarse una biblioteca de secuencias de URP candidatas con una proteasa o muestra biologica de interes e identificar secuencias que resistan a la degradacion por espectrometria de masas. En un enfoque similar, pueden identificarse secuencias de URP que facilitan la captacion oral. Puede alimentarse una mezcla de secuencias de URP candidatas a animales o seres humanos e identificar variantes con la mayor eficiencia

de transferencia o captacion a traves de algun tejido barrera (es decir, dermico, etc.) por espectrometria de masas. De un modo similar, pueden identificarse secuencias de URP que favorecen otros mecanismos de captacion como administracion pulmonar, intranasal, rectal, transdermica. Tambien pueden identificarse secuencias de URP que favorezcan la captacion celular o secuencias de URP que resistan a la captacion celular.

5 [0128] Las secuencias de URP pueden disefarse combinando secuencias de URP o fragmentos de secuencias de URP que se disefaron por cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente. Ademas, pueden aplicarse enfoques semi-aleatorios para optimizar secuencias que se disefaron basandose en las reglas descritas anteriormente. Es de particular interes la optimizacion de codones con el objetivo de mejorar la expresion

10 de las proteinas potenciadas y mejorar la estabilidad genetica del gen codificante en los huespedes de produccion. La optimizacion de codones es de particular importancia para secuencias de URP que son ricas en glicina o que tienen secuencias de aminoacidos muy repetitivas. La optimizacion de codones puede realizarse usando programas informaticos (Gustafsson, C. y col. (2004) Trends Biotechnol, 22: 346-53), algunos de los cuales minimizan la detencion ribosomica (Coda Genomics Inc.). Cuando se disefan secuencias de URP pueden considerarse varias

15 propiedades. Puede minimizarse la repetitividad en las secuencias de ADN codificantes. Ademas, puede evitarse o minimizarse el uso de codones que son raramente usados por el huesped de produccion (es decir, los codones de arginina AGG y AGA y un codon de leucina en E. coli ). Las secuencias de ADN que tienen un alto nivel de glicina tienden a tener un alto contenido de GC que puede conducir a inestabilidad o bajos niveles de expresion. Asi, cuando sea posible, se prefiere elegir codones de forma que el contenido de GC de la secuencia codificante de URP

20 sea adecuado para el organismo de produccion que se usara para fabricar el URP.

[0129] Pueden prepararse genes que codifican URP en una o mas etapas, tanto completamente sinteticamente como por sintesis combinada con procedimientos enzimaticos tales como clonacion mediada por enzimas de restriccion, PCR y extension por solapamiento. Los modulos de URP pueden construirse de forma que el 25 gen que codifica el modulo de URP tenga baja repetitividad, mientras que la secuencia de aminoacidos codificada tenga un alto grado de repetitividad. El enfoque se ilustra en la Figura 11. Como primera etapa se construye una biblioteca de secuencias de URP relativamente cortas. Esta puede ser una biblioteca de codones pura de forma que cada miembro de la biblioteca tenga la misma secuencia de aminoacidos, pero son posibles muchas secuencias codificantes diferentes. Para facilitar la identificacion de miembros de bibliotecas de buena expresion, la biblioteca 30 puede construirse como fusion con una proteina indicadora. Ejemplos de genes indicadores adecuados son proteina verde fluorescente, luciferasa, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa. Mediante cribado pueden identificarse secuencias de URP cortas que pueden expresarse en alta concentracion en el organismo huesped de eleccion. Posteriormente, puede generarse una biblioteca de dimeros de URP aleatorios y repetir el cribado para alto nivel de expresion. La dimerizacion puede realizarse por ligacion, extension por solapamiento o tecnicas de clonacion 35 similares. Este procedimiento de dimerizacion y posterior cribado puede repetirse multiples veces hasta que la secuencia de URP resultante haya alcanzado la longitud deseada. Opcionalmente, pueden secuenciarse clones en la biblioteca para eliminar cepas aisladas que contienen secuencias no deseables. La biblioteca inicial de secuencias de URP cortas puede permitir alguna variacion en la secuencia de aminoacidos. Por ejemplo, pueden aleatorizarse algunos codones de forma que puedan producirse varios aminoacidos hidrofilos en dicha posicion. Durante el

40 procedimiento de multimerizacion iterativa pueden cribarse miembros de la biblioteca para otras caracteristicas como solubilidad o resistencia a proteasas, ademas de un cribado para expresion de alto nivel. En lugar de dimerizar secuencias de URP, tambien pueden generarse multimeros mas largos. Esto permite aumentar mas rapidamente la longitud de modulos de URP.

45 [0130] Muchas secuencias de URP contienen aminoacidos particulares a alta fraccion. Tales secuencias pueden ser dificiles de producir por tecnicas recombinantes, ya que sus genes codificantes pueden contener secuencias repetitivas que estan sometidas a recombinacion. Ademas, genes que contienen codones particulares a frecuencias muy altas pueden limitar la expresion, ya que los ARNt cargados respectivos en el huesped de produccion se vuelven limitantes. Un ejemplo es la produccion recombinante de GRS. Los residuos de glicina estan

50 codificados por 4 tripletes, GGG, GGC, GGA y GGT. Como resultado, los genes que codifican GRS tienden a tener alto contenido de GC y tienden a ser particularmente repetitivos. Un reto adicional puede resultar del sesgo de codones del huesped de produccion. En el caso de E. coli , dos codones de glicina, GGA y GGG, se usan raramente en proteinas altamente expresadas. Asi, la optimizacion de codones del gen que codifica secuencias de URP puede ser muy deseable. Puede optimizarse el uso de codones empleando programas informaticos que consideran sesgo

55 de codones del huesped de produccion (Gustafsson, C. y col. (2004) Trends Biotechnol, 22: 346-53). Como alternativa, pueden construirse bibliotecas de codones en las que todos los miembros de la biblioteca codifican la misma secuencia de aminoacidos, pero en la que se varia el uso de codones. Tales bibliotecas pueden cribarse para miembros altamente expresantes y geneticamente estables que son particularmente adecuados para la produccion a gran escala de productos que contienen URP.

Proteinas recombinantes no estructuradas multivalentes (MURP):

[0131] Como se observa anteriormente, los URP objeto son particularmente utiles como modulos para disefar

5 proteinas de valor terapeutico. Por consiguiente, en el presente documento se desvelan proteinas que comprenden uno o mas URP objeto. Tales proteinas se denominan en el presente documento proteinas recombinantes no estructuradas multivalentes (MURP).

[0132] Para construir MURP, una o mas secuencias de URP pueden fusionarse con el extremo N o extremo C

10 de una proteina o insertarse en el centro de la proteina, por ejemplo, en bucles de una proteina o entre modulos de la proteina de interes, dando las propiedades mejoradas de proteinas modificadas resultantes con respecto a las proteinas sin modificar. La longitud combinada de secuencias de URP que estan unidas a una proteina puede tener 200 o mas aminoacidos.

15 [0133] Las MURP presentan una o mas propiedades mejoradas como se detalla a continuacion.

Semivida mejorada:

[0134] Afadiendo secuencias de URP a una proteina farmaceuticamente activa pueden mejorarse muchas

20 propiedades de esa proteina. En particular, afadiendo una secuencia de URP larga puede aumentarse significativamente la semivida en suero de la proteina. Tales URP contienen secuencias de aminoacidos de al menos aproximadamente 200 o mas aminoacidos.

[0135] Los URP pueden fragmentarse de forma que la proteina resultante contenga multiples URP, o multiples

25 fragmentos de URP. En un aspecto, los URP fusionados pueden aumentar el radio hidrodinamico de una proteina y asi reducir su eliminacion de la sangre por el rifon. El aumento en el radio hidrodinamico de la proteina de fusion resultante con respecto a la proteina sin modificar puede detectarse por ultracentrifugacion, cromatografia de exclusion por tamafo o dispersion de la luz.

30 Selectividad por tejido mejorada:

[0136] El aumento del radio hidrodinamico tambien puede conducir a penetracion reducida en tejidos, que puede explotarse para minimizar efectos secundarios de una proteina farmaceuticamente activa. Esta muy documentado que los polimeros hidrofilos tienen una tendencia a acumularse en tejido tumoral que se produce por

35 el potenciado efecto de la permeabilidad y retencion (EPR). La causa subyacente del efecto EPR es la naturaleza porosa de la vasculatura tumoral (McDonald, D. M. y col. (2002) Cancer Res, 62: 5381-5) y la falta de drenaje linfatico en tejidos tumorales. Por tanto, la selectividad de proteinas farmaceuticamente activas por tejidos tumorales puede potenciarse afadiendo polimeros hidrofilos. Como tal, el indice terapeutico de una proteina farmaceuticamente activa dada puede aumentarse incorporando los URP objeto.

Proteccion de la degradacion e inmunogenicidad reducida:

[0137] La adicion de secuencias de URP puede mejorar significativamente la resistencia a proteasas de una proteina. Las propias secuencias de URP pueden disefarse para ser resistentes a proteasas y uniendolas a una 45 proteina puede protegerse esa proteina del acceso de enzimas degradantes. Las secuencias de URP pueden afadirse a proteinas farmaceuticamente activas con el objetivo de reducir interacciones no deseables de la proteina con otros receptores o superficies. Para lograr esto puede ser beneficioso afadir las secuencias de URP a la proteina farmaceuticamente activa en proximidad al sitio de la proteina que hace tales contactos no deseados. En particular, pueden afadirse secuencias de URP a proteinas farmaceuticamente activas con el objetivo de reducir sus 50 interacciones con cualquier componente del sistema inmunitario para prevenir una respuesta inmunitaria contra el producto del procedimiento de la invencion. La adicion de una secuencia de URP a una proteina farmaceuticamente activa puede reducir la interaccion con anticuerpos preexistentes o receptores de linfocitos B. Ademas, la adicion de secuencias de URP puede reducir la captacion y procesamiento del producto del procedimiento de la invencion por celulas presentadoras de antigeno. La adicion de una o mas secuencias de URP a una proteina es una forma

55 preferida de reducir su inmunogenicidad, ya que suprimira una respuesta inmunitaria en muchas especies, permitiendo que se prediga la inmunogenicidad esperada de un producto en pacientes basandose en datos animales. Tal prueba independiente de inmunogenicidad de la especie no es posible para enfoques que se basan en la identificacion y eliminacion de epitopes de linfocitos T humanos o comparacion de secuencias con secuencias humanas.

Interrupcion de epitopes de linfocitos T:

[0138] Las secuencias de URP pueden introducirse en proteinas con el fin de interrumpir epitopes de linfocitos

5 T. Esto es particularmente util para proteinas que combinan multiples modulos funcionales separados. La formacion de epitopes de linfocitos T requiere que los fragmentos de peptido de un antigeno de proteina se unan a MHC. Las moleculas de MHC interaccionan con un segmento de aminoacidos corto, normalmente 9 residuos contiguos de los peptidos presentados. La fusion directa de diferentes modulos de union en una molecula de proteina puede conducir a epitopes de linfocitos T que atraviesan dos dominios vecinos. Separando los modulos funcionales por modulos de

10 URP se previene la generacion de tales epitopes de linfocitos T que atraviesan modulos como se ilustra en la Figura

7. La insercion de secuencias de URP entre modulos funcionales tambien puede interferir con el procesamiento proteolitico en celulas presentadoras de antigeno, que conducira a una reduccion adicional de la inmunogenicidad. Otro enfoque para reducir el riesgo de inmunogenicidad es alterar epitopes de linfocitos T dentro de modulos funcionales de un producto. En el caso de microproteinas, un enfoque es que algunos de los bucles de intercisteina 15 (aquellos que no participan en la union a diana) sean ricos en glicina. En microproteinas, cuya estructura es debida a un numero pequefo de cisteinas, podria de hecho sustituirse la mayoria o todos los residuos que no participan en la union a diana con glicina, serina, glutamato, treonina, reduciendose asi las posibilidades de inmunogenicidad, a la vez que no se afecta la afinidad por la diana. Por ejemplo, esto puede llevarse a cabo realizando un 'barrido de glicinas' de todos los residuos, en el que cada residuo se sustituye con una glicina, luego seleccionando los clones 20 que retienen la union a diana usando visualizacion o cribado de fago, y luego combinando todas las sustituciones de glicina que son permitidas. En general, los modulos funcionales tienen una probabilidad mucho mayor de contener epitopes de linfocitos T que los modulos de URP. Puede reducirse la frecuencia de epitopes de linfocitos T en modulos funcionales reemplazando todos o muchos residuos de aminoacidos no criticos con residuos hidrofilos pequefos como gly, ser, ala, glu, asp, asn, gln, thr. Las posiciones en un modulo funcional que permiten la

25 sustitucion pueden identificarse usando una variedad de enfoques aleatorios o de ingenieria de proteinas basada en estructura.

Solubilidad mejorada:

30 [0139] Los modulos funcionales de una proteina pueden tener solubilidad limitada. En particular, modulos de union tienden a llevar residuos hidrofobos sobre su superficie, que pueden limitar su solubilidad y pueden conducir a agregacion. Separando o flanqueando tales modulos funcionales con modulos de URP puede mejorarse la solubilidad global del producto resultante. Esto es cierto en particular para modulos de URP que llevan un porcentaje significativo de residuos hidrofilos o cargados. Separando modulos funcionales con modulos de URP solubles

35 pueden reducirse interacciones intramoleculares entre estos modulos funcionales.

Perfil de pH mejorado y homogeneidad de la carga del producto:

[0140] Pueden disefarse secuencias de URP para llevar un exceso de cargas negativas o positivas. Como

40 resultado, confieren un campo electrostatico a cualquier componente de fusion que pueda utilizarse para desplazar el perfil de pH de una enzima o una interaccion de union. Ademas, el campo electrostatico de una secuencia de URP cargada puede aumentar la homogeneidad de valores de pKa de cargas superficiales de un producto de proteina, que conduce a perfiles de pH bruscos de interacciones de ligandos y a separaciones refinadas por isoelectroenfoque

o cromatoenfoque. 45

Propiedades de purificacion mejoradas debido a pKa de producto mas refinado:

[0141] Cada aminoacido en disolucion tiene por si mismo un unico pKa fijo, que es el pH al que sus grupos funcionales estan protonados a la mitad. En una proteina tipica se tienen muchos tipos de residuos y debido a la

50 proximidad y los efectos de respiracion de la proteina, tambien se cambian entre si el pKa eficaz de formas variables. Debido a esto, a un amplio intervalo de condiciones de pH, proteinas tipicas pueden adoptar cientos de especies diferentemente ionizadas, cada una con un peso molecular diferente y carga neta, debido a grandes numeros de combinaciones de residuos de aminoacidos cargados y neutros. Esto se denomina un espectro de ionizacion ancho y dificulta mas el analisis (es decir, espectrometria de masas) y purificacion de tales proteinas.

55 [0142] El PEG no tiene carga y no afecta el espectro de ionizacion de la proteina con la que esta unido, dejandola con un amplio espectro de ionizacion. Sin embargo, un URP con un alto contenido de Gly y Glu solo existe en principio en dos estados: neutro (-COOH) si el pH esta por debajo del pKa del glutamato y negativamente cargado (-COO') si el pH esta por encima del pKa del glutamato. Los modulos de URP pueden formar un unico tipo de molecula homogeneamente ionizada y pueden dar una unica masa en espectrometria de masas.

[0143] Si se desea, las MURP pueden expresarse como una fusion con un URP que tiene un unico tipo de carga (Glu) distribuida a separacion constante por el modulo de URP. Puede elegirse incorporar 25-50 residuos de 5 Glu por 20 kD de URP y todos estos 25-50 residuos tendrian pKa muy similar.

[0144] Ademas, la adicion de 25-50 cargas negativas a una proteina pequefa como IFN, hGH o GCSF (con solo 20 residuos cargados) aumentaria la homogeneidad de la carga del producto y aumentaria su punto isoelectrico, que seria muy proximo al pKa del glutamato libre.

10 [0145] El aumento en la homogeneidad de la carga de la poblacion de proteinas tiene propiedades de procesamiento favorables tales como en intercambio ionico, isoelectroenfoque, espectrometria de masas, etc., en comparacion con la PEGilacion tradicional.

15 Formulacion mejorada y/o administracion:

[0146] La adicion de secuencias de URP a proteinas farmaceuticamente activas puede simplificar significativamente la formulacion y o la administracion de los productos resultantes. Las secuencias de URP pueden disefarse para ser muy hidrofilas y como resultado mejoran la solubilidad de (por ejemplo) proteinas humanas, que 20 frecuentemente contienen parches hidrofobos que se usan para unirse a otras proteinas humanas. La formulacion de tales proteinas humanas, como anticuerpos, puede ser bastante exigente y frecuentemente limita sus opciones de concentracion y administracion. Los URP pueden reducir la precipitacion y agregacion de productos y permite que se usen formulaciones mas simples que contienen menos componentes, que son normalmente necesarios para estabilizar un producto en disolucion. La solubilidad mejorada de productos que contienen secuencias de URP 25 permite formular estos productos a mayor concentracion y como resultado puede reducirse el volumen de inyeccion para productos inyectables, que pueden permitir la inyeccion en casa, que esta limitado a un volumen inyectado muy bajo. La adicion de una secuencia de URP tambien puede simplificar el almacenamiento de los productos formulados resultantes. Las secuencias de URP pueden afadirse a proteinas farmaceuticamente activas para facilitar su captacion oral, pulmonar, rectal o intranasal. Las secuencias de URP pueden facilitar diversos modos de

30 administracion debido a que permiten mayores concentraciones de producto y estabilidad de producto mejorada. Pueden lograrse mejoras adicionales disefando secuencias de URP que facilitan la penetracion en la membrana.

Produccion mejorada:

35 [0147] La adicion de secuencias de URP puede tener beneficios significativos para la produccion del producto resultante. Muchos productos recombinantes, especialmente proteinas humanas nativas, tienen una tendencia a formar agregados durante la produccion que pueden ser dificiles o imposibles de disolver e incluso cuando se eliminan del producto final pueden volver a producirse. Estos son normalmente debidos a parches hidrofobos por los cuales estas proteinas (humanas nativas) se pusieron en contacto con otras proteinas (humanas nativas) y la

40 mutacion de estos residuos se considera arriesgado debido a la inmunogenicidad. Sin embargo, los URP pueden aumentar la hidrofilia de tales proteinas y permitir su formulacion sin mutar la secuencia de la proteina humana. Las secuencias de URP pueden facilitar el plegamiento de una proteina para alcanzar su estado nativo. Muchas proteinas farmaceuticamente activas se producen mediante procedimientos recombinantes en un estado agregado no nativo. Estos productos necesitan desnaturalizarse y posteriormente se incuban en condiciones que permitan que

45 las proteinas se plieguen en su estado activo nativo. Una reaccion secundaria frecuente durante la renaturalizacion es la formacion de agregados. La fusion de secuencias de URP con una proteina reduce significativamente su tendencia a formar agregados y asi facilita el plegamiento del componente farmaceuticamente activo del producto. Productos que contienen URP son mucho mas faciles de preparar con respecto a proteinas modificadas con polimeros. La modificacion con polimeros quimicos requiere etapas de modificacion y de purificacion adicionales

50 despues de purificarse la proteina activa. A diferencia, pueden fabricarse secuencias de URP usando procedimientos de ADN recombinante junto con la proteina farmaceuticamente activa. Los productos de los procedimientos de la invencion tambien son significativamente mas faciles de caracterizar en comparacion con productos modificados con polimeros. Debido al procedimiento de produccion recombinante, pueden obtenerse productos mas homogeneos con caracteristicas moleculares definidas. Las secuencias de URP tambien pueden

55 facilitar la purificacion de un producto. Por ejemplo, secuencias de URP pueden incluir subsecuencias que pueden ser capturadas por cromatografia de afinidad. Un ejemplo son secuencias ricas en histidina, que pueden ser capturadas sobre resinas con metales inmovilizados como niquel. Las secuencias de URP tambien pueden disefarse para tener un exceso de aminoacidos negativamente o positivamente cargados. Como resultado, pueden impactar significativamente en la carga neta de un producto, que puede facilitar la purificacion de productos por cromatografia de intercambio ionica o electroforesis preparativa.

[0148] Las MURP objeto pueden contener una variedad de modulos que incluyen, pero no se limitan a, modulos de union, modulos efectores, modulos de multimerizacion, modulos del extremo C y modulos del extremo

5 N. La Figura 1 representa una MURP a modo de ejemplo que tiene multiples modulos. Sin embargo, las MURP tambien pueden tener arquitecturas relativamente simples que se ilustran en la Fig. 2. Las MURP tambien pueden contener sitios de fragmentacion. Estos pueden ser secuencias sensibles a proteasas o secuencias quimicamente sensibles que pueden escindirse preferencialmente cuando las MURP llegan a su sitio diana.

10 Modulo de union (8M):

[0149] Las MURP empleadas en los procedimientos de la presente invencion pueden comprender uno o mas modulos de union. Modulo de union (BM) se refiere a una secuencia de peptidos o de proteinas que puede unirse especificamente a una o varias dianas, que pueden ser una o mas dianas terapeuticas o dianas accesorias, tales 15 como para la eleccion de diana de celulas, tejidos u organos. Los BM pueden ser peptidos lineales o ciclicos, peptidos restringidos a cisteina, microproteinas, proteinas de andamiaje (por ejemplo, fibronectina, anquirinas, cristalina, estreptavidina, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de dominio), hormonas peptidicas, factores de crecimiento, citocinas, o cualquier tipo de dominio de proteina, humano o no humano, natural o no natural, y pueden basarse en un andamiaje natural o no basarse en un andamiaje natural, o basarse en combinaciones o pueden ser 20 fragmentos de cualquiera de lo anterior. Opcionalmente, estos BM pueden manipularse afadiendo, quitando o sustituyendo uno o multiples aminoacidos con el fin de potenciar sus propiedades de union, su estabilidad, u otras propiedades. Los modulos de union pueden obtenerse de proteinas naturales, por disefo o por visualizacion de paquetes geneticos, que incluyen visualizacion de fago, visualizacion celular, visualizacion ribosomica u otros procedimientos de visualizacion. Los modulos de union pueden unirse a la misma copia de la misma diana, que

25 produce avidez, o pueden unirse a diferentes copias de la misma diana (que puede producir avidez si estas copias estan conectadas o ligadas de alguna forma, tal como por una membrana celular), o pueden unirse a dos dianas sin relacionar (que da avidez si estas dianas estan ligadas de alguna forma, tal como por una membrana). Los modulos de union pueden identificarse cribando o analizando de otro modo bibliotecas aleatorias de peptidos o proteinas.

30 [0150] Modulos de union particularmente deseables son aquellos que tras la incorporacion en una MURP, la MURP da una puntuacion de epitope T deseable. La puntuacion de epitope T de una proteina es el log de Kd (constante de disociacion, afinidad, tasa de disociacion) de la union de esa proteina a multiples de los alelos de MHC humanos mas comunes, como se desvela en Sturniolo T. y col. (1999) Nature Biotechnology 17:555). La puntuacion oscila sobre al menos 15 logaritmos, de aproximadamente 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0, -1, -2, -3, -4, -5

35 (10e10 Kd) a aproximadamente -5. MURP preferidas dan una puntuacion inferior a aproximadamente -3,5 [KKW: iEn escala absoluta?]

[0151] Tambien son de particular interes modulos de union que comprenden enlaces disulfuro formados por apareamiento de dos residuos de cisteina. En ciertas realizaciones, los modulos de union comprenden polipeptidos 40 que tienen alto contenido de cisteina o alta densidad de disulfuro (HDD). Los modulos de union de la familia HDD normalmente tienen 5-50% (5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50%) de residuos de cisteina y cada dominio contiene normalmente al menos dos disulfuros y opcionalmente un co-factor tal como calcio u otro ion.

[0152] La presencia del andamiaje de HDD permite que estos modulos sean pequefos, pero que todavia

45 adopten una estructura relativamente rigida. La rigidez es importante para obtener altas afinidades de union, resistencia a proteasas y calor, que incluyen las proteasas que participan en el procesamiento de antigenos, y asi contribuye a la baja inmunogenicidad o no inmunogenicidad de estos modulos. La region estructural de disulfuro pliega los modulos sin la necesidad de un gran numero de interacciones de cadenas laterales hidrofobas en el interior de la mayoria de los modulos. El pequefo tamafo tambien es ventajoso para la rapida penetracion en el

50 tejido y para administracion alternativa tal como oral, nasal, intestinal, pulmonar, barrera hematoencefalica, etc. Ademas, el pequefo tamafo tambien ayuda a reducir la inmunogenicidad. Puede obtenerse una mayor densidad de disulfuro, tanto aumentando el numero de disulfuros como usando dominios con el mismo numero de disulfuros, pero menos aminoacidos. Tambien se desea disminuir el numero de residuos fijos de no cisteina, de manera que este disponible un mayor porcentaje de aminoacidos para la union a diana.

55 [0153] Los modulos de union que contienen cisteina pueden adoptar una amplia gama de patrones de enlaces disulfuro (DBP). Por ejemplo, modulos de dos disulfuros pueden tener tres patrones de enlaces disulfuro (DBP) diferentes, modulos de tres disulfuros pueden tener 15 DBP diferentes y modulos de cuatro disulfuros tienen hasta 105 DBP diferentes. Ejemplos naturales existen para todos los DBP de 2SS, la mayoria de los DBP de 3SS y

menos de la mitad de los DBP de 4SS.

[0154] En un aspecto, el modulo que contiene cisteina (C) natural o que no se produce naturalmente comprende un polipeptido que tiene dos enlaces disulfuro formados por apareamiento de cisteinas contenidos en el 5 polipeptido segun un patron seleccionado del grupo constituido por C1-2, 3-4, C1-3, 2-4 y C1-4, 2-3, en los que los dos numeros numericos unidos por un guion indican que dos cisteinas contando desde el extremo N del polipeptido se aparean para formar un enlace disulfuro. En otro aspecto, el modulo que contiene cisteina (C) natural o que no se produce naturalmente comprende un polipeptido que tiene tres enlaces disulfuro formados por apareamiento de cisteinas entre andamiajes segun un patron seleccionado del grupo constituido por C1-2, 3-4 5-6, C1-2, 3-5, 4-6, C1-2, 3-6, 4-5 ,

C1-3, 2-4, 5-6, Cl-3, 2-5, 4-6, C1-3, 2-6, 4-4, C1-4, 2-3, 5-6, C1-4, 2-6, 3-5, C1-5, 2-2, 4-6, C1-5, 2-4, 3-6, C1-5, 2-6, 3-4, C1-6, 2-3, 4-5 y C1-6, 2-5, 3-4

10 ,en los que los dos numeros numericos unidos por un guion indican que dos cisteinas contando desde el extremo N del polipeptido se aparean para formar un enlace disulfuro. En otro aspecto mas, el modulo que contiene cisteina (C) natural o que no se produce naturalmente comprende un polipeptido que tiene al menos cuatro enlaces disulfuro formados por apareamiento de cisteinas contenidas en el polipeptido segun un patron seleccionado del grupo de

15 permutaciones definidas por la formula anterior. En otro aspecto mas, el modulo que contiene cisteina (C) natural o que no se produce naturalmente comprende un polipeptido que tiene al menos cinco, seis o mas enlaces disulfuro formados por apareamiento de cisteinas entre proteinas segun un patron seleccionado del grupo de permutaciones representado por la formula anterior. Cualquiera de las proteinas que contienen cisteina o andamiajes desvelados en las solicitudes de patente en tramitacion junto con la presente [numeros de serie 11/528.927 y 11/528.950] son

20 modulos de union candidatos.

[0155] Los modulos de union tambien pueden seleccionarse de bibliotecas de peptidos ciclicos restringidos a cisteina con 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12 aminoacidos aleatorizados o parcialmente aleatorizados entre las cisteinas unidas por disulfuro (por ejemplo, en un modo de formacion), y en algunos casos aminoacidos aleatorizados 25 adicionales sobre el exterior del par de cisteinas puede construirse usando una variedad de procedimientos. Los miembros de las bibliotecas con especificidad por una diana de interes pueden identificarse usando diversos procedimientos que incluyen visualizacion de fago, visualizacion ribosomica, visualizacion de levadura y otros procedimientos conocidos en la tecnica. Tales peptidos ciclicos pueden utilizarse como modulos de union en MURP. En una realizacion preferida, pueden manipularse adicionalmente peptidos restringidos a cisteina para aumentar la 30 afinidad de union, estabilidad proteolitica y/o especificidad usando enfoques de formacion que conducen a modulos de union que contienen mas de un enlace disulfuro. Un enfoque de formacion particular se ilustra en la Fig. 25. Se basa en la adicion de una unica cisteina mas multiples residuos aleatorizados sobre el lado del extremo N del peptido ciclico previamente seleccionado, ademas de sobre el lado del extremo C. Pueden generarse bibliotecas que han sido disefadas como se ilustra en la Fig. 25. Los modulos de union con propiedades mejoradas pueden 35 identificarse por visualizacion de fago o procedimientos similares. Tales bibliotecas de formacion pueden contener entre 1 y 12 posiciones aleatorias sobre el extremo N, ademas de sobre el lado del extremo C de un peptido ciclico. La distancia entre los residuos de cisteina en los flancos aleatorios recientemente afadidos y los residuos de cisteina en el peptido ciclico puede variarse entre 1 y 12 residuos. Tales bibliotecas contendran cuatro residuos de cisteina por miembro de biblioteca, con dos cisteinas resultantes del peptido ciclico original y dos residuos de 40 cisteina en los flancos recientemente afadidos. Este enfoque favorece un DBP 1-4 2-3 o un cambio en DBP, rompiendo el disulfuro 1-2 preexistente (= 2-3 en la construccion de 4 cisteinas) para formar un DBP 1-2 3-4 o 1-3 2

4. Tales enfoques de formacion pueden realizarse con cebadores especificos para clon de manera que no quede secuencia fija entre las areas de la biblioteca como se muestra en la Fig. 25, o pueden realizarse con cebadores que usan (y entonces queda) una secuencia fija en ambos lados del peptido previamente seleccionado y, por tanto, estos

45 mismos cebadores pueden usarse para cualquier clon previamente seleccionado como se ilustra en la Fig. 26. El procedimiento ilustrado en la Fig. 26 puede aplicarse a un conjunto de peptidos ciclicos con especificidad por una diana de interes. Se mostro que ambos enfoques de formacion funcionaban para maduracion por afinidad anti-VEGF por formacion. Este enfoque puede repetirse para generar modulos de union con seis o mas residuos de cisteina.

50 [0156] Otra formacion de un disulfuro en una secuencia de 2 disulfuros se ilustra en la Fig. 27. Implica la dimerizacion de un conjunto previamente seleccionado de peptidos de 1 disulfuro consigo mismo de manera que el conjunto de peptidos preseleccionado termine en el extremo N, ademas de en la posicion del extremo C. Este enfoque favorece la formacion de secuencias de 2 disulfuros que reconocen dos epitopes separados sobre una diana.

55 [0157] Otro enfoque de formacion implica la adicion de una secuencia (parcialmente) aleatorizada de 6-15 residuos que contiene dos cisteinas que estan separadas 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoacidos, con posiciones aleatorizadas opcionalmente adicionales fuera de las cisteinas ligadas. Esta secuencia aleatoria de 2 cisteinas se afade sobre el lado del extremo N del peptido previamente seleccionado, o sobre el lado del extremo C. Este enfoque favorece un DBP 1-2 3-4, aunque pueden formarse otros DBP. Este enfoque puede repetirse para generar modulos de union con seis o mas residuos de cisteina.

[0158] Los modulos de union pueden construirse basandose en andamiajes de estructuras naturales. Tales

5 andamiajes pueden identificarse por busqueda en bases de datos. Bibliotecas que se basan en andamiajes naturales pueden someterse a inmunopurificacion por visualizacion de fago, seguido de cribado para identificar secuencias que se unen especificamente a una diana de interes.

[0159] Esta disponible una amplia seleccion de andamiajes naturales para construir los modulos de union. La

10 eleccion de un andamiaje particular dependera de la diana prevista. Ejemplos no limitantes de andamiajes naturales incluyen proteinas similares a toxinas de serpiente tales como toxinas del veneno de serpiente y dominio extracelular de receptores de la superficie celular humana. Ejemplos no limitantes de toxinas del veneno de serpiente son erabutoxina B, gamma-cardiotoxina, faciculina, toxina muscarinica, erabutoxina A, neurotoxina I, cardiotoxina V4II (toxina III), cardiotoxina V, alfa-cobratoxina, neurotoxina larga 1, FS2 axina, bungarotoxina, bucandina, cardiotoxina

15 CTXI, cardiotoxina CTX IIB, cardiotoxina II, cardiotoxina III, cardiotoxina IV, cobrotoxina 2, alfa-toxinas, neurotoxina II (cobrotoxina B), toxina B (neurotoxina), candotoxina, bucaina. Ejemplos no limitantes de dominio extracelular de receptores de la superficie celular (humana) incluyen CD59, receptor de activina tipo II, ectodominio del receptor Ia de BMP, dominio extracelular del receptor de tipo II de TGF-beta. Otros andamiajes naturales incluyen, pero no se limitan a, A-dominios, EGF, Ca-EGF, TNF-R, Notch, DSL, Trefoil, PD, TSP1, TSP2, TSP3, anato, integrina beta,

20 tiroglobulina, defensina 1, defensina 2, ciclotida, SHKT, desintegrinas, miotoxinas, gamma-tioneinas, conotoxina, mu-conotoxina, omega-atracotoxinas, delta-atracotoxinas, ademas de familias adicionales desveladas en las solicitudes de patente en tramitacion junto con la presente numero de serie 11/528.927 y 11/528.950, que se incorporan en el presente documento en su totalidad.

25 [0160] Se ha descrito una gran variedad de procedimientos que permiten identificar moleculas de union en una gran biblioteca de variantes. Un procedimiento es la sintesis quimica. Los miembros de las bibliotecas pueden sintetizarse sobre perlas de forma que cada perla lleve una secuencia de peptidos diferente. Las perlas que llevan ligandos con una especificidad deseable pueden identificarse usando componentes de union marcados. Otro enfoque es la generacion de sub-bibliotecas de peptidos que permiten identificar secuencias de union especificas en

30 un procedimiento iterativo (Pinilla, C. y col. (1992) BioTechniques, 13: 901-905). Mas comunmente usados son los procedimientos de visualizacion en los que una biblioteca de variantes se expresa sobre la superficie de un fago, proteina o celula. Estos procedimientos tienen en comun que el ADN o ARN que codifica cada variante en la biblioteca esta fisicamente ligado al ligando. Esto permite detectar o recuperar el ligando de interes y luego determinar su secuencia de peptidos secuenciando el ADN o ARN unido. Los procedimientos de visualizacion

35 permiten que un experto en la tecnica enriquezca miembros de las bibliotecas con propiedades de union deseables de grandes bibliotecas de variantes aleatorias. Frecuentemente, variantes con propiedades de union deseables pueden identificarse de bibliotecas enriquecidas cribando cepas individuales aisladas de una biblioteca enriquecida para propiedades deseables. Ejemplos de procedimientos de visualizacion son fusion con el represor lac (Cull, M. y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 1865-1869), visualizacion de superficie celular (Wittrup, K. D. (2001) Curr

40 Opin Biotechnol, 12: 395-9). Son de particular interes procedimientos en los que los peptidos o proteinas aleatorios se ligan a particulas de fago. Comunmente se usan fago M13 (Smith, G. P. y col. (1997) Chem Rev, 97: 391-410) y fago T7 (Danner, S. y col. (2001) Proc Natl Acad Sci U S A, 98: 12954-9). Hay multiples procedimientos disponibles para visualizar peptidos o proteinas sobre el fago M13. En muchos casos, la secuencia de la biblioteca esta fusionada con el extremo N del peptido pIII del fago M13. El fago lleva normalmente 3-5 copias de esta proteina y

45 asi el fago en una biblioteca tal llevara en la mayoria de los casos entre 3-5 copias de un miembro de la biblioteca. Este enfoque se denomina visualizacion multivalente. Una alternativa es la visualizacion de fagemido en la que la biblioteca esta codificada sobre un fagemido. Las particulas de fago pueden formarse por infeccion de celulas que llevan un fagemido con un fago colaborador (Lowman, H. B. y col. (1991) Biochemistry, 30: 10832-10838). Este procedimiento normalmente conduce a visualizacion monovalente. En algunos casos se prefiere la visualizacion

50 monovalente para obtener ligantes de alta afinidad. En otros casos se prefiere la visualizacion multivalente (O'Connell, D. y col. (2002) J Mol Biol. 321: 49-56).

[0161] Se han descrito una variedad de procedimientos para enriquecer secuencias con caracteristicas deseables por visualizacion de fago. Puede inmovilizarse una diana de interes por union a inmunotubos, placas de 55 microtitulacion, perlas magneticas u otras superficies. Posteriormente, una biblioteca de fagos se pone en contacto con la diana inmovilizada, el fago que carece de un ligando de union se lava, y el fago que lleva un ligando especifico para diana puede eluirse mediante una variedad de condiciones. La elucion puede realizarse a pH bajo, pH alto, urea u otras condiciones que tienden a romper contactos proteina-proteina. El fago unido tambien puede eluirse afadiendo celulas de E. coli de forma que la elucion del fago pueda infectar directamente el huesped de E.

coli afadido. Un protocolo interesante es la elucion con proteasa que puede degradar el ligando unido a fago o la diana inmovilizada. Tambien pueden utilizarse proteasas como herramientas para enriquecer ligandos unidos a fago resistentes a proteasas. Por ejemplo, puede incubarse una biblioteca de ligandos unidos a fago con una o mas proteasas (humanas o de raton) antes de la inmunopurificacion sobre la diana de interes. Este procedimiento 5 degrada y elimina ligandos labiles a proteasas de la biblioteca (Kristensen, P. y col. (1998) Fold Des, 3: 321-8). Tambien pueden enriquecerse bibliotecas de visualizacion de fago de ligandos para unirse a muestras biologicas complejas. Ejemplos son la inmunopurificacion sobre fracciones de membrana celular inmovilizadas (Tur, M. K. y col. (2003) Int J Mol Med, 11: 523-7), o celulas enteras (Rasmussen, U. B. y col. (2002) Cancer Gene Ther, 9: 606-12; Kelly, K. A. y col. (2003) Neoplasia, 5: 437-44). En algunos casos tienen que optimizarse las condiciones de 10 inmunopurificacion para el enriquecimiento de ligantes especificos para celulas de bibliotecas de fagos (Watters, J.

M. y col. (1997) Immunotechnology, 3: 21-9). La inmunopurificacion de fagos tambien puede realizarse en pacientes

o animales vivos. Este enfoque es de particular interes para la identificacion de ligandos que se unen a dianas vasculares (Arap,W. y col. (2002) Nat Med, 8: 121-7).

15 [0162] Estan disponibles una variedad de procedimientos de clonacion que permiten que un experto en la materia genere bibliotecas de secuencias de ADN que codifican bibliotecas de peptidos. Pueden utilizarse mezclas aleatorias de nucleotidos para sintetizar oligonucleotidos que contienen una o multiples posiciones aleatorias. Este procedimiento permite controlar el numero de posiciones aleatorias, ademas del grado de aleatorizacion. Ademas, pueden obtenerse secuencias aleatorias o semi-aleatorias de ADN por digestion parcial de ADN de muestras

20 biologicas. Pueden usarse oligonucleotidos aleatorios para construir bibliotecas de plasmidos o fagos que se aleatorizan en localizaciones predefinidas. Esto puede hacerse por fusion de PCR como se describe en (de Kruif, J. y col. (1995) J Mol Biol, 248: 97-105). Otros protocolos se basan en ligacion de ADN (Felici, F. y col. (1991) J Mol Biol, 222: 301-10; Kay, B. K. y col. (1993) Gene, 128: 59-65). Otro enfoque comunmente usado es mutagenesis de Kunkel en la que una hebra mutagenizada de un plasmido o fagemido se sintetiza usando ADN ciclico

25 monocatenario como molde. Vease, Sidhu, S. S. y col. (2000) Methods Enzymol, 328: 333-63; Kunkel, T. A. y col. (1987) Methods Enzymol, 154: 367-82.

[0163] La mutagenesis de Kunkel usa moldes que contienen bases de uracilo aleatoriamente incorporadas que pueden obtenerse de cepas de E. coli como CJ236. La hebra molde que contiene uracilo se degrada

30 preferencialmente tras la transformacion en E. coli, mientras que se retiene la hebra mutagenizada sintetizada in vitro. Como resultado, la mayoria de las celulas transformadas llevan la version mutagenizada del fagemido o fago. Un enfoque valioso para aumentar la diversidad en una biblioteca es combinar multiples sub-bibliotecas. Estas subbibliotecas pueden generarse por cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente y pueden basarse en el mismo andamiaje o en andamiajes diferentes.

35 [0164] Recientemente se ha descrito un procedimiento util para generar grandes bibliotecas de fagos de peptidos cortos (Scholle, M. D. y col. (2005) Comb Chem High Throughput Screen, 8: 545-51). Este procedimiento esta relacionado con el enfoque de Kunkel, pero no requiere la generacion de ADN mensajero monocatenario que contiene bases de uracilo aleatorias. En su lugar, el procedimiento empieza con un fago molde que lleva una o mas

40 mutaciones proximas al area que va a mutagenizarse y dicha mutacion hace que el fago sea no infeccioso. El procedimiento usa un oligonucleotido mutagenico que lleva codones aleatorizados en algunas posiciones y que corrige la mutacion inactivante del fado en el molde. Como resultado, solo particulas de fago mutagenizadas son infecciosas despues de la transformacion y muy pocos fagos parentales estan contenidos en tales bibliotecas. Este procedimiento puede modificarse adicionalmente de varias formas. Por ejemplo, pueden utilizarse multiples

45 oligonucleotidos mutagenicos para mutagenizar simultaneamente multiples regiones discontiguas de un fago. Los presentes inventores han dado un paso mas con este enfoque aplicandolo a microproteinas completas de gt;25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 y 60 aminoacidos, en lugar de a peptidos cortos de lt;10, 15 o 20 aminoacidos, que plantea un desafio adicional. Este enfoque da ahora bibliotecas de mas de 10e10 transformantes (hasta 10e11) con una unica transformacion, de manera que de 10 transformaciones se espera una unica biblioteca con una diversidad de 10e12.

50 [0165] Otra variacion del procedimiento de Scholle es disefar el oligonucleotido mutagenico de forma que un codon de terminacion ambar en el molde se convierta en un codon de terminacion ocre, y uno ocre en uno ambar en el siguiente ciclo de mutagenesis. En este caso, el fago molde y los miembros de la biblioteca mutagenizada deben cultivarse en diferentes cepas supresoras de E. coli, alternando un supresor ocre con cepas de supresor ambar.

55 Esto permite realizar rondas sucesivas de mutagenesis de un fago alternando entre estos dos tipos de codones de terminacion y dos cepas supresoras.

[0166] Todavia otra variacion del enfoque de Scholle implica el uso de megacebadores con un molde de ADN de fago monocatenario. El megacebador es un ADNmc largo que se genero a partir de los insertos de biblioteca del

conjunto seleccionado del fago de la ronda previa de inmunopurificacion. El objetivo es capturar la diversidad completa de los insertos de biblioteca del conjunto previo, que se mutagenizo en una o mas areas, y transferirla a una nueva biblioteca de tal forma que pueda mutagenizarse un area adicional. El procedimiento de megacebadores puede repetirse para multiples ciclos usando el mismo molde que contiene un codon de terminacion en el gen de 5 interes. El megacebador es un ADNmc (opcionalmente generado por PCR) que contiene 1) areas de solapamiento de 5' y 3' de al menos 15 bases para complementariedad con el molde de ADNmc, y 2) una o mas areas de la biblioteca previamente seleccionadas (1, 2, 3, 4 o mas) que se copiaron (opcionalmente por PCR) del conjunto de clones previamente seleccionados, y 3) un area de biblioteca recientemente mutagenizada que va a seleccionarse en la siguiente ronda de inmunopurificacion. El megacebador se prepara opcionalmente 1) sintetizando uno o mas 10 oligonucleotidos que codifican el area de la biblioteca recientemente sintetizada y 2) fusionado esta, opcionalmente usando PCR de solapamiento, con un fragmento de ADN (opcionalmente obtenido por PCR) que contiene cualquier otra area de biblioteca que se optimizo previamente. La ronda final o PCR monocatenaria del producto de PCR (solapado) combinado se usa para generar el megacebador monocatenario que contiene todas las areas previamente optimizadas de la nueva biblioteca para un area que va a optimizarse en el siguiente experimento de

15 inmunopurificacion. Se espera que este enfoque permita afinidad por maduracion de proteinas usando multiples ciclos rapidos de creacion de bibliotecas que generan 10e11 a 10e12 diversidades por ciclo, cada uno seguido de inmunopurificacion.

[0167] Puede aplicarse una variedad de procedimientos para introducir diversidad de secuencias en

20 bibliotecas (previamente seleccionadas o sin tratamiento previo) de microproteinas o para mutar clones de microproteinas individuales con el objetivo de potenciar su union u otras propiedades como fabricacion, estabilidad o inmunogenicidad. En principio, todos los procedimientos que pueden usarse para generar bibliotecas tambien pueden usarse para introducir diversidad en bibliotecas enriquecidas (previamente seleccionadas) de microproteinas. En particular, pueden sintetizarse variantes con union deseable u otras propiedades y disefar

25 oligonucleotidos parcialmente aleatorizados basandose en estas secuencias. Este procedimiento permite controlar las posiciones y grado de aleatorizacion. Puede deducirse la utilidad de mutaciones individuales en una proteina de datos de secuencia de multiples variantes usando una variedad de algoritmos informaticos (Jonsson, J. y col. (1993) Nucleic Acids Res. 21: 733-9; Amin. N. y col. (2004) Protein Eng Des Sel, 17: 787-93). De particular interes para la re-mutagenesis de bibliotecas enriquecidas es el barajado de ADN (Stemmer, W. P. C. (1994) Nature, 370: 389

30 391), que genera recombinantes de secuencias individuales en una biblioteca enriquecida. El barajado puede realizarse usando una variedad de condiciones de PCR modificadas y los moldes pueden degradarse parcialmente para potenciar la recombinacion. Una alternativa es la recombinacion en posiciones predefinidas usando clonacion basada en enzimas de restriccion. Son de particular interes procedimientos que utilizan enzimas de restriccion tipo IIS que escinden ADN fuera de su sitio de reconocimiento de secuencias (Collins, J. y col. (2001) J Biotechnol. 74:

35 317-38). Pueden utilizarse enzimas de restriccion que generan residuos protuberantes no palindromicos para escindir plasmidos u otras mezclas de variantes que codifican ADN en multiples localizaciones y plasmidos completos pueden reensamblarse por ligacion (Berger, S. L. y col. (1993) Anal Biochem, 214: 571-9). Otro procedimiento para introducir diversidad es mutagenesis por PCR en la que las secuencias de ADN que codifican miembros de las bibliotecas se someten a PCR bajo condiciones mutagenicas. Se ha descrito que las condiciones

40 de PCR conducen a mutaciones a frecuencias de mutacion relativamente altas (Leung, D. y col. (1989) Technique,

1: 11-15). Ademas, puede emplearse una polimerasa con fidelidad reducida (Vanhercke, T. y col. (2005) Anal Biochem, 339: 9-14). Un procedimiento de particular interes se basa en cepas de mutador (Irving, R. A. y col. (1996) Immunotechnology, 2: 127-43; Coia, G. y col. (1997) Gene, 201: 203-9). Estas son cepas que llevan defectos en uno

o mas genes de reparacion de ADN. Los plasmidos o fago u otro ADN en estas cepas acumulan mutaciones durante

45 la replicacion normal. Pueden propagarse clones individuales o poblaciones enriquecidas en cepas de mutador para introducir diversidad genetica. Muchos de los procedimientos descritos anteriormente pueden utilizarse en un procedimiento iterativo. Pueden aplicarse multiples rondas de mutagenesis y cribado o inmunopurificacion a genes enteros, o a porciones de un gen, o pueden mutagenizarse diferentes porciones de una proteina durante cada ronda posterior (Yang,W. P. y col. (1995) J Mol Biol, 254: 392-403).

50 [0168] Las bibliotecas pueden tratarse adicionalmente para reducir artefactos. Artefactos conocidos de inmunopurificacion de fagos incluyen 1) union no especifica basada en hidrofobia, y 2) union multivalente a la diana, tanto debido a a) la pentavalencia de la proteina del fago pIII como b) debido a la formacion de disulfuros entre diferentes microproteinas, produciendo multimeros, o c) debido a recubrimiento de alta densidad de la diana sobre

55 un soporte solido y 3) union a diana dependiente de contexto, en la que el contexto de la diana o el contexto de las microproteinas se vuelve critico para la actividad de union o de inhibicion. Pueden realizarse diferentes etapas de tratamiento para minimizar la magnitud de estos problemas. Por ejemplo, tales tratamientos se aplican a la biblioteca completa, pero algunos tratamientos utiles que eliminan clones malos solo pueden aplicarse a conjuntos de proteinas solubles o solo a proteinas solubles individuales.

[0169] Es probable que las bibliotecas de andamiajes que contienen cisteina contengan tioles libres, que pueden complicar la evolucion dirigida por reticulacion a otras proteinas. Un enfoque es eliminar los peores clones de la biblioteca pasandolos por una columna sin tiol, eliminando asi todos los clones que tienen uno mas sulfhidrilos

5 libres. Los clones con grupos SH libres tambien pueden hacerse reaccionar con reactivos de biotina-SH, permitiendo la eliminacion eficiente de clones con grupos SH reactivos usando columnas de estreptavidina. Otro enfoque es no eliminar los tioles libres, pero inactivarlos tapando los extremos con compuestos quimicos reactivos con sulfhidrilo tales como acido yodoacetico. Son de particular interes reactivos de sulfhidrilo voluminosos o hidrofilos que reducen la union a diana no especifica o variantes modificadas.

10 [0170] Ejemplos de dependencia del contexto son todas las secuencias constantes, que incluyen la proteina pIII, ligadores, marcas de peptidos, biotina-estreptavidina, Fc y otras proteinas de fusion que contribuyen a la interaccion. El enfoque tipico para evitar la dependencia del contexto implica cambiar el contexto tan frecuentemente como sea practico con el fin de evitar la formacion. Esto puede implicar alternar entre diferentes sistemas de

15 visualizacion (es decir, M13 frente a T7, o M13 frente a levadura), alternar las marcas y ligadores que se usan, alternar el soporte (solido) usado para la inmovilizacion (es decir, quimica de inmovilizacion) y alternar las propias proteinas diana (diferentes vendedores, diferentes versiones de fusion).

[0171] Tambien puede usarse tratamiento de bibliotecas para seleccionar proteinas con cualidades preferidas.

20 Una opcion es el tratamiento de bibliotecas con proteasas con el fin de eliminar variantes inestables de la biblioteca. Las proteasas usadas son normalmente aquellas que se encontrarian en la aplicacion. Para administracion pulmonar se usarian proteasas pulmonares, por ejemplo, obtenidas por un lavado pulmonar. Similarmente, se obtendrian mezclas de proteasas de suero, saliva, estomago, intestino, piel, nariz, etc. Sin embargo, tambien es posible usar mezclas de proteasas purificadas individuales. Una amplia lista de proteasas se muestra en [Apendice

25 E]. Los fagos por si mismos son excepcionalmente resistentes a la mayoria de las proteasas y otros tratamientos rigurosos.

[0172] Por ejemplo, es posible seleccionar la biblioteca para las estructuras mas estables, es decir, aquellas con los enlaces disulfuro mas fuertes, por exposicion a concentraciones crecientes de agentes reductores (es decir,

30 DTT o beta-mercaptoetanol), eliminando asi primero las estructuras menos estables. Normalmente se usaria agente reductor (es decir, DTT, BME, otro) a concentraciones de 2,5 mM, a 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM o incluso 100 mM, dependiendo de la estabilidad deseada.

[0173] Tambien es posible seleccionar clones que pueden replegarse eficientemente in vitro, reduciendo la

35 biblioteca de visualizacion entera con un alto nivel de agente reductor, seguido de reoxidando gradualmente la biblioteca de proteinas para volver a formar los disulfuros, seguido de la eliminacion de clones con grupos SH libres, como se ha descrito anteriormente. Este procedimiento puede aplicarse una vez o multiples veces para eliminar clones que tienen baja eficiencia de replegamiento in vitro.

40 [0174] Un enfoque es aplicar una seleccion genetica para el nivel de expresion de proteinas, plegamiento y solubilidad como se describe por A. C. Fisher y col. (2006) Genetic selection for protein solubility enabled by the folding quality control feature of the twin-arginine translocalization pathway. Protein Science (en linea). Despues de la inmunopurificacion de bibliotecas de visualizacion (opcional), se querria evitar cribar miles de clones al nivel de proteinas para la union a diana, nivel de expresion y plegamiento. Una alternativa es clonar el conjunto completo de

45 insertos seleccionados en un vector de fusion de beta-lactamasa que, cuando se siembra sobre beta-lactama, los autores demostraron que era selectivo para proteinas bien expresadas, completamente unidas por disulfuro y solubles.

[0175] Tras la visualizacion de fago M13 de bibliotecas de proteinas e inmunopurificacion sobre dianas para

50 uno o mas ciclos, hay una variedad de formas de proceder, que incluyen (1) cribar clones de fago individuales por ELISA de fago, que mide el numero de particulas de fago (usando anticuerpos anti-M13) que se unen a una diana inmovilizada; (2) transferir bibliotecas de visualizacion de fago de M13 a T7. El segundo enfoque es particularmente util en reducir la aparicion de positivos falsos basandose en la valencia. Cualquier formato de biblioteca individual tiende a favorecer clones que puedan formar contacto de alta avidez con la diana. Este es el motivo por el cual el

55 cribado de proteinas solubles es importante, aunque esto es una solucion tediosa. La multivalencia alcanzada en la visualizacion de fago T7 es probablemente muy diferente de la alcanzada en la visualizacion de M13, y la realizacion en ciclos entre T7 y M13 puede ser un enfoque excelente para reducir la aparicion de positivos falsos basandose en la valencia.

[0176] La elevacion del filtro es otra metodologia que puede ser con colonias bacterianas cultivadas a alta densidad sobre placas de agar grandes (10e2-10e5). Pequefas cantidades de algunas proteinas son secretadas en los medios y terminan unidas a la membrana de filtracion (nitrocelulosa o nailon). Entonces, los filtros se bloquean en leche desnatada, 1% de hidrolizado de caseina o una disolucion de 1% de BSA y se incuban con la proteina diana 5 que se ha marcado con un colorante fluorescente o una enzima indicadora (directamente o indirectamente mediante anticuerpos o mediante biotina-estreptavidina). La localizacion de la colonia se determina por revestimiento del filtro sobre el fondo de la placa y todas las colonias positivas se seleccionan y se usan para caracterizacion adicional. La ventaja de las elevaciones del filtro es que puede hacerse que sean selectivas por afinidad leyendo la sefal despues de lavar durante diferentes periodos de tiempo. La sefal de clones de alta afinidad se 'atenua' lentamente, mientras

10 que la sefal de clones de baja afinidad se atenua rapidamente. Tal caracterizacion por afinidad normalmente requiere un ensayo de 4 puntos con un ensayo fundamentado y puede proporcionar mejor comparabilidad clon a clon que ensayos fundamentados. La molienda de colonias en una matriz es util, ya que minimiza diferencias debido al tamafo o localizacion de colonias.

15 Modulos del extremo N:

[0177] Las MURP objeto pueden contener modulos del extremo N (NM), que son particularmente utiles, por ejemplo, en facilitar la produccion de las MURP. El NM puede ser un unico residuo de metionina si los productos se expresan en el citoplasma de E. coli. Un formato de producto tipico es un URP fusionado con una proteina

20 terapeutica, que se expresa en el citoplasma bacteriano de manera que el extremo N sea formil-metionina. La formilmetionina puede tanto ser permanente como temporal, si se elimina por procesamiento biologico o quimico.

[0178] El NM tambien puede ser una secuencia de peptidos que se ha manipulado para procesamiento proteolitico, que puede usarse para eliminar marcas o para eliminar proteinas de fusion. El modulo del extremo N 25 puede manipularse para facilitar la purificacion de la MURP, incluyendo una marca de afinidad tal como la marca Flag, Myc, HA o His. El modulo del extremo N tambien puede incluir una marca de afinidad que puede usarse para la deteccion de la MURP. Un NM puede manipularse o seleccionarse para expresion de alto nivel de la MUMP. Tambien puede manipularse o seleccionarse para potenciar la resistencia a proteasas de la MURP resultante. Las MURP pueden producirse con un modulo del extremo N que facilita la expresion y/o purificacion. Este modulo del

30 extremo N puede separarse por escision durante el procedimiento de produccion con una proteasa, de forma que el producto final no contiene un modulo del extremo N.

[0179] Optimizando la eleccion de aminoacidos y codones del modulo del extremo N puede aumentarse la produccion recombinante. El modulo del extremo N tambien puede contener un sitio de procesamiento que puede 35 escindirse por una proteasa especifica como factor Xa, trombina o enterocinasa. Proteasa del virus del grabado del tomate (VGT). Tambien pueden disefarse sitios de procesamiento para ser escindibles por hidrolisis quimica. Un ejemplo es la secuencia de aminoacidos asp-pro que puede escindirse en condiciones acidas. Tambien puede disefarse un modulo del extremo N para facilitar la purificacion de una MURP. Por ejemplo, pueden disefarse modulos del extremo N para contener multiples residuos his que permiten la captura de producto por cromatografia 40 de metal inmovilizado. Los modulos del extremo N pueden contener secuencias de peptidos que pueden capturarse

o detectarse especificamente por anticuerpos. Ejemplos son FLAG, HA, c-myc.

Modulos del extremo C:

45 [0180] Las MURP pueden contener un modulo del extremo C, que son particularmente utiles, por ejemplo, en facilitar la produccion de las MURP. Por ejemplo, el modulo del extremo C puede comprender un sitio de escision para efectuar el procesamiento proteolitico para eliminar secuencias que estan fusionadas y de ahi aumentar la expresion de proteinas o facilitar la purificacion. En particular, el modulo del extremo C tambien puede contener un sitio de procesamiento que puede escindirse por una proteasa especifica como factor Xa, trombina, proteasa de

50 VGT o enterocinasa. Los sitios de procesamiento tambien pueden disefarse para ser escindibles por hidrolisis quimica. Un ejemplo es la secuencia de aminoacidos asp-pro que puede escindirse en condiciones acidas. El modulo del extremo C puede ser una marca de afinidad que tiene como objetivo facilitar la purificacion de la MURP. Por ejemplo, los modulos del extremo C pueden disefarse para contener multiples residuos his que permiten la captura de producto por cromatografia de metal inmovilizado. Los modulos del extremo C pueden contener

55 secuencias de peptidos que pueden capturarse o detectarse especificamente por anticuerpos. Ejemplos no limitantes de las marcas incluyen marca FLAG, HA, c-myc o His. El modulo del extremo C tambien puede manipularse o seleccionarse para potenciar la resistencia a proteasas de la MURP resultante.

[0181] Si se desea, el extremo N de la proteina puede ligarse a su propio extremo C. Por ejemplo, la ligacion de estos dos modulos puede llevarse a cabo creando un enlace natural similar a aminoacido (enlace peptidico) o usando una entidad de enlace exogena. Son de particular interes ciclotidas, una familia de proteinas pequefas en que esto se produce naturalmente. Adoptando un formato estructural como ciclotidas se espera proporcionar estabilidad adicional contra exo-proteasas. Tal enlace intramolecular normalmente funciona mejor a menores

5 concentraciones de proteina.

Modulos efectores:

[0182] Las MURP pueden comprender uno o multiples modulos efectores (EM), o ninguno. Los modulos

10 efectores normalmente no proporcionan la eleccion de diana, pero proporcionan una actividad requerida para efecto terapeutico, como destruccion de celulas. Los EM pueden ser moleculas pequefas farmaceuticamente activas (es decir, farmacos toxicos), peptidos o proteinas. Ejemplos no limitantes son citocinas, anticuerpos, enzimas, factores de crecimiento, hormonas, receptores, agonistas o antagonistas de receptores, tanto si estan completos como un fragmento o dominio de los mismos. Los modulos efectores tambien pueden comprender secuencias de peptidos

15 que llevan farmacos de molecula pequefa quimicamente ligados, tanto si son sinteticos como naturales. Opcionalmente, estas moleculas efectoras pueden ligarse al modulo efector mediante ligadores quimicos, que pueden o pueden no escindirse bajo condiciones seleccionadas conduciendo a una liberacion de la actividad toxica. Los EM tambien pueden incluir radioisotopos y sus quelatos, ademas de diversas marcas para TEP y RMN. Los modulos efectores tambien pueden ser toxicos para una celula o un tejido. Son de particular interes MURP que

20 contienen modulos efectores toxicos y modulos de union con especificidad por un tejido enfermo o tipo de celula enferma. Tales MURP pueden acumularse especificamente en un tejido enfermo o en celulas enfermas y pueden ejercer su accion toxica preferencialmente en las celulas o tejidos enfermos. A continuacion se enumeran modulos efectores a modo de ejemplo.

25 [0183] Enzimas -Los modulos efectores pueden ser enzimas. Son de particular interes enzimas que degradan metabolitos que son criticos para el crecimiento celular como hidratos de carbono o aminoacidos o lipidos

o co-factores. Otros ejemplos de modulos efectores con actividad enzimatica son RNAsa, ADNasa y fosfatasa, asparaginasa, histidinasa, arginasa, beta-lactamasa. Los modulos efectores con actividad enzimatica pueden ser toxicos cuando se administran a un tejido o celula. Son de particular interes MURP que combinan modulos efectores

30 que son toxicos y modulos de union que se unen especificamente a un tejido enfermo. Tambien son modulos efectores posibles enzimas que convierten un profarmaco inactivo en un farmaco activo en el sitio tumoral.

[0184] Farmaco -La MURP objeto puede contener un efector que es un farmaco. Si se desea, pueden disefarse secuencias para la administracion selectiva al organo de moleculas de farmaco. Un ejemplo se ilustra en 35 la Figura 8. Una secuencia de URP puede fusionarse con una proteina que se une preferencialmente a tejido enfermo. La misma secuencia de URP puede contener uno o mas residuos de aminoacidos que pueden modificarse para la union de moleculas de farmaco. Un conjugado tal puede unirse a tejido enfermo con alta especificidad y las moleculas de farmaco unidas pueden producir accion local, a la vez que mantienen la exposicion a farmaco sistemico. La MURP puede disefarse para facilitar la liberacion de moleculas de farmaco al tamafo diana 40 introduciendo sitios sensibles a proteasas que pueden escindirse por proteasas nativas en el sitio de accion deseada. Una ventaja significativa de uso de secuencias de URP para el disefo de construcciones de administracion de farmaco es que pueden evitarse interacciones no deseables entre la molecula de farmaco y el dominio que elige diana de la construccion. Muchas moleculas de farmaco que pueden conjugarse con dominios que eligen diana tienen hidrofobia significativa y los conjugados resultantes tienden a agregarse. Afadiendo secuencias de URP 45 hidrofilas a tales construcciones puede mejorarse la solubilidad de las construcciones de administracion resultantes y, como consecuencia, reducirse la tendencia a la agregacion. Ademas, puede aumentarse el numero de moleculas de farmaco que pueden fusionarse con un dominio que elige diana afadiendo secuencias de URP largas. Ademas, el uso de secuencias de URP permite optimizar la distancia entre los sitios de conjugacion del farmaco para facilitar la completa conjugacion. La lista de farmacos adecuados incluye, pero no se limita a, agentes quimioterapeuticos 50 tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXANT); alquilsulfonatos tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; mostazas de nitrogeno tales como clorambucilo, clornafazina, ciclofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de oxido de mecloretamina, melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; 55 nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibioticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, acido micofenolico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); analogos de acido folico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; analogos de purina tales como fludarabina, 6mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; analogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, androgenos tales como calusterona, 5 propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenergicos tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reparadores de acido folico tales como acido frolinico; aceglatona; glucosido aldofosfamida; acido aminolevulinico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; duocarmicina, maitansina, auristatina, elfornitina; acetato de eliptinio; etoglucido, nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; 10 pirarubicina; acido podofilinico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK.RTM; razoxana; sizofiran; espirogermanio; acido tenuazonico; triazicuona; 2,2',2quot;-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosido (quot;Ara-Cquot;); ciclofosfamida; tiotepa; taxanos, por ejemplo, paclitaxel (TAXOLTM, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y doxetaxel (TAXOTERETM, Rh6ne-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; analogos de platino tales 15 como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; teniposido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; camptotecina-11 (CPT-11); inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); acido retinoico; esperamicinas; capecitabina; y sales, acidos o derivados farmaceuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Como acondicionadores celulares quimioterapeuticos adecuados tambien estan incluidos agentes

20 antihormonales que actuan para regular o inhibir la accion de hormonas sobre tumores tales como antiestrogenos que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (Fareston); y antiandrogenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, goserelina, doxorubicina, daunomicina, duocarmicina, vincristina y vinblastina.

25 [0185] Otros farmacos que pueden usarse como modulos efectores incluyen aquellos que son utiles para tratar afecciones inflamatorias, enfermedades cardiacas, enfermedades infecciosas, enfermedades respiratorias, enfermedades autoinmunitarias, trastornos neuronales y musculares, trastornos metabolicos y canceres.

[0186] Farmacos adicionales que pueden usarse como efectores en MURP incluyen agentes para el dolor e

30 inflamacion tales como histamina y antagonistas de la histamina, bradiquinina y antagonistas de bradiquinina, 5hidroxitriptamina (serotonina), sustancias lipidicas que se generan por biotransformacion de los productos de la hidrolisis selectiva de fosfolipidos de membrana, eicosanoides, prostaglandinas, tromboxanos, leucotrienos, aspirina, agentes antiinflamatorios no esteroideos, agentes analgesico-antipireticos, agentes que inhiben la sintesis de prostaglandinas y tromboxanos, inhibidores selectivos de la ciclooxigenasa inducible, inhibidores selectivos de la

35 ciclooxigenasa-2 inducible, autacoides, hormonas paracrinas, somatostatina, gastrina, citocinas que median en interacciones implicadas en respuestas inmunitarias humorales y celulares, autacoides derivados de peptidos, eicosanoides, agonistas β-adrenergicos, ipratropio, glucocorticoides, metilxantinas, bloqueantes de los canales de sodio, agonistas de receptores de opioides, bloqueantes de canales de calcio, estabilizadores de la membrana e inhibidores de leucotrieno.

40 [0187] Otros farmacos que pueden usarse como efector incluyen agentes para el tratamiento de ulceras peptidicas, agentes para el tratamiento de enfermedad por reflujo gastroesofagico, agentes procineticos, antiemeticos, agentes usados en sindrome del intestino irritable, agentes usados para diarrea, agentes usados para estrefimiento, agentes usados para enfermedad inflamatoria del intestino, agentes usados para enfermedad biliar,

45 agentes usados para enfermedad pancreatica.

[0188] Radionuclidos -Las MURP pueden disefarse para la administracion que elige tejido como diana de radionuclidos, ademas de para la obtencion de imagenes con radionuclidos. Las URP son ideales para la obtencion de imagenes debido a que la semivida puede optimizarse cambiando la longitud del URP. Para la mayoria de las 50 aplicaciones de obtencion de imagenes es probable que se prefiera un URP moderadamente largo, proporcionando una semivida de 5 minutos a algunas horas, no dias o semanas. Las MURP pueden disefarse de forma que solo contengan un unico grupo amino o un pequefo numero definido de grupos amino que pueden modificarse con agentes quelantes (tales como DOTA) para radioisotopos tales como tecnecio, indio e itrio (EXPAND). Procedimientos alternativos de conjugacion son mediante cadenas laterales de cisteina reservadas. Tales MURP

55 que llevan radionuclidos pueden emplearse para el tratamiento de tumores u otros tejidos enfermos, ademas de para la obtencion de imagenes.

[0189] Muchas proteinas farmaceuticamente activas o dominios de proteina pueden usarse como modelos efectores en MURP. Ejemplos son las siguientes proteinas, ademas de fragmentos de estas proteinas: citocinas, factores de crecimiento, enzimas, receptores, microproteinas, hormonas, eritropoyetina, adenosina desiminasa, asparaginasa, arginasa, interferon, hormona de crecimiento, hormona liberadora de hormona de crecimiento, G-CSF, GM-CSM, insulina, hirudina, receptor de TNF, uricasa, rasburicasa, axokine, RNAsa, ADNsa, fosfatasa, exotoxina de Pseudomonas, ricina, gelonina, desmoteplasa, laronidasa, trombina, enzima de coagulacion de la

5 sangre, VEGF, protropina, somatropina, alteplasa, interleucina, factor IIV, factor VIII, factor X, factor IX, dornasa, glucocerebrosidasa, folitropina, glucagon, tirotropina, nesiritida, alteplasa, teriparatida, agalsidasa, laronidasa, metioninasa.

[0190] MURP activada por proteasa: Para potenciar el indice terapeutico de un modulo efector pueden

10 insertarse secuencias labiles a proteasas en secuencias de URP que son sensibles a proteasas que se encuentran preferencialmente en suero o en el tejido diana que va a tratarse por la MURP. Este enfoque se ilustra en la Figura

9. Algunos disefos permiten construir proteinas que son selectivamente activadas cuando llegan a un tejido diana. Son de particular interes MURP que se activan en un sitio de enfermedad. Para facilitar tal activacion especifica para diana, secuencias de URP pueden unirse en estrecha proximidad al sitio activo o sitio de union a receptor del 15 modulo efector de forma que la proteina de fusion resultante tenga actividad biologica limitada. Es de particular interes la activacion de un modulo efector en un sitio tumoral. Muchos tejidos tumorales expresan proteasas a concentraciones relativamente altas y secuencias que son especificamente escindidas por estas proteasas tumorales pueden insertarse en secuencias de URP. Por ejemplo, la mayoria de los tejidos tumorales de la prostata contienen altas concentraciones de antigeno especifico de la prostata (PSA), que es una serina proteasa.

20 Profarmacos constituidos por un peptido labil a PSA conjugado con el farmaco contra el cancer doxorubicina han mostrado activacion selectiva en tejido de prostata [DeFeo-Jones, D. y col. (2000) Nat Med, 6: 1248]. De particular interes para activacion especifica para enfermedad son proteinas con actividad citostatica o citotoxica como TNFalfa, y muchas citocinas e interleucinas. Otra aplicacion es la activacion selectiva de proteinas en el sitio de inflamacion o en el sitio de virus o infeccion bacteriana.

25 [0191] Procedimientos de produccion -Las MURP que contienen secuencias de URP pueden producirse usando enfoques de biologia molecular que son muy conocidos en la materia. Estan disponibles una variedad de vectores de clonacion para diversos sistemas de expresion como celulas de mamifero, levadura y microbios. De particular interes como huespedes de expresion son E. coli, S. cerevisiae, P. pastoris y celulas de ovario de hamster

30 chino. Son de particular interes huespedes que han sido optimizados para ampliar su uso de codones. Es de particular interes un huesped que ha sido modificado para potenciar la expresion de GRS. Esto puede hacerse proporcionando ADN que codifica ARNt especificos para glicina. Ademas, puede manipularse el huesped de forma que se potencie la carga de ARNt especifico para glicina. El ADN que codifica la proteina potenciada puede ligarse operacionalmente a secuencias promotoras. El ADN que codifica la proteina potenciada, ademas del promotor

35 operacionalmente ligado, puede ser parte de un vector de plasmido, vector virico o puede insertarse en el cromosoma del huesped.

[0192] Para la produccion, el huesped puede cultivarse en condiciones que faciliten la produccion de la proteina potenciada. Son de particular interes condiciones que mejoran la produccion de GRS.

40 [0193] Las MURP objeto pueden adoptar una variedad de formatos. Por ejemplo, las MURP pueden contener URP que estan fusionados con proteinas farmaceuticamente activas para producir productos de lenta liberacion. Tales productos pueden inyectarse o implantarse localmente, por ejemplo, en o bajo la piel de un paciente. Debido a su gran radio hidrodinamico, el producto que contiene secuencias de URP se libera lentamente del sitio de inyeccion

45 o implantacion que conduce a una reduccion de la frecuencia de inyeccion o implantacion. Las secuencias de URP pueden disefarse para contener regiones que se unen a superficies celulares o tejido con el fin de prolongar la retencion local del farmaco en el sitio de inyeccion. Son de particular interes productos que contienen URP que pueden formularse como compuestos solubles, pero forman agregados o precipitados tras la inyeccion. Esta agregacion o precipitacion puede desencadenarse por un cambio en pH entre el producto formulado y el pH en el

50 sitio de inyeccion. Alternativas son productos que contienen URP que precipitan o forman agregados como resultado de un cambio en las condiciones redox. Todavia otro enfoque es un producto que contiene URP que se estabiliza en disolucion mediante la adicion de solutos no activos, pero que precipita o se agrega tras la inyeccion como resultado de la difusion de los solutos solubilizantes. Otro enfoque es disefar productos que contienen URP que contienen uno o multiples residuos de lisina o cisteina en su secuencia de URP y que pueden reticularse antes de la inyeccion.

55 [0194] Si se desea, la MURP es monomerica (que aqui significa no reticulada) cuando se fabrica y se formula y cuando se inyecta, pero despues de la inyeccion subcutanea la proteina empieza a reticularse consigo mismo o con proteinas humanas nativas, formando un polimero bajo la piel del cual las moleculas de farmaco activas se liberan solo muy gradualmente. Tal liberacion puede ser por reduccion del enlace disulfuro o barajado de disulfuros como se ilustra en la Fig. 18, o puede mediarse por la proteolisis como se muestra en la Fig. 19, liberando fragmentos activos en la circulacion. Es importante que estos fragmentos activos sean suficientemente grandes para tener una larga semivida, debido a que cuanto mas larga sea su semivida de secrecion, menor podra ser la dosis de la proteina liberada, permitiendo el uso de una menor dosis de producto que va a inyectarse o un tiempo prolongado

5 entre inyecciones.

[0195] Un enfoque que ofrece estas ventajas es la reticulacion mediada por disulfuro de proteinas. Por ejemplo, un farmaco de proteina se fabricaria con un peptido ciclico en el (uno o mas). Este peptido ciclico puede o puede no participar en la union a la diana. Esta proteina se fabrica con el peptido ciclico formado, es decir, en forma 10 oxidada, para simplificar la purificacion. Sin embargo, el producto se reduce luego y se formula para mantener la proteina en forma reducida. Es importante que el peptido ciclico se reduzca a una baja concentracion de agente reductor, tal como ditiotreitol 0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0 o 8,0 mM o beta-mercaptoetanol o cisteina o agente reductor equivalente, de manera que el peptido ciclico pueda reducirse sin reducir otros modulos de proteina que contienen disulfuro en el producto. Se prefiere el uso de agentes reductores aprobados por la FDA, tales como cisteina o 15 glutation. Despues de la inyeccion subcutanea, el agente reductor de bajo peso molecular difunde rapidamente o se neutraliza por proteinas humanas, exponiendo el farmaco a un ambiente oxidante, a la vez que esta a alta concentracion molar, produciendo reticulacion de cisteinas localizadas sobre diferentes cadenas de proteina, que conducen a polimerizacion del farmaco en el sitio de inyeccion. Cuanto mayor sea la distancia entre las cisteinas en el peptido ciclico, y mayor sea la concentracion de farmaco, mayor sera el grado de polimerizacion del farmaco, ya 20 que la polimerizacion compite con la re-formacion de peptido ciclico. Con el tiempo, la reduccion y oxidacion del disulfuro producira re-barajado de disulfuro, que conducira a la re-formacion de peptido ciclico y monomerizacion y re-solubilizacion del farmaco. La liberacion del farmaco del polimero tambien puede producirse mediante proteolisis, que podria ser elegida como diana y controlarse o aumentarse formando sitios de escision para proteasas del suero. La reticulacion de las proteinas tambien podria realizarse con un agente de reticulacion quimico de proteina-proteina

25 tal como los enumerados en la [Tabla x]. Idealmente, este es un agente ya aprobado por la FDA, tal como aquellos usados para la conjugacion de vacunas o conjugacion de productos quimicos con proteinas.

[0196] En lugar de usar disulfuros, tambien pueden estabilizarse proteinas contra la degradacion proteolitica usando una amplia variedad de agentes de reticulacion. La mayoria de los siguientes agentes son comercializados

30 por Pierce Chemicals bajo el mismo nombre e instrucciones para su uso estan disponibles en linea (www.piercenet.com). Los agentes que producen la misma distancia cadena a cadena como se ha obtenido con disulfuros son los que mas probablemente seran utiles para la presente aplicacion. Los agentes de ligador corto tales como DFDNB son los mas prometedores. La distancia entre cadenas puede determinarse facilmente a partir de las estructuras de los productos quimicos como se muestra en www.piercenet.com.

35 [0197] Hay un gran numero de productos quimicos especificos que funcionan basandose en el siguiente numero pequefo de esquemas de reaccion basicos, todos los cuales se describen en detalle en www.piercenet.com. Ejemplos de agentes de reticulacion utiles son imidoesteres, halogenos activos, maleimida, disulfuro de piridilo, ester de NHS. Los agentes de reticulacion homobifuncionales tienen dos grupos reactivos identicos y se usan

40 frecuentemente en un procedimiento de reticulacion quimica de una etapa. Ejemplos son BS3 (un analogo de DSS soluble en agua no escindible), BSOCOES (de bases reversibles), DMA (adipimidato de dimetilo-2HCl), DMP (pimelimidato de dimetilo-2HCl), DEM (suberimidato de dimetilo-2HCl), DSG (analogo de 5 carbonos de DSS), DSP (reactivo de Lomant), DSS (no escindible), DST (escindible por agentes de oxidacion), DTBP (3,3'ditiobispropionimidato de dimetilo-2HCl), DTSSP, EGS, Sulfo-EGS, THPP, TSAT, DFDNB (1,5-difluoro-2,4

45 dinitrobenceno) es especialmente util para reticular entre pequefas distancias espaciales (Kornblatt, J.A. y Lake,

D.F. (1980). Cross-linking of cytochrome oxidase subunits with difluorodinitrobenzene. Can J. Biochem. 58, 219-224).

[0198] Los agentes de reticulacion homofuncionales reactivos con sulfhidrilo que son reticulantes de proteinas homobifuncionales que reaccionan con sulfhidrilos se basan frecuentemente en maleimidas, que reaccionan con 50 grupos -SH a pH 6,5-7,5, formando enlaces tioeter estables. BM[PEO]3 es un espaciador de polieter de 8 atomos que reduce las posibilidades de precipitacion de conjugados en aplicaciones de reticulacion de sulfhidrilo con sulfhidrilo. BM[PEO]4 es similar, pero con un espaciador de 11 atomos. BMB es un reticulante no escindible con un espaciador de cuatro carbonos. BMDB forma un enlace que puede escindirse con peryodato. BMH es un reticulante reactivo con sulfhidrilo homobifuncional ampliamente usado. BMOE tiene un ligador especialmente corto. DPDPB y 55 DTME son reticulantes escindibles. HVBS no tiene el potencial de hidrolisis de las meleimidas. TMEA es otra opcion. Los agentes reticulantes heterobifuncionales tienen dos grupos reactivos diferentes. Ejemplos son esteres de NHS y aminas/hidracinas mediante activacion de EDC, AEDP, ASBA (fotorreactivo, yodable), EDC (carbodiimida soluble en agua). Los reticulantes bifuncionales reactivos con amina-sulfhidrilo son AMAS, APDP, BMPS, EMCA, EMCS, GMBS, KMUA, LC-SMCC, LC-SPDP, MBS, SBAP, SIA (extra-corto), SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, SMPT, SPDP,

sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-KMUS, Sulfo-LC-SMPT, Sulfo-LC-SPDP, Sulfo-MBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMCC, Sulfo-SMPB. Agentes de reticulacion heterobifuncionales reactivos con grupos amino son ANB-NOS, MSA, NHS-ASA, SADP, SAED, SAND, SANPAH, SASD, SFAD, Sulfo-HSAB, Sulfo-NHS-LC-ASA, Sulfo-SADP, Sulfo-SANPAH, TFCS.

5 [0199] El farmaco marcado con una marca de His6 tiene un formato de liberacion lenta diferente, que se mezcla y co-inyecta con perlas conjugadas con niquel-acido nitrilotriacetico (perlas Ni-NTA), una version de GMO de las que estan disponibles de Qiagen. El farmaco se liberaria lentamente de las perlas, proporcionando liberacion controlada y lenta como se ilustra en la Fig. 20. Las perlas son opcionales y pueden sustituirse por un niquel-acido

10 nitrilotriacetico polimerico reticulado que conduce a ensamblaje de un polimero incluso mayor.

[0200] Las secuencias de URP pueden contener secuencias que son conocidas por formar multimeros como alfa2D [Hill, R, y col. (1998) J Am Chem Soc, 120: 1138-1145] que se utilizo para dimerizar un fragmento de anticuerpo [Kubetzko, S. y col. (2005) Mol Pharmacol, 68: 1439-54]. Ejemplos de un peptido de homodimerizacion

15 util es la secuencia SKVILFE. Un ejemplo de secuencias de heterodimerizacion utiles son el peptido ARARAR que puede formar dimeros con la secuencia DADADA y secuencias relacionadas. La multimerizacion puede mejorar la funcion biologica de una molecula aumentando su avidez y puede influir en las propiedades farmacocineticas y distribucion de tejido de las MURP resultantes.

20 [0201] Los quot;modulos de multimerizacionquot; son secuencias de aminoacidos que facilitan la formacion de dimeros o multimeros de MURP. Los modulos de multimerizacion pueden unirse a si mismos para formar dimeros o multimeros. Alternativamente, los modulos de multimerizacion pueden unirse a otros modulos de la MURP. Estas pueden ser cremalleras de leucina o peptidos pequefos como derivados del activador de la cabeza de la hidra (similares a SKVILF) que forman homopolimeros antiparalelos, o peptidos como RARARA y DADADA, que forman

25 heteropolimeros antiparalelos de alta afinidad. Usando una, dos o mas copias de estos peptidos puede forzarse la formacion de dimeros de proteina, multimeros lineales o multimeros ramificados.

[0202] La afinidad de la asociacion puede confeccionarse cambiando el tipo, longitud y composicion de los peptidos. Algunas aplicaciones requieren peptidos que forman homodimeros como se ilustra en la Fig. 21. Otras

30 aplicaciones requieren heterodimeros. En algunos casos, una vez asociados, los peptidos pueden bloquearse in situ formando enlaces disulfuro entre las dos cadenas de proteina, normalmente a cualquier lado de los peptidos. Los modulos de multimerizacion son utiles para enlazar juntas dos moleculas de MURP (cabeza con cola, cabeza con cabeza, o cola con cola) como se ilustra en la Fig. 21. Los modulos de multimerizacion pueden localizarse en cualquiera del extremo N o C con el fin de formar dimeros. Si los modulos de multimerizacion estan presentes en

35 ambos extremos, se formaran multimeros lineales largos. Si mas de dos modulos de multimerizacion estan presentes por proteina, pueden formarse redes polimericas ramificadas. Los conceptos de multimerizacion y conjugacion quimica pueden combinarse conduciendo a utiles para la extension de la semivida y formacion de deposito, conduciendo a lenta liberacion del farmaco activo del deposito o sitio de inyeccion como se ilustra en la Fig. 23.

40 [0203] Las MURP objeto pueden incorporar un URP generico o universal. Un enfoque es expresar un URP que contiene un modulo de URP largo, que proporciona semivida y contiene multiples (normalmente 4-10) lisinas (u otros sitios) que permiten la conjugacion especifica para sitio de peptidos (es decir, lineales, ciclicos, 2SS, 3SS, etc.) que se unen a una diana especifica. La ventaja de este enfoque es que el modulo de URP es generico y puede

45 conjugarse con cualquier peptido especifico para diana. Idealmente, el enlace del peptido especifico para diana con el URP es un enlace dirigido, de manera que los residuos sobre el URP solo pueden reaccionar con un residuo sobre el peptido especifico para diana y el acoplamiento exhaustivo solo puede producir una unica especie, que es, por ejemplo, un URP que esta ligado a un peptido en cada lisina. Este complejo se comporta como un multimero de alta avidez en sus propiedades de union, pero es simple de fabricar. Este enfoque se ilustra en la Fig. 24.

50 [0204] Las MURP objeto tambien pueden incorporar URP para efectuar la administracion a traves de barreras de tejido. Los URP pueden manipularse para potenciar la administracion a traves de las barreras dermica, oral, bucal, intestinal, nasal, hematoencefalica, pulmonar, tecal, peritoneal, rectal, vaginal o muchas otras barreras de tejido.

55 [0205] Uno de los obstaculos clave para la administracion de proteinas orales es la sensibilidad de la mayoria de las proteinas a proteasas en el aparato digestivo. La conjugacion con secuencias de URP puede mejorar la resistencia a proteasas de proteinas farmaceuticamente activas y asi facilitar su captacion. Se ha mostrado que la captacion de proteinas en el aparato digestivo puede mejorarse afadiendo vehiculos moleculares. La funcion

principal de estos vehiculos es una mejora de la permeabilidad de la membrana [Stoll, B. R. y col. (2000) J Control Release, 64: 217-28]. Asi, pueden incluirse secuencias en secuencias de URP que mejoran la permeabilidad de la membrana. Muchas secuencias que mejoran la permeabilidad de la membrana son conocidas y ejemplos son secuencias ricas en arginina [Takenobu, T. y col. (2002) Mol Cancer The, 1: 1043-9]. Asi, pueden disefarse 5 secuencias de URP que mejoran la captacion celular u oral de proteinas combinando dos funciones, una reduccion en la degradacion proteolitica de la proteina de interes, ademas de un aumento en la permeabilidad de la membrana del producto de fusion. Opcional, puede afadirse secuencia a la secuencia de URP que es sensible a una proteasa que esta preferencialmente localizada en el tejido diana para el farmaco de interes, pero es estable a proteasas en el tubo digestivo. Ejemplos de tales secuencias de URP son secuencias que contienen regiones largas de GRS,

10 ademas de secuencias que son ricas en aminoacidos basicos, en particular arginina, y facilitan la transferencia de la membrana. URP puede utilizarse de un modo similar para mejorar la captacion de proteinas mediante las vias intranasal, intrapulmonar, u otras vias de administracion.

Ejemplos de productos especificos:

15 [0206] Agonista de DR4/DR5 - DR4 y DR5 son receptores de muerte que se expresan en muchas celulas tumorales. Estos receptores pueden desencadenarse por trimerizacion, que conduce a muerte celular y regresion tumoral. Los dominios de union con especificidad por DR4 o DR5 pueden obtenerse por inmunopurificacion de fago u otros procedimientos de visualizacion: Estos dominios especificos de union a DR4 o DR5 pueden multimerizarse

20 usando modulos de URP como ligadores como se ilustra en la Figura 12. Son de particular interes MURP que contienen tres o mas modulos de union con especificidad por DR4 o DR5 o ambos. Como se ilustra en la Figura 12, las MURP pueden contener modulos de union adicionales con especificidad por antigenos de tumor que se expresan en exceso en tejidos tumorales. Esto permite construir MURP que se acumulan especificamente en tejido tumoral y desencadenan muerte celular. Las MURP pueden contener modulos que se unen a o bien DR4 o a DR5.

25 Son de particular interes MURP que contienen modulos de union que se unen tanto a DR4 como a DR5.

[0207] Interleucina 2 elegida como diana por tumor - La interleucina 2 (IL2) es una citocina que puede potenciar la respuesta inmunitaria a tejido tumoral. Sin embargo, la terapia con IL2 sistemica se caracteriza por efectos secundarios significativos. Las MURP pueden construirse de forma que combinen dominios de union con 30 especificidad por antigenos de tumor e IL2 como modulo efector como se ilustra en la Figura 13. Tales MURP pueden acumularse selectivamente en tejido tumoral y asi provocar una respuesta inmunitaria selectiva para tumor, a la vez que se minimizan los efectos secundarios sistemicos de la terapia con citocinas. Tales MURP pueden elegir como diana una variedad de antigenos de tumor como EpCAM, Her2, CEA, EGFR, antigeno de Thomsen-Friedenreich. Son de particular utilidad MURP que se unen a antigenos de tumor que muestran lenta internalizacion. 35 Pueden disefarse MURP similares usando otras citocinas o factor de necrosis tumoral-alfa como modulos efectores.

[0208] Asparaginasa selectiva para tumor -La asparaginasa se usa para tratar pacientes con leucemia aguda. Tanto la asparaginasa de E. coli como la asparaginasa de Errinia se usan para tratamiento. Ambas enzimas pueden conducir a inmunogenicidad y reacciones hipersensibles. Oncaspar es la version PEGilada de la 40 asparaginasa que tiene inmunogenicidad reducida. Sin embargo, la proteina es dificil de fabricar y se administra como una mezcla de isomeros. La adicion de secuencias de URP a los extremos y/o a bucles internos permite la fabricacion recombinante directa de una variante de asparaginasa que es homogenea y tiene baja inmunogenicidad. Pueden compararse diversas secuencias de URP y sitios de union para determinar la posicion optima para la union a secuencia de URP. Varias otras enzimas que pueden degradar aminoacidos han informado actividad antitumoral. 45 Ejemplos son arginasa, metioninasa, fenilalanina amoniaco liasa y triptofanasa. Es de particular interes la fenilalanina amoniaco liasa de Streptomyces maritimus, que tiene una alta actividad especifica y no requiere un cofactor [Calabrese, J. C. y col. (2004) Biochemistry, 43: 11403-16]. La mayoria de estas enzimas son de origen bacteriano u otro origen no humano y es probable que provoquen reacciones inmunitarias. La inmunogenicidad de estas enzimas puede reducirse afadiendo una o mas secuencias de URP. Ademas, el indice terapeutico y las

50 propiedades PK de estas enzimas pueden mejorarse aumentando su radio hidrodinamico como resultado de union a secuencias de URP.

[0209] Las MURP objeto pueden disefarse para elegir como diana cualquier proteina celular. Una lista no limitante se proporciona a continuacion.

55 [0210] VEGF, VEGF-R1, VEGF-R2, VEGF-R3, Her-1, Her-2, Her-3, EGF-1, EGF-2, EGF-3, Alfa3, cMet, ICOS, CD40L, LFA-1, c-Met, ICOS, LFA-1, IL-6, B7,1, B7,2, OX40, IL-lb, TACI, IgE, BAFF o BLys, TPO-R, CD19, CD20, CD22, CD33, CD28, IL-1-R1, TNFα, TRAIL-R1, receptor 1 del complemento, FGFa, osteopontina, vitronectina, efrina A1-A5, efrina B1-B3, alfa-2-macroglobulina, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CXCL8, CXCL9,

CXCL10, CXCL11, CXCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CXCL16, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, PDGF, TGFb, GMCSF, SCF, p40 (IL12/IL23), IL1b, IL1a, IL1ra, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL8, IL10, IL12, IL15, IL23, Fas, FasL, ligando Flt3, 41BB, ACE, ACE-2, KGF, FGF-7, SCF, netrina 1, 2, IFNa, b, g, caspasa 2, 3, 7, 8, 10, ADAM S1, S5, 8, 9, 15, TS1, TS5; adiponectina, ALCAM, ALK-1, APRIL, anexina V, angiogenina, anfiregulina, 5 angiopoyetina 1, 2, 4, B7-1/CD80, B7-2/CD86, B7-H1, B7-H2, B7-H3, Bc1-2, BACE-1, BAK, BCAM, BDNF, bNGF, bECGF, BMP2, 3, 4, 5, 6, 7, 8; CRP, cadherina 6, 8, 11; catepsina A, B, C, D, E, L, S, V, X; CD11a/LFA-1, LFA-3, GP2b3a, receptor de GH, proteina RSV F, IL-23 (p40, p19), IL-12, CD80, CD86, CD28, CTLA-4, α4β1, α4β7, TNF/linfotoxina, IgE, CD3, CD20, IL-6, IL-6R, BLYS/BAFF, IL-2R, HER2, EGFR, CD33, CD52, digoxina, Rho (D), varicela, hepatitis, CMV, tetanos, variolovacuna, antidoto, bolutinica, Trail-R1, Trail-R2, cMet, familia de TNF-R, tal 10 como LA NGF-R, CD27, CD30, CD40, CD95, receptor de linfotoxina a/b, Wsl-1, TL1A/TNFSF15, BAFF, BAFF-R/TNFRSF13C, TRAIL R2/TNFRSF10B, TRAIL R2/TNFRSF10B, Fas/TNFRSF6 CD27/TNFRSF7, DR3/TNFRSF25, HVEM/TNFRSF14, TROY/TNFRSF19, ligando CD40/TNFSF5, BCMA/TNFRSF17, CD30/TNFRSF8, LIGHT/TNFSF14, 4-1BB/TNFRSF9, CD40/TNFRSF5, GITR/TNFRSF18, osteoprotegerina/TNFRSF11B, RANK/TNFRSF11A, TRAIL R3/TNFRSF10C, TRAIL/TNFSF10, TRANCE/RANK L/TNFSF11, 4-1BB 15 Ligando/TNFSF9, TWEAK/TNFSF12, ligando CD40/TNFSF5, ligando Fas/TNFSF6, RELT/TNFRSF19L, APRIL/TNFSF13, DcR3/TNFRSF6B, TNF RI/TNFRSF1A, TRAIL R1/TNFRSF10A, TRAIL R4/TNFRSF10D, ligando CD30/TNFSF8, ligando GITR/TNFSF18, TNFSF18, TACI/TNFRSF13B, NGF R/TNFRSF16, ligando OX40/TNFSF4, TRAIL R2/TNFRSF10B, TRAIL R3/TNFRSF10C, TWEAK R/TNFRSF12, BAFF/BLyS/TNFSF13, DR6/TNFRSF21, TNF-alfa/TNFSF1A, Pro-TNFalfa/TNFSF1A, R de linfotoxina beta/TNFRSF3, quimera de R de linfotoxina beta

20 (LTbR)/Fc, TNF RI/TNFRSF1A, TNF-beta/TNFSF1B, PGRP-S, TNF RI/TNFRSF1A, TNF RII/TNFRSF1B, EDA-A2, TNF-alfa/TNFSF1A, EDAR, XEDAR, TNF RI/TNFRSF1A.

[0211] Son de particular interes proteinas diana humana que estan comercialmente disponibles en forma purificada. Ejemplos son: 4EBP1, 14-3-3 zeta, 53BP1, 2B4/SLAMF4, CCL21/6Ccina, 4-1BB/TNFRSF9, 8D6A, 25 ligando 4-1BB/TNFSF9, 8-oxo-dG, 4-amino-1,8-naftalimida, A2B5, aminopeptidasa LRAP/ERAP2, A33, aminopeptidasa N/ANPEP, Aag, aminopeptidasa P2/YPNPEP2, ABCG2,aminopeptidasa P1/XPNPEP1, ACE, aminopeptidasa PILS/ARTS1, ACE-2, Amnionless, actina, anfiregulina, beta-actina, AMPK alfa 1/2, activina A, AMPK alfa 1, activina AB, AMPK alfa 2, activina B, AMPK beta 1, activina C, AMPK beta 2, activina RIA/ALK-2, R de androgenos/NR3C4, activina RIB/ALK-4, angiogenina, activina RIIA, angiopoyetina-1, activina RIIB, angiopoyetina-2, 30 ADAM8, angiopoyetina-3, ADAM9, angiopoyetina-4, ADAM10, 1 similar a angiopoyetina, ADAM12, 2 similar a angiopoyetina, ADAM15, 3 similar a angiopoyetina, TACE/ADAM17, 4 similar a angiopoyetina, ADAM19, 7 similar a angiopoyetina/CDT6, ADAM33, angiostatina, ADAMTS4, anexina A1/anexina I, ADAMTS5, anexina A7, ADAMTS1, anexina A10, ADAMTSL-1/punctina, anexina V, adiponectina/Acrp30, ANP, AEBSF, sitio AP, agrecano, APAJF-1, agrina, APC, AgRP, APE, AGTR-2, APJ, AIF, APLP-1, Akt, APLP-2, Akt1, apolipoproteina AI, Akt2, apolipoproteina 35 B, Akt3, APP, albumina de suero, APRIL/TNFSF13, ALCAM, ARC, ALK-1, artemina, ALK-7, arilsulfatasa A/ARSA, fosfatasa alcalina, ASAH2/N-acilesfingosina amidohidrolasa-2, alfa 2u-globulina, ASC, glicoproteina alfa-1-acida, ASGR1, alfa-fetoproteina, ASK1, ALS, ATM, ameloblastina, ATRIP, AMICA/JAML, Aurora A, AMIGO, Aurora B, AMIGO2, axina-1, AMIGO3, Axl, aminoacilasa/ACY1, azurocidina/CAP37/HBP, aminopeptidasa A/ENPEP, B4 gALT1, BIM, B7-1/CD80, 6-biotina-17-NAD, B7-2/CD86, BLAME/SLAMF8, B7-H1/PD-L1, CXCL13/BLC/BCA-1, B740 H2, BLIMP1, B7-H3, Blk, B7-H4, BMI-1, BACE-1, BMP-1/PCP, BACE-2, BMP-2, Bad, BMP-3, BAFF/TNFSF13B, BMP-3b/GDF-10, BAFF R/TNFRSF13C, BMP-4, Bag-1, BMP-5, BAK, BMP-6, BAMBI/NMA, BMP-7, BARD1, BMP-8, Bax, BMP-9, BCAM, BMP-10, Bcl-10, BMP-15/GDF-9B, Bcl-2, BMPR-IA/ALK-3, proteina A1 relacionada con Bcl-2, BMPR-IB/ALK-6, Bcl-w, BMPR-II, Bcl-x, BNIP3L, Bcl-xL, BOC, BCMA/TNFRSF17, BOK, BDNF, BPDE, benzamida, Brachyury, cadena beta comun, B-Raf, beta IG-H3, CXCL14/BRAK, betacelulina, BRCA1, beta-defensina 2, BRCA2, 45 BID, BTLA, biglicano, Bub-1, proteina asesina similar a Bik, c-jun, CD90/Thy1, c-Rel, CD94, CCL6/C10, CD97, Clq R1/CD93, CD151, ClqTNF1, CD160, ClqTNF4, CD163, ClqTNF5, CD164, componente del complemento C1r, CD200, componente del complemento C1s, CD200 R1, componente del complemento C2, CD229/SLAMF3, componente del complemento C3a, CD23/Fc epsilon RII, componente del complemento C3d, CD2F-10/SLAMF9, componente del complemento C5a, CD5L, cadherina-4/R-cadherina, CD69, cadherina-6, CDC2, cadherina-8, 50 CDC25A, cadherina-11, CDC25B, cadherina-12, CDCP1, cadherina-13, CDO, cadherina-17, CDX4, E-cadherina, CEACAM-1/CD66a, N-cadherina, CEACAM-6, P-cadherina, Cerberus 1, VE-cadherina, CFTR, calbindina D, cGMP, calcineurina A, Chem R23, calcineurina B, Chemerin, calreticulina-2, envases de muestreo de quimiocinas, CaM cinasa II, 1 similar a quitinasa 3, cAMP, quitotriosidasa/CHITI, R1 de cannabinoide; Chk1, R2 de cannabinoide/CB2/CNR2, Chk2, CAR/NR1I3, CHL-1/L1CAM-2, anhidrasa carbonica I, colina acetiltransferasa/ChAT, 55 anhidrasa carbonica II, condrolectina, anhidrasa carbonica III, cordina, anhidrasa carbonica IV, 1 similar a cordina, anhidrasa carbonica VA, 2 similar a cordina, anhidrasa carbonica VB, CINC-1, anhidrasa carbonica VI, CINC-2, anhidrasa carbonica VII, CINC-3, anhidrasa carbonica VIII, claspina, anhidrosa carbonica IX, claudina-6, anhidrasa carbonica X, CLC, anhidrasa carbonica XII, CLEC-1, anhidrasa carbonica XIII, CLEC-2, anhidrasa carbonica XIV, CLECSF13/CLEC4F, carboximetil lisina, CLECSFB, carboxipeptidasa A1/CPA1, CLF-1, carboxipeptidasa A2, CLP1/COLEC12, carboxipeptidasa A4, clusterina, carboxipeptidasa B1, 1 similar a clusterina, carboxipeptidasa E/CPE, CMG-2, carboxipeptidasa X1, CMV UL146, cardiotropina-1, CMV UL147, carnosina dipeptidasa 1, CNP, caronte, CNTF, CART, CNTF R alfa, caspasa, factor de coagulacion II/trombina, caspasa-1, factor de coagulacion III/factor tisular, caspasa-2, factor de coagulacion VII, caspasa-3, factor de coagulacion X, caspasa-4, factor de coagulacion 5 XI, caspasa-6, factor de coagulacion XIV/proteina C, caspasa-7, COCO, caspasa-8, cohesina, caspasa-9, colageno 1, caspasa-10, colageno II, caspasa-12, colageno IV, caspasa-13, cadena gamma comun/IL-2 R gamma, inhibidores de peptidos de caspasa, COMP/trombospondina-5, catalasa, componente del complemento C1rLP, beta-catenina, componente del complemento ClqA, catepsina 1, componente del complemento C1qC, catepsina 3, factor D del complemento, catepsina 6, factor I del complemento, catepsina A, complemento MASP3, catepsina B, conexina 43, 10 catepsina C/DPPI, contactina-1, catepsina D, contactina-2/TAG1, catepsina E, contactina-4, catepsina F, contactina5, catepsina H, corina, catepsina L, comulina, catepsina O, CORS26/ClqTNF,3, catepsina S, citoblastos corticales de rata, catepsina V, cortisol, catepsina X/Z/P, COUP-TF I/NR2F1, CBP, COUP-TF II/NR2F2, CCI, COX-1, CCK-A R, COX-2, CCL28, CRACC/SLAMF7, CCR1, proteina C reactiva, CCR2, creatina cinasa, musculo/CKMM, CCR3, creatinina, CCR4, CREB, CCR5, CREG, CCR6, CRELD1, CCR7, CRELD2, CCR8, CRHBP, CCR9, CRHR-1, 15 CCR10, CRIM1, CD155/PVR, Cripto, CD2, CRISP-2, CD3, CRISP-3, CD4, Crossveinless-2, CD4+/45RA-, CRTAM, CD4+/45RO-, CRTH-2, CD4+/CD62L-/CD44, CRY1, CD4+/CD62L+/CD44, criptico, CD5, CSB/ERCC6, CD6, CCL27/CTACK, CD8, CTGF/CCN2, CD8+/45RA-, CTLA-4, CD8+/45RO-, cubilina, CD9, CX3CR1, CD14, CXADP, CD27/TNFRSF7, CXCL16, ligando CD27/TNFSF7, CXCR3, CD28, CXCR4, CD30/TNFRSF8, CXCR5, ligando CD30/TNFSF8, CXCR6, CD31/PECAM-1, ciclofilina A, CD34, Cyr61/CCN1, CD36/SR-B3, cistatina A, CD38, 20 cistatina B, CD40/TNFRSF5, cistatina C, ligando CD40/TNFSF5, cistatina D, CD43, cistatina E/M, CD44, cistatina F, CD45, cistatina H, CD46, cistatina H2, CD47, cistatina S, CD48/SLAMF2, cistatina SA, CD55/DAF, cistatina SN, CD58/LFA-3, citocromo c, CD59, apocitocromo c, CD68, holocitocromo c, CD72, citoqueratina 8, CD74, citoqueratina 14, CD83, citoqueratina 19, CD84/SLAMF5, citonina, D6, DISP1, DAN, Dkk-1, DANCE, Dkk-2, DARPP-32, Dkk-3, DAX1/NR0B1, Dkk-4, DCC, DLEC, DCIR/CLEC4A, DLL1, DCAR, DLL4, DcR3/TNFRSF6B, d-luciferina, DC-SIGN, 25 ADN ligasa IV, DC-SIGNR/CD299, ADN polimerasa beta, DcTRAIL R1/TNFRSF23, ADNM-1, DcTRAIL R2/TNFRSF22, ADN-PKcs, DDR1, DNER, DDR2, dopa descarboxilasa/DDC, DEC-205, DPCR-1, decapentaplegico, DPP6, decorina, DPPA4, dectina-1/CLEC7A, DPPA5/ESG1, dectina-2/CLEC6A, DPPII/QPP/DPP7, DEP-1/CD148, DPPIV/CD26, Desert Hedgehog, DR3/TNFRSF25, desmina, DR6/TNFRSF21, desmogleina-1, DSCAM, desmogleina-2, DSCAM-L1, desmogleina-3, DSPG3, Dishevelled-1, Dtk, Dishevelled-3, dinamina, EAR2/NR2F6, 30 EphA5, ECE-1, EphA6, ECE-2, EphA7, ECF-L/CHL3L3, EphA8, ECM-1, EphB1, ecotina, EphB2, EDA, EphB3, EDA-A2, EphB4, EDAR, EphB6, EDG-1, efrina, EDG-5, efrina-A1, EDG-8, efrina-A2, eEF-2, efrina-A3, EGF, efrina-A4, EGF R, efrina-A5, EGR1, efrina-B, EG-VEGF/PK1, efrina-B1, eIF2 alfa, efrina-B2, eIF4E, efrina-B3, Elk-1, epigen, EMAP-II, epimorfina/sintaxina 2, EMMPRIN/CD147, epiregulina, CXCL5/ENA, EPR-1/receptor Xa, endocano, ErbB2, endoglina/CD105, ErbB3, endoglicano, ErbB4, endonucleasa III, ERCC1, endonucleasa IV, ERCC3, endonucleasa 35 V, ERK1/ERK2, endonucleasa VIII, ERK1, endorepelina/perlecano, ERK2, endostatina, ERK3, endotelina-1, ERK5/BMK1, Engrailed-2, ERR alfa/NR3B1, EN-RAGE, ERR beta/NR3B2, enteropeptidasa/enterocinasa, ERR gamma/NR3B3, CCL11/eotaxina, eritropoyetina, CCL24/eotaxina-2, eritropoyetina R, CCL26/eotaxina-3, ESAM, EpCAM/TROP-1, ER alfa/NR3A1, EPCR, ER beta/NR3A2, Eph, exonucleasa III, EphA1, 2 similar a exostosina/EXTL2, EphA2, 3 similar a exostosina /EXTL3, EphA3, FABP1, FGF-BP, FABP2, FGF R1-4, FABP3, FGF 40 R1, FABP4, FGF R2, FABP5, FGF R3, FABP7, FGF R4, FABP9, FGF R5, factor B del complemento, Fgr, FADD, FHR5, FAM3A, fibronectina, FAM3B, ficolina-2, FAM3C, ficolina-3, FAM3D, FITC, proteina alfa de activacion de fibroblastos/FAP, FKBP38, Fas/TNFRSF6, Flap, ligando Fas /TNFSF6, FLIP, FATP1, FLRG, FATP4, FLRT1, FATP5, FLRT2, Fc gamma RI/CD64, FLRT3, Fc gamma RIIB/CD32b, Flt-3, Fc gamma RIIC/CD32c, ligando Flt-3, Fc gamma RIIA/CD32a, folistatina, Fc gamma RIII/CD16, 1 similar a folistatina, FcRH1/IRTA5, FosB/G0S3, FcRH2/IRTA4, 45 FoxD3, FcRH4/IRTA1, FoxJ1, FcRH5/IRTA2, FoxP3, 3 similar a receptor Fc/CD16-2, Fpg, FEN-1, FPR1, fetuina A, FPRL1, fetuina B, FPRL2, FGF acido, CX3CL1/fractalcina, FGF basico, Frizzled-1, FGF-3, Frizzled-2, FGF-4, Frizzled-3, FGF-5. Frizzled-4, FGF-6, Frizzled-5, FGF-8, Frizzled-6, FGF-9, Frizzled-7, FGF-10, Frizzled-8, FGF-11, Frizzled-9, FGF-12, Frk, FGF-13, sFRP-1, FGF-16, sFRP-2, FGF-17, sFRP-3, FGF-19, sFRP-4, FGF-20, furina, FGF-21, FXR/NR1H4, FGF-22, Fyn, FGF-23, G9a/EHMT2, GFR alfa-3/GDNF R alfa-3, GABA-A-R alfa 1, GFR alfa50 4/GDNF R alfa-4, GABA-A-R alfa 2, GITR/TNFRSF18, GABA-A-R alfa 4, ligando GITR/TNFSF18, GABA-A-R alfa 5, GLI-1, GABA-A-R alfa 6, GLI-2, GABA-A-R beta 1, GLP/EHMT1, GABA-A-R beta 2, GLP-1 R, GABA-A-R beta 3, glucagon, GABA-A-R gamma 2, glucosamina (N-acetil)-6-sulfatasa/GNS, GABA-B-R2, GluR1, GAD1/GAD67, GluR2/3, GAD2/GAD65, GluR2, GADD45 alfa, GluR3, GADD45 beta, Glut1, GADD45 gamma, Glut2, galectina-1, Glut3, galectina-2, Glut4, galectina-3, Glut5, galectina-3 BP, glutaredoxina 1, galectina-4, glicina R, galectina-7, 55 glicoforina A, galectina-8, glipicano 2, galectina-9, glipicano 3, GaINAc4S-6ST, glipicano 5, GAP-43, glipicano 6, GAPDH, GM-CSF, Gas1, GM-CSF R alfa, Gas6, GMF-beta, GASP-1/WFIKKNRP, gp130, GASP-2/WFIKKN, glicogeno fosforilasa BB/GPBB, GATA-1, GPR15, GATA-2, GPR39, GATA-3, GPVI, GATA-4, GR/NR3C1, GATA-5, Gr-1/Ly-6G, GATA-6, granulisina, GBL, granzima A, GCNT/NR6A 1, granzima B, CXCL6/GCP-2, granzima D, G-CSF, granzima G, G-CSF R, granzima H, GDF-1, GRASP, GDF-3 GRB2, GDF-5, gremlina, GDF-6, GRO, GDF-7, CXCL1/GRO alfa, GDF-8, CXCL2/GRO beta, GDF-9, CXCL3/GRO gamma, GDF-11, hormona de crecimiento, GDF15, hormona de crecimiento R, GDNF, GRP75/HSPA9B, GFAP, GSK-3 alfa/beta, GFI-1, GSK-3 alfa, GFR alfa-1/GDNF R alfa-1, GSK-3 beta, GFR alfa-2/GDNF R alfa-2, EZFIT, H2AX, histidina, H60, HM74A, HAI-1, HMGA2, HAI-2, HMGB1, HAI-2A, TCF-2/HNF-1 beta, HAI-2B, HNF-3 beta/FoxA2, HAND1, HNF-4 alfa/NR2A1, HAPLN1, 5 HNF-4 gamma/NR2A2, proteasa similar a tripsina de las vias respiratorias/HAT, HO-1/HMOX1/HSP32, HB-EGF, HO-2/HMOX2, CCL14a/HCC-1, HPRG, CCL14b/HCC-3, Hrk, CCL16/HCC-4, HRP-1, alfa HCG, HS6ST2, Hck HSD1, HCR/CRAM-A/B, HSD-2, HDGF, HSP10/EPF, hemoglobina, HSP27, Hepassocin, HSP60, HES-1, HSP70, HES-4, HSP90, HGF, HTRA/proteasa Do, activador de HGF, HTRA1/PRSS11, HGF R, HTRA2/Omi, HIF-1 alfa, HVEM/TNFRSF14, HIF-2 alfa, hialuronano, HIN-1/secretoglobulina 3A1, 4-hidroxinonenal, Hip,CCL1/I-309/TCA-3, 10 IL-10, cIAP (pan), IL-10 R alfa, cIAP-1/HIAP-2, IL-10 R beta, cIAP-2/HLAP-1, IL-11, IBSP/sialoproteina II, IL-11 R alfa, ICAM-1/CD54, IL-12, ICAM-2/CD102, IL-12/IL-23 p40, ICAM-3/CD50, IL-12 R beta 1, ICAM-5, IL-12 R beta 2, ICAT, IL-13, ICOS, IL-13 R alfa 1, iduronato 2-sulfatasa/IDS, IL-13 R alfa 2, IFN, IL-15, IFN-alfa, IL-15 R alfa, IFNalfa 1, IL-16, IFN-alfa 2, IL-17, IFN-alfa 4b, IL-17 R, IFN-alfa A, IL-17 RC, IFN-alfa B2, IL-17 RD, IFN-alfa C, 1L-17B, IFN-alfa D, IL-17B R, IFN-alfa F, IL-17C, IFN-alfa G, IL-17D, IFN-alfa H2, IL-17E, IFN-alfa I, IL-17F, IFN-alfa J1, IL15 18/IL-IF4, IFN-alfa K, IL-18 BPa, IFN-alfa WA, IL-18 BPc, IFN-alfa/beta R1, IL-18 BPd, IFN-alfa/beta R2, IL-18 R alfa/IL-1 R5, IFN-beta, IL-18 R beta/IL-1 R7, IFN-gamma, IL-19, IFN-gamma R1, IL-20, IFN-gamma R2, IL-20 R alfa, IFN-omega, IL-20 R beta, IgE, IL-21, IGFBP-1, IL-21 R, IGFBP-2, IL-22, IGFBP-3, IL-22 R, IGFBP-4, IL-22BP, IGFBP-5, IL-23, IGFBP-6, IL-23 R, IGFBP-L1, IL-24, IGFBP-rp1/IGFBP-7, IL-26/AK155, IGFBP-rP10, IL-27, IGF-I, IL28A, IGF-I R, IL-28B, IGF-II, IL-29/IFN-lambda 1, IGF-II R, IL-31, IgG, IL-31 RA, IgM, IL-32 alfa, IGSF2, IL-33, 20 IGSF4A/SynCAM, ILT2/CD85j, IGSF4B, ILT3/CD85k, IGSF8, ILT4/CD85d, IgY, ILT5/CD85a, IkB-beta, ILT6/CD85e, IKK alfa, Hedgehog indio, IKK epsilon, INSRR, IKK gamma, insulina, IL-1 alfa/IL-1F1, insulina R/CD220, IL-1 beta/IL1F2, proinsulina, IL-1ra/IL-1F3, insulisina/IDE, 1L-1F5/FIL1 delta, integrina alfa 2/CD49b, IL-1F6/FIL1 epsilon, integrina alfa 3/CD49c, IL-1F7/FIL1 zeta, integrina alfa 3 beta 1/VLA-3, IL-1F8/FIL1 eta, integrina alfa 4/CD49d, IL-1F9/IL-1 H1, integrina alfa 5/CD49e, IL-1F10/IL-1HY2, integrina alfa 5 beta 1, IL-1 RI, integrina alfa 6/CD49f, IL-1 RII, 25 integrina alfa 7, IL-1 R3/IL-1 R AcP, integrina alfa 9, IL-1 R4/ST2, integrina alfa E/CD103, IL-1 R6/IL-1 R rp2; integrina alfa L/CD11a, IL-1 R8, integrina alfa L beta 2, IL-1 R9, integrina alfa M/CD11b, IL-2, integrina alfa M beta 2, IL-2 R alfa, integrina alfa V/CD51, IL-2 R beta, integrina alfa V beta 5, IL-3, integrina alfa V beta 3, IL-3 R alfa, integrina alfa V beta 6, IL-3 R beta, integrina alfa X/CD11c, IL-4, integrina beta 1/CD29, IL-4 R, integrina beta 2/CD18, IL-5, integrina beta 3/CD61, IL-5 R alfa, integrina beta 5, IL-6, integrina beta 6, IL-6 R, integrina beta 7, IL-7, 30 CXCL10/IP-10/CRG-2, IL-7 R alfa/CD127, IRAK1, CXCR1/IL-8 RA, IRAK4, CXCR2/IL-8 RB, IRS-1, CXCL8/IL-8, Islet-1, IL-9, CXCL11/1-TAC, IL-9 R, Jagged 1, JAM-4/IGSF5, Jagged 2, JNK, JAM-A, JNK1/JNK2, JAM-B/VE-JAM, JNK1, JAM-C, JNK2, quininogeno, calicreina 3/PSA, quininostatina, calicreina 4, KIR/CD158, calicreina 5, KIR2DL1, calicreina 6/neurosina, KIR2DL3, calicreina 7, KIR2DLA/CD158d, calicreina 8/neuropsina, KIR2DS4, calicreina 9, KIR3DL1, calicreina plasmatica/KLKB1, KIR3DL2, calicreina 10, Kirrel2, calicreina 11, KLF4, calicreina 12, KLF5, 35 calicreina 13, KLF6, calicreina 14, Klotho, calicreina 15, Klotho beta, KC, KOR, Keap1, Kremen-1, Kell, Kremen-2, KGF/FGF-7, LAG-3, LINGO-2, LAIR1, lipina 2, LAIR2, lipocalina-1, laminina alfa 4, lipocalina-2/NGAL, laminina gamma 1, 5-lipoxigenasa, laminina I, LXR alfa/NR1H3, laminina S, LXR beta/NR1H2, laminina-1, livina, laminina-5, LIX, LAMP, LMIR1/CD300A, langerina, LMIR2/CD300c, LAR, LMIR3/CD300LF, latexina, LMIRS/CD300LB, layilina, LMIR6/CD300LE, LBP, LM02, LDL R, LOX-1/SR-E1, LECT2, LRH-1/NR5A2, LEDGF, LRIG1, Lefty, LRIG3, Lefty-1, 40 LRP-1, Lefty-A, LRP-6, legumaina, LSECtin/CLEC4G, leptina, lumicano, leptina R, CXCL15/Lungkine, leucotrieno B4, XCL1/linfotactina, leucotrieno B4 R1, linfotoxina, LIF, linfotoxina beta/TNFSF3, LIF R alfa, linfotoxina beta R/TNFRSF3, LIGHT/TNFSF14, Lyn, limitina, Lyp, LIMPII/SR-B2, homologo 2 de lisil oxidasa, LIN-28, LYVE-1, LINGO-1, alfa 2-macroglobulina, CXCL9/MIG, MAD2L1, mimecano, MAdCAM-1, mindina, MafB, R de mineralocorticoide/NR3C2, MafF, CCL3L1/MIP-1 alfa isoforma LD78 beta, MafG, CCL3/MIP-1 alfa, MafK, 45 CCL4L1/LAG-1, MAG/Siglec-4a, CCL4/MIP-1 beta, MANF, CCL15/MIP-1 delta, MAP2, CCL9/10/MIP-1 gamma, MAPK, MIP-2, marapsina/pancreasina, CCL19/MIP-3 beta, MARCKS, CCL20/MIP-3 alfa, MARCO, MIP-I, Mash1, MIP-II, matrilina-2, MIP-III, matrilina-3, MIS/AMH, matrilina-4, MIS RII, matriptasa/ST14, MIXL1, MBL, MKK3/MKK6, MBL-2, MKK3, melanocortina 3R/MC3R, MKK4, MCAM/CD146, MKK6, MCK-2, MKK7, Mcl-1, MKP-3, MCP-6, MLH1, CCL2/MCP-1, MLK4 alfa, MCP-11, MMP, CCL8/MCP-2, MMP-1, CCL7/MCP-3/MARC, MMP-2, CCL13/MCP-4, 50 MMP-3, CCL12/MCP-5, MMP-7, M-CSF, MMP-8, M-CSF R, MMP-9, MCV-tipo II, MMP-10, MD-1, MMP-11, MD-2, MMP-12, CCL22/MDC, MMP-13, MDL-1/CLEC5A, MMP-14, MDM2, MMP-15, MEA-1, MMP-16/MT3-MMP, MEK1/MEK2, MMP-24/MT5-MMP, MEK1, MMP-25/MT6-MMP, MEK2, MMP-26, melusina, MMR, MEPE, MOG, meprina alfa, CCL23/MPBP-1, meprina beta, M-Ras/R-Ras3, Mer, Mre11, mesotelina, MRP1, meteorina, MSK1/MSK2, metionina aminopeptidasa 1, MSK1, metionina aminopeptidasa, MSK2, metionina aminopeptidasa 2, 55 MSP, MFG-E8, MSP R/Ron, MFRP, Mug, MgcRacGAP, MULT-1, MGL2, Musashi-1, MGMT, Musashi-2, MIA, MuSK, MICA, MutY ADN glicosilasa, MICB, MyD88, MICL/CLEC12A, mieloperoxidasa, beta 2 microglobulina, miocardina, Midkine, miocilina, MIF, mioglobina, NAIP NGFI-B gamma/NR4A3, Nanog, NgR2/NgRH1, CXCL7/NAP-2, NgR3/NgRH2, Nbsl, nidogen-1/entactina, NCAM-1/CD56, nidogen-2, NCAM-L1, oxido nitrico, nectina-1, nitrotirosina, nectina-2/CD112, NKG2A, nectina-3, NKG2C, nectina-4, NKG2D, neogenina, NKp30, neprilisina/CD10, NKp44, neprilisina-2/MMEL1/MMEL2, NKp46/NCR1, nestina, NKp80/KLRF1, NET02, NKX2,5, netrina-1, NMDA R, subunidad de NR1, netrina-2, NMDA R, subunidad de NR2A, netrina-4, NMDA R, subunidad de NR2B, netrina-G1a, NMDA R, subunidad de NR2C, netrina-G2a, N-Me-6,7-diOH-TIQ, neuregulina-1/NRG1, nodal, neuregulina-3/NRG3, noggina, neuritina, receptor de nogo, NeuroD1, Nogo-A, neurofascina, NOMO, neurogenina-1, nope, neurogenina-2, 5 norrina, neurogenina-3, eNOS, neurolisina, iNOS, neurofisina II, nNOS, neurofilina-1, Notch-1, neurofilina-2, Notch-2, neuropoyetina, Notch-3, neurotrimina, Notch-4, neurturina, NOV/CCN3, NFAM1, NRAGE, NF-H, NrCAM, NFkB1, NRL, NFkB2, NT-3, NF-L, NT-4, NF-M, NTB-A/SLAMF6, NG2/MCSP, NTH1, NGF R/TNFRSF16, nucleostemina, beta-NGF, Nurr-1/NR4A2, NGFI-B alfa/NR4A1, OAS2, orexina B, OBCAM, OSCAR, OCAM, OSF-2/periostina, OCIL/CLEC2d, oncostatina M/OSM, OCILRP2/CLEC2i, OSM R beta, Oct-3/4, osteoactivina/GPNMB, OGG1, 10 osteoadherina, Olig 1, 2, 3, osteocalcina, Olig1, osteocrina, Olig2, osteopontina, Olig3, osteoprotegerina/TNFRSF11B, marcador de oligodendrocitos O1, Otx2, marcador de oligodendrocitos 04, OV-6, OMgp, OX40/TNFRSF4, opticina, ligando OX40/TNFSF4, orexina A, OAS2, orexina B, OBCAM, OSCAR, OCAM, OSF-2/periostina, OCIL/CLEC2d, oncostatina M/OSM, OCILRP2/CLEC2i, OSM R beta, Oct-3/4, osteoactivina/GPNMB, OGG1, osteoadherina, Olig 1, 2, 3, osteocalcina, Olig1, osteocrina, Olig2, osteopontina, 15 Olig3, osteoprotegerina/TNFRSF11B, marcador de oligodendrocitos O1, Otx2, marcador de oligodendrocitos 04, OV6, OMgp, OX40/TNFRSF4, opticina, ligando OX40/TNFSF4, orexina A, RACK1, Ret, Rad1, REV-ERB alfa/NR1D1, Rad17, REV-ERB beta/NR1D2, Rad51, Rex-1, Rae-1, RGM-A, Rae-1 alfa, RGM-B, Rae-1 beta, RGM-C, Rae-1 delta, Rheb, Rae-1 epsilon, proteina ribosomica S6, Rae-1 gamma, RIP1, Raf-1, ROBO1, RAGE, ROB02, Ra1A/Ra1B, ROB03, Ra1A, ROBO4, Ra1B, ROR/NR1F1-3 (pan), RANK/TNFRSF11A, ROR alfa/NR1F1, 20 CCL5/RANTES, ROR gamma/NR1F3, Rap1A/B, receptor 1 de orfano similar a RTK/ROR1, RAR alfa/NR1B1, receptor 2 de orfano similar a RTK/ROR2, RAR beta/NR1B2, RP105, RAR gamma/NR1B3, RPA2, Ras, RSK (pan), RBP4, RSK1/RSK2, RECK, RSK1, Reg 2/PAP, RSK2, Reg I, RSK3, Reg II, RSK4, Reg III, R-espondina 1, Reg IIIa, R-espondina 2, Reg IV, R-espondina 3, relaxina-1, RUNX1/CBFA2, relaxina-2, RUNX2/CBFA1, relaxina-3, RUNX3/CBFA3, RELM alfa, RXR alfa/NR2B1, RELM beta, RXR beta/NR2B2, RELT/TNFRSF19L, RXR 25 gamma/NR2B3, resistina, S100A10, SLITRK5, S100A8, SLPI, S100A9, SMAC/diablo, S100B, Smad1, S100P, Smad2, SALL1, Smad3, delta-sarcoglicano, Smad4, Sca-1/Ly6, Smad5, SCD-1, Smad7, SCF, Smad8, SCF R/c-kit, SMC1, SCGF, alfa-actina de musculo liso, SCL/Tal1, SMUG1, SCP3/SYCP3, Snail, CXCL12/SDF-1, intercambiador 1 de sodio y calcio, SDNSF/MCFD2, Soggy-1, alfa-secretasa, Sonic Hedgehog, gamma-secretasa, SorCS1, betasecretasa, SorCS3, E-selectina, sortilina, L-selectina, SOST, P-selectina, SOX1, semaforina 3A, SOX2, semaforina 30 3C, SOX3, semaforina 3E, SOX7, semaforina 3F, SOX9, semaforina 6A, SOX10, semaforina 6B, SOX17, semaforina 6C, SOX21 semaforina 6D,SPARC, semaforina 7A, 1 similar a SPARC, separasa, SP-D, sustrato I de serina/treonina fosfatasa, espinesina, serpina A1, F-espondina, serpina A3, SR-AI/MSR, serpina A4/calistatina, Src, serpina A5/inhibidor de proteina C, SREC-I/SR-F1, serpina A8/angiotensinogeno, SREC-II, serpina B5, SSEA-1, serpina C1/antitrombina-III, SSEA-3, serpina D1/cofactor II de heparina, SSEA-4, serpina E1/PAI-1, ST7/LRP12, serpina E2, 35 estabilina-1, serpina F1, estabilina-2, serpina F2, estaniocalcina 1, serpina G1/inhibidor de C1, estaniocalcina 2, serpina I2, STAT1, amiloide A1 del suero, STAT2, SF-1/NR5A1, STAT3, SGK, STAT4, SHBG, STAT5a/b, SHIP, STAT5a, SHP/NR0B2, STAT5b, SHP-1, STAT6, SHP-2, VE-estatina, SIGIRR, Stella/Dppa3, Siglec-2/CD22, STRO1, Siglec-3/CD33, sustancia P, Siglec-5, sulfamidasa/SGSH, Siglec-6, factor 1 modificador de sulfatasa/SUMF1, Siglec-7, factor 2 modificador de sulfatasa/SUMF2, Siglec-9, SUMO1, Siglec-10, SUMO2/3/4, Siglec-11, SUMO3, 40 Siglec-F, superoxido dismutasa, SIGNR1/CD209, superoxido dismutasa-1/Cu-Zn SOD, SIGNR4, superoxido dismutasa-2/Mn-SOD, SIRP beta 1, superoxido dismutasa-3/EC-SOD, SKI, survivina, SLAM/CD150, sinapsina I, transposasa Sleeping Beauty, sindecano-1/CD138, Slit3, sindecano-2, SLITRK1, sindecano-3, SLITRK2, sindecano4, SLITRK4, TACI/TNFRSF13B, TMEFF1/tomoregulina-1, TAO2, TMEFF2, TAPP1, TNF-alfa/TNFSF1A, CCL17/TARC, TNF-beta/TNFSF1B, Tau, TNF RI/TNFRSF1A. TC21/R-Ras2, TNF RII/TNFRSF1B, TCAM-1, TOR, 45 TCCR/WSX-1, TP-1, TC-PTP, TP63/TP73L, TDG, TR, CCL25/TECK, TR alfa/NR1A1, tenascina C, TR beta 1/NR1A2, tenascina R, TR2/NR2C1, TER-119, TR4/NR2C2, TERT, TRA-1-85, testicano 1/SPOCK1, TRADD, testicano 2/SPOCK2,TRAF-1, testicano 3/SPOCK3, TRAF-2, TFPI, TRAF-3, TFPI-2, TRAF-4, TGF-alfa, TRAF-6, TGF-beta, TRAIL/TNFSF10, TGF-beta 1, TRAIL R1/TNFRSF10A, LAP (TGF-beta 1), TRAIL R2/TNFRSF10B, TGFbeta 1 latente, TRAIL R3/TNFRSF10C, TGF-beta 1,2, TRAIL R4/TNFRSF10D, TGF-beta 2, TRANCE/TNFSF11, 50 TGF-beta 3, TfR (transferrina R), TGF-beta 5, apo-transferrina, TGF-beta latente pb 1, holo-transferrina, TGF-beta latente pb 2, trapina-2/elafina, TGF-beta latente pb4, TREM-1, TGF-beta RI/ALK-5, TREM-2, TGF-beta RII, TREM-3, TGF-beta RIIb, TREML1/TLT-1, TGF-beta RIII, TRF-1, termolisina, TRF-2, tiorredoxina-1, ectoenzima degradadora de TRH/TRHDE, tiorredoxina-2, TRIM5, tiorredoxina-80, tripeptidil-peptidasa I, 5 similar a tiorredoxina /TRP14, TrkA, THOP1, TrkB, trombomodulina/CD141, TrkC, trombopoyetina, TROP-2, trombopoyetina R, peptido 3 de troponina I, 55 trombospondina-1, troponina T, trombospondina-2, TROY/TNFRSF19, trombospondina-4, tripsina 1, timopoyetina, tripsina 2/PRSS2, quimiocina-1 del timo, tripsina 3/PRSS3, Tie-1, triptasa-5/Prss32, Tie-2, triptasa alfa/TPS1, TIM-1/KIM-1/HAVCR, triptasa beta-1/MCPT-7, TIM-2, triptasa beta-2/TPSB2, TIM-3, triptasa epsilon/BSSP-4, TIM-4, triptasa gamma-1/TPSG1, TIM-5, triptofano hidroxilasa, TIM-6, TSC22, TIMP-1, TSG, TTMP-2, TSG-6, TIMP-3, TSK, TIMP-4, TSLP, TL1A/TNFSF15, TSLP R, TLR1, TSP50, TLR2, beta-III tubulina, TLR3, TWEAK/TNFSF12, TLR4,

TWEAK R/TNFRSF12, TLR5, Tyk2, TLR6, fosfo-tirosina, TLR9, tirosina hidroxitasa, TLX/NR2E1, sustrato I de tirosina fosfatasa, ubiquitina, UNCSH3, Ugi, UNCSH4, UGRP1, UNG, ULBP-1, uPA, ULBP-2, uPAR, ULBP-3, URB, UNC5H1, UVDE, UNC5H2, vainilloide R1, VEGF R, VASA, VEGF R1/Flt-1, vasohibina, VEGF R2/KDR/Flk-1, vasorina, VEGF R3/Flt-4, vasostatina, versicano, Vav-1, VG5Q, VCAM-1, VHR, VDR/NR1I1, vimentina, VEGF,

5 vitronectina, VEGF-B, VLDLR, VEGF-C, vWF-A2, VEGF-D, sinucleina-alfa, Ku70, WASP, Wnt-7b, WIF-1, Wnt-8a WISP-1/CCN4, Wnt-8b, WNK1, Wnt-9a, Wnt-1, Wnt-9b, Wnt-3a, Wnt-10a, Wnt-4, Wnt-10b, Wnt-5a, Wnt-11, Wnt-5b,wnvNS3, Wnt7a, XCR1, XPE/DDB1, XEDAR, XPE/DDB2, Xg, XPF, XIAP, XPG, XPA, XPV, XPD, XRCC1, Si, YY1, EphA4.

10 [0212] Numerosos canales de iones humanos son dianas de particular interes. Ejemplos no limitantes incluyen subunidad B del receptor 3 de 5-hidroxitriptamina, precursor del receptor 3 de 5-hidroxitriptamina, subunidad C del receptor 3 de 5-hidroxitriptamina, proteina 14 de AAD, proteina de receptor de acetilcolina, precursor de la subunidad alfa, proteina de receptor de acetilcolina, precursor de la subunidad beta, proteina de receptor de acetilcolina, precursor de la subunidad delta, proteina de receptor de acetilcolina, precursor de la subunidad epsilon,

15 proteina de receptor de acetilcolina, precursor de la subunidad gamma, variante de corte y empalme b de canales de iones sensibles a acidos 3, variante de corte y empalme c de canales de iones sensible a acidos 3, canal de iones sensible a acidos 4, ADP-ribosa pirofosfatasa, precursor mitocondrial, canal de calcio dependiente de voltaje alfa1A, canal de cationes sensible a amilorida 1, neuronal, canal de cationes sensible a amilorida 2, canal de cationes sensible a amilorida 4 neuronal, isoforma 2, canal de sodio sensible a amilorida, subunidad alfa de canales de sodio

20 sensibles a amilorida, subunidad beta de canales de sodio sensibles a amilorida, subunidad delta de canales de sodio sensibles a amilorida, subunidad gamma de canales de sodio sensibles a amilorida, anexina A7, proteina similar a apical, canal de potasio de rectificacion interna sensible a ATP 1, canal de potasio de rectificacion interna sensible a ATP 10, canal de potasio de rectificacion interna sensible a ATP 11, canal de potasio de rectificacion interna sensible al ATP 14, canal de potasio de rectificacion interna sensible al ATP 15, canal de potasio de

25 rectificacion interna sensible al ATP 8, subunidad alfa 12.2 de canales de calcio, subunidad alfa 12.2 de canales de calcio, subunidad alfa1E de canales de calcio, variante de corte y empalme delta19 delta40 delta46, subunidad 1 de canales de potasio activados por calcio alfa, subunidad 1 de canales de potasio activados por calcio beta, subunidad 2 de canales de potasio activados por calcio beta, subunidad 3 de canales de potasio activados por calcio beta, canal de cloruro dependiente de calcio 1, canal de cationes TRPM4B, CADN FLJ90453 fis, clon NT2RP3001542,

30 altamente similar a 6 que contiene dominio de tetramerizacion de canales de potasio, CADN FLJ90663 fis, clon PLACE1005031, altamente similar a proteina 5 de canales intracelulares de cloruro, subunidad beta de canales de cationes regulados por CGMP, proteina de canales de cloruro, proteina de canales de cloruro 2, proteina de canales de cloruro 3, proteina de canales de cloruro 4, proteina de canales de cloruro 5, proteina de canales de cloruro 6, proteina de canales de cloruro C1C-Ka, proteina de canales de cloruro C1C-Kb, proteina de canales de cloruro,

35 musculo esqueletico, canal intracelular de cloruro 6, proteina 3 de canales intracelulares de cloruro, proteina 4 de canales intracelulares de cloruro, proteina 5 de canales intracelulares de cloruro, proteina CHRNA3, proteina Clcn3e, proteina CLCNKB, proteina CNGA4, culina-5, canal de potasio regulado por GMP ciclico, canal de cationes regulado por nucleotido ciclico 4, canal de cationes regulado por nucleotido ciclico alfa 3, canal de cationes regulado por nucleotido ciclico beta 3, canal olfativo regulado por nucleotidos ciclicos, regulador de la conductancia

40 transmembrana de fibrosis quistica, cadena pesada de citocromo B-245, tipo L sensible a dihidropiridina, precursor de subunidades alfa-2/delta de canales de calcio, precursor del regulador 3 del transporte de iones que contiene dominio de FXYD, precursor del regulador 5 del transporte de iones que contiene dominio de FXYD, precursor del regulador 6 del transporte de iones que contiene dominio de FXYD, regulador 7 del transporte de iones que contiene dominio de FXYD, precursor del regulador 8 del transporte de iones que contiene dominio de FXYD, canal de

45 potasio de rectificacion interna activado por proteina G 1, canal de potasio de rectificacion interna activado por proteina G 2, canal de potasio de rectificacion interna activado por proteina G 3, canal de potasio de rectificacion interna activado por proteina G 4, precursor de la subunidad alfa-1 de receptor de acido gamma-aminobutirico, precursor de la subunidad alfa-2 de receptor de acido gamma-aminobutirico, precursor de la subunidad alfa-3 de receptor de acido gamma-aminobutirico, precursor de la subunidad alfa-4 de receptor de acido gamma

50 aminobutirico, precursor de la subunidad alfa-5 de receptor de acido gamma-aminobutirico, precursor de la subunidad alfa-6 de receptor de acido gamma-aminobutirico, precursor de la subunidad beta-1 de receptor de acido gamma-aminobutirico, precursor de la subunidad beta-2 de receptor de acido gamma-aminobutirico, precursor de la subunidad beta-3 de receptor de acido gamma-aminobutirico, precursor de la subunidad delta de receptor de acido gamma-aminobutirico, precursor de la subunidad epsilon de receptor de acido gamma-aminobutirico, precursor de la

55 subunidad gamma-1 de receptor de acido gamma-aminobutirico, precursor de la subunidad gamma-3 de receptor de acido gamma-aminobutirico, precursor de la subunidad pi de receptor de acido gamma-aminobutirico, precursor de la subunidad rho-1 de receptor de acido gamma-aminobutirico, precursor de la subunidad rho-2 de receptor de acido gamma-aminobutirico, precursor de la subunidad theta de receptor de acido gamma-aminobutirico, receptor de kainato GluR6, precursor del receptor 1 de glutamato, precursor del receptor 2 de glutamato, precursor del receptor 3

de glutamato, precursor del receptor 4 de glutamato, receptor 7 de glutamato, receptor B de glutamato, precursor de la subunidad delta-1 del receptor de glutamato, receptor de glutamato, precursor de kainato 1 ionotropico, receptor de glutamato, precursor de kainato 2 ionotropico, receptor de glutamato, precursor de kainato 3 ionotropico, receptor de glutamato, precursor de kainato 4 ionotropico, receptor de glutamato, precursor de kainato 5 ionotropico, 5 precursor de la subunidad 3A del receptor de glutamato [NMDA], precursor de la subunidad 3B del receptor de glutamato [NMDA], precursor de la subunidad epsilon 1 del receptor de glutamato [NMDA], precursor de la subunidad epsilon 2 del receptor de glutamato [NMDA], precursor de la subunidad epsilon 4 del receptor de glutamato [NMDA], precursor de la subunidad zeta I del receptor de glutamato [NMDA], precursor de la cadena alfa-1 de receptor de glicina, precursor de la cadena alfa-2 de receptor de glicina, precursor de la cadena alfa-3 de receptor 10 de glicina, precursor de la cadena beta de receptor de glicina, subunidad 1 del complejo de ribonucleoproteina H/ACA, subunidad beta del receptor epsilon de inmunoglobulina de alta afinidad, proteina hipotetica DKFZp313I0334, proteina hipotetica DKFZp761M1724, proteina hipotetica FLJ12242, proteina hipotetica FLJ14389, proteina hipotetica FLJ14798, proteina hipotetica FLJ14995, proteina hipotetica FLJ16180, proteina hipotetica FLJ16802, proteina hipotetica FLJ32069, proteina hipotetica FLJ37401, proteina hipotetica FLJ38750, proteina 15 hipotetica FLJ40162, proteina hipotetica FLJ41415, proteina hipotetica FLJ90576, proteina hipotetica FLJ90590, proteina hipotetica FLJ90622, proteina hipotetica KCTD15, proteina hipotetica MGC15619, receptor tipo 1 de 1,4,5trisfosfato de inositol, receptor tipo 2 de 1,4,5-trisfosfato de inositol, receptor tipo 3 de 1,4,5-trisfosfato de inositol, proteina 4 de canales de potasio activados por calcio de conductancia intermedia, canal de potasio de rectificacion interna 13, canal de potasio de rectificacion interna 16, canal de potasio de rectificacion interna 4, regulador Kir2.2v 20 negativo de canales de K(+) de rectificacion interna, subunidad KA2a del receptor de kainato, proteina KCNH5, proteina KCTD 17, proteina KCTD2, proteina transmembrana asociada a queratinocitos 1, proteina 4 de interaccion con canales Kv, melastatina 1, proteina MLC1 de membrana, proteina MGC15619, mucolipina-1, mucolipina-2, mucolipina-3, proteina 4 asociada a resistencia a multiples farmacos, precursor de la subunidad 2C del receptor de N-metil-D-aspartato, homologo de NADPH oxidasa 1, proteina de receptor de acetilcolina neuronal Nav1.5, precursor 25 de la subunidad alfa-10, proteina del receptor de acetilcolina neuronal, precursor de la subunidad alfa-2, proteina del receptor de acetilcolina neuronal, precursor de la subunidad alfa-3, proteina del receptor de acetilcolina neuronal, precursor de la subunidad alfa-4, proteina del receptor de acetilcolina neuronal, precursor de la subunidad alfa-5, proteina del receptor de acetilcolina neuronal, precursor de la subunidad alfa-6, proteina del receptor de acetilcolina neuronal, precursor de la subunidad alfa-7, proteina del receptor de acetilcolina neuronal, precursor de la subunidad 30 alfa-9, proteina del receptor de acetilcolina neuronal, precursor de la subunidad beta-2, proteina del receptor de acetilcolina neuronal, precursor de la subunidad beta-3, proteina del receptor de acetilcolina neuronal, precursor de la subunidad beta-4, subunidad alfa 2D de canales de calcio dependientes de voltaje neuronales, receptor purinergico P2X 1, receptor purinergico P2X 2, receptor purinergico P2X 3, receptor purinergico P2X 4, receptor purinergico P2X 5, receptor purinergico P2X 6, receptor purinergico P2X 7, canal de potasio pancreatico TALK-1b, 35 canal de potasio pancreatico TALK-1c, canal de potasio pancreatico TALK-1d, precursor de Phospholemman, plasmolipina, proteina relacionada con 2 de enfermedad del rifon poliquistico, proteina 1 similar a 2 de enfermedad del rifon poliquistico, proteina 2 similar a 2 de enfermedad del rifon poliquistico, enfermedad del rifon poliquistico y receptor para precursor de la proteina relacionada con la gelatina del huevo, policistina-2, regulador de los canales de potasio, miembro 1 de la subfamilia K de canales de potasio, miembro 10 de la subfamilia K de canales de 40 potasio, miembro 12 de la subfamilia K de canales de potasio, miembro 13 de la subfamilia K de canales de potasio, miembro 15 de la subfamilia K de canales de potasio, miembro 16 de la subfamilia K de canales de potasio, miembro 17 de la subfamilia K de canales de potasio, miembro 2 de la subfamilia K de canales de potasio, miembro 3 de la subfamilia K de canales de potasio, miembro 4 de la subfamilia K de canales de potasio, miembro 5 de la subfamilia K de canales de potasio, miembro 6 de la subfamilia K de canales de potasio, miembro 7 de la subfamilia K de 45 canales de potasio, miembro 9 de la subfamilia K de canales de potasio, 3 que contiene dominios de tetramerizacion de canales de potasio, proteina 12 que contiene dominios de tetramerizacion de canales de potasio, proteina 14 que contiene dominios de tetramerizacion de canales de potasio, proteina 2 que contiene dominios de tetramerizacion de canales de potasio, proteina 4 que contiene dominios de tetramerizacion de canales de potasio, proteina 5 que contiene dominios de tetramerizacion de canales de potasio, 10 que contiene dominios de tetramerizacion de 50 canales de potasio, proteina 13 que contiene dominios de tetramerizacion de canales de potasio, 1 que contiene dominios de tetramerizacion de canales de potasio, miembro 1 de la subfamilia A de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 2 de la subfamilia A de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 4 de la subfamilia A de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 5 de la subfamilia A de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 6 de la subfamilia A de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 1 de la subfamilia B de 55 canales regulados por voltaje de potasio, miembro 2 de la subfamilia B de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 1 de la subfamilia C de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 3 de la subfamilia C de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 4 de la subfamilia C de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 1 de la subfamilia D de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 2 de la subfamilia D de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 3 de la subfamilia D de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 1 de la subfamilia E de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 2 de la subfamilia E de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 3 de la subfamilia E de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 4 de la subfamilia E de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 1 de la subfamilia F de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 1 de la subfamilia G de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 2 de la 5 subfamilia G de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 3 de de la subfamilia G de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 4 de la subfamilia G de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 1 de la subfamilia H de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 2 de la subfamilia H de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 3 de la subfamilia H de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 4 de la subfamilia H de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 5 de la subfamilia H de canales regulados por 10 voltaje de potasio, miembro 6 de la subfamilia H de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 7 de la subfamilia H de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 8 de la subfamilia H de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 1 de la subfamilia KQT de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 2 de la subfamilia KQT de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 3 de la subfamilia KQT de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 4 de la subfamilia KQT de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 5 de la 15 subfamilia KQT de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 1 de la subfamilia S de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 2 de la subfamilia S de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 3 de la subfamilia S de canales regulados por voltaje de potasio, miembro 2 de la subfamilia V de canales regulados por voltaje de potasio, canales regulados por voltaje de potasio, subfamilia H, miembro 7, isoforma 2, canal regulado por nucleotidos ciclicos activados por hiperpolarizacion de potasio/sodio 1, canal regulado por nucleotidos ciclicos 20 activados por hiperpolarizacion de potasio/sodio 2, canal regulado por nucleotidos ciclicos activados por hiperpolarizacion de potasio/sodio 3, canal regulado por nucleotidos ciclicos activados por hiperpolarizacion de potasio/sodio 4, homologos de TOM40 de la subunidad de receptores de importacion mitocondrial probable, receptor purinergico, isoforma A, canal de iones seleccionados por voltaje de 4 repeticiones putativas, proteina 7 de canales de cloruro putativos, receptor de kainato GluR6 putativo, variante 1 de la proteina CATSPER2 de canales de iones 25 putativos, variante 2 de la proteina CATSPER2 de canales de iones putativos, variante 3 de la proteina CATSPER2 de canales de iones putativos, regulador putativo de la variante 1 de proteina de canales de potasio, proteina tirosina fosfatasa TPTE putativa, receptor 1 de rianodina, receptor 2 de rianodina, receptor 3 de rianodina, proteina 1 de union a SH3KBP1, canal 1 de potencial receptor transitorio corto, canal 4 de potencial receptor transitorio corto, canal 5 de potencial receptor transitorio corto, canal 6 de potencial receptor transitorio corto, canal 7 de potencial 30 receptor transitorio corto, proteina 1 de canales de potasio activados por calcio de conductancia pequefa, proteina 2 de canales de potasio activados por calcio de conductancia pequefa, isoforma b, proteina 3 de canales de potasio activados por calcio de conductancia pequefa, isoforma b, canal de potasio activado por calcio de conductancia pequefa SK2, canal de potasio activado por calcio de conductancia pequefa SK3, canal de sodio, precursor de la subunidad beta-1 de canales de sodio, subunidad alfa de proteina tipo II de canales de sodio, subunidad alfa de 35 proteina tipo III de canales de sodio, subunidad alfa de proteina tipo IV de canales de sodio, subunidad alfa de proteina tipo IX de canales de sodio, subunidad alfa de proteina tipo V de canales de sodio, subunidad alfa de proteina tipo VI de canales de sodio, subunidad alfa de proteina tipo VIII de canales de sodio, subunidad alfa de proteina tipo X de canales de sodio, subunidad alfa de proteina tipo XI de canales de sodio, canal de potasio sensible al ATP activado por sodio y cloruro, cadena gamma de ATPasa transportadora de sodio/potasio, canal de 40 cationes asociado a espermatozoides 1, canal de cationes asociado a espermatozoides 2, isoforma 4, sintaxina-1 B1, miembro 1 de la subfamilia A de canales de cationes de potencial receptor transitorio, miembro 2 de la subfamilia M de canales de cationes de potencial receptor transitorio, miembro 3 de la subfamilia M de canales de cationes de potencial receptor transitorio, miembro 6 de la subfamilia M de canales de cationes de potencial receptor transitorio, miembro 7 de la subfamilia M de canales de cationes de potencial receptor transitorio, miembro 1 de la subfamilia V 45 de canales de cationes de potencial receptor transitorio, miembro 2 de la subfamilia V de canales de cationes de potencial receptor transitorio, miembro 3 de la subfamilia V de canales de cationes de potencial receptor transitorio, miembro 4 de la subfamilia V de canales de cationes de potencial receptor transitorio, miembro 5 de la subfamilia V de canales de cationes de potencial receptor transitorio, miembro 6 de la subfamilia A de canales de cationes de potencial receptor transitorio, variante de corte y empalme epsilon de canales de potencial receptor transitorio 4, 50 variante de corte y empalme zeta de canales de potencial receptor transitorio 4, variante de corte y empalme gamma de canales de potencial receptor transitorio 7, factor de necrosis tumoral, proteina 1 alfa-inducida, endotelial, proteina 2 de canales de calcio de dos poros, proteina VDAC4, canal de potasio regulado por voltaje Kv3.2b, subunidad beta1B de canales de sodio regulados por voltaje, canales de aniones dependientes de voltaje, canales de aniones dependientes de voltaje 2, proteina 1 de canales selectivos de aniones dependientes de voltaje, proteina 55 2 de canales selectivos de aniones dependientes de voltaje, proteina 3 de canales selectivos de aniones dependientes de voltaje, subunidad gamma-1 de canales de calcio dependientes de voltaje, subunidad gamma-2 de canales de calcio dependientes de voltaje, subunidad gamma-3 de canales de calcio dependientes de voltaje, subunidad gamma-4 de canales de calcio dependientes de voltaje, subunidad gamma-5 de canales de calcio dependientes de voltaje, subunidad gamma-6 de canales de calcio dependientes de voltaje, subunidad gamma-7 de canales de calcio dependientes de voltaje, subunidad gamma-8 de canales de calcio dependientes de voltaje, subunidad alfa-1C de canales de calcio tipo L dependientes de voltaje, subunidad alfa-1D de canales de calcio tipo L dependientes de voltaje, subunidad alfa-1S de canales de calcio tipo L dependientes de voltaje, subunidad beta-1 de canales de calcio tipo L dependientes de voltaje, subunidad beta-2 de canales de calcio tipo L dependientes de 5 voltaje, subunidad beta-3 de canales de calcio tipo L dependientes de voltaje, subunidad beta-4 de canales de calcio tipo L dependientes de voltaje, subunidad alfa-1B de canales de calcio tipo N dependientes de voltaje, subunidad alfa-1A de canales de calcio tipo P/G dependientes de voltaje, subunidad alfa-1E de canales de calcio tipo R dependientes de voltaje, subunidad alfa-1G de canales de calcio tipo T dependientes de voltaje, subunidad alfa-1H de canales de calcio tipo L dependientes de voltaje, subunidad alfa-1I de canales de calcio tipo T dependientes de

10 voltaje, subunidad alfa-1 de canales de calcio tipo L dependientes de voltaje, subunidad beta-1 de canales de potasio dependientes de voltaje, subunidad beta-2 de canales de potasio dependientes de voltaje, subunidad beta-3 de canales de potasio dependientes de voltaje, canal de potasio dependiente de voltaje KCNA7.

[0213] GPCR a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, rodopsina de clase A como receptores tales

15 como acetilcolina muscular de vertebrado tipo 1, acetilcolina muscular de vertebrado tipo 2, acetilcolina muscular de vertebrado tipo 3, acetilcolina muscular de vertebrado tipo 4; receptores adrenergicos (receptores adrenergicos alfa tipo 1, receptores adrenergicos alfa tipo 2, receptores adrenergicos beta tipo 1, receptores adrenergicos beta tipo 2, receptores adrenergicos beta tipo 3, dopamina de vertebrado tipo 1, dopamina de vertebrado tipo 2, dopamina de vertebrado tipo 3, dopamina de vertebrado tipo 4, histamina tipo 1, histamina tipo 2, histamina tipo 3, histamina tipo

20 4, serotonina tipo 1, serotonina tipo 2, serotonina tipo 3, serotonina tipo 4, serotonina tipo 5, serotonina tipo 6, serotonina tipo 7, serotonina tipo 8, otros tipos de serotonina, amina Trace, angiotensina tipo 1, angiotensina tipo 2, bombesina, bradiquinina, anafilatoxina C5a, Fmet-leu-phe, similar a APJ, interleucina-8 tipo A, interleucina-8 tipo B, otros tipos de interleucina-8, quimiocina C-C tipo 1 a tipo 11 y otros tipos, quimiocina C-X-C (tipos 2 a 6 y otros), quimiocina C-X3-C, colecistoquinina CCK, CCK tipo A, CCK tipo B, otras CCK, endotelina, melanocortina (hormona

25 estimulante de melanocitos, hormona adrenocorticotropica, hormona melanocortina), antigeno Duffy, peptido liberador de prolactina (GPR10), neuropeptido Y (tipo 1 a 7), neuropeptido Y, otros neuropeptidos Y, neurotensina, opioide (tipo D, K, M, X), somatostatina (tipo 1 a 5), taquiquinina (sustancia P (NK1), sustancia K (NK2), neuromedina K (NK3), 1 similar a taquiquinina, 2 similar a taquiquinina, vasopresina / vasotocina (tipo 1 a 2), vasotocina, oxitocina / mesotocina, conopresina, similar a galanina, similar a activada con proteinasa, orexina y

30 neuropeptidos FF, QRFP, similar a receptor de quimiocina, similar a neuromedina U (neuromedina U, PRXamida), proteina hormonal (hormona estimulante del foliculo, hormona lutropina-coriogonadotropica, tirotropina, gonadotropina tipo I, gonadotropina tipo II), (rod)opsina, rodopsina de vertebrado (tipos 1-5), rodopsina de vertebrado tipo 5, rodopsina de artropodo, rodopsina de artropodo tipo 1, rodopsina de artropodo tipo 2, rodopsina de artropodo tipo 3, rodopsina de molusco, rodopsina, olfativa (olfativa II fam 1 a 13), prostaglandina (prostaglandina

35 E2 subtipo EP1, prostaglandina E2/D2 subtipo EP2, prostaglandina E2 subtipo EP3, prostaglandina E2 subtipo EP4, prostaglandina F2-alfa, prostaciclina, tromboxano, adenosina tipo 1 a 3, receptores purinergicos, receptor purinergico P2RY1-4, 6, 11 GPR91, receptor purinergico P2RY5, 8, 9, 10 GPR35, 92, 174, receptor purinergico P2RY12-14 GPR87 (UDP-Glucosa), cannabinoide, factor de activacion de plaquetas, hormona liberadora de gonadotropina, hormona liberadora de gonadotropina tipo I, hormona liberadora de gonadotropina tipo II, similar a hormona

40 adipocinetica, corazonina, hormona liberadora de tirotropina y secretagogo, hormona liberadora de tirotropina, secretagogo de hormona de crecimiento, similar a secretagogo de hormona de crecimiento, hormona desencadenante de ecdisis (ETHR), melatonina, lisoesfingolipido y LPA (EDG), esfingosina 1-fosfato Edg-1, acido lisofosfatidico Edg-2, esfingosina 1-fosfato Edg-3, acido lisofosfatidico Edg-4, esfingosina 1-fosfato Edg-5, esfingosina 1-fosfato Edg-6, acido lisofosfatidico Edg-7, esfingosina 1-fosfato Edg-8, Edg. Otro receptor de

45 leucotrieno B4, receptor BLT1 de leucotrieno B4, receptor BLT2 de leucotrieno B4, orfano de clase A/otro, neurotransmisores putativos, SREB, proto-oncogen mas y relacionado con mas (MRG), similar a GPR45, cisteinilleucotrieno, receptor de acido biliar acoplado a proteina G, receptor de acidos grasos libres (GP40, GP41, GP43), similar a secretina de clase B, calcitonina, factor liberador de corticotropina, peptido inhibidor gastrico, glucagon, hormona liberadora de hormona de crecimiento, hormona paratiroidea, PACAP, secretina, polipeptido intestinal

50 vasoactivo, latrofilina, latrofilina tipo 1, latrofilina tipo 2, latrofilina tipo 3, receptores de ETL, inhibidor de angiogenesis especifica para cerebro (BAI), proteinas similares a Methuselah (MTH), cadherina EGF LAG (CELSR), receptor acoplado a proteina G muy grande, glutamato metabotropico de clase C/feromona, glutamato metabotropico grupo I a III, similar a sensibilizacion al calcio, sensibilizacion al calcio extracelular, feromona, otra similar a sensibilizacion al calcio, receptores de feromonas putativas, GABA-B, GABA-B subtipo 1, GABA-B subtipo 2, similar a GABA-B, orfano

55 GPRC5, orfano GPCR6, novia de proteinas sevenless (BOSS), receptores de Taste (T1R), feromonas fungicas de clase D, similar a factor de feromonas fungicas A (STE2, STE3), similar a feromona B fungica (BAR, BBR, RCB, PRA), receptores de cAMP de clase E, proteinas del albinismo ocular, familia de Frizzled/Smoothened, frizzled grupo A (Fz 1 y 2 y 4 y 5 y 7-9), frizzled grupo B (Fz 3 y 6), frizzled grupo C (otros), receptores vomeronasales, quimioreceptores de nematodos, receptores olorosos de insectos y opsinas arqueales/bacterianas/fungicas de clase

Z.

[0214] Las MURP objeto pueden disefarse para elegir como diana cualquier proteina celular que incluye, pero no se limita a, proteina de la superficie celular, proteina secretasa, proteina citosolica y proteina nuclear. Una diana 5 de particular interes es un canal de iones.

[0215] Los canales de iones constituyen una superfamilia de proteinas, que incluyen la familia de canales de potasio (canales de K), la familia de canales de sodio (canales de Na), la familia de canales de calcio (canales de Ca), la familia de canales de cloro (canales de Cl) y la familia de canales de acetilcolina. Cada una de estas familias

10 contiene subfamilias y cada subfamilia normalmente contiene canales especificos derivados de genes individuales. Por ejemplo, la familia de los canales de K contiene subfamilias de canales de potasio regulados por voltaje llamados Kv1.x y Kv3.x. La subfamilia Kv1.x contiene los canales Kv1.1, Kv1.2 y Kv1.3, que se corresponden con los productos de genes individuales y asi se llaman 'especies'. La clasificacion se aplica a las familias de canales de Na, Ca, Cl y a otras familias tambien.

15 [0216] Los canales de iones tambien pueden clasificarse segun los mecanismos por los que operan los canales. Especificamente, los principales tipos de proteinas de canales de iones se caracterizan por el procedimiento empleado de abrir o cerrar la proteina del canal para tanto permitir como prevenir que iones especificos entren en la proteina del canal y atraviesen una membrana celular bicapa lipidica. Un tipo importante de

20 proteina de canales es la proteina de canales regulados por voltaje que se abre o cierra (regula) en respuesta a cambios en el potencial electrico a traves de la membrana celular. El canal de sodio regulado por voltaje 1.6 (Nav1.6) es de particular interes como diana terapeutica. Otro tipo de proteina de canales de iones es el canal mecanicamente regulado, para el cual una tension mecanica sobre la proteina abre o cierra el canal. Todavia otro tipo se llama canal regulado por ligando, que se abre o cierra dependiendo de si un ligando particular se une o no a

25 la proteina. El ligando puede ser tanto un resto extracelular, tal como un neurotransmisor, como un resto intracelular, tal como un ion o nucleotido.

[0217] Los canales de iones generalmente permiten flujo pasivo de iones hacia un gradiente electroquimico, mientras que las bombas de iones usan ATP para transportar contra un gradiente. Los transportadores acoplados,

30 tanto antiportadores como simportadores, permiten el movimiento de una especie de ion contra su gradiente, accionado por el movimiento descendente de otra especie de ion.

[0218] Uno de los tipos mas comunes de proteinas de canales, encontradas en la membrana de casi todas las celulas animales, permite la permeacion especifica de iones potasio a traves de una membrana celular. En 35 particular, los iones potasio entran rapidamente a traves de membranas celulares a proteinas de canales de K+ (hasta 10-8 iones por segundo). Ademas, las proteinas de canales de potasio tienen la capacidad para distinguir entre iones potasio y otros iones alcalinos metalicos pequefos tales como Li+ o Na+ con gran fidelidad. En particular, los iones potasio son al menos diez mil veces mas permanentes que los iones sodio. Las proteinas de los canales de potasio normalmente comprenden cuatro subunidades (normalmente identicas), asi sus dianas de la superficie

40 celular estan presentes como tetrameros, permitiendo la union tetravalente de MURP. Un tipo de subunidad contiene seis segmentos hidrofobos de longitud (que puede atravesar la membrana), mientras que los otros tipos contienen dos segmentos hidrofobos.

[0219] Otra familia significativa de canales es el canal de calcio. Los canales de calcio se clasifican

45 generalmente segun sus propiedades electrofisiologicas como canales activados por bajo voltaje (LVA) o activados por alto voltaje (HVA). Los canales HVA comprenden al menos tres grupos de canales, conocidos como canales tipo L, N y P/Q. Estos canales se han diferenciado entre si electrofisiologicamente, ademas de bioquimicamente, basandose en su farmacologia y propiedades de union a ligando. Por ejemplo, las dihidropiridinas, difenilalquilaminas y piperidinas se unen a la subunidad α1 del canal de calcio tipo L y bloquean una proporcion de

50 corrientes de calcio HVA en tejido neuronal, que se llaman corrientes de calcio tipo L. Los canales de calcio tipo N son sensibles a conopeptidos omega, pero son relativamente insensibles a compuestos de dihidropiridina tales como nimodipina y nifedipina. Los canales tipo P/Q, por otra parte, son insensibles a dihidropiridinas, pero son sensibles a la toxina de la arafa de tela en embudo Aga IIIA. Los canales de calcio tipo R, al igual que los canales tipo L, N, P y Q, se activan por grandes despolarizaciones de membrana, y asi se clasifican como canales activados por alto

55 voltaje (HVA). Los canales de tipo R son generalmente insensibles a las dihidropiridinas y conopeptidos omega, pero, al igual que los canales P/Q, L y N, son sensibles a la toxina de la arafa de tela en embudo AgaIVA. Estudios de tincion inmunocitoquimica indican que estos canales estan localizados en todo el cerebro, particularmente en las estructuras de la linea media profunda (caudado-putamen, talamo, hipotalamo, amigdala, cerebelo) y en los nucleos del cerebro medio ventral y tronco encefalico. Los canales de calcio sensibles al voltaje neuronal normalmente consisten en una subunidad central α1, una subunidad α2/δ, una subunidad β y una subunidad de 95 kD.

[0220] Ejemplos no limitantes adicionales incluyen Kir (un canal de potasio de rectificacion interna), Kv (un canal de potasio regulado por voltaje), Nav (un canal de sodio regulado por voltaje), Cav (un canal de calcio

5 regulado por voltaje), CNG (canal regulado por nucleotidos ciclicos), HCN (canal activado por hiperpolarizacion), TRP (un canal de potencial receptor transitorio), CIC (un canal de cloruro), CFTR (un regulador de la conductancia transmembrana de fibrosis quistica, un canal de cloruro), IP3R (un receptor de trisfosfato de inositol), RYR (un receptor de rianodina). Otros tipos de canales son canales de 2 poros, receptores de glutamato (AMPA, NMDA, KA), M2, conexinas y receptores de bucle Cys.

10 [0221] Un disefo comun para proteinas de los canales de iones tales como Kv1.2, Kv3.1, Shaker, TRPC1 y TRPC5 es que tengan seis segmentos que atraviesan la membrana dispuestos del siguiente modo:

extremo N-S1-E1-S2-X1-S3-E2-S4-X2-S5-E3-S6-extremo C

15 [0222] En la que S1-6 son secuencias que atraviesan la membrana, E1-3 son bucles de la superficie extracelular y X1-2 son bucles de la superficie intracelular. El bucle E3 es generalmente el mas largo de los tres bucles extracelulares y es hidrofilo de forma que es una buena diana para la union de farmacos y MURP. La parte que forma los poros de la mayoria de los canales es un complejo multimerico (por ejemplo, tetramerico o raramente

20 pentamerico) de helices alfa que atraviesa la membrana. Generalmente hay un bucle de poros, que es una region de la proteina que retorna a la membrana para formar el filtro de selectividad que determina que especie de ion puede entrar. Tales canales se llaman canales de 'poro-bucle'.

[0223] Los canales de iones son dianas valiosas para el disefo de farmacos debido a que participan en una

25 amplia gama de procesos fisiologicos. En seres humanos existen aproximadamente mas de trescientas proteinas de los canales de iones, muchas de las cuales participan en enfermedades geneticas. Por ejemplo, la expresion o funcion anomala de los canales de iones se ha mostrado que produce una amplia gama de enfermedades que incluyen enfermedades cardiacas, neuronales, musculares, respiratorias y metabolicas. Esta seccion se basa en canales de iones, pero los mismos conceptos y enfoques son igualmente aplicables a todas las proteinas de la

30 membrana, que incluyen 7TM, 1TM, proteinas G y receptores acoplados a proteina G (GPCR), etc. Algunos de los canales de iones son GPGR.

[0224] Los canales de iones normalmente forman grandes complejos macromoleculares que incluyen subunidades de proteinas accesorias estrechamente unidas y el uso combinatorio de tales subunidades contribuye a

35 la diversidad de los canales de iones. Estas proteinas accesorias tambien puede ser las dianas de union de las MURP objeto, microproteinas y toxinas.

[0225] Las MURP objeto pueden disefarse para unirse a cualquiera de los canales conocidos en la tecnica y a aquellos especificamente ejemplificados en el presente documento. Las MURP que presentan una capacidad de 40 union a canales de iones deseada (que engloba especificidad y avidez) pueden seleccionarse por cualquier tecnica recombinante y bioquimica (por ejemplo, expresion y visualizacion) conocida en la tecnica. Por ejemplo, las MURP pueden visualizarse por un paquete genetico que incluye, pero no se limita a, fagos y esporas, y someterse a inmunopurificacion contra membranas celulares intactas, o preferentemente celulas intactas tales como celulas de mamifero completas. Para eliminar el fago que se unen a las otras moleculas de la superficie celular no diana, el 45 enfoque convencional era realizar inmunopurificacion de sustraccion contra lineas celulares similares que tenian un nivel bajo o no detectable del receptor diana. Sin embargo, Popkov y col. (J. Immunol. Methods 291:137-151 (2004)) mostraron que tipos de celulas relacionados no son ideales para la sustraccion debido a que generalmente tienen un nivel reducido, pero todavia significativo, de la diana sobre su superficie, que reduce el numero de clones de fago deseados. Este problema se produce incluso cuando se inmunopurifica sobre celulas que han sido transfectadas 50 con el gen que codifica la diana, seguido de seleccion/sustraccion negativa sobre la misma linea celular que no se transfecto, especialmente si el gen diana nativo no estaba inactivado. En su lugar, Popkov y col. mostraron que la seleccion o inmunopurificacion por sustraccion negativa funciona mucho mejor si se realiza con un exceso de las mismas celulas que se usan para inmunopurificacion normal (seleccion positiva), excepto que la diana se ha bloqueado ahora con un inhibidor especifico para diana de alta afinidad tal como una molecula pequefa, peptido o

55 un anticuerpo para la diana, que hace que el sitio activo no este disponible. Este procedimiento se llama quot;seleccion negativa con celulas enmascaradas por epitopequot;, que es particularmente util en seleccionar MURP objeto con una capacidad de union a canales de iones deseada.

[0226] En el presente documento tambien se desvelan microproteinas, y particularmente microproteinas que presentan capacidad de union hacia al menos una familia de canales de iones. En el presente documento tambien se desvela un paquete genetico que visualiza tales microproteinas. Ejemplos no limitantes de canales de iones a los que las microproteinas objeto se unen son canales de sodio, potasio, calcio, acetilcolina y cloro. Son de particular interes aquellas microproteinas y los paquetes geneticos que visualizan tales microproteinas, que presentan

5 capacidad de union hacia dianas nativas. Las dianas nativas son generalmente moleculas o fragmentos naturales, derivados de los mismos de los que se sabe que la microproteina se une, incluyendo normalmente aquellas dianas de union conocidas de las que se ha informado en la bibliografia.

[0227] En el presente documento tambien se desvela un paquete genetico que visualiza una microproteina de

10 union a canales de iones que ha sido modificada. La microproteina modificada puede (a) unirse a una familia diferente de canal con respecto a la microproteina sin modificar correspondiente; (b) unirse a una subfamilia diferente de la misma familia del canal con respecto a la microproteina sin modificar correspondiente; (c) unirse a una especie diferente de la misma subfamilia de canal con respecto a la microproteina sin modificar correspondiente;

(d) la microproteina se une a un sitio diferente sobre el mismo canal con respecto a la microproteina sin modificar

15 correspondiente; y/o (e) unirse al mismo sitio del mismo canal, pero da un efecto biologico diferente con respecto a la microproteina sin modificarcorrespondiente.

[0228] La Figura 22 y 46 muestran como los dominios de microproteina o toxinas que cada uno se unen a diferentes sitios del mismo canal de iones pueden combinarse en una unica proteina. Los dos sitios de union en los 20 que se unen estas dos microproteinas pueden estar sobre dos canales de familias diferentes, dos canales de la misma familia, pero una subfamilia diferente, dos canales de la misma subfamilia, pero una especie diferente (producto genico), o dos sitios de union diferentes sobre el mismo canal (especie) o pueden unirse (simultaneamente

o no) al mismo sitio de union sobre el mismo canal (especie), ya que los canales son multimericos. Los modulos y dominios de union que se unen a sitios sobre los canales pueden ser dominios de microproteina (natural o no

25 natural, que contienen 2 a 8 disulfuros), peptidos de un disulfuro, o peptidos lineales. Estos modulos pueden seleccionarse independientemente y combinarse, o pueden seleccionarse de una biblioteca para unirse en presencia de un modulo de union activo fijo. En el ultimo caso, la biblioteca de visualizacion visualizaria multiples modulos de que los que uno contendria una biblioteca de variantes. Un objetivo tipico es seleccionar un dimero de esta biblioteca que tiene una mayor afinidad que el monomero activo que era el punto de partida.

30 [0229] En el presente documento tambien se desvela una proteina que comprende una pluralidad de dominios de union a canales de iones, en la que los dominios individuales son dominios de microproteina que han sido modificados de forma que.

35 (a) los dominios de microproteina se unen a una familia diferente de canal con respecto a los dominios de microproteina sin modificar correspondientes; (b) los dominios de microproteina se unen a una subfamilia diferente de la misma familia del canal con respecto a los dominios de microproteina sin modificar correspondientes; (c) los dominios de microproteina se unen a una especie diferente de la misma subfamilia con respecto a los dominios de microproteina sin modificar correspondientes; (d) los dominios de microproteina se unen a un sitio diferente sobre el

40 mismo canal con respecto a los dominios de microproteina sin modificar correspondientes; (e) los dominios de microproteina se unen al mismo sitio del mismo canal, pero dan un efecto biologico diferente con respecto a los dominios de microproteina sin modificar correspondientes; y/o (f) los dominios de microproteina se unen al mismo sitio del mismo canal y dan el mismo efecto biologico con respecto a los dominios de microproteina sin modificar correspondientes. Si se desea, los dominios de microproteina pueden comprender secuencias naturales o no

45 naturales. Los dominios individuales pueden ligarse juntos mediante un ligador heterologo. Los dominios individuales de microproteina pueden unirse a la misma familia de canales o diferente, la misma subfamilia de canales o diferente, la misma especie o diferente de la misma subfamilia, el mismo sitio o diferente sobre el mismo canal.

[0230] Las microproteinas objeto pueden ser una toxina. Preferentemente, la toxina retiene en parte o por

50 completo su espectro de toxicidad. En particular, animales venenosos, tales como serpientes, tienen una gama de especies de presa e intrusas y las toxinas de veneno se diferencian en la actividad para los diferentes receptores de las diferentes especies. El veneno consiste en un gran numero de toxinas relacionadas y sin relacionar, teniendo cada toxina un quot;espectro de actividadquot;, que puede definirse como todos los receptores de todas las especies sobre las que esa toxina tiene actividad medible. Todas las dianas en el 'espectro de actividad' se consideran quot;dianas

55 nativasquot; y esto incluye cualquier diana humana contra la que la toxina es activa. La(s) diana(s) nativa(s) de una microproteina o toxina incluyen todas las dianas de las que se informa en la bibliografia que la toxina inhibe. Cuanto mayor sea la afinidad o actividad sobre una diana, mas probable sera que esa diana sea la diana nativa natural, pero es comun para toxinas que actuan sobre multiples dianas dentro de la misma especie. La(s) diana(s) nativa(s) puede(n) ser receptor(es) humano(s) o no humano(s) contra los que la toxina es activa.

[0231] Para que la toxina retenga la capacidad para unirse a celulas despues de la fusion con el vector de visualizacion, puede desearse probar tanto el extremo N como el extremo C para la fusion y probar una variedad de sitios de fusion (es decir, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 aminoacidos antes de la primera cisteina o despues de la ultima cisteina 5 del dominio de toxina, si el dominio de toxina es un dominio que contiene cisteina) usando un enfoque de biblioteca de ADN sintetico, que preferentemente codifica una biblioteca de ligadores ricos en glicina, que forman la cadena de aminoacidos mas pequefa, no tienen carga y lo mas probablemente es que sean compatibles con la union de la toxina a la diana. Como el grupo amino del extremo N y los grupos carboxilo del extremo C pueden participar en la union a diana, la biblioteca debe contener una lisina o una arginina para imitar el grupo amino positivamente cargado

10 (o fusiones con el extremo N de la toxina) y un glutamato o un aspartato para imitar el grupo carboxilo negativamente cargado (para fusiones con el extremo C de la toxina).

[0232] El (Los) inhibidor(s) que se usan para bloquear la diana durante la seleccion negativa pueden ser moleculas pequefas, peptidos o proteinas, y naturales o no naturales. Ademas de la simple sustraccion, la eleccion

15 de la mezcla de inhibidores es una herramienta valiosa para controlar la especificidad de los inhibidores de los canales de iones que estan siendo disefados. Debido a que hay mas de trescientos canales de iones en total, con especificidades parcialmente solapantes y similitudes de secuencia, y multiples sitios moduladores por canal, teniendo cada uno un efecto diferente, el requisito de especificidad puede ser complejo.

20 [0233] Si se modifica la actividad de una toxina, o si se combinan dos toxinas diferentes en una unica proteina, las dos toxinas pueden unirse al mismo canal en el mismo sitio y tener el mismo efecto fisiologico, o las dos toxinas pueden unirse al mismo canal en el mismo sitio y tener un efecto fisiologico diferente, o las dos toxinas pueden unirse al mismo canal en un sitio diferente, o las dos toxinas pueden unirse a diferentes canales que pertenecen a la misma subfamilia (es decir, Kv1.3 y Kv1.2; que significa producto de un gen o 'especie' diferente), o

25 las dos toxinas pueden unirse a diferentes canales que pertenecen a la misma familia (es decir, ambos son canales de K), o las dos toxinas pueden unirse a canales que pertenecen a familias diferentes (es decir, canales de K frente a canales de Na).

[0234] Los canales de iones tienen normalmente muchos segmentos transmembrana (24 para canales de

30 sodio) y asi ofrecen varios sitios de union diferentes, no competitivos y no solapantes para que los moduladores alteren la actividad del canal de diferentes formas. Un enfoque es crear ligantes para un sitio sobre el mismo canal de iones de ligantes existentes para un sitio diferente, aunque estos sitios no esten relacionados. Para lograr esto, la toxina existente puede usarse como agente que elige diana para una biblioteca de proteinas de 1, 2, 3 o 4 disulfuros que estan separados de la toxina que elige diana por un ligador flexible de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30,

35 35, 40 o 50 aminoacidos. Es util si la afinidad del agente que elige diana no es demasiada alta, de manera que la afinidad de la nueva biblioteca pueda tener una contribucion significativa a la afinidad global. Otro enfoque es crear nuevos moduladores para canales de moduladores existentes para otros canales que estan relacionados en secuencia o en estructura. La familia de las conotoxinas, por ejemplo, contiene moduladores relacionados con secuencia y relacionados con estructura para canales de Ca, K, Na y receptores de acetilcolina nicotinicos. Parece

40 factible convertir un modulador de canales de K en un modulador de canales de Na usando una biblioteca de derivados de conotoxina, o viceversa. Por ejemplo, las conotoxinas kappa inhiben canales de K, las conotoxinas mu y las conotoxinas delta inhiben canales de Na, las conotoxinas omega inhiben canales de Ca y las conotoxinas alfa inhiben receptores de acetilcolina.

45 [0235] La proximidad de sitios de union diferentes, cada uno con un efecto diferente sobre la actividad de los canales, del mismo canal de iones hace atractivo ligar los inhibidores usando ligadores flexibles, que crean un unico inhibidor con dos dominios, cada union en un sitio diferente, o una unica proteina con dos dominios que se unen en copias diferentes del mismo sitio, dando una interaccion de alta afinidad bivalente (avidez). Este enfoque no ha sido tomado por toxinas naturales, supuestamente debido a que deben actuar rapidamente y asi permanecer pequefas

50 con el fin de tener maxima penetracion en el tejido, pero para la farmaceutica la velocidad de accion es menos importante, haciendo esto un enfoque atractivo.

[0236] Asi pueden crearse bibliotecas combinatorias de toxinas/moduladores dimericos, trimericos, tetramericos o multimericos, cada uno nativo o modificado, y cribar directamente estas bibliotecas al nivel de 55 proteinas o inmunopurificar estas bibliotecas usando paquetes geneticos para afinidad mejorada (avidez, si se produce la union simultaneamente en multiples sitios) y luego caracterizar la especificidad y actividad de tales clones multimericos por expresion de proteinas y purificacion, seguido de ensayos de actividad basados en celulas, que incluyen ensayos de fijacion de parches. Los modulos individuales pueden inmunopurificarse y seleccionarse por separado, en aislamiento entre si, o pueden disefarse en presencia de los otros, de forma que el nuevo dominio se

afade a un sistema de visualizacion como una biblioteca que tambien contiene una copia activa fija que sirve de elemento que elige diana para la biblioteca y solo clones que son significativamente mejores que el monomero activo fijado se seleccionan y se caracterizan.

5 [0237] Las Figs. 46 y 47 muestran algunos de los derivados monomericos que pueden prepararse a partir de proteinas nativas (naturales), y algunos de los multimeros que pueden prepararse para unirse a multiples sitios de union diferentes de la diana. Los ligadores se muestran como PEGr rico en glicina, pero los ligadores podrian ser cualquier secuencia y tambien podrian optimizarse usando bibliotecas moleculares, seguido de inmunopurificacion. Pueden crearse bibliotecas dentro de la propia toxina nativa activa usando una variedad de estrategias de

10 mutagenesis como se ha descrito anteriormente, o pueden extender el area existente de contacto con la diana creando bibliotecas sobre el lado del extremo N o extremo C de las toxinas activas, esperando crear contactos adicionales con la diana. Tales bibliotecas pueden basarse en toxinas existentes con actividad conocida para ese sitio, o pueden ser o bibliotecas de 1, 2, 3, 4 disulfuros sin tratamiento previo basandose en andamiajes de microproteina sin relacionar. Estos elementos de contacto adicionales pueden afadirse a uno o ambos lados de los

15 dominios activos, y pueden ser directamente adyacentes al dominio modulador existente o pueden separarse del mismo por ligadores flexibles. El multimero inicial o el multimero mejorado final puede ser un homomultimero o un heteromultimero, basandose en similitud de secuencias de los dominios o basandose en la especificidad diana de los dominios del multimero. Asi, los monomeros que comprenden el multimero pueden unirse a los mismos sitios diana, pero tener las mismas secuencias o diferentes. Con 10-100 toxinas nativas diferentes que son conocidas por

20 unirse a cada familia de canales, y con 2, 3, 4, 5 o 6 dominios por clon, pueden crearse las bibliotecas de visualizacion con una enorme diversidad combinatoria, aunque solo una usa secuencias de toxina nativa. La mutagenesis sintetica de bajo nivel basada en similitud de aminoacidos o en tasas de sustitucion filogenetica dentro de la familia puede usarse para crear bibliotecas de alta calidad de mutantes, de las cuales se espera que una fraccion muy alta retenga la funcion, con una alta probabilidad de funcion potenciada en algunas de las propiedades

25 de interes.

[0238] La capacidad de union de las MURP objeto, microproteinas o toxinas a un canal de iones dado puede medirse en terminos del coeficiente de Hill. El coeficiente de Hill indica la estequiometria de la interaccion de union. Un coeficiente de Hill de 2 indica que 2 inhibidores se unen a cada canal. Tambien puede evaluarse la modulacion

30 alosterica, que es la modulacion de la actividad en un sitio producida por la union en un sitio remoto.

[0239] La actividad biologica o efecto de un canal de iones y la capacidad de las MURP objeto, microproteinas

o toxinas para regular una actividad de canal de iones puede evaluarse usando una variedad de ensayos in vitro e in vivo. Por ejemplo, en la tecnica estan disponibles procedimientos para medir voltaje, medir corriente, medir potencial

35 de membrana, medir flujo de iones, por ejemplo, potasio o rubidio, medir concentracion de iones, medir regulacion, medir segundos mensajeros y niveles de transcripcion, y usar, por ejemplo, colorantes sensibles al voltaje, trazadores radiactivos y electrofisiologia por fijacion de parches. En particular, tales ensayos pueden usarse para probar microproteinas y toxinas que pueden inhibir o activar un canal de iones de interes.

40 [0240] Especificamente, pueden probarse inhibidores o activadores de canales de potencial en comparacion con un control adecuado para examinar el grado de modulacion. Las muestras de control tambien puede ser muestras sin tratar con los activadores o inhibidores candidatos. La inhibicion esta presente cuando un valor de actividad de canales de iones dado con respecto al control es aproximadamente el 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, o incluso menos. La CI50 es una unidad comunmente usada (la concentracion de inhibidor

45 que reduce la actividad del canal de iones al 50%) para determinar el efecto inhibidor. Similar a CI90. La activacion de canales se logra cuando un valor de actividad de canal de iones dado con respecto al control aumenta el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 500%, o mas.

[0241] Pueden evaluarse cambios en el flujo de iones determinando cambios en la polarizacion (es decir,

50 potencial electrico) de la celula o membrana que expresa el canal de interes. Por ejemplo, un procedimiento es determinar cambios en la polarizacion celular midiendo cambios en la corriente (midiendo asi cambios en la polarizacion) con tecnicas de fijacion de voltaje y fijacion de parches, por ejemplo, el modo quot;unido a celulaquot;, el modo quot;al revesquot; y el modo quot;celula completaquot; (vease, por ejemplo, Ackerman y col., New Engl. J. Med. 336:1575-1595 (1997)). Las corrientes de celula completa se determinan convenientemente usando la metodologia convencional

55 (vease, por ejemplo, Hamil y col., Pflugers. Archiv. 391:85 (1981). Otros ensayos conocidos incluyen: ensayos de flujo de rubidio radiomacado y ensayos de fluorescencia usando colorantes sensibles al voltaje (vease, por ejemplo, Vestergarrd-Bogind y col., J. Membrane Biol. 88:67-75 (1988); Daniel y col., J. Pharmacol. Meth. 25:185-193 (1991); Holevinsky y col., J. Membrane Biology 137:59-70 (1994)).

[0242] Los efectos de las MURP candidatas, microproteinas o toxinas sobre la funcion de un canal de interes pueden medirse por cambios en las corrientes electricas o flujo ionico o por las consecuencias de los cambios en las corrientes y flujo. Puede variarse el efecto aguas abajo de las proteinas candidatas sobre el flujo de iones. Por consiguiente, cualquier cambio fisiologico adecuado puede usarse para evaluar la influencia de una proteina 5 candidata sobre los canales de prueba. Los efectos de la proteina candidata pueden medirse por un ensayo de union a toxina. Si las consecuencias funcionales se determinan usando celulas o animales intactos, tambien puede medirse una variedad de efectos tales como liberacion de transmisor (por ejemplo, dopamina), liberacion de hormona (por ejemplo, insulina), cambios transcripcionales a tanto marcadores geneticos conocidos como no caracterizados (por ejemplo, transferencias Northern), cambios del volumen de celulas (por ejemplo, en globulos

10 rojos), inmunorrespuestas (por ejemplo, activacion de linfocitos T), cambios en el metabolismo de las celulas tal como crecimiento celular o cambios de pH, y cambios en los segundos mensajeros intracelulares tales como Ca2+.

[0243] Otras actividades biologicas clave de los canales de iones son selectividad por iones y regulacion. La selectividad es la capacidad de algunos canales para discriminar entre especies de iones, permitiendo que algunos 15 pasen al poro mientras que excluyen otros. La regulacion es la transicion entre estados abiertos y cerrados. Puede evaluarse por cualquiera de los procedimientos conocidos en la tecnica o desvelados en el presente documento

[0244] Todavia otra propiedad biologica por la que la MURP objeto, microproteina o toxina puede seleccionarse es la frecuencia de apertura y cierre de los canales diana, llamado frecuencia de regulacion. La 20 frecuencia de regulacion esta influida por el voltaje (en canales regulados por voltaje, que se abren o se cierran por cambios en el voltaje de la membrana) y la union a ligando. La tasa de transicion entre estados abiertos y cerrados es normalmente lt;10 microsegundos, pero puede aumentarse o disminuirse por otras moleculas. La tasa de flujo (corriente) en el poro cuando se abre es del orden de 10e7 iones por segundo para canales de iones y mucho menos para intercambiadores acoplados. Tras la apertura, algunos canales regulados por voltaje entran en un estado no

25 conductor inactivado en el que son resistentes a la despolarizacion.

EJEMPLOS

Ejemplo: Disero de un olig6mero de glicina-serina basado en secuencias humanas

30 [0245] Se busco en la base de datos del genoma humano secuencias que eran ricas en glicina. Se identificaron tres secuencias como secuencias de donante adecuadas como se muestra en la Tabla X.

Tabla X: Secuencias de donante para el disefo A de GRS.

35

Acceso

Secuencias Aminoacido Proteina

NP 009060

GGGSGGGSGSGGGG 486-499 proteina de dedo de cinc

Q9Y2X9

GSGSGGGGSGG 19-31 proteina de dedo de cinc

CAG38801

SGGGGSGGGSGSG 7-19 MAP2K4

[0246] Basandose en las secuencias en la Tabla X, los presentes inventores disefaron una secuencia rica en glicina que contenia multiples repeticiones del peptido A con la secuencia GGGSGSGGGGS. El peptido A puede oligomerizarse para formar estructuras con la formula (GGGSGSGGGGS)n en la que n esta entre 2 y 40. La Figura 5

40 muestra que todas las posibles subsecuencias 9-meras en oligomeros del peptido A estan contenidas en al menos una de las proteinas enumeradas en la Tabla 3. Asi, los oligomeros del peptido A no contienen epitopes de linfocitos T humanos. La inspeccion de la Figura 5 revela que GRS basada en oligomeros de peptido A puede empezar y terminar en cualquiera de las posiciones del peptido A.

45 Ejemplo: Disero de un olig6mero de glicina-prolina basado en secuencias humanas

[0247] Se disefaron secuencias ricas en glicina basandose en la secuencia GPGGGGGPGGGGGPGGGGPGGGGGGGPGGGGGGPGGG que representa los aminoacidos 146-182 del dominio POU de clase 4 humano con numero de acceso NP 006228. La Figura 6 ilustra que los oligomeros del peptido B

50 con la secuencia GGGGGPGGGGP pueden utilizarse como GRS. Todas las subsecuencias 9-meras que estan contenidas en peptidos con la secuencia (GGGGGPGGGGP)n tambien estan contenidas en la secuencia del dominio POU. Asi, tales secuencias oligomericas no contienen epitopes de linfocitos T.

Ejemplo: Disero de olig6mero de glicina-acido glutamico

[0248] Pueden disefarse secuencias ricas en glicina basandose en la subsecuencia GAGGEGGGGEGGGPGG que es parte de la proteina S6 cinasa ribosomica (numero de acceso BAD92170). Por ejemplo, los oligomeros del peptido C con la secuencia GGGGE formaran secuencias en las que la mayoria de las subsecuencias 9-meras estaran contenidas en la secuencia de la proteina S6 cinasa ribosomica. Asi, las GRS

5 oligomericas de la estructura general (GGGGE)n tienen un riesgo muy bajo de contener epitopes de linfocitos T.

Ejemplo: Identificaci6n de secuencias ricas en glicina hidr6filas humanas

[0249] Se busco en una base de datos de proteinas humanas subsecuencias que eran ricas en residuos de

10 glicina. Estas subsecuencias contuvieron al menos el 50% de glicina. Solo se dejo que se produjeran los siguientes residuos de no glicina en la GRS: ADEHKPRST. Se identificaron 70 subsecuencias que tenian una longitud minima de 20 aminoacidos. Estas subsecuencias se enumeran en el Apendice A. Pueden utilizarse para construir GRS con bajo potencial inmunogenico en seres humanos.

15 Ejemplo: Construcci6n de rPEG�J288

[0250] El siguiente ejemplo describe la construccion de un gen de codones optimizados que codifica una secuencia de URP con 288 aminoacidos y la secuencia (GSGGEG)48. Primero, los presentes inventores construyeron un vector de relleno pCW0051 como se ilustra en la Fig. 40. La secuencia del casete de expresion en 20 pCW0051 se muestra en la Fig. 42. El vector de relleno se baso en un vector pET e incluyo un promotor T7. El vector codifica una secuencia Flag, seguida de una secuencia de relleno que esta flanqueada por sitios BsaI, BbsI y KpnI. Los sitios BsaI y BbsI se insertaron de forma que generaron residuos protuberantes compatibles despues de la digestion como se ilustra en la Fig. 42. La secuencia de relleno fue seguida de una marca His6 y el gen de proteina verde fluorescente (GFP). La secuencia de relleno contiene codones de terminacion y asi celulas de E. coli que 25 llevan el plasmido de relleno pCW0051 formaron colonias no fluorescentes. El vector de relleno pCW0051 se digirio con BsaI y KpnI. Una biblioteca de codones que codifica secuencias de URP de 36 aminoacidos de longitud se construyo como se muestra en la Fig. 41. La secuencia de URP se designo rPEG 136 y tuvo la secuencia de aminoacidos (GSGGEG)6. El inserto se obtuvo hibridando pares de oligonucleotidos sinteticos que codifican la secuencia de aminoacidos GSGGEGGSGGEG, ademas de un par de oligonucleotidos que codifican un adaptador

30 con el sitio KpnI. Se usaron los siguientes oligonucleotidos: pr LCW0057for: AGGTAGTGGWGGWGARGGWGGWTCYGGWGGAGAAGG, pr LCW0057rev:

[0251] ACCTCCTTCTCCWCCRGAWCCWCCYTCWCCWCCACT, pr 3KpnIstopperFor: AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC, pr 3KpnIstopperRev: CCTCGAGTGAAGACGA. Los pares de 35 oligonucleotidos hibridados se ligaron, que produjo una mezcla de productos con longitud variable que representa el numero variable de repeticiones de rPEG J12. El producto correspondiente a la longitud de rPEG J36 se aislo de la mezcla por electroforesis en gel de agarosa y se ligo al vector de relleno digerido con BsaI/KpnI pCW0051. La mayoria de los clones en la biblioteca resultante designada LCW0057 mostro fluorescencia verde despues de la induccion, que muestra que la secuencia de rPEG J36 se habia ligado en marco con el gen GFP. El procedimiento 40 de cribado y multimerizacion iterativa de secuencias de rPEG J36 se ilustra en la Fig. 14. Los presentes inventores cribaron 288 cepas aisladas de la biblioteca LCW0057 para alto nivel de fluorescencia. Las 48 cepas aisladas con fuerte fluorescencia se analizaron por PCR para verificar la longitud del segmento de rPEG J y se identifico que 16 clones tenian la longitud esperada de rPEG J36. Este procedimiento produjo una coleccion de 16 cepas aisladas de rPEG J36, que muestran alta expresion y que se diferencian en su uso de codones. Las cepas aisladas se 45 reunieron y se dimerizaron usando un procedimiento explicado resumidamente en la Fig. 40. Una mezcla de plasmidos se digirio con BsaI/NcoI y un fragmento que comprendia la secuencia rPEG J36 y una parte de GFP se aislo. La misma mezcla de plasmidos tambien se digirio con BbsI/NcoI y el fragmento de vector que comprende rPEG J36, la mayor parte del vector de plasmido, y el resto del gen GFP se aislo. Ambos fragmentos se mezclaron, se ligaron y se transformaron en BL21 y se cribaron cepas aisladas para fluorescencia. Este procedimiento de 50 dimerizacion se repitio dos rondas mas como se ha explicado resumidamente en la Fig. 14. Durante cada ronda, los presentes inventores duplicaron la longitud del gen rPEG J y por ultimo lugar obtuvieron una coleccion de genes que codificaban rPEG J288. La secuencia de aminoacidos y de nucleotidos de rPEG J288 se muestra en la Fig. 15. Puede observarse que el modulo de rPEG J288 contiene segmentos de rPEG J36 que se diferencian en su secuencia de nucleotidos a pesar de tener secuencia de aminoacidos identica. Asi, los presentes inventores

55 minimizaron la homologia interna en el gen y como resultado los presentes inventores redujeron el riesgo de recombinacion espontanea. Los presentes inventores cultivaron BL21 de E. coli que alojaba plasmidos que codificaban rPEG J288 para al menos 20 duplicados y no se observo recombinacion espontanea.

Ejemplo: Construcci6n de rPEG�H288

[0252] Se construyo una biblioteca de genes que codifica un URP de 288 aminoacidos llamado rPEG H288 usando el mismo procedimiento que se uso para construir rPEG J288. rPEG H288 tiene la secuencia de aminoacidos (GSGGEGGSGGSG)24. El diagrama de flujo del procedimiento de construccion se muestra en la Fig.

5 14. La secuencia de aminoacidos completa, ademas de la secuencia de nucleotidos de una cepa aislada de rPEG H288, se facilitan en la Fig. 16.

Ejemplo: Estabilidad en suero de rPEG�J288

10 [0253] Una proteina de fusion que contiene una marca Flag del extremo N y la secuencia de URP rPEG J288 fusionada con el extremo N de la proteina verde fluorescente se incubo en 50% de suero de raton a 37 °C durante 3 dias. Las muestras se extrajeron en diversos momentos de tiempo y se analizaron por SDS-PAGE, seguido de deteccion usando analisis Western. Se uso un anticuerpo contra la marca Flag del extremo N para deteccion por Western. Los resultados se muestran en la Fig. 28, que indica que una secuencia de URP de 288 aminoacidos

15 puede ser completamente estable en suero durante al menos tres dias.

Ejemplo: Ausencia de anticuerpos pree�istentes para rPEG�J288 en suero

[0254] La existencia de anticuerpos contra URP seria una indicacion de una posible respuesta inmunogenica

20 a esta secuencia rica en glicina. Para probar la presencia de anticuerpos existentes en suero, una fusion URP-GFP se sometio a un ELISA inmovilizando URP-GFP sobre un soporte y posteriormente incubando con 30% de suero. La presencia de anticuerpos unidos a URP-GFP se detecto usando un anticuerpo anti-IgG-peroxidasa de rabano picante y sustrato. Los datos se muestran en la Fig. 29. Los datos muestran que la proteina de fusion puede detectarse por anticuerpos contra GFP o Flag, pero no por suero murino. Esto indica que el suero murino no

25 contiene anticuerpos que contienen la secuencia de URP.

Ejemplo: Purificaci6n de una proteina de fusi6n que contiene rPEG�J288

[0255] Los presentes inventores purificaron una proteina con la arquitectura Flag-rPEG J288-H6-GFP. La

30 proteina se expreso en BL21 de E. coli en medio SB. Los cultivos se indujeron con IPTG 0,5 mM durante la noche a 18 °C. Las celulas se recogieron por centrifugacion. El sedimento se resuspendio en tampon TBS que contenia benzonasa y una mezcla de inhibidor de proteasa comercial. La suspension se calento durante 10 min a 75 °C en un bafo de agua para lisar las celulas. El material insoluble se elimino por centrifugacion. El sobrenadante se purifico usando especificidad por ion metalico inmovilizado (IMAC), seguido de una columna con anticuerpo anti-Flag

35 inmovilizado. La Fig. 43 muestra el analisis de PAGE del procedimiento de purificacion. El procedimiento dio proteina con al menos el 90% de pureza.

Ejemplo: Construcci6n de proteina de fusi6n entre rPEG�J288 e interfer6n-alfa

40 [0256] Se disefo un gen que codifica interferon alfa humano usando la optimizacion de codones para expresion de E. coli. El gen sintetico se fusiono con un gen que codificaba rPEG J288. Se dispuso una marca de His6 en el extremo N para facilitar la deteccion y purificacion de la proteina de fusion. La secuencia de aminoacidos de la proteina de fusion se facilita en la Fig. 44.

45 Ejemplo: Construcci6n de la fusi6n de rPEG�J288-G-CSF

[0257] Se disefo un gen que codifica G-CSF humano usando la optimizacion de codones para expresion de

E. coli. El gen sintetico se fusiono con un gen que codificaba rPEG J288. Se dispuso una marca de His6 en el

extremo N para facilitar la deteccion y purificacion de la proteina de fusion. La secuencia de aminoacidos de la 50 proteina de fusion se facilita en la Fig. 44.

Ejemplo: Construcci6n de la fusi6n de rPEG�J288-hGH

[0258] Se disefo un gen que codifica hormona de crecimiento humana usando la optimizacion de codones

55 para expresion de E. coli. El gen sintetico se fusiono con un gen que codificaba rPEG J288. Se dispuso una marca de His6 en el extremo N para facilitar la deteccion y purificacion de la proteina de fusion. La secuencia de aminoacidos de la proteina de fusion se facilita en la Fig. 44.

Ejemplo: E�presi6n de proteinas de fusi6n entre rPEG�J288 yproteinas humanas

[0259] Las proteinas de fusion entre rPEG J288 y dos proteinas humanas, interferon-alfa y hormona de crecimiento humana, se clonaron en un vector de expresion T7 y se transformaron en BL21 de E. coli. Las celulas se cultivaron a 37 °C a una densidad optica de DO 0,5. Posteriormente, las celulas se cultivaron a 18 °C durante 30 5 min. Luego se afadio IPTG 0,5 mM y los cultivos se incubaron en una estufa de incubacion con agitacion a 18 °C durante la noche. Las celulas se recogieron por centrifugacion y la proteina soluble se libero usando BugBuster (Novagen). Ambas fracciones de proteina, insoluble e soluble, se separaron por SDS-PAGE y las proteinas de fusion se detectaron por Western usando un anticuerpo contra la marca His6 del extremo N para la deteccion. La Fig. 45 muestra el analisis Western de las dos proteinas de fusion, ademas de rPEG J288-GFP como control. Todas 10 las proteinas de fusion se expresaron y la mayoria de la proteina estuvo en la fraccion soluble. Esto es una prueba de la alta solubilidad de rPEG J288 debido a que la mayoria de los intentos en la expresion del interferon-alfa y hormona de crecimiento humana en el citosol de E. coli, que se han informado en la bibliografia, produjeron la formacion de cuerpos de inclusion insolubles. La Fig. 45 muestra que la mayoria de las proteinas de fusion se expresan como proteinas de longitud completa, es decir, no se detecto ningun fragmento que sugiriera sintesis

15 incompleta o degradacion de la proteina parcial.

Ejemplo: Construcci6n yuni6n de un multimero de VEGF

[0260] Se construyeron bibliotecas de peptidos restringidos a cisteina como se ha publicado [Scholle, M. D. y

20 col. (2005) Comb Chem High Throughput Screen, 8: 545-51]. Estas bibliotecas se inmunopurificaron contra VEGF humano y se identificaron dos modulos de union constituidos por secuencias de aminoacidos FTCTNHWCPS o FQCTRHWCPI. Los oligonucleotidos que codifican la secuencia de aminoacidos FTCTNHWCPS se ligaron a una secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de URP rPEG A36 con la secuencia (GGS)12. Posteriormente, la secuencia de fusion se dimerizo usando enzimas de restriccion y etapas de ligacion para construir una molecula que

25 contenia 4 copias del modulo de union de VEGF separado por rPEG A36 fusionado con GFP. La afinidad de union por VEGF de proteinas de fusion que contienen entre cero y cuatro unidades de union a VEGF se comparo en la Fig. 30. Una proteina de fusion que contiene solo rPEG A36 fusionado con GFP no muestra afinidad por VEGF. La adicion de numeros crecientes de modulos de union a VEGF aumenta la afinidad de las proteinas de fusion resultantes.

Ejemplo: Descubrimiento de m6dulos de uni6n 1SS contra dianas terap�uticas

[0261] Se generaron bibliotecas de peptidos aleatorias segun Scholle y col. [Scholle, M. D. y col. (2005) Comb Chem High Throughput Screen, 8: 545-51]. Las bibliotecas de peptidos sin tratamiento previo visualizaron peptidos

35 restringidos a cisteina separados 4 a 10 residuos aleatorios. El disefo de la biblioteca se ilustra en la tabla:

Tabla X: Bibliotecas de 1SS sin tratamiento previo:

LNG0001 XXXCXXCXXX X3CX2CX3 NNS NNS NNS TGC NNS NNS TGT NNS NNS NNSLNG0002 XXCXXXCXXX X2CX3CX3 NNS NNS TGC NNS NNS NNS TGT NNS NNS NNSLNG0003 XXCXXXXCXX X2CX4CX2 NNS NNS TGC NNS NNS NNS NNS TGT NNS NNS.LNG0004 XCXXXXXCXX X1CX5CX2 NNS TGC NNS NNS NNS NNS NNS TGT NNS NNSLNG0005 XCXXXXXXCX X1CX6CX1 NNS TGC NNS NNS NNS NNS NNS NNS TGT NNSLNG0006 CXXXXXXXCX CX7CX1 TGC NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS TGT NNSLNG0007 CXXXXXXXXC CX8C TGC NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS TGT LNG0008 CXXXXXXXXXC CX9C TGC NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS TGLNG0009 CXXXXXXXXXXC CX10C

LNG0010 XXXXXXCXXCXXXXXX X6CX2CX6

LNG0011 XXXXXCXXXCXXXXXX X5CX3CX6 LNG0012 XXXXXCXXXXCXXXXX X5CX4CX5 LNG0013 XXXXCXXXXXCXXXXX X4CX5CX5 LNG0014 XXXXCXXXXXXCXXXX X4CX6CX4 LNG0015 XXXCXXXXXXXCXXXX X3CX7CX4 LNG0016 XXXCXXXXXXXXCXXX X3CX8CX3 LNG0017 XXCXXXXXXXXXCXXX X2CX9CX3

LNG0018 XXCXXXXXXXXXXCXX X2CX10CX2

[0262] Las bibliotecas se inmunopurificaron de nuevo contra una serie de dianas terapeuticamente relevantes usando el siguiente protocolo: pocillos sobre placas de ELISA inmunosorbentes se recubrieron con 5 �g/ml de antigeno diana en PBS durante la noche a 4 °C. Las placas recubiertas se lavaron con PBS, y los sitios no especificos se bloquearon con tampon de bloqueo (PBS que contenia tanto 0,5% de BSA como 0,5% de albumina 5 de huevo) durante 2 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron entonces con PBST (PBS que contiene 0,05% de Tween 20), y particulas de fago a 1-5x1012/ml en tampon de union (tampon de bloqueo que contiene 0,05% de Tween 20) se afadieron a los pocillos y se incubaron con agitacion durante 2 h a temperatura ambiente. Entonces, los pocillos se vaciaron y se lavaron con PBST. Las particulas de fago unidas se eluyeron de los pocillos por incubacion con HCl 100 mM durante 10 min a temperatura ambiente, se transfirieron a tubos esteriles y se 10 neutralizaron con base TRIS 1 M. Para la infeccion, SS320 de E. coli de fase logaritmica que se cultivan en Super Broth complementado con 5 �g/ml de tetraciclina se afadieron al eluato de fago neutralizado, y el cultivo se incubo con agitacion durante 30 min a 37 °C. Entonces, los cultivos infectados se transfirieron a tubos mayores que contenian Super Broth con 5 �g/ml de tetraciclina y los cultivos se incubaron con agitacion durante la noche a 37 °C. Los cultivos durante la noche se limpiaron de E. coli por centrifugacion, y el fago precipito en el sobrenadante tras la 15 adicion de una disolucion de 20% de PEG y NaCl 2,5 M a una concentracion de PEG final del 4%. El fago precipitado se recogio por centrifugacion, y el sedimento de fago se resuspendio en 1 ml de PBS, se limpio de E. coli residual por centrifugacion y se transfirio a un tubo nuevo. Las concentraciones de fago se estimaron espectrofotometricamente y el fago se utilizo para la siguiente ronda de seleccion. Los clones individuales se cribaron para afinidad de union a diana despues de 3 o 4 rondas de inmunopurificacion en fago. Las placas 20 individuales de los clones de fago seleccionadas durante la inmunopurificacion se recogieron en Super Broth que contenia 5 �g/ml de tetraciclina y se cultivaron durante la noche con agitacion a 37 °C. Se prepararon placas de ELISA por recubrimiento de antigeno y proteinas de control (BSA, albumina de huevo, IgG) a 3 �g/ml en PBS durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron con PBS y se bloquearon con tampon de bloqueo (PBS que contiene 0,5% de BSA) durante 2 h a temperatura ambiente. Los cultivos durante la noche se limpiaron de E. coli por 25 centrifugacion y el sobrenadante se diluyo 1:10 en tampon de union (tampon de bloqueo que contiene 0,05% de Tween 20) y se transfirio a placas de ELISA despues de lavar con PBST (PBS que contenia 0,05% de Tween 20). Las placas se incubaron con agitacion durante 2 h a temperatura ambiente. Tras el lavado con PBST, anti-M13-HRP (Pharmacia), dilucion 1:5000 en PBS, se afadio a pocillos. Las placas se incubaron con agitacion durante 30 min a temperatura ambiente y se lavaron con PBST, seguido de PBS. Una disolucion de sustrato que contiene 0,4 mg/ml

30 de ABTS y 0,001% de H2O2 en tampon fosfato-citrato 50 mM se afadio a los pocillos, y se dejo que se revelaran durante 40 min despues de que las placas se leyeran en un lector de placas a 405 nm. Estas lecturas de ELISA permitieron la determinacion de la especificidad por clon, y clones especificos para antigeno se secuenciaron comercialmente mediante procedimientos establecidos.

35 Tabla X: Secuencias de modulos de union especifica para EpCAM

S

Y I C H N C L L S sNG0017S3.021

L

R C W G M L C Y A sNG0017S3.017

L

R C I G Q I C W R sNG0017S3.022

L

K C L Y N I C W V sNG0017S3.024

R

P G M A C S G Q L C W L N S P sNG0018S3.015

P

H A L Q C Y G S L C W P S H L sNG0018S3.018

R

A G I T C H G H L C W P I T D sNG0018S3.019

R

P A L K C I G T L C S L A N P sNG0015S3.014

P

H G L W C H G S L C H Y P L A sNG0018S3.012

P

H G L I C A G S I C F W P P P sNG0018S3.007

P

R N L T C Y G Q I C F Q S Q H sNG0018S3.011

P

H N L A C Q N S I C V R L P R sNG0018S3.021

P

H G L T C T N Q I C F Y G N T sNG0018S3.006

L

F C G N V C H F sNG0017S3.006

L

T C W G Q V C F R sNC0017S3.009

R

C P S R V P W C V sNG0017S3.011

Q

L V C G F S D S S R C Y M R sNG0018S3.009

L

L

C Y I T S P G N R L C S P Y sNG0018S3.022

Tabla X: S

ecue ncias de mo dulos de un ion es pecific a para VE GF

W

E C T Q H W C P S sNG0025S3.021

A

P F F S C S F G F C R D L Q T sNG0026S3.035

T

P Y F R C Q F G F C F D S F S sNG0026S3.045

N

P F F Y C V A G K C V D A P L sNG0026S3.029

D

M R F L C R H G K C H D L P L sNG0026S3.034

P

P

F F V C S L G K C R D A H L sNG0026S3.043

P

P

Q F Q C V R G K C F D L T F sNG0026S3.053

I

S T F F C S N G S C V D V P A sNG0026S3.006

P

P

H F R C F N G S C V D L S R sNG0026S3.051

N

V H F W C H N H K C H D L V S sNG0026S3.040

L

F F K C D V G H G C Y D I K H sNG0026S3.038

L

Y F Q C F P N R G C S T L Q P sNG0026S3.002

P

S F F C S P L L G C R D S L S sNG0026S3.052

G

T P R C N P F R Q F C A I P S sNG0026S3.032

L

C L P L G R W C P sNG0025S3.016

T

S P A C N P F R H F C T L P T sNG0026S3.058

Q

P P I C N P F R Q L C G I P L sNG0026S3.046

V

H T F C N P F R Q M C S L P M sNG0026S3.027

R

M V N C N P F N S W C S L P S sNG0026S3.001

S

K H M C N P F H S W C G V P L sNG0026S3.047

R

W P V C N P F L G Y C G I P N sNG0026S3.056

S

K P T C N V F N S W C S V P L sNG0026S3.059

R

P P A C N L F L S W C S Y D S sNG0026S3.004

G

R S V C N P Y K S W C P V R Q sNG0026S3.011

A

S S C K D S P H F R C L F P L sNG0026S3.055

L

A N C P N S P G F L C L H A V sNG0026S3.024

P

F A C P H S S G F R C L Y N I sNG0026S3.005

S

F T C S L F P S P H C T T L R sNG0026S3.054

L

R L C T Y G G G K Y D C S S T sNG0026S3.050

G

S Y C Q Y R P F S S F C N R S sNG0026S3.048

C

S Y N Q V L G R A C sNG0025S3.001

P

H C R Q H P L D R W M C S P S sNG0026S3.057

S

L C S M F G D T P H W N C V P sNG0026S3.007

S

S

C S L F N N T R H W S C T D sNG0026S3.008

Tabla X: Secuencias de modulos de union especifica para CD28

T

T

A Y P D C F W C S L F G P P sNG0028S3.085

M

L D T T I C P W C S L F G P V sNG0028S3.081

M

L X T T I C P W C S L F G P V sNG0028S3.018

E

L L L E R C S W C S L F G P P sNG0028S3.086

S

L S Q Q S C D W C W L F G P P sNG0028S3.060

K

R L L E C G A L C A L F G P P sNG0028S3.008

H

T I L T C D S G F C T L F G P sNG0028S3.012

N

L W H V C H T S L C H S R L A sNG0028S3.092

N

S F Y L C H S S V C G Q L P S sNG0028S3.082

A

G F S C E N Y F F C P P K N L sNG0028S3.016

S

W C T V F G N H D P S C N S R sNG0028S3.004

C

S S N G R W K A H C sNG0028S3.076

L

P N M W R V V V P D V Y D R R sNG0028S3.068

Tabla X: Secuencias de modulos de union especifica para CD28

K

H Y C F G P K S W T T C A R G sNG0030S3.096

P

W C H L C P G S P S R C C Q P sNG0030S3.091

P

E S K L I E E D L N G D V S sNG003053.042

Tabla X: Secuencias de modulos de union especifica para Tiel

I

W D R V C R M N T C H Q H S H sNG0032S3.096

P

Y T I F C L H S S C R s S S S sNG0032S3.087

D

W C L T G P N T L S F c P R R sNG0032S3.031

Tabla X: Secuencias de modulos de union especifica para DR4

L

S T W C L H D V C W P P L K sNG0033S3.072

Tabla X: Secuencias de modulos de union especifica para DR5

V

Y L T Q C G A Q L C L K R T N sNG0034S3.039

P

Y L T S C G D R V C L K R P P sNG0034S3.001

P

V L S R C G G R I C M H D R L sNG0034S3.026

L

K L T P C S H G V C M H R L R sNG0034S3.087

Y Y L T NCP K GH CLRRVDsNG0034S3.080 (continuacion) Tabla X: Secuencias de modulos de union especifica para DR5

L Y L H S C S R F S C Q S S F P H R C S A H G S Tabla X: Secuencias dK T W D C N S A T W D C R D H

G G S G N e mo I R S H F dulos C R S C S de un L M F V C ion es S C C J V pecific P E P T R R L G a para TrkA F L V R S K S sNG0034S3.082 sNG0034S3.040 sNG0034S3.029 sNG0035S3.074 sNG003SS3.089

Ejemplo: Conjugados de farmaco de aEpCAM

5 [0263] Se aislaron peptidos anti-EpCAM de bibliotecas de peptidos aleatorias que se generaron segun Scholle y col. [Scholle, M. D. y col. (2005) Comb Chem High Throughput Screen, 8: 545-51]. Las bibliotecas de peptidos sin tratamiento previo visualizaron peptidos restringidos a cisteina con cisteinas separadas 4 a 10 residuos aleatorios. Despues de tres rondas de seleccion por afinidad con las bibliotecas anteriores se aislaron varios ligandos de peptidos especificos para EpCAM (EpCam1) (Tabla X). Las cepas aisladas de EpCam1 tienen una separacion de

10 cisteinas conservadas de cuatro aminoacidos (CXXXXC). Los ligando de peptido EpCam1 se aleatorizaron entonces suavemente (excepto posiciones de cisteina) con codones que codificaban 3-9 residuos y se movieron en un vector de fagemido. Las bibliotecas de fagemido se seleccionaron posteriormente por afinidad contra EpCAM para aislar ligandos de peptido optimizados para la union (Tabla X, EpCam2). Los ligandos EpCam2 contienen la separacion de cisteinas CXXXXC conservada. Ademas, la mayoria de las secuencias anti-EpCam no contienen un residuo de

15 lisina, que permite la conjugacion con grupos amina libres fuera de las secuencias de union. Ademas, ligandos de peptido anti-EpCam pueden fusionarse geneticamente con secuencias de URP (de cualquier longitud) y multimerizarse usando dimerizacion iterativa. Las MURP anti-EpCAM resultantes pueden usarse para elegir especificamente como diana EpCAM con afinidad elevada con respecto a secuencias de monomero. Un ejemplo de una secuencia de aminoacidos de EpCAM-URP de tetramero se muestra en la Fig. 31. Esta secuencia solo contiene

20 dos residuos de lisina que estan localizados en la marca Flag del extremo N. Las cadenas laterales de estos residuos de lisina son particularmente adecuadas para la conjugacion de farmacos.

Tabla X. Secuencias anti-EpCam

Nombre

Secuencia

EpCam 1

LRCWGMLCYA

LRCIGQICWR

LKCLYNICWV

LFCWGNVCHF

LTCWGQVCFR

RPGMACSGQLCWLNSP

-

PHALQCYGSLCWPSHL

RAGITCHGHLCWPITD

RPALKCIGTLCSLANP

PHGLWCHGSLCHYPLA

PHGLICAGSICFWPPP

PRNLTCYGQICFQSQH

PHNLACQNSICVRLPR

PHGLTCTNQICFYGNT

EpCam 2

HSLTCYGQICWVSNI

PTLTCYNQVCWVNRT

PALRCLGQLCWVTPT

PGLRCLGTLCWVPNR

RNLTCWNTVCYAYPN

RGLKCLGQLCWVSSN

PTLKCSGQICWVPPP

RNLECLGNVCSLLNQ

PTLTCLNNLCWVPPQ

RGLKCSGHLCWVTPQ

HGLTCHNTVCWVHHP

HTLECLGNICWVINQ

HGLTCYNQICWAPRP

HGLACYNQLCWVNPH

(continuacion)

Nombre

Secuencia

RGLACQGNICWRLNP

RAITCLGTLCWPTSP

LTLECIGNICYVPHH

5

Ejemplo: Adici6n de secuencias aleatorias

[0264] Los modulos de union pueden madurarse por afinidad, o alargarse, mediante la adicion de ligadores similares a URP y secuencia aleatoria para el extremo N, extremo C, o tanto el extremo N como C, de la secuencia 10 de union. La Fig. 32 muestra la adicion de secuencias restringidas a cisteina sin tratamiento previo a un modulo de union anti-EpCAM. Pueden generarse bibliotecas de adiciones de secuencias aleatorias usando un enfoque de clonacion de ADN monocatenario o bicatenario. Una vez generadas, las bibliotecas pueden seleccionarse por afinidad contra la proteina diana inicial o una segunda proteina. Por ejemplo, puede usarse una biblioteca de adicion que contiene un modulo de union anti-EpCAM para seleccionar secuencias que contienen 2 o mas sitios de union a

15 la proteina diana.

Ejemplo: Construcci6n de una biblioteca de formaci6n 2SS

[0265] Se disefo una serie de oligonucleotidos para construir una biblioteca basada en el peptido 1SS de 20 union a VEGF FTCTNHWCPS. Los oligonucleotidos incorporan variaciones en los patrones de distancia de cisteina de las secuencias flanqueantes, mientras que la secuencia de peptidos de union a VEGF se mantuvo fija.

Oligonucleotidos directos:

25 [0266] LMS70-1 CAGGCAGCGGGCCCGTCTGGCCCGTG�TTTACTTGTACGAATCATTGGTGTCCT

[0267] LMS70-2 CAGGCAGCGGGCCCGTCTGGCCCGTG�NN�TTTAACTTGTACGAATCATTGGTGTCCT

[0268] LMS70-3 CAGGCAGCGGGCCCGTCTGGCCCGTG�NN�NN�TTTACTTGTACGAATCATTGGTGTCCT [0269] LMS70-4

CAGGCAGCGGGCCCGTCTGGCCCGTG�NHTNHTTTTACTTGTACGAATCATTGGTGTCCT [0270] LMS70-5

[0271] LMS70-6

Oligonucleotidos inversos (complementados inversos):

ACCGGAACCACCAGACTGGCCRCAMNNMNNCGAAGGACACCAATGATTCGTACAA

[0272]

LMS70-1R ACCGGAACCACCAGACTGGCCRCACGAAGGACACCAATGATTCGTACAA

[0273]

LMS70-2R ACCGGAACCACCAGACTGGCCRCAMNNCGAAGGACACCAATGATTCGTACAA

[0274]

LMS70-3R

25 [0275] LMS70-4R ACCGGAACCACCAGACTGGCCRCAAADNADNDNCGAAGGACACCAATGATTCGTACAA

[0276] LMS70-5R ACCGGAACCACCAGACTGGCCRCAAADNADNADNDNCGAAGGACACCAATGATTCGTACAA

[0277] LMS70-6R

35 Diluciones de oligonucleotidos

[0278] Mezcla 1 (de mezclas madre 100 �M): 100 �l de 70-6, 33 �l de 70-5, 11 �l de 70-4, 3,66 �l de 70-3, 1,2 �l de 70-2, 0,4 �l de 70-1. Mezcla 2 (de mezclas madre 100 �M): 100 �l de 70-6R, 33 �l de 70-5R, 11 �lde 70-4R, 3,66 �l de 70-3R, 1,2 �l de 70-2R, 0,4 �l de 70-1R

Ensamblaje por PCR

[0279] 10,0 �l de oligonucleotido molde (5 �M), 10,0 �l de 10 X tampon, 2,0 dNTP (10 mM), 1,0 �l de ADNc

45 polimerasa (Clonetech), 77 �l de H2O destilada. Programa de PCR: 95 °C 1 min, (95 °C 15 s, 54 °C 30 s, 68 °C 15 s) x5, 68 °C 1 min

Amplificacion por PCR

[0280] Cebadores, 10,0 �l de mezcla ensamblada, 10,0 �l de 10 X tampon, 2,0 dNTP (10 mM), 10,0 �l de LIBPTF (5 �M), 10,0 �l de LIBPTR (5 �M), 1,0 �l de ADNc polimerasa (Clonetech), 57 �l de H2O destilada. Programa de PCR: 95 °C 1 min, (95 °C 15 s, 54 °C 30 s, 68 °C 15 s) x25, 68 °C 1 min. El producto se purifico por columna Y10 de Amicon. El producto ensamblado se digirio con SfiI y BstXI y se ligo en el vector de fagemido pMP003. La ligacion se realizo durante la noche a 16 °C en una maquina de PCR MJ. La ligacion se purifico entonces por precipitacion con EtOH. Transformacion en celulas ER2738 competentes frescas por electroporacion.

[0281] La biblioteca resultante se inmunopurifico contra VEGF como se describe a continuacion. Se identificaron varias cepas aisladas que mostraron union mejorada a VEGF con respecto a la secuencia de partida de 1SS. Los datos de union y expresion se muestran en la Fig. 38. Las secuencias y resultados del analisis Western de clones de formacion se muestra en la Fig. 39.

Ejemplo: Inmunopurificaci6n en fago de bibliotecas de formaci6n

[0282] Primera ronda de inmunopurificacion:

[0283] 1) Primera ronda, recubrir 4 pocillos por biblioteca a cribar. Recubrir el pocillo de una placa de ELISA de 96 pocillos Costar con 0,25 �g de antigeno VEGF121 en 25 �l de PBS. Cubrir la placa con un sellante de placas. El recubrimiento puede realizarse durante la noche a 4 °C o durante 1 h a 37 °C.

[0284] 2) Despues de sacudir la disolucion de recubrimiento, bloquear el pocillo afadiendo 150 �l de PBS/1% DE BSA. Sellar e incubar durante 1 h a 37 °C.

[0285] 3) Despues de sacudir la disolucion de bloqueo, afadir 50 �l de fago recientemente preparado (vease el protocolo de reamplificacion de bibliotecas) al pocillo. Solo para la primera ronda, afadir tambien 5 �l de 5% de Tween. Sellar la placa e incubar durante 2 h a 37 °C.

[0286] Mientras tanto, inocular 2 ml de medio SB mas 2 �l de 5 mg/ml de tetraciclina con 2 �l de una preparacion de celulas ER 2738 y permitir el crecimiento a 250 rpm y 37 °C durante 2,5 h. Cultivar 1 cultivo para cada biblioteca que se criba que incluye selecciones negativas. Tomar todas las precauciones para evitar una contaminacion del cultivo con fago.

[0287] 4) Sacudir la disolucion de fago, afadir 150 �l de PBS/0,5% de Tween al pocillo y pipetear 5 veces vigorosamente arriba y abajo. Esperar 5 min, sacudir y repetir esta etapa de lavado. En la primera ronda, lavar de este modo 5 veces, en la segunda ronda 10 veces, y en la tercera, cuarta y quinta ronda 15 veces.

[0288] 5) Despues de sacudir la disolucion de lavado final, afadir 50 �l de 10 mg/ml de tripsina en PBS recientemente preparada, sellar e incubar durante 30 min a 37 °C. Pipetear 10 veces vigorosamente arriba y abajo y transferir el eluato (4 x 50 �l en la primera ronda, 2 x 50 ml en la segunda ronda, 1 x 50 �l en las rondas posteriores) al cultivo de 2 ml de E. coli preparado e incubar a temperatura ambiente durante 15 min.

[0289] 6) Afadir 6 ml de medio SB precalentado, 1,6 �l de carbenicilina y 6 �l de 5 mg/ml de tetraciclina. Transferir el cultivo a un tubo de polipropileno de 50 ml.

[0290] 7) Agitar el cultivo de 8 ml a 250 rpm y 37 °C durante 1 h, afadir 2,4 �l de 100 mg/ml de carbenicilina y agitar durante una hora adicional a 250 rpm y 37 °C.

[0291] 8) Afadir 1 ml de fago auxiliar VCSM 13 y transferir a una botella de centrifuga de polipropileno de 500 ml. Afadir 91 ml de medio SB precalentado (37 °C) y 46 �l de 100 mg/ml de carbenicilina y 92 �l de 5 mg/ml de tetraciclina. Agitar el cultivo de 100 ml a 300 rpm y 37 °C durante 11/2 a 2 h.

[0292] 9) Afadir 140 �l de 50 mg/ml de kanamicina y continuar la agitacion a 300 rpm y 37 °C durante la noche.

[0293] 10) Centrifugar a 4000 rpm durante 15 min a 4 °C. Transferir el sobrenadante a una botella de centrifuga de 500 ml limpia y afadir 25 ml de 20% de PEG-8000/NaCl 2,5 M. Guardar sobre hielo durante 30 min.

[0294] 11) Centrifugar a 9000 rpm durante 15 min a 4 °C. Desechar el sobrenadante, drenar invertido sobre una toalla de papel durante al menos 10 min y limpiar el liquido restante de la parte superior de la botella de centrifuga con una toalla de papel.

[0295] 12) Resuspender el sedimento de fago en 2 ml de tampon PBS/0,5% de BSA/0,5% de Tween pipeteando arriba y abajo a lo largo del lado de la botella de centrifuga y transferir a un tubo de microcentrifuga de 2 ml. Resuspender adicionalmente pipeteando arriba y abajo usando una punta de pipeta de 1 ml, centrifugar a velocidad completa en una microcentrifuga durante 1 min a 4 °C y pasar el sobrenadante a un filtro de 0,2 �m en un tubo de microcentrifuga de 2 ml esteril.

[0296] 13) Continuar la etapa 3) durante la siguiente ronda o guardar la preparacion de fago a 4 °C. Puede afadirse azida de sodio al 0,02% (peso/volumen) para almacenamiento a largo plazo. Solo debe usarse fago recientemente preparado para cada ronda.

[0297] Segunda ronda de inmunopurificacion

[0298] Segunda ronda, recubrir 2 pocillos por biblioteca a cribar. Recubrir el pocillo de una placa de ELISA de 96 pocillos Costar con 0,25 �g de antigeno VEGF121 en 25 �l de PBS. Cubrir la placa con un sellante de placas. El recubrimiento puede realizarse durante la noche a 4 °C o durante 1 h a 37 °C.

[0299] Bloquear tambien 2 pocillos sin recubrir para cada biblioteca que va a usarse como control negativo para el calculo de la relacion de enriquecimiento.

[0300] Tercera ronda de inmunopurificacion

[0301] Tercera ronda, recubrir 1 pocillo por biblioteca a cribar. Recubrir el pocillo de una placa de ELISA de 96 pocillos Costar con 0,25 �g de antigeno VEGF121 en 25 �l de PBS. Cubrir la placa con un sellante de placas. El recubrimiento puede realizarse durante la noche a 4 °C o durante 1 h a 37 °C.

[0302] Bloquear tambien 1 pocillos sin recubrir para cada biblioteca que va a usarse como control negativo para el calculo de la relacion de enriquecimiento.

Ejemplo: Inmunopurificaci6n basada en disoluci6n: [0303] 1. Biotinilar la proteina diana segun el fabricante. [0304] 2. Recubrir un total de 8 pocillos (por seleccion) con 1,0 �g de neutravidina (Pierce) en PBS e incubar

durante la noche a 4 °C.

[0305] 3. Bloquear los pocillos con SuperBlock (Pierce) durante 1 h a temp ambiente. Guardar la placa con tampon de bloqueo hasta que se necesite (en la etapa 6). [0306] 4. Usar 100 nM de proteina diana biotinilada y afadir 1012 fago/ml (en PBST) para un volumen total de

100-200 �l usando SuperBlock mas 0,05% de Tween 20. [0307] 5. Voltear la mezcla de fago-diana a temp ambiente durante al menos 1 h. [0308] 6. Diluir 100 �l de mezcla de fago-diana con 700 �l de SuperBlock, mezclar y afadir 100 �l a cada uno

de 8 pocillos recubiertos con neutravidina (de la etapa 3).

[0309]

7. Incubar durante 5 min a temp ambiente.

[0310]

8. Lavar 8X con PBST.

[0311]

9. Eluir el fago con 100 �l de HCl 100 mM durante 10 min.

[0312]

10. Neutralizar afadiendo 10 �l de TRIS 1 M a pH=8,0.

[0313]

11. Infectar las celulas para siembra o amplificar el fago para una ronda posterior de inmunopurificacion

en disolucion.

Ejemplo: Cribado por ELISA de fago para clones positivos para VEGF

[0314] 1) Afadir 0,5 ml de SB que contiene 50 �g/ml de carbenicilina a placa de 96 pocillos profunda. Recoger una colonia e inocular pocillos.

[0315] 2) Agitar la placa que contiene los cultivos bacterianos a 300 rpm durante la noche a 37 °C.

[0316] 3) Preparar 4 ng/�l de disolucion de proteina diana en PBS. Afadir 25 �l (100 ng) de proteina a cada pocillo e incubar durante la noche a 4 °C.

[0317] 4) Sacudir las placas de ELISA recubiertas y lavar 2x con PBS. Afadir 150 �l/pocillo de PBS + 0,5% de BSA (tampon de bloqueo). Bloquear durante 1 h a TA.

[0318] 5) Centrifugar las gradillas de microtubos (3000 rpm; 20 min).

[0319] 6) Preparar tampon de union (tampon de bloqueo + 0,5% de Tween 20). Tomar alicuotas de 135 �l de tampon de union por pocillo en placa de 96 pocillos de baja union a proteina.

[0320] 7) Sacudir los pocillos sobre placas de ELISA y lavar 2 veces con PBST (PBS + 0,5% de Tween 20).

[0321] 8) Diluir 15 �l de fago de cultivos durante la noche 1:10 en PBST, mezclar por pipeteado y transferir 30

�l a cada pocillo recubierto de proteina. Incubar 2 h a TA con agitacion suave.

[0322] 9) Lavar las placas 6 veces con PBST.

[0323] 10) Afadir 50 �l de anti-M13-HRP 1:5000 en tampon de union a los pocillos. Incubar 30 min con agitacion suave a TA.

[0324] 11) Lavar las placas 4 veces con PBST, seguido de 2 veces con H2O.

[0325] 12) Preparar 6 ml de disolucion de ABTS (5,88 ml de tampon citrato mas 120 �l de ABTS y 2 �l de H2O2). Tomar alicuotas de 50 �l por pocillo sobre cadaplaca de ELISA.

[0326] 13) Incubar a TA y leer la DO a 405 nm usando un lector de placas de ELISA en momentos de tiempo apropiados dependiendo de la sefal (hasta 1 h)

Ejemplo: Dimeri�aci6n de m6dulos de uni6n

[0327] Se crearon bibliotecas visualizadas en fago de 10e9 a 10e11 peptidos ciclicos con 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12 aminoacidos aleatorizados o parcialmente aleatorizados entre las cistinas unidas a disulfuro, y en algunos casos aminoacidos aleatorizados adicionales sobre el exterior del par de cisteinas mediante procedimientos convencionales. La inmunopurificacion de estas bibliotecas de peptidos ciclicos contra varias dianas, que incluyen VEGF humano, dio fidedignamente peptidos que se unieron especificamente a VEGFh y no a BSA, albumina de huevo o IgG.

Ejemplo: Construcci6n e inmunopurificaci6n de una biblioteca basada en ple�ina

[0328] Se disefaron dos bibliotecas basandose en el andamiaje de plexina. La base de datos de proteinas Pfam se uso para alineamiento filogenetico de dominios de plexina que se producen naturalmente como se muestra en la Fig. 35. La parte central del andamiaje de plexina (Cys24-Gly25-Trp26-Cys27) se conserva en ambos disefos de biblioteca y sirvio de region cruzada para la generacion de bibliotecas de N y C. Los esquemas de aleatorizacion de ambas bibliotecas de plexina se muestran en la Fig. 36. Las dos bibliotecas se generaron solapando dos oligonucleotidos que codifican bibliotecas en la region cruzada y usando PCR de estiramiento a traves (quot;pullthroughquot;), seguida de clonacion por restriccion (SfiI/BstXI) y clonacion en el vector de fagemido pMP003. Las bibliotecas de plexina resultantes se designaron LMP031 (biblioteca del extremo N) y LMP032 (biblioteca del extremo C) y cada una se represento por una complejidad de aproximadamente 5 x 108 transformantes independientes. Para la validacion, aproximadamente 24 clones resistentes a Carb de cada biblioteca sin seleccionar se analizaron por PCR. Los clones que dieron un fragmento de tamafo correcto (375 pb) se analizaron adicionalmente por secuenciacion de ADN. Las secuencias de plexina de longitud completa correctas se obtuvieron para el 50% y 67% de clones derivados de las bibliotecas LMP031 y LMP032, respectivamente.

[0329] Las dos bibliotecas se mezclaron juntas a la relacion 50/50 y se inmunopurificaron en paralelo contra VEGF, receptor de muerte Dr4, ErbB2 y HGFR inmovilizados sobre placas de ELISA de 96 pocillos. Se llevaron a cabo cuatro rondas de inmunopurificacion usando 1000 ng de proteina diana en la primera ronda, 500 ng en la segunda ronda, 250 ng en la tercera ronda y 100 ng en la cuarta ronda. Despues de la ronda final de inmunopurificacion, 192 clones resistentes a Carb de cada seleccion se analizaron para unirse a 100 ng de proteina diana inmovilizada, IgG humana, albumina de huevo y BSA por ELISA en fago usando Ab anti-M13 policlonal conjugado con peroxidasa de rabano picante para la deteccion. El mayor porcentaje de clones positivos se obtuvo para DR4 diana (69%), seguido de ErbB2 diana (53%), HGFR (13%) y BoNT diana (1%). Los clones positivos se analizaron adicionalmente por PCR y por secuenciacion de ADN. Todos los clones revelaron secuencias unicas y todos, excepto uno (contra DR4), se derivaron de LMP032 (biblioteca del extremo C). Las secuencias de algunas de las cepas aisladas selectivas para diana identificadas se muestran en la Fig. 37.

[0330] Para analisis adicional, una seleccion de ligantes especificos para diana seleccionada se subclona primero en el vector de expresion de proteina pVS001, luego se produjeron como microproteinas solubles, y finalmente se purificaron por lisis termica. Las microproteinas especificas para diana purificadas se analizan por ELISA de proteinas para confirmar el reconocimiento de diana, por SDS-PAGE para confirmar la formacion de monomeros y por resonancia de plasmones superficiales para medir sus afinidades por la diana. Los mejores clones se usan en la siguiente ronda de generacion de bibliotecas para mejorar adicionalmente sus propiedades.

Ejemplo: Construcci6n de una biblioteca basada en veneno de serpiente

[0331] Se crearon bibliotecas visualizadas en fago de 10e8 a 10e10 del andamiaje de la toxina de 3 dedos (3FT) con aminoacidos parcialmente aleatorizados de la punta del dedo 1 y la parte descendente del dedo 2 o la punta del dedo 3 y la parte ascendente del dedo 2 mediante procedimientos convencionales.

[0332] Se usaron dos andamiajes de 3FT como molde para la generacion de la biblioteca de 3FT (configuracion de dedos 1 y 2). La estructura de un andamiaje de 3FT y un alineamiento de multiples secuencias de secuencias relacionadas se muestra en la Fig. 33. Se disefo una biblioteca de forma que dos bucles de superficie de la toxina estan aleatorizados como se ilustra en la Fig. 34. La biblioteca de andamiaje de 3FT parcialmente aleatorizada se genero solapando cuatro oligonucleotidos que codifican la biblioteca en las regiones de hibridacion y usando PCR de estiramiento a traves (quot;pull-throughquot;), seguido de clonacion por restriccion (SfiI/BstXI) en el vector de fagemido pMP003. La biblioteca de 3FT resultante se designo LMP041.

Ejemplo: Injerto de p�ptidos de uni6n en andamiajes de microproteina � aleatori�aci6n asistida por p�ptidos especificos para diana

[0333] El objetivo aqui es usar los peptidos que se han identificado que son especificos para diana de interes con el fin de generar 3SS mas ligantes especificos para diana. Esta estrategia se ilustra usando transferencia de peptidos especifica para VEGF en la punta del dedo 1 de andamiaje de 3FT y modificando los residuos de AA del dedo 2, que estan en estrecha proximidad de la secuencia especifica para diana para generar ligantes de VEGF de alta afinidad. Las bibliotecas visualizadas de fago de 10e8 a 10e10 del andamiaje de la toxina de 3 dedos (3FT) con secuencia especifica para VEGF de la punta de dedo 1 y parte descendente parcialmente aleatorizada del dedo 2 se creo mediante procedimientos convencionales como se describe en el ejemplo anterior, excepto que 2 cebadores directos del dedo 1 aleatorios se sustituyeron por cebador directo especifico para F1-VEGF que codifica la siguiente secuencia: P S G P S C H T T N H W P I S A V T C P P.

[0334] La biblioteca del andamiaje de 3FT (especifica para VEGF) centrada con el dedo 2 parcialmente aleatorizado se genero solapando cuatro oligonucleotidos que codifican la biblioteca en las regiones de hibridacion y usando PCR de estiramiento a traves (quot;pull-throughquot;), seguido de clonacion por restriccion (SfiI/BstXI) en el vector de fagemido pMP003. La biblioteca de 3FT resultante se designo LMP042.

Ejemplo: Semivida en plasma de una MURP

[0335] La semivida en plasma de MURP pueden medirse despues de inyeccion i.v. o i.p. de la MURP en ratas cateterizadas esencialmente como se describe por [Pepinsky, R. B. y col. (2001) J Pharmacol Exp Ther, 297: 105966]. Pueden extraerse muestras de sangre en diversos momentos de tiempo (5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 5 h, 1 d, 2 d, 3 d) y la concentracion en plasma de la MURP puede medirse usando ELISA. Los parametros farmacocineticos pueden calcularse usando WinNonlin version 2.0 (Scientific Consulting Inc., Apex, NC). Para analizar el efecto del modulo de URP puede compararse la semivida en plasma de una proteina que contiene el modulo de URP con la semivida en plasma de la misma proteina que carece del modulo de URP.

Ejemplo: Prueba de solubilidad de una MURP

[0336] La solubilidad de MURP puede determinarse concentrando muestras purificadas de MURP en tampones fisiologicos como solucion salina tamponada con fosfato a concentraciones diversas en el intervalo de 0,01 mg/ml a 10 mg/ml. Las muestras pueden incubarse para hasta varias semanas. Muestras en las que la concentracion supera la solubilidad de la MURP muestran precipitacion como se indica por turbidez, que puede medirse en un lector de absorbancia. Puede eliminarse material precipitado por centrifugacion o filtracion y medir la concentracion de proteina restante en el sobrenadante usando un ensayo de proteina como el ensayo de Bradford midiendo la absorbancia a 280 nm. Los estudios de solubilidad pueden acelerarse congelando las muestras a -20 °C y posterior descongelacion. Este procedimiento frecuentemente conduce a la precipitacion de proteinas escasamente solubles.

Ejemplo: Actividad de uni6n a suero de MURP

[0337] Pueden recubrirse MURP de interes en placas de microtitulacion y proteinas de control en otros pocillos de la placa. Posteriormente, pueden afadirse muestras de suero de interes a los pocillos durante 1 hora. Posteriormente, los pocillos pueden lavarse con un lavador de placas. Las proteinas del suero unidas pueden detectarse afadiendo anticuerpos contra las proteinas del suero que se han conjugado con enzimas como peroxidasa de rabano picante o fosfatasa alcalina para la deteccion. Otra forma de detectar la union del suero a MURP, afadir la MURP de interes a suero durante aproximadamente 1 hora para permitir la union. Posteriormente, puede inmunoprecipitarse la MURP usando un anticuerpo contra un epitope en la secuencia de MURP. Las muestras precipitadas pueden analizarse por PAGE y opcionalmente por Western para detectar cualquier proteina que co-precipito con la MURP. Pueden identificarse proteinas del suero que muestran co-precipitacion por espectrometria de masas.

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento de aumento de la semivida en suero de una proteina, que comprende:

   fusionar dicha proteina con uno o mas polimeros recombinantes no estructurados (URP), en el que el URP comprende al menos aproximadamente 200 aminoacidos contiguos, y en el que

   (a)

   la suma de los residuos de glicina (G), aspartato (D), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) y prolina

   (P)

   contenidos en el URP constituye mas de aproximadamente el 80% de los aminoacidos totales del URP; y

   (b)

   al menos el 50% de los aminoacidos del URP no estan presentes en la estructura secundaria como se ha determinado por el algoritmo de Chou-Fasman; y en el que dicho URP es sustancialmente incapaz de unirse no especificamente a una proteina del suero; y

   (c)

   el URP tiene una puntuacion de epitope T igual a o inferior a -4.

2. 2.

   El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la semivida en suero de la proteina se prolonga al menos 2 veces.

3. 3.

   El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el URP comprende una secuencia de aminoacidos no naturales.

4. 4.

   El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el URP carece sustancialmente de estructura secundaria como se ha determinado por el algoritmo de Chou-Fasman.

5. 5.

   El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que residuos de glicina contenidos en el URP constituyen al menos aproximadamente el 50% de los aminoacidos totales del URP.

6. 6.

   El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el URP comprende repeticion de secuencias.

7. 7.

   El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la proteina es una proteina farmaceuticamente activa.

8. 8.

   El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la proteina comprende uno o mas modulos seleccionados del grupo constituido por modulos de union, modulos efectores, modulos de multimerizacion, modulos del extremo C y modulos del extremo N.

9. 9.

   El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho URP contiene solo 3, 4, 5 o 6 tipos diferentes de aminoacidos seleccionados del grupo constituido por glicina (G), aspartato (D), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) y prolina (P).

10. 10.

    El procedimiento de la reivindicacion 7, en el que la proteina farmaceuticamente activa esta seleccionada del grupo constituido por citocinas, factores de crecimiento, enzimas, receptores, microproteinas, hormonas, eritropoyetina, adenosina desiminasa, asparaginasa, arginasa, interferon, hormona de crecimiento, hormona liberadora de hormona de crecimiento, G-CSF, GM-CSM, insulina, hirudina, receptor de TNF, uricasa, rasburicasa, axokine, RNasa, ADNsa, fosfatasa, exotoxina de Pseudomonas, ricina, gelonina, desmoteplasa, laronidasa, trombina, enzima de coagulacion de la sangre, VEGF, protropina, somatropina, alteplasa, interleucina, factor VII, factor VIII, factor X, factor IX, dornasa, glucocerebrosidasa, folitropina, glucagon, tirotropina, nesiritida, alteplasa, teriparatida, agalsidasa, laronidasa, metioninasa.

11. 11.

    El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que un tipo cualquiera de los aminoacidos solos seleccionados del grupo constituido por glicina (G), aspartato (D), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) y prolina (P) contenidos en el URP constituye mas de aproximadamente el 20% o mas de los aminoacidos totales del URP.