JP2012532614A - バイオ絹糸タンパク質ベース核酸送達システム - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、米国立衛生研究所(Tissue Engineering Resource Center)により与えられた助成金P41 EB002520による資金供与を受けた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
本願は、2009年7月10日に出願された米国特許仮出願第61/224,618号の優先権の恩典を主張する。米国特許仮出願第61/224,618号の内容はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
本発明は、分子遺伝学、遺伝子療法、生体高分子核酸送達システム、およびバイオ医薬品に関する。より具体的には、本態様は、高度に調整される核酸送達システムの新たなファミリーとしてバイオ絹糸タンパク質を提供する。
遺伝子発現の分子機構についての知識が増えるにつれて、数十年前に遺伝子療法という概念が生まれた。組換えDNA法の出現と共に、クローニングされた遺伝子が利用可能になり、外来遺伝子によってインビトロで哺乳動物細胞の遺伝子異常および疾患表現型を実際に補正できると証明するために用いられた。効率的なレトロウイルスベクターおよび他の遺伝子導入法によって、インビトロおよびインビボでの効率的な表現型補正することが説得力をもって証明されたので、今や、遺伝子療法は治療法として広く受け入れられている。最近、様々な疾患を治療するために、RNA干渉または遺伝子サイレンシングがある特定の配列のRNAを分解する新手法となってきている。欠陥のある遺伝子からコピーされたRNAと適合するように低分子ヘアピン型RNAが設計されれば、その遺伝子の異常タンパク質産物は産生されないだろう。
絹糸タンパク質は、生分解性および生体適合性もある機械的に頑強な材料構造に自己組織化する。このことから、絹糸タンパク質は核酸送達に有用なことが示唆される。絹糸タンパク質はまた遺伝子工学を介して化学的性質、分子量、および他の設計特性を調整することができるので、この核酸送達システムは微調整することができる。本発明は、概して、標的細胞への核酸(例えば、プラスミドDNA、低分子干渉RNA)送達を対象としている。
本発明は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコール、および試薬などに限定されず、従って、変更してもよい。本明細書において用いられる専門用語は特定の態様の説明のみを目的とし、本発明の範囲の限定を目的とせず、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ定義される。
値は、平均値±標準偏差、n=30、a, b 同じ上付き符号を共有しない群の間では、p<0.05で統計的有意差が見られた。
クモ絹糸反復ユニットは、クモであるネフィラ・クラビペス(Nephila clavipes)の引き糸タンパク質MaSp1配列の天然配列(Accession P19837)に由来するコンセンサス反復
に基づいて選択された。この反復の6つの連続コピーを含有する6マーは、以前に公開された手順に従って、制限部位NheIおよびSpeIを有するリンカーによって改変されているpET-30aに、クローニングインサートを導入することによって作り出した。Prince et al., 34 Biochem. 10879-85(1995)。15個のリジン残基をコードする合成オリゴヌクレオチドの配列は以下の通りであった。
構築物pET30-6マー(対照)、pET30-6マー-15リジン、pET30-6マー-30リジン、およびpET30-6マー-45リジンを用いて、SlyDタンパク質産生に欠陥のある変異株である大腸菌RY-3041株を形質転換した。タンパク質発現は以前に報告された方法によって行った。Huang et al., 278 J. Biol. Chem. 46117-23(2003); Yan et al., 276 J. Biol. Chem. 8500-06(2001)。簡単に述べると、細胞を、カナマイシン(50μg/ml)を含有するLBブロス中で37℃で培養した。OD600nmが0.6になった時に、0.5mM IPTG(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を添加することによってタンパク質発現を誘導した。約4時間のタンパク質発現の後に、細胞を13,000gの遠心分離によって収集した。細胞ペレットを変性緩衝液(100mM NaH2PO4、10mM Tris HCl、8M尿素、pH8.0)に再懸濁し、12時間攪拌することによって溶解した後に、13,000rcf、4℃で30分間、遠心分離した。変性条件下でNi-NTAアガロース樹脂(Qiagen, Valencia, CA)および20mMイミダゾールを上清に添加することによって(バッチ精製)、タンパク質のHis-タグ精製を行った。カラムをpH6.3の変性緩衝液で洗浄した後に、pH4.5の変性緩衝液(イミダゾールを含まない)によってタンパク質を溶出した。4〜12%プレキャストNuPage Bis-Trisゲル(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を行った。ゲルをコロイダルブルー(Invitrogen)で染色した。精製試料をMilli-Q水に対して大規模に透析した。透析のために、MWCOが3,500のSlide-A-Lyzer Cassettes(Pierce, Rockford, IL)を使用した。透析した試料を1mLのヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)に溶解した。配列を確認するために、Tufts University Core FacilityにおいてLC/MS/MS分析によって組換えタンパク質をさらに特徴付けた。
GFP(EGFP、7,650bp)をコードするpDNAをコンピテントDH5α大腸菌(Invitrogen)において増幅し、EndoFree Plasmid Maxi Kits(Qiagen, Hilden, Germany)を用いて精製した。DNA濃度は260nmにおける吸光度によって求めた。組換え絹糸タンパク質とpDNAの複合体を調製するために、様々なN/P比で、絹糸タンパク質を含有するHFIP溶液(10mg/mL)をpDNA溶液(370μg/mL)と混合した。ここで、P/N比は、組換え絹糸とpDNAのヌクレオチドとのモル比を指す。組換え絹糸およびpDNAの混合物を室温(約20℃)で一晩インキュベートした後に、特徴付けを行った。pDNA複合体を、アガロースゲル電気泳動、動的光散乱(DLS, Brookhaven Instruments Corporation, Holts ville, NY)、および原子間力顕微鏡(AFM, Dimension V, Veeco Instruments Inc., Plainview, NY)によって特徴付けた。アガロースゲル電気泳動のために、10μLの各試料をローディング緩衝液と混合し、臭化エチジウムを含有する1%アガロースゲル上で分析した(TAE緩衝液、100V、60分)。DLSは、532nmレーザーを用いて37℃、散乱角90°で行い、粒径およびその分布は、Dynamic Light Scatteringソフトウェア(Brookhaven Instruments Corp.)を用いて分析した。pDNA絹糸複合体溶液(約70μL)を超純水(450μL)に添加し、次いで、DLS測定のために試料として使用した。AFM観察は、タッピングモードAFMにおいて、ばね定数2.8N/m、長さ200〜250μmのシリコンカンチレバーを用いて室温で空気中で観察した。以前に報告された方法によって、物体の真の寸法を得るために、カンチレバー先端コンボリューション効果(tip-convolution effect)の較正を行った。Numata et al., 6 Macromol. Biosci. 41-50(2006)。
絹糸フィブロンを、B.モリ(B.mori)カイコの繭(Tajima Shoji Co., Yokohama, Japan)から抽出し、以前に述べられたように絹糸溶液(5wt%)を調製した。Jin & Kaplan, 424 Nature 1057-61(2003)。絹糸溶液を24マルチウェルプレートおよび96マルチウェルプレートの中で成型し、溶媒を蒸発させた後に絹糸フィルムを得た。その後に、絹糸フィルムをエタノール溶液(70%)で滅菌した。pDNA複合体を含有する絹糸フィルムを調製するために、pDNA絹糸複合体溶液(HFIP/水)を絹糸フィルム上で成型し、溶媒(HFIP/水)を除去するために室温で少なくとも12時間乾燥させた。遊離pDNAを除去するために、絹糸フィルムを超純水(DNアーゼ、RNアーゼフリー、Invitrogen)で洗浄した後に、細胞トランスフェクション実験において使用した。
HEK細胞(293FT)は組換えタンパク質の発現ツールとして広く役立っており、モデル細胞株として使用した。例えば、Thomas & Smart, 51 J. Pharmacol. Toxicol. Methods 187-200(2005)を参照されたい。DMEM、10%FBS、5%グルタミン、5%NEAAからなる培地を用いて、培養物をコンフルエンスになるまで増殖させた。培養物を、0.25%トリプシン(Invitrogen)を用いて培養基からはがし、次いで、2.5μLリポフェクタミン(Invitrogen)と共に、24マルチウェルプレートに入っているpDNA絹糸複合体がロードされた絹糸フィルム上に5,000個の細胞/cm2の密度で再プレートした。37℃で24時間、細胞をインキュベートした後に、GFPプラスミドトランスフェクションを評価するために、蛍光画像を蛍光顕微鏡(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)によって得た。発現結果(n=4)は、計数した全細胞に対するGFP蛍光陽性細胞のパーセントとして表した。
クモ絹糸反復ユニットは、クモであるネフィラ・クラビペスの引き糸タンパク質MaSp1配列の天然配列(Accession P19837)に由来するコンセンサス反復
に基づいて選択された。この反復の6つの連続コピーおよび30個のリジンを含有する絹糸6マー-30lysを、以前に公開された手順に従って、クローニングインサートをpET-30aに導入することによって作り出した。Prince et al., 1995; Huang et al., 2003。RGD残基をコードする合成オリゴヌクレオチドの配列は以下の通りであった。
NheIおよびSpeIの制限部位をイタリック体で示した。RGD-aおよびRGD-bは、アニーリングして二本鎖DNAを形成する相補オリゴヌクレオチドである。図11に示したように、DNAリガーゼ(New England Biolabs Inc, Ipswich, MA)によって、RGD配列の二本鎖DNAをpET30-6マー-ポリリジンと連結して、5種類のpET30-6マー-ポリリジン-RGDを作製した。
構築物pET30-RGD-6マー-30リジン、pET30-RGD-6マー-30リジン-RGD、pET30-6マー-30リジン-RGD、pET30-6マー-30リジン-2xRGD、およびpET30-11xRGD-6マー-30リジンを用いて、SlyDタンパク質産生に欠陥のある変異株である大腸菌RY-3041株を形質転換した。タンパク質発現は以前に報告された方法によって行った。Huang et al., 278 J. Biol. Chem. 46117-23(2003); Yan et al., 276 J. Biol. Chem. 8500-06(2001)。簡単に述べると、細胞を、カナマイシン(50μg/ml)を含有するLBブロス中で37℃で培養した。OD600nmが0.6になった時に、1.0mM IPTG(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を添加することによってタンパク質発現を誘導した。約4時間のタンパク質発現の後に、細胞を13,000gの遠心分離によって収集した。細胞ペレットを変性緩衝液(100mM NaH2PO4、10mM Tris HCl、8M尿素、pH8.0)に再懸濁し、12時間攪拌することによって溶解した後に、13,000g、4℃で30分間、遠心分離した。変性条件下でNi-NTAアガロース樹脂(Qiagen, Valencia, CA)および20mMイミダゾールを上清に添加することによって(バッチ精製)、タンパク質のHis-タグ精製を行った。カラムをpH6.3の変性緩衝液で洗浄した後に、pH4.5の変性緩衝液(イミダゾールを含まない)によってタンパク質を溶出した。4%〜12%プレキャストNuPage Bis-Trisゲル(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を行った。ゲルをコロイダルブルー(Invitrogen, Carlsbad, CA)で染色した。精製試料をMilli-Q水に対して大規模に透析した。透析のために、MWCOが100〜500DaのSpectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membranes(Spectrum Laboratories Inc, Rancho Dominguez, CA)を使用した。配列および分子量を確かめるために、Tufts University Core FacilityにおいてMALDI-TOFによって組換えタンパク質をさらに特徴付けた。
GFP(EGFP、7,650bp)をコードするプラスミドDNA(pDNA)をコンピテントDH5α大腸菌(Invitrogen)において増幅し、EndoFree Plasmid Maxi Kits(Qiagen, Hilden, Germany)を用いて精製した。DNA濃度は260nmの吸光度によって求めた。組換え絹糸タンパク質とpDNAとの複合体を調製するために、絹糸タンパク質(10mg/mL)を含有する溶液を様々なP/N比でpDNA溶液(370μg/mL)と混合した。ここで、P/N比は、組換え絹糸ポリマーとpDNAのヌクレオチドとの重量比を指す。組換え絹糸およびpDNAの混合物を室温(約20℃)で一晩インキュベートした後に、特徴付けを行った。pDNA複合体を、アガロースゲル電気泳動、ゼータ電位メーター(Zetasizer Nano-ZS, Malvern Instruments Ltd, Worcestershire, UK)、DLS(Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY)、およびAFM(Dimension V, Veeco Instruments Inc., Plainview, NY)によって特徴付けた。アガロースゲル電気泳動のために、10μLの各試料をローディング緩衝液と混合し、臭化エチジウムを含有する1%アガロースゲル上で分析した(TAE緩衝液、100V、60分)。試料のゼータ電位およびゼータ偏差(zeta deviation)をゼータ電位メーターによって3回測定した。Dispersion Technology Software バージョン5.03(Malvern Instruments Ltd)を用いて、平均データを得た。DLSは532nmレーザーを用いて、37℃、散乱角90°で行い、粒径およびその分布は、Dynamic Light Scatteringソフトウェア(Brookhaven Instruments Corporation)を用いて分析した。pDNA複合体溶液(約70μL)を超純水(450 μL, Invitrogen)に添加し、次いで、DLS測定のために試料として使用した。pDNA複合体溶液を、切断されたマイカ上で成型し、タッピングモードAFMにおいて、ばね定数2.8N/m、長さ200〜250μmのシリコンカンチレバーを用いて室温で空気中で観察した。以前に報告された方法によって、物体の真の寸法を得るために、カンチレバー先端コンボリューション効果の較正を行った。Numata et al., 6 Macromol. Biosci. 41-50(2006)。
HEK細胞(293FT)は組換えタンパク質の発現ツールとして広く役立っており、モデル細胞株として使用した。ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、10%FBS、5%グルタミン、5%非必須アミノ酸(NEAA)からなる培地を用いて、培養物をコンフルエンスになるまで増殖させた。培養物を、0.25%トリプシン(Invitrogen)を用いて培養基からはがし、次いで、96マルチウェルプレートに入れてフィルム上に1500個の細胞/ウェルの密度で再プレートした。pDNA(1.2μg)および組換え絹糸(適量)の複合体を各ウェルに添加した。細胞を37℃で6時間インキュベートした後に、培地を、pDNA複合体を含まない培地と交換した。さらに48時間インキュベートした後に、GFPプラスミドトランスフェクションを評価するために、蛍光顕微鏡(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)によって蛍光画像を得た。発現結果(n=3)は、計数した全細胞に対するGFP蛍光陽性細胞のパーセントとして表した。細胞生存率については、HEK細胞(50,000個の細胞/ウェル)を、pDNA複合体を含有する96ウェルプレートに播種し、トランスフェクション実験において使用した培地(100μL)中で48時間培養した。HEK細胞に対するpDNA複合体の細胞傷害性を、標準的な3-(4,5-ジメチルチアゾール2-イル)2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)(MTT)アッセイ(Promega, Madison, WI)によって製造業者の説明書に従って特徴付けた(n=8)。
ホタルルシフェラーゼをコードするpDNA(7041bp)をコンピテントDH5α大腸菌(Invitrogen)において増幅し、EndoFree Plasmid Maxi Kits(Qiagen, Hilden, Germany)を用いて精製した。DNA濃度は260nmにおける吸光度によって求めた。組換え絹糸タンパク質とpDNAの複合体を調製するために、様々なN/P比(0.1〜10)で、絹糸タンパク質(0.1mg/mL)を含有する溶液をpDNA溶液(370μg/mL)と混合した。ここで、N/P比は、アミンの数とpDNAのリン酸の数との比を指す。複合体のサイズを均一にするために、組換え絹糸およびpDNAの混合物を室温(約20℃)で一晩インキュベートした後に、特徴付けを行った。pDNA複合体は、アガロースゲル電気泳動、ゼータナノサイザー(zeta nanosizer)(Zetasizer Nano-ZS, Malvern Instruments Ltd, Worcestershire, UK)、DLS(Brookhaven Instruments Corp., Holtsville, NY)、およびAFM(Dimension V, Veeco Instruments Inc., Plainview, NY)によって特徴付けた。アガロースゲル電気泳動のために、10μLの各試料をローディング緩衝液と混合し、臭化エチジウムを含有する1%アガロースゲル上で分析した(TAE緩衝液、100V、60分)。試料のゼータ電位およびゼータ偏差をゼータナノサイザーによって3回測定した。Dispersion Technology Softwareバージョン 5.03(Malvern Instruments Ltd)を用いて、平均データを得た。DLSは633nm He-Neレーザーを用いて、25℃、散乱角173°で行った。粒径および分布(PDI)は、Dispersion Technology Softwareバージョン5.03(Malvern Instruments Ltd)を用いて求めた。pDNA複合体溶液を、切断されたマイカ上で成型し、タッピングモードAFMにおいて、ばね定数2.8N/m、長さ200〜250μmのシリコンカンチレバーを用いて室温で空気中で観察した。以前に報告された方法によって、物体の真の寸法を得るために、カンチレバー先端コンボリューション効果の較正を行った。Numata et al., 2006。
αvβ3インテグリンおよびαvβ5インテグリンを発現すると報告されているHeLa細胞、ならびに遺伝子発現ツールとして広く用いられており、αvβ3インテグリンが無く、αvβ5インテグリンが少ないと報告されているヒト胎児由来腎臓(HEK)細胞(293FT)をモデル細胞株として使用した。Oba et al., 2007; Hu et al., 270 J. Biol. Chem. 26232-38(1995); Simon et al., 272 J. Biol. Chem. 29380-89(1997); Thomas & Smart, 2005。DMEM、10%FBS、5%グルタミン、5%NEAAからなる培地を用いて、培養物をコンフルエンスになるまで増殖させた。培養物を、0.25%トリプシン(Invitrogen)を用いて培養基からはがし、次いで、24マルチウェルプレートに入れてフィルム上に7000個の細胞/ウェルの密度で再プレートした。HeLa細胞用およびHEK細胞用のトランスフェクション培地は、10%FBSを含有するDMEMであった。pDNA(1.2μg)および組換え絹糸(適量)の複合体を各ウェルに添加した。細胞を37℃で6時間インキュベートした後に、培地を、pDNA複合体を含まない培地と交換した。さらに48時間インキュベートした後に、ルシフェラーゼ遺伝子発現を定量評価するために、ルシフェラーゼアッセイ(Promega, Madison, WI)を製造業者のプロトコールに従って行った(n=4)。簡単に述べると、トランスフェクトされた細胞をPBS(Invitrogen)で洗浄し、Luciferase Cell Culture Lysis Regent(Promega)によって溶解した。溶解産物をLuciferase Assay SubstrateおよびLuciferase Assay Buffer(Promega)と混合し、次いで、ルシフェラーゼ遺伝子発現を、ルミネセンスマイクロプレートリーダー(Spectra MAX Gemini EM, Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA)を用いて光ルミネセンスの強度(相対光単位)に基づいて評価した。各ウェルにおけるタンパク質の量を、BCAタンパク質アッセイ(Pierce Biotech., Rockford, IL)を用いて求め、次いで、相対光単位/タンパク質重量(RLU/mg)を得た。本実験では、リポフェクタミン2000(Invitrogen)を正の対照ベクターとして使用した。細胞生存率については、HEK細胞(5000個の細胞/ウェル)を、pDNA複合体を含有する96ウェルプレートに播種し、トランスフェクション実験において使用した培地(100μL)中で48時間培養した。HEK細胞に対するpDNA複合体の細胞傷害性を、標準的な3-(4,5-ジメチルチアゾール2-イル)2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)(MTT)アッセイ(Promega)によって製造業者の説明書に従って特徴付けた(n=8)。
シリコンウェーハ上にある粒径を、Research Nanoscopeソフトウェアバージョン7.30(Veeco)を用いてAFMによって測定した。30の測定値の平均値を使用した。AFMによる粒径、細胞トランスフェクション効率、および細胞生存率の統計差を独立t検定と両側分布によって求め、p<0.05で統計的に有意な差があるとみなした。AFM、細胞トランスフェクション効率、および細胞生存率実験のデータを平均±標準偏差として表した。
pDNAを、Label IT Nucleic Acid Labeling Kit(Mirus, Madison, WI)を用いて製造業者の手順に従ってCy5で標識した。HeLa細胞をGlass Bottom Culture Dishes(MatTeK Corporation, Ashland, MA)に播種し、2mLのDMEM中で一晩インキュベートした。標識pDNA(2.4μg)と11RSタンパク質との複合体(N/P2)をウェルに添加した。6時間インキュベートした後に、培地を新鮮な培地と交換した。さらに48時間インキュベートした後に、細胞をPBSで2回洗浄し、300nM 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI, Invitrogen)PBS溶液と10分間インキュベートした。Cy5標識されたpDNA複合体およびDAPI染色された核の細胞内分布を、CLSM(Leica Microsystems)によって488nm(Arレーザー)、633nm(He-Neレーザー)、および710nm(Mai Taiレーザー)の励起波長で観察した。
ポリリジンおよびRGDを含む絹糸タンパク質の発現および精製:
ポリリジンおよびRGD細胞結合モチーフ(RS、RSR、SR、S2R、および11RS)を用いて作製された5種類のクモ絹糸変異体のアミノ酸配列を、図11および図18に示したように作製した。組換え絹糸タンパク質の収率は精製および透析の後に約10mg/Lであった。Ni-NTAクロマトグラフィーによる精製前および精製後のタンパク質をSDS-PAGEによって分析し、純度を評価するためにコロイダルブルーで染色した。RS、RSR、SR、S2R、および11RSはそれぞれ、約33kDa、32kDa、30kDa、30kDa、および35kDaに対応するバンドを示し(図12)、それぞれ、26,068.1Da、26,584.4Da、25,565.9Da、26,082.1Da、31,669.86Daの理論分子量(モノアイソトピック質量)より高かった。典型的に、SDS-PAGEゲルは純度を評価するのに有用であるが、絹糸ベースポリマーが疎水性であるために、このタンパク質の本当のサイズを特徴付けることができない。Prince et al., 1995。しかしながら、MALDI-TOFの結果は、それぞれ、26,068.1Da、26,584.4Da、25,565.9Da、26,082.1Da、31,669.86Daを示し、バイオタンパク質が予想された組換え絹糸タンパク質であることを裏付けた。組換えタンパク質は10.6の理論pIを示し、室温で水溶性であった(5.0mg/mL)。
ルシフェラーゼをコードするDNAと5種類の組換え絹糸タンパク質(RS、RSR、SR、S2R、および11RS)のDNA-タンパク質複合体形成を、AFM、DLS、およびゼータ電位メーターによって特徴付けた。
aN/P比は、アミンの数とpDNAのリン酸との比を指す。
bPDIは双峰分布のために正確に求められなかった。
インテグリンを介したエンドサイトーシスによる核酸送達のためにRGDペプチドを含有するカチオン性組換え絹糸とのpDNA複合体の実現性を評価するために、HeLa細胞およびHEK細胞を用いてインビトロトランスフェクション実験を行った。様々なN/P比で様々な組換え絹糸(11RS、RS、RSR、SR、およびS2R)と複合体を形成したDNAのpDNAトランスフェクション効率を比較するために、HeLa細胞にレポーター遺伝子としてルシフェラーゼpDNAを移入した。図21Aは、ルシフェラーゼアッセイに基づいた、HeLa細胞に対する、N/P比が0.1〜10の11RSのpDNA複合体のトランスフェクション効率を示す(n=4)。N/P2で調製した11RSのpDNA複合体は、様々なN/P比の中で最も高いトランスフェクション効率を示し、この後に、効力は急に減少した。これは、恐らく、細胞と相互作用する組換え絹糸が過剰になったためである。図21Bおよび図21Cは、HeLa細胞およびHEK細胞に対する、N/P2の様々な組換え絹糸(11RS、RS、RSR、SR、およびS2R)と複合体を形成したpDNAならびに絹糸6マー-30lysブロックコポリマー(図を参照されたい)および対照であるリポフェクタミン2000のトランスフェクション効率を示す。RGD配列を含有する組換え絹糸と比較して、絹糸6マー-30lysブロックコポリマーはRGD配列を含有せず、HeLa細胞およびHEK細胞に対して実質的なトランスフェクションを示さなかった。N/P2でのトランスフェクション効率の相対順序は以下の通りに減少した:11RS>RSR≒S2R>RS≒SR。さらに、11RSのpDNA複合体は、N/P2で1つまたは2つのRGD配列を含有する他の組換え絹糸のpDNA複合体と比較してHeLa細胞に対して有意に高いトランスフェクション効率を示した(図21B)。他方で、11RSのpDNA複合体は、RSRおよびSR2と比較してHEK細胞に対して有意に高いトランスフェクション効率を示さなかった(図21C)。
ポリリジンおよびppTG1を含有する絹糸配列の設計およびクローニング:
クモ絹糸反復ユニットは、クモであるネフィラ・クラビペスの引き糸タンパク質MaSp1配列の天然配列(Accession P19837)に由来するコンセンサス反復
に基づいて選択された。この反復の6つの連続コピーおよび30個のリジンを含有する絹糸6マー-30lysを、以前に公開された手順に従って、クローニングインサートをpET-30aに導入することによって作り出した。Numata et al., 30 Biomats. 5775-84(2009); Ferrari et al., 8 Mol. Ther. 284-94(2003); Rabotyagova et al., 10 Macromol. Biosci. 49-59(2010)。ppTG1残基をコードする合成オリゴヌクレオチドの配列は以下の通りであった。
SpeIの制限部位をイタリック体で示した。ppTG1-aおよびppTG1-bは、アニーリングして二本鎖DNAを形成する相補オリゴヌクレオチドである。図23Bに示したように、DNAリガーゼ(New England Biolabs Inc, Ipswich, MA)によって、ppTG1配列の二本鎖DNAをpET30-絹糸6マー-30lysと連結して、pET30-絹糸6マー-30lys-ppTG1を作製した。
構築物pET30-絹糸6マー-30lys-ppTG1単量体およびpET30-絹糸6マー-30lys-ppTG1二量体を用いて大腸菌RY-3041株を形質転換し、以前に報告された方法によって、これらのタンパク質の発現および精製を行った。Numata et al., 2009; Numata et al., 6 Macromol. Biosci. 41-50(2006); Arai et al., 91 J. Appl. Polym. Sci. 2383-90(2004)。4%〜12%プレキャストNuPage Bis-Trisゲル(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を行った。ゲルをコロイダルブルー(Invitrogen, Carlsbad, CA)で染色した。精製試料をMilli-Q水に対して大規模に透析した。透析のために、MWCOが100〜500DaのSpectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membranes(Spectrum Laboratories Inc, Rancho Dominguez, CA)を使用した。配列および分子量を確かめるために、Tufts University Core Facilityにおいてマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型(MALDI-TOF)質量分析によって組換えタンパク質をさらに特徴付けた。
Green Fluorescence Protein(GFP、7650bp)またはホタルルシフェラーゼ(Luc、7041bp)をコードする2種類のpDNAをコンピテントDH5α大腸菌(Invitrogen)において増幅し、EndoFree Plasmid Maxi Kits(Qiagen, Hilden, Germany)を用いて精製した。DNA濃度は260nmにおける吸光度によって求めた。組換え絹糸タンパク質とpDNAの複合体を調製するために、様々なN/P比で、絹糸タンパク質を含有する溶液(0.1mg/mL)をpDNA溶液(370μg/mL)と混合した。ここで、N/P比は、アミンの数とpDNAのリン酸の数との比を指す。組換え絹糸およびpDNAの混合物を室温(約20℃)で一晩インキュベートした後に、特徴付けを行った。さらに多くのβシート構造を誘導するために、pDNA複合体を遠心分離によって収集し、上清を除去し、次いで、pDNA複合体を50%メタノール溶液中で24時間インキュベートした後に、メタノール処理したpDNA複合体を得た。pDNA複合体を、ゼータ電位(Zetasizer Nano-ZS, Malvern Instruments Ltd, Worcestershire, UK)、AFM(Dimension V, Veeco Instruments Inc, Plainview, NY)、および多重反射水平MIRacle ATRアタッチメント(Ge結晶を使用する, Pike Tech, Madison WI)を備えるFTIR-ATR(JASCO FT/IR-6200)によって特徴付けた。pDNA複合体溶液(約70μL)を超純水(450μL, Invitrogen)に添加し、次いで、ゼータ電位およびサイズ測定のために試料として使用した。ゼータ電位メーターによって、試料のゼータ電位およびゼータ偏差を3回測定し、平均データを、Dispersion Technology Softwareバージョン5.03(Malvern Instruments Ltd)を用いて得た。pDNA複合体溶液を、切断されたマイカ上で成型し、タッピングモードAFMにおいて、ばね定数2.8N/m、長さ200〜250μmのシリコンカンチレバーを用いて室温で空気中で観察した。以前に報告された方法によって、物体の真の寸法を得るために、カンチレバー先端コンボリューション効果の較正を行った。Li et al., 24 Biomats. 357-65(2003)。
pDNA複合体を、1単位のDNアーゼI(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を含有するPBS 100μLと37℃で1時間インキュベートした。20℃で20μLの0.5M EDTAを添加することによって、消化反応を止めた。pDNA複合体を、プロテアーゼXIVまたはα-キモトリプシン(150μg/mL)でも37℃で2時間処理した。分解産物のアガロースゲル電気泳動のために、20μLの各試料をローディング緩衝液と混合し、臭化エチジウムを含有する1%アガロースゲル上で分析した(TAE緩衝液、100V、60分)。
組換えタンパク質用の発現ツールとして広く用いられているヒト胎児由来腎臓(HEK)細胞(293FT)をモデル細胞株として使用した。Ross & Hui, 6 Gene Ther. 651-59(1999)。HEK細胞と比較するために、MDA-MB-435黒色腫細胞株も使用した。培養物を、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、10%FBS、5%グルタミン、5%非必須アミノ酸(NEAA)からなる培地を用いてコンフルエンスになるまで増殖させた。培養物を、0.25%トリプシン(Invitrogen)を用いて培養基からはがし、次いで、24マルチウェルプレートに入れて70,000個の細胞/ウェルの密度で再プレートした。pDNA(1.2μg)および組換え絹糸(適量)の複合体を各ウェルに添加した。細胞を37℃で6時間インキュベートした後に、培地を、pDNA複合体を含まない培地と交換した。さらに72時間インキュベートした後に、GFPプラスミドトランスフェクションを評価するために、蛍光画像を蛍光顕微鏡(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)によって得た。ルシフェラーゼ遺伝子発現を定量評価するために、ルシフェラーゼアッセイ(Promega, Madison, WI)を行った(n=4)。各ウェルにおけるタンパク質の量を、BCAタンパク質アッセイ(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)を用いて求め、次いで、相対光単位(アウトプット)/タンパク質重量(RLU/mg)を得た。リポフェクタミン2000(Invitrogen)を正の対照ベクターとして使用した。細胞生存率については、HEK細胞(30,000個の細胞/ウェル)を、pDNA複合体を含有する96ウェルプレートに播種し、トランスフェクション実験において使用した培地(100μL)中で48時間培養した。HEK細胞に対するpDNA複合体の細胞傷害性を、標準的な3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム(MTS)アッセイ(Promega, Madison, WI)によって製造業者の説明書に従って特徴付けた(n=8)。
マイカ基板上にある粒径を、Research Nanoscopeソフトウェアバージョン7.30(Veeco Instruments Inc)を用いてAFMによって測定した。30の測定値の平均値を使用した。AFMによる粒径、細胞トランスフェクション効率、および細胞生存率の統計差を独立t検定と両側分布によって求め、p<0.05で統計的に有意な差があるとみなした。AFM、細胞トランスフェクション効率、および細胞生存率実験のデータを平均±標準偏差として表した。
ポリリジンおよびppTG1配列を含有する組換え絹糸タンパク質を大腸菌において発現させ、Ni-NTAクロマトグラフィーを用いて精製した。ポリリジンおよび細胞膜不安定化ペプチド(ppTG1)を用いて作製したクモ絹糸変異体のドメイン構造およびアミノ酸配列を図23Aおよび図23Bに示した。精製および透析の後に、組換え絹糸タンパク質の収率は約0.7mg/Lであった。Ni-NTAクロマトグラフィーおよび透析による精製の後にタンパク質をSDS-PAGEによって分析し、純度を評価するためにコロイダルブルーで染色した。絹糸-ポリリジン-ppTG1単量体および二量体は、それぞれ、約33kDaおよび34kDaの分子量に対応するメジャーバンドを示し(図23C)、それぞれ、27,602.29Daおよび30,067.87Daの理論分子量(モノアイソトピック質量)より大きかった。典型的に、SDS-PAGEゲルは純度を評価するのに有用であるが、絹糸ベースポリマーが疎水性であるために、このタンパク質の本当のサイズを特徴付けることができない。Numata et al., 30 Biomats. 5775-84(2009); Prince et al., 34 Biochem. 10879-85(1995)。しかしながら、MALDI-TOF質量分析からの結果は、それぞれ、27,602.29Daおよび30,067.87Daを示した。このことから、このバイオタンパク質は、予想された組換えタンパク質であることが裏付けられた。絹糸-ポリリジン-ppTG1単量体および二量体は、それぞれ、10.70および10.75の理論pIを示し、室温で水溶性であった(約2.0mg/mL)。
ルシフェラーゼをコードするpDNAおよび組換え絹糸タンパク質である絹糸-ポリリジン-ppTG1単量体および二量体とのイオン複合体形成を、様々なN/P比(アミンの数とpDNAのリン酸の数の比)で、AFM、DLS、およびゼータ電位メーターによって特徴付けた。
αSL-単量体:絹糸-ポリリジン-ppTG1単量体、SL-二量体:絹糸-ポリリジン-ppTG1二量体。
βPDIは双峰分布のために正確に求められなかった。
図26に示したように、DNアーゼに対する、組換え絹糸タンパク質である絹糸-ポリリジン-ppTG1二量体と共に組込まれたpDNAの安定性を、DNアーゼI処理およびアガロースゲル電気泳動を用いて特徴付けた。全試料の結果を、遊離pDNAのみを含有する試料の結果と比較した(図26、レーン1)。遊離pDNAの場合、1時間のDNアーゼI酵素処理によって遊離pDNAが迅速に分解されたのに対して(図26、レーン2)、2時間のプロテアーゼXIVおよびα-キモトリプシンによる分解は明らかでなかった(図26、レーン3および4)。絹糸-ポリリジン-ppTG1二量体のpDNA複合体の場合、DNアーゼI処理後、ウェルの中にpDNAが依然としてあった(図26、レーン5)。DNアーゼI処理に続いて、プロテアーゼXIVによる酵素処理後に、絹糸-ポリリジン-ppTG1二量体の中のpDNAは複合体から放出された(図26、レーン6)。絹糸-ポリリジン-ppTG1二量体のpDNA複合体の場合、絹糸タンパク質を消化する加水分解酵素であるα-キモトリプシンおよびプロテアーゼXIV(Numata et al., 31 Biomats. 2926-33(2010); Almofti et al., 20 Mol. Membr. Biol. 35-43(2003); Bowman et al., 85 P.N.A.S. 7972-76(1988))も複合体からpDNAを放出した(図26、レーン7および8)。メタノール処理したpDNA複合体も、1時間のDNアーゼI処理から、組込まれているpDNAを保護した(図26、レーン9)。α-キモトリプシンによる酵素処理後にメタノール処理pDNA複合体から放出されるpDNAは、プロテアーゼXIVによる処理と比較して少なかった(図26、レーン11および12)。恐らく、このプロテアーゼに対する結晶化絹糸の感受性が、タンパク質を含有する非結晶化(βシートを含有しない)絹糸より小さいからである。Numata et al., 2010; Bowman et al., 1988; Huang et al., 278 J. Biol. Chem. 46117-23(2003)。
核酸送達のためのppTG1細胞膜不安定化ペプチドを含有するカチオン性組換え絹糸と複合体を形成したpDNAの実現性を評価するために、HEK細胞およびMDA-MB-435細胞を用いてインビトロトランスフェクション実験を行った。pDNA複合体の最も効率的なN/P比を求めるために、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼpDNAを有する絹糸-ポリリジン-ppTG1二量体を介して、HEK細胞をトランスフェクトした。図27Aは、ルシフェラーゼアッセイに基づいた、HEK細胞に対する、N/P比が0.1〜5の絹糸-ポリリジン-ppTG1二量体のpDNA複合体のトランスフェクション効率を示す(n=4)。N/P2で調製した絹糸-ポリリジン-ppTG1二量体のpDNA複合体は様々なN/P比の中で最も高いトランスフェクション効率を示し、この後に、効力は急に減少した。これは、恐らく、細胞およびpDNAと相互作用する組換え絹糸が過剰になったためである。図27Bは、対照としてトランスフェクション試薬であるリポフェクタミン2000と比較した、HEK細胞およびMDA-MB-435細胞に対する、ppTG1単量体を含有する組換え絹糸タンパク質のpDNA複合体およびppTG1二量体を含有する組換え絹糸タンパク質のpDNA複合体(N/P2)のトランスフェクション効率を示す。絹糸-ポリリジン-ppTG1二量体のpDNA複合体はHEK細胞に対してリポフェクタミン2000と同じトランスフェクション効率を示し、両細胞に対して、N/P2の絹糸-ポリリジン-ppTG1単量体と比較して有意に高いトランスフェクション効率も示した。図27Cおよび図27Dに示したように、HEK細胞およびMDA-MB-435細胞に対してGFPレポーター遺伝子を用いたトランスフェクション実験も行った。このことから、pDNA複合体のトランスフェクションおよび細胞内にあるこれらの分解産物は細胞形態に大きな影響を及ぼさなかった。
Claims (79)
- 正に荷電したR基を有する複数のアミノ酸を含む組換え絹糸タンパク質反復ユニット;および
イオン相互作用を介して組換え絹糸タンパク質と複合体を形成する核酸
を含む、生体材料核酸複合体。 - 正に荷電したR基を有するアミノ酸がリジンまたはアルギニンである、請求項1記載の生体材料核酸複合体。
- 正に荷電したR基を有する複数のアミノ酸がポリリジンである、請求項2記載の生体材料核酸複合体。
- 生体材料核酸複合体が球形である、請求項1記載の生体材料核酸複合体。
- 生体材料核酸複合体の組換え絹糸タンパク質が少なくとも部分的にβシート構造に自己組織化する、請求項1記載の生体材料核酸複合体。
- 生体材料核酸複合体の組換え絹糸タンパク質がβシート構造を含有しない、請求項1記載の生体材料核酸複合体。
- 組換え絹糸タンパク質が1つまたは複数の細胞結合モチーフをさらに含む、請求項1記載の生体材料核酸複合体。
- 細胞結合モチーフが1つまたは複数のRGD残基を含む、請求項7記載の生体材料核酸複合体。
- 組換え絹糸タンパク質が1つまたは複数の細胞透過ペプチドおよび/または細胞膜不安定化ペプチド(CPP)をさらに含む、請求項1記載の生体材料核酸複合体。
- CPPが1つまたは複数のppTG1配列を含む、請求項9記載の生体材料核酸複合体。
- 組換え絹糸タンパク質が、ウイルスのシグナルペプチド、腫瘍ホーミングペプチド、金属結合ドメイン、細胞標的化ペプチド、薬物結合ペプチド、細胞活性を変える機能ドメイン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される1つまたは複数の機能ペプチドドメインをさらに含む、請求項1記載の生体材料核酸複合体。
- 核酸が、DNA、cDNA、DNAベクターまたはDNAプラスミド、RNAベクターまたはRNAプラスミド、dsRNA、siRNA、shRNA、saRNA、mRNA、miRNA、プレmiRNA、リボザイム、アンチセンスRNA、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1記載の生体材料核酸複合体。
- 核酸と複合体を形成する組換え絹糸ベースブロックコポリマーを含み、該コポリマーが絹糸コンセンサス配列の反復ユニットおよびポリ(L-リジン)ドメインを含む、絹糸ベース核酸送達システム。
- 核酸が、DNA、cDNA、DNAベクターまたはDNAプラスミド、RNAベクターまたはRNAプラスミド、dsRNA、siRNA、shRNA、saRNA、mRNA、miRNA、プレmiRNA、リボザイム、アンチセンスRNA、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項13記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- 組換え絹糸タンパク質とDNAのヌクレオチドとモル比(P/N)が約2.5〜約50である、請求項15記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- P/Nが約10〜約25である、請求項16の絹糸ベース核酸送達システム。
- 組換え絹糸ベースブロックコポリマーが6マーの絹糸コンセンサス残基および30lysのポリ(L-リジン)ドメインであり、P/Nが10である、請求項13記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- 組換え絹糸ベースブロックコポリマーが1つまたは複数のRGDドメインをさらに含む、請求項13記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- アミンの数とDNAのリン酸の数の比(N/P)が約2〜約10である、請求項19記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- 組換え絹糸ベースブロックコポリマーが6マーの絹糸コンセンサス残基、30lysのポリ(L-リジン)ドメイン、および11RGDのRGDドメインであり、N/Pが2である、請求項20記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- 組換え絹糸ベースブロックコポリマーが1つまたは複数のppTG1ドメインをさらに含む、請求項13記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- アミンの数とDNAのリン酸の数の比(N/P)が約2〜約10である、請求項22記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- 組換え絹糸ベースブロックコポリマーが6マーの絹糸コンセンサス残基、30lysのポリ(L-リジン)ドメイン、および二量体ppTG1であり、N/Pが2である、請求項23記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- 複合体が球形であり、平均サイズが約50nm〜約400nmの直径である、請求項13記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- 組換え絹糸タンパク質がβシート構造を含有する、請求項13記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- 組換え絹糸タンパク質がβシート構造を含有しない、請求項13記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- 複合体が中性または正に荷電している、請求項13記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- 複合体が負に荷電している、請求項13記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- 複合体が、複合体を含有する絹糸フィルムの表面に固定化されている、請求項13記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- 核酸が、緑色蛍光タンパク質(GFP)またはルシフェラーゼをコードする核酸を含む、請求項13記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- 細胞をトランスフェクトする方法であって、細胞と、核酸と複合体を形成した組換え絹糸ベースブロックコポリマーを含む絹糸ベース核酸送達システムを接触させる工程を含み、コポリマーが絹糸コンセンサス配列の反復ユニットおよびポリ(L-リジン)ドメインを含む、前記方法。
- 組換え絹糸ベースブロックコポリマーが1つまたは複数の細胞結合モチーフをさらに含む、請求項32記載の方法。
- 細胞トランスフェクションが細胞結合モチーフの1つによって標的化される、請求項34記載の方法。
- 細胞結合モチーフが1つまたは複数のRGD残基を含む、請求項34記載の方法。
- 組換え絹糸ベースブロックコポリマーが1つまたは複数のCPPをさらに含む、請求項32記載の方法。
- CPPが1つまたは複数のppTG1残基を含む、請求項38記載の方法。
- 組換え絹糸ベースブロックコポリマーが、細胞透過ペプチド、ウイルスのシグナルペプチド、腫瘍ホーミングペプチド、金属結合ドメイン、細胞標的化ペプチド、薬物結合ペプチド、細胞活性を変える機能ドメイン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される機能ペプチドドメインをさらに含む、請求項32記載の方法。
- 接触させる工程の前に、組換え絹糸生体高分子の二次構造を移行させる工程をさらに含み、複合体からの核酸の放出によって特徴付けられるトランスフェクション挙動が組換え絹糸コポリマーの二次構造によって制御される、請求項32記載の方法。
- 正に荷電したR基を有する複数のアミノ酸を含む組換え絹糸タンパク質反復ユニットおよび1つまたは複数の機能ペプチドドメイン;ならびに
イオン相互作用を介して組換え絹糸タンパク質と複合体を形成する核酸
を含む、生体材料核酸複合体。 - 機能ペプチドドメインが1つまたは複数の細胞結合モチーフを含む、請求項43記載の生体材料核酸複合体。
- 細胞結合モチーフが1つまたは複数のRGD残基を含む、請求項44記載の生体材料核酸複合体。
- 機能ペプチドドメインが1つまたは複数の細胞透過ペプチドおよび/または細胞膜不安定化ペプチド(CPP)を含む、請求項43記載の生体材料核酸複合体。
- CPPが1つまたは複数のppTG1配列を含む、請求項46記載の生体材料核酸複合体。
- 機能ペプチドドメインが、ウイルスのシグナルペプチド、腫瘍ホーミングペプチド、金属結合ドメイン、細胞標的化ペプチド、薬物結合ペプチド、細胞活性を変える機能ドメイン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項43記載の生体材料核酸複合体。
- 正に荷電したR基を有するアミノ酸がリジンまたはアルギニンである、請求項43記載の生体材料核酸複合体。
- 正に荷電したR基を有する複数のアミノ酸がポリリジンである、請求項43記載の生体材料核酸複合体
- 生体材料核酸複合体が球形である、請求項43記載の生体材料核酸複合体。
- 生体材料核酸複合体の組換え絹糸タンパク質が少なくとも部分的にβシート構造に自己組織化する、請求項43記載の生体材料核酸複合体。
- 生体材料核酸複合体の組換え絹糸タンパク質がβシート構造を含有しない、請求項43記載の生体材料核酸複合体。
- 核酸が、DNA、cDNA、DNAベクターまたはDNAプラスミド、RNAベクターまたはRNAプラスミド、dsRNA、siRNA、shRNA、saRNA、mRNA、miRNA、プレmiRNA、リボザイム、アンチセンスRNA、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項43〜53のいずれか一項記載の生体材料核酸複合体。
- 核酸と複合体を形成した組換え絹糸ベースブロックコポリマーを含み、コポリマーが絹糸コンセンサス配列の反復ユニット、ポリ(L-リジン)ドメイン、および1つまたは複数の細胞結合ドメインを含む、絹糸ベース核酸送達システム。
- 細胞結合モチーフが1つまたは複数のRGD残基を含む、請求項55記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- 核酸と複合体を形成した組換え絹糸ベースブロックコポリマーを含み、コポリマーが絹糸コンセンサス配列の反復ユニット、ポリ(L-リジン)ドメイン、ならびに1つまたは複数の細胞透過ペプチドおよび/または細胞膜不安定化ペプチド(CPP)を含む、絹糸ベース核酸送達システム。
- CPPが1つまたは複数のppTG1残基を含む、請求項57記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- 核酸が、DNA、cDNA、DNAベクターまたはDNAプラスミド、RNAベクターまたはRNAプラスミド、dsRNA、siRNA、shRNA、saRNA、mRNA、miRNA、プレmiRNA、リボザイム、アンチセンスRNA、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項55〜58のいずれか一項記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- アミンの数とDNAのリン酸の数の比(N/P)が約2〜約10である、請求項60記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- 組換え絹糸ベースブロックコポリマーが、6マーの絹糸コンセンサス残基、30lysのポリ(L-リジン)ドメイン、および11RGDのRGDドメインであり、N/Pが2である、請求項60記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- 組換え絹糸ベースブロックコポリマーが、6マーの絹糸コンセンサス残基、30lysのポリ(L-リジン)ドメイン、および二量体ppTG1であり、N/Pが2である、請求項60記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- 組換え絹糸タンパク質がβシート構造を含有する、請求項55〜63のいずれか一項記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- 組換え絹糸タンパク質がβシート構造を含有しない、請求項55〜63のいずれか一項記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- 複合体が球形であり、平均サイズが約50nm〜約400nmの直径である、請求項55〜65のいずれか一項記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- 複合体が中性または正に荷電している、請求項55〜66のいずれか一項記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- 複合体が負に荷電している、請求項55〜66のいずれか一項記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- 複合体が、複合体を含有する絹糸フィルムの表面に固定化されている、請求項55〜68のいずれか一項記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- 核酸が、緑色蛍光タンパク質(GFP)またはルシフェラーゼをコードする核酸を含む、請求項55〜69のいずれか一項記載の絹糸ベース核酸送達システム。
- 細胞をトランスフェクトする方法であって、細胞と、核酸と複合体を形成した組換え絹糸ベースブロックコポリマーを含む絹糸ベース核酸送達システムを接触させる工程を含み、コポリマーが、絹糸コンセンサス配列の反復ユニット、ポリ(L-リジン)ドメイン、および1つまたは複数の機能ペプチドドメインを含む、前記方法。
- 機能ペプチドドメインが1つまたは複数の細胞結合モチーフを含み、細胞トランスフェクションが細胞結合モチーフの1つによって標的化される、請求項71記載の方法。
- 細胞結合モチーフがRGD残基を含む、請求項72記載の方法。
- 機能ペプチドドメインが1つまたは複数のCPPを含む、請求項71記載の方法。
- CPPが1つまたは複数のppTG1残基を含む、請求項75記載の方法。
- 機能ペプチドドメインが、細胞透過ペプチド、ウイルスのシグナルペプチド、腫瘍ホーミングペプチド、金属結合ドメイン、細胞標的化ペプチド、薬物結合ペプチド、細胞活性を変える機能ドメイン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項71記載の方法。
- 接触させる工程の前に、組換え絹糸生体高分子の二次構造を移行させる工程をさらに含み、複合体からの核酸の放出によって特徴付けられるトランスフェクション挙動が組換え絹糸コポリマーの二次構造によって制御される、請求項71〜78のいずれか一項記載の方法。
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