JP2013048618A - 遺伝子導入効率を高めたウイルスベクター及びその利用 - Google Patents
遺伝子導入効率を高めたウイルスベクター及びその利用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2013048618A JP2013048618A JP2012168861A JP2012168861A JP2013048618A JP 2013048618 A JP2013048618 A JP 2013048618A JP 2012168861 A JP2012168861 A JP 2012168861A JP 2012168861 A JP2012168861 A JP 2012168861A JP 2013048618 A JP2013048618 A JP 2013048618A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- viral vector
- cells
- cancer
- adenovirus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 136
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 title claims abstract description 62
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 title abstract description 8
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 claims abstract description 67
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 claims abstract description 54
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 claims abstract description 54
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 49
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 16
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 72
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 70
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 34
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 claims description 31
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 claims description 30
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 claims description 28
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 23
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 18
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 16
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 162
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 abstract description 65
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 abstract description 7
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 29
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 25
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 20
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 19
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 description 18
- 206010060931 Adenovirus infection Diseases 0.000 description 17
- 208000011589 adenoviridae infectious disease Diseases 0.000 description 17
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 14
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 10
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 9
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 102100038885 Histone acetyltransferase p300 Human genes 0.000 description 7
- 101000882390 Homo sapiens Histone acetyltransferase p300 Proteins 0.000 description 7
- 101000978776 Mus musculus Neurogenic locus notch homolog protein 1 Proteins 0.000 description 7
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 6
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 6
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 102000000509 Estrogen Receptor beta Human genes 0.000 description 5
- 108010041356 Estrogen Receptor beta Proteins 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 235000012680 lutein Nutrition 0.000 description 2
- 229960005375 lutein Drugs 0.000 description 2
- KBPHJBAIARWVSC-RGZFRNHPSA-N lutein Chemical compound C([C@H](O)CC=1C)C(C)(C)C=1\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\[C@H]1C(C)=C[C@H](O)CC1(C)C KBPHJBAIARWVSC-RGZFRNHPSA-N 0.000 description 2
- ORAKUVXRZWMARG-WZLJTJAWSA-N lutein Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=CC(O)CC2(C)C)C ORAKUVXRZWMARG-WZLJTJAWSA-N 0.000 description 2
- 239000001656 lutein Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 2
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- KBPHJBAIARWVSC-XQIHNALSSA-N trans-lutein Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CC(O)CC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=CC(O)CC2(C)C)C KBPHJBAIARWVSC-XQIHNALSSA-N 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- FJHBOVDFOQMZRV-XQIHNALSSA-N xanthophyll Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CC(O)CC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C=C(C)C(O)CC2(C)C FJHBOVDFOQMZRV-XQIHNALSSA-N 0.000 description 2
- PTICRCXOOWOLGJ-UHFFFAOYSA-N 5-fluoro-3,4,7,9-tetrahydropurine-2,6,8-trione Chemical compound FC12NC(NC1NC(NC2=O)=O)=O PTICRCXOOWOLGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 101150089247 B7 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700010154 BRCA2 Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101150008921 Brca2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010028780 Complement C3 Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 101000617546 Homo sapiens Presenilin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 description 1
- 102100032241 Lactotransferrin Human genes 0.000 description 1
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010011536 PTEN Phosphohydrolase Proteins 0.000 description 1
- 102000014160 PTEN Phosphohydrolase Human genes 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000612288 Pinus strobus Putative oxygen-evolving enhancer protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101150020201 RB gene Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 108700025701 Retinoblastoma Genes Proteins 0.000 description 1
- 101710173511 Tensin homolog Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 102100039175 Trefoil factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 101710159283 Vitellogenin-A2 Proteins 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 description 1
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 description 1
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 description 1
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 108091007428 primary miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000000583 progesterone congener Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【解決手段】エストロゲン応答配列を付加した外来遺伝子を組み込んだウイルスベクターは、細胞(特に、癌細胞)に対する遺伝子導入効率が顕著に向上しており、遺伝治療等の有用である。外来遺伝子が癌抑制遺伝子のp53遺伝子又はその変異体であり、ウイルスベクターがアデノウイルスベクターであり、エストロゲン応答配列が直接又はリンカー配列を介して付加。
【選択図】なし
Description
項1.エストロゲン応答配列を付加した外来遺伝子がプロモーターに作動可能に連結されていることを特徴とする、ウイルスベクター。
項2.外来遺伝子が癌抑制遺伝子である、項1に記載のウイルスベクター。
項3.外来遺伝子がp53遺伝子又はその変異体である、項1又は2に記載のウイルスベクター。
項4.外来遺伝子がp53遺伝子又はその変異体であって、p53遺伝子又はその変異体のコドン72がプロリンをコードしている、項1乃至3のいずれかに記載のウイルスベクター。
項5.外来遺伝子がp53遺伝子又はその変異体であって、p53遺伝子又はその変異体のコドン72がアルギニンをコードしている、項1乃至3のいずれかに記載のウイルスベクター。
項6.アデノウイルスベクターである、項1乃至5のいずれかに記載のウイルスベクター。
項7.外来遺伝子の5’末端にエストロゲン応答配列の3’末端に直接結合している、項1乃至6のいずれかに記載のウイルスベクター。
項8.項1乃至7のいずれかに記載のウイルスベクターを含む、医薬組成物。
項9.遺伝子治療に使用される、項8に記載の医薬組成物。
項10.外来遺伝子としてp53遺伝子又はその変異体を含有するウイルスベクターを含み、癌の治療に使用される、項8又は9に記載の医薬組成物。
項11.外来遺伝子がp53遺伝子又はその変異体であって、p53遺伝子又はその変異体のコドン72がプロリンをコードしており、エストロゲン受容体を発現している癌細胞を保有する癌患者に対して適用される、項10に記載の医薬組成物。
項12.外来遺伝子がp53遺伝子又はその変異体であって、p53遺伝子又はその変異体のコドン72がアルギニンをコードしており、エストロゲン受容体を発現している癌細胞を保有していない癌患者を保有する癌患者に対して適用される、項10に記載の医薬組成物。
項13.エストロゲン応答配列が直接又はリンカー配列を介して付加されたp53遺伝子又はその変異体からなる、融合遺伝子。
本発明のウイルスベクターは、エストロゲン応答配列を付加した外来遺伝子がプロモーターに作動可能に連結されていることを特徴とする。以下に、本発明のウイルスベクターについて、詳細に説明する。
本発明は、更に、エストロゲン応答配列が直接又はリンカー配列を介して付加されたp53遺伝子又はその変異体からなる融合遺伝子を提供する。当該融合遺伝子は、ウイルスベクターに挿入され、癌の遺伝子治療に使用することができる。当該融合遺伝子に使用されるエストロゲン配列、p53遺伝子又はその変異体、リンカー配列等については、前述する通りである。また、当該融合遺伝子が挿入されるウイルスベクターの種類等についても、前述する通りである。
上記ウイルスベクターが、外来遺伝子として、疾患の治療に有効な外来遺伝子(例えば、疾患の治療に有効なタンパク質又はペプチドをコードしているDNA、或いは疾患の治療に有効なmiRNA、pre−miRNA、又はpri−miRNAに転写されるDNA等)を含む場合には、上記ウイルスベクターは、医薬組成物として提供することができる。即ち、当該医薬組成物は遺伝子治療の用途で使用される。
1.実験材料及び方法
(1)プラスミド
ヒト絨毛膜組織由来の全RNAを用いて、RT−PCRによってヒトcDNAを得た。PfuUltra high fidelity DNA polymerase (Agilent Technologies社製)を用い、フォワードプライマー(GAAGACCCAGGTCCAGAT:配列番号4)及びリバースプライマー(TTTATGGCGGGAGGT:配列番号5)を利用して、断片化p53の遺伝子(配列番号3における第166〜1143位の塩基配列からなる遺伝子(但し、214〜216位の塩基はCGCである))を増幅させた。得られた断片化p53の遺伝子に対して、EcoR1サイト、エストロゲン応答配列、及び5’末端での開始コドンを付加するために、5’末端での開始コドンを付加し、更にEcoR1サイトを結合させるために、フォワードプライマー(GAATTCGGTCATAGTGACCATATGGAAGACCCAGGTCCAGAT:配列番号6)、及びリバースプライマー(AGTGTGATGGATATCTGCAGAATTCTTTATGGCGGGAGGT:配列番号7)を用いて増幅を行い、エストロゲン応答配列結合の断片化p53遺伝子(配列番号3における第166〜1143位の塩基配列の3’末端に開始コドンが付加され、且つEcoR1サイトが連結されている遺伝子)を調製した。また、別途、得られた断片化p53の遺伝子に対して、EcoR1サイト及び5’末端での開始コドンを付加するために、フォワードプライマー(AGGAATTCATGGAAGACCCAGGTCCAGAT:配列番号8)、及びリバースプライマー(CAGAATTCTTTATGGCGGGAGGT:配列番号9)を用いて増幅を行いエストロゲン応答配列未結合の断片化p53遺伝子を調製した。得られた各PCR産物をアガロースゲル電気泳動により生成し、pGEM−T easy vector (Promega社製)にライゲートし、Escherichia coli DH5αにトランスフェクトした。増幅させたプラスミドをEcoR1で消化し、pIRES−hrGFP II(Agilent Technologies社製)(HAタグとhrGFPの付いたシャトルベクター)にライゲートし、当該シャトルベクターの発現カセットに目的遺伝子をサブクローニングした。なお、断片化p53遺伝子のコドン72がアルギニン(CGC)であったため、p53のコドン72の変種を作製するために、QuikChange II Site−Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies)を用いて、プライマー(GCCAGAGGCTGCTCCCCC:配列番号10、及びCGTGCAAGTCACAGACTT:配列番号11)で、絨毛膜組織由来のcDNA中の対応するアルギニン変種(CGC)をプロリン変種(CCC)に変換したものも作製した。
AdEasyTMXLアデノウイルスベクターシステム(Agilent Technologies社製)を用いて、エストロゲン応答配列結合又は未結合の断片化p53遺伝子を含むシャトルベクターと、pAdEasy−1ベクターを大腸菌(BJ5183株)に同時に形質転換し、相同性組換えを誘発することにより、目的遺伝子を含む発現カセットをアデノウイルスのゲノム内へ移行させ、組み換えアデノウイルスを調製した。
培養細胞に感染するアデノウイルスは、Ad prepを用いた遠心分離にて精製した。次いで、0.6% SDSなどを加えてタンパクを可溶化し、5M NaClによる沈殿後に冷エタノールによる沈殿、0.2mg/mlのプロテイナーゼK及び0.2%SDSを含む溶液での消化、及びフェノール/クロロホルムでの抽出により、DNAを分離した。
子宮体癌細胞株としてHHUA細胞及びKLE細胞を用いた。また、結腸癌としてSW48細胞を用いた。
アデノウイルスで癌細胞を感染させてから48時間後に、癌細胞を0.25%トリプシン溶液に分散させて、fluorescein−conjugated annexin V(Becton−Dikinson社製)と共にインキュベートした。その後、癌細胞を洗浄して、FACScanを用いたフローサイトメトリーにて分析した。
( )を用いて、アデノウイルス感染後72時間の細胞からDNAを抽出した。抽出されたDNAについてTaqManプローブを用いたリアルタイムPCRに供して、p53遺伝子量を測定することにより、細胞に感染したアデノウイルス量を定量した。p53遺伝子量は、予め、既知のコピー数を持つp53遺伝子を用いてコピー数とPCRのサイクル数との関係を示す検量線を作製することにより、サンプルの増幅曲線からコピー数を算出することにより行った。
RNeasy kit(Quiagen社製)を用いて、アデノウイルス感染後72時間の細胞からRNAを抽出した。RNAを逆転写した後に、TaqManプローブを用いたリアルタイムPCRにより、p53mRNA量を分析した。p53mRNA量は、細胞内で一定濃度存在すると考えられる18S ribosomal RNAの発現量に対するp53Rcが挿入されたアデノウイルスを感染させた細胞の1検体における該当mRNA量比を1とした場合の相対値として算出した。
図1に、コドン72がアルギニンである断片化p53遺伝子(p53Rc)、コドン72がプロリンである断片化p53遺伝子(p53Pc)、コドン72がアルギニンである断片化p53遺伝子にエストロゲン応答配列が付加されているもの(EREp53Rc)、又はコドン72がプロリンである断片化p53遺伝子にエストロゲン応答配列が付加されているもの(EREp53Pc)が挿入されたアデノウイルスをHHUA細胞に感染させて、48時間後にGFP蛍光を示す細胞を観察した結果を示す。図1から明らかなように、EREp53Pcを含むアデノウイルスを使用した場合は、GFPの蛍光を示す細胞が顕著に多く、p53Rc、p53Pc、及びEREp53Rcに比してアデノウイルスの感染率が高いことが確認された。この結果から、ERβを発現しているHHUA細胞に対して、EREp53Pcを含むアデノウイルスの感染率が顕著に高いことが確認された。
1.実験材料及び方法
(1)組み換えアデノウイルス
実施例1と同様の方法で、p53Rc、p53Pc、EREp53Rc、又はEREp53Pcが挿入されたアデノウイルスを作製した。
実施例1と同様の方法で、HHUA細胞を培養した。
未処置群
1×105/cm2のHHUA細胞が底面に生着しているシャーレの培養液(に、前記組み換えアデノウイルス10 MOI(multiplicity of infection)未満の一定量を添加して、37℃5%CO2の条件で培養することにより行った。
エストラジオール添加群
1×105/cm2のHHUA細胞が底面に生着しているシャーレの培養液に、1×109Mのエストラジオール(和光純薬工業株式会社)を添加し、前記組み換えアデノウイルス10 MOI(multiplicity of infection)未満の一定量を添加して、37℃5%CO2の条件で培養することにより行った。
X線照射群
1×105/cm2のHHUA細胞が底面に生着しているシャーレの培養液に、前記組み換えアデノウイルス10 MOI(multiplicity of infection)未満の一定量を添加して、37℃5%CO2の条件で培養し、アデノウイルス添加から24時間後に、150kVで10GyのX線を照射して、引き続き培養を行った。
各群のアデノウイルス感染後48時間のHHUA細胞について、実施例1と同様の方法で、fluorescein−conjugated annexin Vを用いた染色を行い、FACScanを用いたフローサイトメトリーにて分析した。
各群のアデノウイルス感染後72時間のHHUA細胞について、実施例1と同様の方法で、細胞内p53mRNA量及びp300mRNA量を測定した。p53mRNA量及びp300mRNA量は、細胞内で一定濃度存在すると考えられる18S ribosomal RNAの発現量に対するp53Rcが挿入されたアデノウイルスを感染させた未処置群の細胞の1検体における該当mRNA量比を1とした場合の相対値として算出した。
図8に、アデノウイルスの感染から48時間後の各群のHHUA細胞について、Annexin V陽性細胞の割合(%)を測定した結果を示す。また、図9に、アデノウイルスの感染から72時間後の各群のHHUA細胞について、PI陽性細胞の割合(%)を測定した結果を示す。この結果から、実施例1での結果と同様に、EREp53Pcを含むアデノウイルスを使用した場合は、annexin V陽性細胞及びPI陽性細胞の割合が高く、アポトーシスが効率的に誘導されていることが確認された。また、未処置群、エストラジオール添加群、及びX線照射群の間では、Annexin V陽性細胞及びPI陽性細胞の割合については、有意な差がなかったことから、本発明のウイルスベクターによる感染と感染細胞内での機能発現は、感染時のエストロゲンやX線照射の有無には影響されないことが分かった。
Claims (13)
- エストロゲン応答配列を付加した外来遺伝子がプロモーターに作動可能に連結されていることを特徴とする、ウイルスベクター。
- 外来遺伝子が癌抑制遺伝子である、請求項1に記載のウイルスベクター。
- 外来遺伝子がp53遺伝子又はその変異体である、請求項1又は2に記載のウイルスベクター。
- 外来遺伝子がp53遺伝子又はその変異体であって、p53遺伝子又はその変異体のコドン72がプロリンをコードしている、請求項1乃至3のいずれかに記載のウイルスベクター。
- 外来遺伝子がp53遺伝子又はその変異体であって、p53遺伝子又はその変異体のコドン72がアルギニンをコードしている、請求項1乃至3のいずれかに記載のウイルスベクター。
- アデノウイルスベクターである、請求項1乃至5のいずれかに記載のウイルスベクター。
- 外来遺伝子の5’末端にエストロゲン応答配列の3’末端に直接結合している、請求項1乃至6のいずれかに記載のウイルスベクター。
- 請求項1乃至7のいずれかに記載のウイルスベクターを含む、医薬組成物。
- 遺伝子治療に使用される、請求項8に記載の医薬組成物。
- 外来遺伝子としてp53遺伝子又はその変異体を含有するウイルスベクターを含み、癌の治療に使用される、請求項8又は9に記載の医薬組成物。
- 外来遺伝子がp53遺伝子又はその変異体であって、p53遺伝子又はその変異体のコドン72がプロリンをコードしており、エストロゲン受容体を発現している癌細胞を保有する癌患者に対して適用される、請求項10に記載の医薬組成物。
- 外来遺伝子がp53遺伝子又はその変異体であって、p53遺伝子又はその変異体のコドン72がアルギニンをコードしており、エストロゲン受容体を発現していない癌細胞を保有する癌患者に対して適用される、請求項10に記載の医薬組成物。
- エストロゲン応答配列が直接又はリンカー配列を介して付加されたp53遺伝子又はその変異体からなる、融合遺伝子。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012168861A JP6099121B2 (ja) | 2011-07-29 | 2012-07-30 | 遺伝子導入効率を高めたウイルスベクター及びその利用 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2011167316 | 2011-07-29 | ||
JP2011167316 | 2011-07-29 | ||
JP2012168861A JP6099121B2 (ja) | 2011-07-29 | 2012-07-30 | 遺伝子導入効率を高めたウイルスベクター及びその利用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013048618A true JP2013048618A (ja) | 2013-03-14 |
JP6099121B2 JP6099121B2 (ja) | 2017-03-22 |
Family
ID=48011252
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012168861A Expired - Fee Related JP6099121B2 (ja) | 2011-07-29 | 2012-07-30 | 遺伝子導入効率を高めたウイルスベクター及びその利用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6099121B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014141940A1 (ja) | 2013-03-12 | 2014-09-18 | 株式会社ジェイテクト | 風力発電装置 |
-
2012
- 2012-07-30 JP JP2012168861A patent/JP6099121B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
JPN6016007128; 日本婦人科腫瘍学会雑誌 (2011-06-25) vol.29, no.3, p.580(P45-2) * |
JPN6016007130; 日本癌学会学術総会記事 (2010) vol.69, p.322(P-0686) * |
JPN6016007132; 日本産科婦人科学会雑誌 (2009) vol.61, no.2, p.536(P2-32) * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014141940A1 (ja) | 2013-03-12 | 2014-09-18 | 株式会社ジェイテクト | 風力発電装置 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP6099121B2 (ja) | 2017-03-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6375273B2 (ja) | 腫瘍選択的e1aおよびe1b変異体 | |
JP5690814B2 (ja) | 抗原特異的な免疫応答を高めるための組成物及び方法 | |
US11850215B2 (en) | Recombinant adenoviruses and stem cells comprising same | |
JP2022500013A (ja) | グリコーゲンシンターゼキナーゼ−3(gsk3)のコード領域を含む複製能力ある組換えウイルス及び異常細胞を殺す方法 | |
JP6014029B2 (ja) | Reic発現アデノウイルスベクター | |
FX Gnant et al. | Sensitization of tumor necrosis factor α-resistant human melanoma by tumor-specific in vivo transfer of the gene encoding endothelial monocyte-activating polypeptide II using recombinant vaccinia virus | |
JP6238485B2 (ja) | Auroraキナーゼプロモーターを含む増殖制御型ウイルスベクター | |
JP6099121B2 (ja) | 遺伝子導入効率を高めたウイルスベクター及びその利用 | |
WO2011118819A1 (ja) | サービビンプロモーターを含む増殖制御型ウイルスベクターによる造血器腫瘍の遺伝子治療 | |
EP4048798B1 (en) | Adenovirus comprising a modified adenovirus hexon protein | |
CN111500632B (zh) | 表达st13和trail的溶瘤腺病毒构建及其应用 | |
CN113577259A (zh) | 组合物在制备用于抑制或治疗肿瘤的药物中的应用 | |
JP2010536380A (ja) | 転写後遺伝子サイレンシングのための方法及び組成物 | |
KR101909905B1 (ko) | 암 줄기세포 및 암세포 특이적 유전자 발현 시스템 | |
NL2031110B1 (en) | Recombinant adeno-associated virus vector, recombinant adeno-associated virus aav8-pd1 and use thereof | |
JP7406263B2 (ja) | 改変アデノウイルス及びこれを含む医薬 | |
US20240165175A1 (en) | Muc16 promoter containing virus | |
Zhang et al. | IFN-γ Enhances the Efficacy of Exosomes Derived from Mesenchymal Stem Cells in Myocardial Infarction Rats via miR-21 Stimulated by STAT1 | |
JP6913930B2 (ja) | 扁平上皮癌に対する抗腫瘍剤 | |
CN115651932A (zh) | 一种靶向消化道肿瘤双靶向溶瘤腺病毒的构建方法及其应用 | |
Robert et al. | Oncolytic Adenovirus for the Targeting of Paclitaxel-Resistant Breast Cancer Stem Cells | |
CN115038455A (zh) | 复制增强的溶瘤腺病毒 | |
US20100130596A1 (en) | Rad51 derived cancer cell specific promoters for targeted anti- cancer therapy | |
JPWO2014050927A1 (ja) | Va遺伝子破壊アデノウイルスベクターおよびそれを調製するための前駆体ベクター | |
WO2004016652A2 (en) | Mammaglobin promoter |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20150727 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20160224 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160301 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20160427 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160630 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160830 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20161027 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161209 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170207 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170216 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6099121 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |