JP2012513202A - グリコーゲンが低減した、改変された光合成微生物および炭素ベースの生成物を生成することにおけるその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、米国特許法§119(e)の下、2008年12月23日に出願された米国仮特許出願第61/140,545号の利益を主張する。この仮出願は、その全体が参考として本明細書に援用される。
本出願に関連する配列表は、紙書類の代わりにテキストフォーマットで提供し、本明細書中に参考として組み込まれている。配列表を含有するテキストファイル名は890071_402PC_SEQUENCE_LISTING.txtである。テキストファイルは274KBであり、2009年12月22日に作成し、EFS−Webを介して電子提出した。
別段に定義しない限りは、本明細書中で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の技術者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載のものに類似または等価な任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料を記載する。本発明の目的のために、以下の用語を以下に定義する。
本発明の特定の実施形態は、ラン藻を含めた改変された光合成微生物およびその使用方法に関し、改変された光合成微生物は、対照光合成微生物における1つまたは複数の遺伝子の発現レベルと比較して、グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の1つまたは複数の遺伝子の発現レベルが低下している。特定の実施形態では、改変された光合成微生物は、グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の1つまたは複数の遺伝子の1つまたは複数の突然変異または欠失を含む。特定の実施形態では、前記1つまたは複数の遺伝子には、グルコース−1−リン酸アデニルトランスフェラーゼ(glgC)、ホスホグルコムターゼ(pgm)、および/またはグリコーゲンシンターゼ(glgA)の遺伝子が含まれる。本発明は、改変されたラン藻が野生型ラン藻と比較して低下した量のグリコーゲンを蓄積する(たとえば低窒素条件下で)限りは、グリコーゲンの生合成または貯蔵に関連する1つまたは複数の遺伝子中の任意の種類の突然変異または欠失の使用を含めた、改変された光合成微生物において1つまたは複数の遺伝子の発現を低下させる任意の方法の使用を企図する。
本発明の改変された光合成微生物は、任意の種類の光合成微生物を用いて作製し得る。これらには、それだけには限定されないが、光合成細菌、緑藻類、およびラン藻が含まれる。光合成微生物は、たとえば、ラン藻などの天然の光合成微生物、または人工的な光合成細菌などの操作した光合成微生物であることができる。天然に光合成するまたは光合成するように操作することができる例示的な微生物には、それだけには限定されないが、細菌、真菌、古細菌、原生生物、緑藻類などの真核生物、ならびにプランクトン、プラナリア、およびアメーバなどの動物が含まれる。天然に存在する光合成微生物の例には、それだけには限定されないが、Spirulina maximum、Spirulina platensis、Dunaliella salina、Botrycoccus braunii、Chlorella vulgaris、Chlorella pyrenoidosa、Serenastrum capricomutum、Scenedesmus auadricauda、Porphyridium cruentum、Scenedesmus acutus、Dunaliella sp.、Scenedesmus obliquus、Anabaenopsis、Aulosira、Cylindrospermum、Synechoccus sp.、Synechocystis sp.、および/またはTolypothrixが含まれる。
また、本発明の実施形態には、グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の1つまたは複数の遺伝子の発現レベルが低下しているように光合成微生物を改変することを含む、野生型光合成微生物と比較して、ストレス条件下、たとえば低窒素下で低下した量のグリコーゲンを蓄積する、改変された光合成微生物、たとえばラン藻を作製する方法も含まれる。特定の実施形態では、前記1つまたは複数の遺伝子には、グルコース−1−リン酸アデニルトランスフェラーゼ(glgC)、ホスホグルコムターゼ(pgm)、および/またはグリコーゲンシンターゼ(glgA)が含まれる。特定の実施形態では、発現または活性は、前記1つまたは複数の遺伝子の一部分またはすべてを突然変異または欠失させることによって低下させる。特定の実施形態では、発現または活性は、前記1つまたは複数の遺伝子の1つまたは複数の対立遺伝子をノックアウトまたはノックダウンすることによって低下させる。特定の実施形態では、1つまたは複数の遺伝子の発現または活性は、光合成微生物を、前記1つまたは複数の遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは干渉RNA、たとえばsiRNAと接触させることによって低下させる。特定の実施形態では、前記1つまたは複数の遺伝子とハイブリダイズするポリヌクレオチド、たとえばアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを発現するベクターを、前記光合成微生物内に導入する。
特定の実施形態では、本発明の改変された光合成微生物、たとえばラン藻は、それだけには限定されないが本明細書中に記載のもののうちの任意のものを含めた、グリコーゲンの分解またはトリグリセリドもしくは脂肪酸の生合成に関連する活性を有するポリペプチドをコードしている、1つまたは複数の外因性または導入した核酸を含む。特定の実施形態では、外因性核酸は、微生物のゲノムにネイティブな核酸配列を含まない。特定の実施形態では、外因性核酸は、微生物のゲノムにネイティブな核酸配列を含むが、これは、たとえば、微生物における核酸および/またはそのコードされているポリペプチドの発現を増加させるために、たとえばベクター中でまたは分子生物学技法によって、微生物内に導入されたものである。
特定の実施形態では、改変された光合成微生物は、グリコーゲンの合成もしくは貯蔵経路に関連する1つまたは複数の遺伝子の発現が低下している、および/または、グリコーゲン分解経路に関連するタンパク質、またはその機能的変異体もしくは断片をコードしている1つまたは複数のポリヌクレオチドの発現が増加している。
一実施形態では、改変された光合成微生物、たとえばラン藻は、低下した量のホスホグルコムターゼ遺伝子を発現する。特定の実施形態では、これは、その調節要素(たとえば、プロモーター、エンハンサー、転写因子、正または負の調節タンパク質など)のうちの任意のものを含めた、ホスホグルコムターゼ遺伝子中の突然変異または欠失を含み得る。遺伝子pgmによってコードされているホスホグルコムターゼ(Pgm)は、典型的には酵素と結合した中間体グルコース1,6−二リン酸を介して、グルコース1−リン酸からグルコース6−リン酸への可逆的変換を触媒する(たとえばLuら、Journal of Bacteriology、176巻:5847〜5851頁、1994年を参照)。この反応は可逆的であるが、グルコース−6−リン酸の形成が顕著に支持される。
一実施形態では、改変された光合成微生物、たとえばラン藻は、低下した量のグルコース−1−リン酸アデニリルトランスフェラーゼ(glgC)遺伝子を発現する。特定の実施形態では、これは、その調節要素のうちの任意のものを含めた、glgC遺伝子中の突然変異または欠失を含み得る。glgC遺伝子によってコードされている酵素(たとえばEC2.7.7.27)は、一般に、以下の化学反応を触媒することによってデンプン、グリコーゲンおよびスクロースの代謝に関与する:
ATP+アルファ−D−グルコース1−リン酸⇔二リン酸+ADP−グルコース
したがって、この酵素の2つの基質はATPおよびアルファ−D−グルコース1−リン酸である一方で、その2つの産物は二リン酸およびADP−グルコースである。glgCにコードされている酵素は、植物中のデンプン生合成および細菌中のグリコーゲン生合成において第1のコミットメントおよび律速ステップを触媒する。これは、植物および細菌における貯蔵多糖の蓄積の調節の酵素部位であり、エネルギー流束の代謝物によってアロステリックに活性化または阻害される。
一実施形態では、改変された光合成微生物、たとえばラン藻は、低下した量のグリコーゲンシンターゼ遺伝子を発現する。特定の実施形態では、これは、その調節要素のうちの任意のものを含めた、グリコーゲンシンターゼ遺伝子中の欠失または突然変異を含み得る。UDP−グルコース−グリコーゲングルコシルトランスフェラーゼとしても公知のグリコーゲンシンターゼ(GlgA)は、UDP−グルコースと(1,4−α−D−グルコシル)nとを反応させてUDPおよび(1,4−α−D−グルコシル)n+1を得る反応を触媒するグリコシルトランスフェラーゼ酵素である。グリコーゲンシンターゼは、追加のグルコース単量体を成長中のグリコーゲンポリマー上に組み込むためにADP−グルコースを使用する、α−保持グルコシルトランスフェラーゼである。本質的に、GlgAは、グリコーゲンとして貯蔵するために過剰のグルコース残基を1個ずつポリマー鎖へと変換する最終ステップを触媒する。
特定の実施形態では、本発明の改変された光合成微生物は、増加した量のグリコーゲン分解経路に関連する1つまたは複数の遺伝子を発現する。特定の実施形態では、前記1つまたは複数のポリヌクレオチドは、グリコーゲンホスホリラーゼ(GlgP)、グリコーゲンイソアミラーゼ(GlgX)、グルカノトランスフェラーゼ(MalQ)、ホスホグルコムターゼ(Pgm)、グルコキナーゼ(Glk)、および/もしくはホスホグルコースイソメラーゼ(Pgi)、またはその機能的断片もしくは変異体をコードしている。Pgm、Glk、およびPgiは、条件次第でグリコーゲンの合成または分解を促進することができる双方向の酵素である。
様々な実施形態では、本発明の改変された光合成微生物、たとえばラン藻は、それだけには限定されないが本明細書中に記載のもののうちの任意のものを含めた、トリグリセリドまたは脂肪酸の生合成に関連する活性を有するポリペプチドをコードしている、1つまたは複数の外因性または導入した核酸を含む。特定の実施形態では、外因性核酸は、微生物のゲノムにネイティブな核酸配列を含まない。特定の実施形態では、外因性核酸は、微生物のゲノムにネイティブな核酸配列を含むが、これは、たとえば、微生物における核酸および/またはそのコードされているポリペプチドの発現を増加させるために、たとえばベクター中でまたは分子生物学技法によって、微生物内に導入されたものである。
トリグリセリド、またはトリアシルグリセロール(TAG)は、主に3個の脂肪酸でエステル化されたグリセロールからなり、酸化された際に炭水化物またはタンパク質のどちらよりも多くのエネルギーを与える。トリグリセリドは、ほとんどの真核生物においてエネルギー貯蔵の重要な機構を提供する。哺乳動物では、TAGは脂肪細胞および肝細胞を含めたいくつかの細胞種中で合成および保存される(Bellら、Annu. Rev. Biochem.、49巻:459〜487頁、1980年)(本明細書中に参考として組み込まれている)。植物では、TAGの産生は種子油の生成に主に重要である。
脂肪酸とは、様々な長さおよび様々な度合の酸化状態の、負荷電の直鎖状の炭化水素鎖の群である。負電荷はカルボキシル末端基に位置し、典型的には生理的pH値(pK約2〜3)で脱プロトン化される。脂肪酸の「尾」の長さにより、その水溶性(というよりは不溶性)および両親媒性の特徴が決定される。脂肪酸は、生体膜の一部を形成するリン脂質およびスフィンゴ脂質、ならびに細胞内でエネルギー貯蔵分子として主に使用されるトリグリセリドの構成要素である。
特定の実施形態では、本発明には、グリコーゲン分解またはトリグリセリドもしくは脂肪酸の生合成に関連するポリペプチド、あるいはその変異体または機能的断片をコードしている、1つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含む改変された光合成微生物が含まれる。したがって、本発明では、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、およびアセチル−CoAカルボキシラーゼなどの、様々なグリコーゲン分解経路のタンパク質ならびに本明細書中で利用するトリグリセリドおよび脂質生シンターゼをコードしている単離したポリヌクレオチド、任意の機能的な天然に存在する変異体もしくは断片(すなわち、対立遺伝子変異体、相同分子種、スプライシング変異体)またはこれらのネイティブ酵素の天然に存在しない変異体もしくは断片(すなわち操作によって最適化したもの)をコードしているヌクレオチド配列、また、たとえばクローニングおよび発現ベクターを含めた、そのようなポリヌクレオチドを含む組成物を利用する。
本発明の実施形態は、前記ラン藻中における脂質産生および/またはトリグリセリドの産生を増加させるための、その切断、変異および/または改変したポリペプチドを含めた、グリコーゲン分解経路に関連するもの、またはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性、および/もしくはアセチル−CoAカルボキシラーゼ活性を有するものを含めた、導入したポリペプチドを含む改変されたラン藻の使用を企図する。
特定の実施形態では、変異体ポリペプチドには、グリコーゲン分解ポリペプチド、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、またはアセチル−CoAカルボキシラーゼ参照ポリペプチドの対応する配列に対して少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%またはそれより多くの配列同一性または類似度を有しており、その参照ポリペプチドの酵素活性を保持しているアミノ酸配列が含まれる。
また、上述したもののうちの任意のものを含めた、本発明の改変された光合成微生物、たとえばラン藻において前記炭素ベースの生成物を産生させることを含む、グリコーゲン以外の炭素ベースの生成物を産生させる方法も企図される。特定の実施形態では、改変された光合成微生物は、低下したレベルのグリコーゲンの生合成または貯蔵経路に関連する1つまたは複数の遺伝子を発現する、および/あるいは増加したレベルのグリコーゲン分解に関連するポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは断片を発現する。特定の実施形態では、光合成微生物は、野生型光合成微生物と比較して、低窒素条件下で低下した量のグリコーゲンを蓄積する。特定の実施形態では、改変された光合成微生物は、グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の発現が低下している、または1つもしくは複数のその遺伝子中に突然変異を含む。上述のように、特定の実施形態では、前記1つまたは複数の遺伝子には、グルコース−1−リン酸アデニルトランスフェラーゼ(glgC)、ホスホグルコムターゼ(pgm)、および/またはグリコーゲンシンターゼ(glgA)が含まれ得る。
DGATおよびPAPを発現するラン藻の調製
グラム陰性のTAG形成原核生物であるAcinetobacter baylii sp.ADP1は、十分に特徴づけられたDGAT遺伝子(AtfA、本明細書中でADP1−DGATとも呼ぶ)を含有する。ADP1−DGATヌクレオチド配列を合成し、DNA2.0を用いてS.elongatus PCC 7942中での発現にコドン最適化し、プラスミド中に受け、確立された分子生物学的技法を用いてIPTG誘導性ベクターpAM2991trc(このベクターは、lacI転写リプレッサー、およびLacIによって制御されるpTrcプロモーターをコードしている配列を含有する)内にサブクローニングし、S.elongatus PCC 7942の中立部位1(NS1)内に組み換えた。コロニーをBG11−spec/strepプレートから選択し、単離のために再度画線し、PCRによって陽性コロニーについて試験した。遺伝子の誘導性転写はリアルタイムPCRによって確認した。
DGATおよびACCaseを発現するラン藻の作製
Synechococcus sp.PCC 7002は、細菌アセチル補酵素Aカルボキシラーゼ(7002acc)の4つのサブユニットをコードしている4つの遺伝子を含有する。これらの遺伝子(accA、accB、accC、およびaccD)をPCR増幅し、重複伸長PCR技法によるスプライシングを用いて、2つの合成の、2個の遺伝子のオペロンを構築した。合成オペロン1はaccADを含有し、合成オペロン2はaccBCを含有する。2つの合成オペロンをベクターpTG2087(pAM2314Ftrc3.)内にクローニングした。ベクターpTG2087は、S.elongatus PCC 7942の中立部位1(NS1)内への組換えのための相同性の領域、lacI転写リプレッサーをコードしている配列、およびLacIによって制御されるpTrcプロモーターを含有する。合成7002accオペロン1および2を、pTrcプロモーターの制御下でpTG2087内に2つの別々の部位でクローニングして、プラスミドpTG2087−7002accを作製した。クローン候補を配列決定して、7002acc遺伝子のいずれのコード配列中にもPCRに誘導された突然変異が存在しないことを確認した。
ラン藻における増加した脂肪酸産生
実施例1からのADP1−DGATを発現するラン藻を、増加したレベルの脂肪酸を産生する能力について試験した。ADP1−DGAT陽性クローンの誘導は、培養物がOD750=0.2に達した際に1mMのIPTGを加えることによって実施した。試料は誘導の24時間後に採取し、ガスクロマトグラフィー(GC)によって脂質含有率を分析した。
ラン藻におけるトリグリセリド産生およびDGATのTLC分析
アシルCoA:ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するいくつかの酵素が文献に記載されており、公的に利用可能なDNAおよびタンパク質のデータベースの相同性検索を実施することによっていくつかの相同体が同定された。いくつかのDGAT相同体を合成し、S.elongatus PCC 7942中での発現に最適化し、実施例1に記載のように相同組換えによってそのゲノム内に組み込ませた。
S.elongatusにおけるトリアシルグリセリドおよび遊離脂肪酸の蓄積
実施例1に記載のS.elongatus PCC 7942のADP1−DGAT発現株を実施例3に記載の誘導条件下で成長させ、実施例4に記載のように調製した全脂質抽出物をHPLC分析に供した。40μLの全脂質抽出物を、ESA Bioscience Corona CAD Plus検出器(Charged Aerosol Detector、荷電エアロゾル検出器)に接続したShimadzu Prominence UFLC(Ultra Fast Liquid Chromatograph、超高速液体クロマトグラフィー)で分析した。Hypersil Gold C8 3μm 150×4.6mmのカラム、0.8mL/分の流速を使用した。移動相A:メタノール/水/酢酸(750:250:4)および移動相B:アセトニトリル/メタノール/THF/酢酸(500:375:125:4)の二成分勾配系を使用した。典型的な実行の結果を図3に示し、y軸は様々な脂質種のピークの強度を示し、x軸は対応する保持時間を示す。3つの主要な脂質群である遊離脂肪酸(FFA)、リン脂質、およびTAGを示し、これはそれらの脂質種の代表的な標準物質を用いて同定した(示さず)。見ることができるように、誘導した株はTAGを産生した。誘導していない株では、これらは検出不可能であった。したがって、TLCによって示されるように、ラン藻におけるDGATの外因性発現はTAGの形成をもたらす。
TAGのアシル鎖組成
実施例1および4に記載のADP1−DGATおよびScoDGAT株を、実施例3に記載のTAGの産生のために誘導した。実施例4に記載の方法に従って、脂質抽出物を調製し、非極性脂質をTLC上で分離した。対応する標準物質とのその共遊走によって決定した、TAGに対応するTLCプレート上のスポットは、それぞれのスポットを包含する四角形の面積を切り出すことによってTLCプレートから抽出した。その後、この物質をエステル交換およびGC分析に供した。図4に見ることができるように、これら2つの株によって産生されるTAGの脂肪酸組成は、ADP1−DGAT株によって産生されたTAGはC18およびC16アシル鎖の混合物から構成されており(図4A)、他方で、ScoDGAT株からのTAGはC16およびC22アシル鎖の混合物から構成されていた(図4B)点で異なっていた。このことは、これら2つのDGAT酵素の様々なアシル変化特異性を強調しており、2つ以上の異なるDGATを改変されたラン藻内に導入して複数の異なるTAGを生じることを支援している。
ラン藻におけるトリアシルグリセリドの産生
DGATの発現がS.elongatus PCC 7942の外でTAGの産生と相関しているかどうかを決定するために、DGATをコードしている遺伝子を異なる株、Synechcocystis sp.株PCC 6803(本明細書中以降、PCC 6803と呼ぶ)内に導入した。2つの変異体をSynechocystis sp.株PCC 6803中で構築した。第1の変異体は、PTrcプロモーターの制御下のADP1−DGATをコードしている遺伝子、カナマイシン耐性(nptA)およびラクトースリプレッサー(lacI)をコードしている座位を保有していた。陰性対照として、nptAおよびlacIを保有していたが、ADP1−DGAT遺伝子は保有していない株を構築した。どちらの構築体も、PCC 6803で使用するために考案した中立部位ベクター中で構築した。
塩耐性Synechococcus elongatus PCC 7942株の作製
S.elongatus PCC 7942は、高塩中では通常良好に成長しない淡水性のラン藻である。本実施例では、塩または汽水中で成長し、TAGを産生することができるラン藻S.elongatus PCC 7942変異体の作製を記載する。淡水培地(BG11)中で成長できることに加えて、この株は3%までの塩濃度(BG11培地中)中で成長することができる。
グリコーゲン経路欠失株の構築
グリコーゲンとしての炭素の野生型貯蔵から他の潜在的な炭素ベースの生成物への炭素流動を転用することが可能であるかどうかを試験するために、Synechococcusのグリコーゲン経路中のグリコーゲン生シンターゼを無能化した。特に、S.elongatus PCC 7942株中のリン酸アデニリルトランスフェラーゼ遺伝子(Synpcc7942_0603、glgC)およびホスホグルコムターゼ遺伝子(Synpcc7942_0156、pgm)遺伝子を、欠失によって個々に失活させて、2つの異なる改変したS.elongatus株、ΔpgmおよびΔglgCを作製した。
グリコーゲン経路欠失株による低下したグリコーゲン産生
窒素制限の条件下におけるS.elongatus PCC 7942の成長は、グリコーゲン蓄積をもたらすことが示されている(たとえばGoerlら、Microbiology、144巻:2449〜2458頁、1998年を参照)。実施例9に記載の、作製されたS.elongates PCC 7942のΔpgmおよびΔglgC欠失株を、窒素制限条件下で成長させた後に、野生型S.elongatus PCC 7942に対するそのグリコーゲン含有率について分析した。
グリコーゲン経路欠失変異体による増加した脂質産生
実施例9に記載のS.elongatus PCC 7942欠失株ΔpgmおよびΔglgCの脂質産生を測定して、細胞が、そのグリコーゲン経路中の生シンターゼの欠失が原因で炭素をグリコーゲンとして保存できない場合、これらは炭素を他の生合成経路へと転用することを実証した。
Synechococcus PCC 7002およびSynechocystis PCC 6803におけるグリコーゲン経路欠失変異体による増加した脂質産生
上述のように、S.elongatus PCC 7942のΔpgmおよびΔglgC欠失株は、増加した量の脂質を産生した。他の株のグリコーゲン経路変異体も増加した量の脂質を産生することを実証するために、glgCノックアウト株をSynechococcus sp.PCC 7002で作製し、glgC−部分二倍体をSynechocystis sp.PCC 6803で作製した。完全なglgCノックアウトはSynechocystis sp.PCC 6803で作製することができなかった。glgCの突然変異および野生型のコピーをどちらも含有する部分二倍体は容易に得られた。Synechococcus sp.PCC 7002およびSynechocystis sp.PCC 6803のノックアウト株は、実施例9にS.elongatus PCC 7942について記載のように作製した。Synechocystis sp.PCC 6803で得られた部分二倍体に関して、glgC遺伝子の突然変異および野生型のコピーは、どちらも複数の形質転換体のゲノムDNAのPCR分析によって検出された。
Claims (61)
- 野生型光合成微生物と比較して低下した量のグリコーゲンを蓄積する改変された光合成微生物であって、前記光合成微生物は、
(a)野生型光合成微生物と比較して、グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の1つまたは複数の遺伝子の発現が低下している、および/あるいは
(b)グリコーゲン分解経路のタンパク質、またはその機能的断片もしくは変異体をコードしている、1つまたは複数の導入されたポリヌクレオチドを含む
、改変された光合成微生物。 - ラン藻である、請求項1に記載の改変された光合成微生物。
- 野生型光合成微生物と比較して、ストレス条件下で低下した量のグリコーゲンを蓄積する、請求項1または請求項2に記載の改変された光合成微生物。
- 野生型光合成微生物と比較して、増加した量の脂質を蓄積する、請求項1から3のいずれかに記載の改変された光合成微生物。
- 前記1つまたは複数の遺伝子が、グルコース−1−リン酸アデニルトランスフェラーゼ(glgC)遺伝子、ホスホグルコムターゼ(pgm)遺伝子、およびグリコーゲンシンターゼ(glgA)遺伝子からなる群から選択される、請求項1から4のいずれかに記載の改変された光合成微生物。
- 前記1つまたは複数の遺伝子が前記glgC遺伝子を含む、請求項5に記載の改変された光合成微生物。
- 前記1つまたは複数の遺伝子が前記pgm遺伝子を含む、請求項5に記載の改変された光合成微生物。
- 前記1つまたは複数の遺伝子が前記glgA遺伝子を含む、請求項5に記載の改変された光合成微生物。
- 前記1つまたは複数の遺伝子が前記glgC遺伝子および前記pgm遺伝子を含む、請求項5に記載の改変された光合成微生物。
- 前記1つまたは複数の遺伝子が完全または部分的な遺伝子欠失を含む、請求項1に記載の改変された光合成微生物。
- 前記光合成微生物が、ラン藻であり、前記ラン藻がSynechococcus elongatusである、請求項2から10のいずれかに記載の改変された光合成微生物。
- 前記Synechococcus elongatusがPCC 7942株である、請求項11に記載の改変されたラン藻。
- Synechococcus elongatus PCC 7942株の塩耐性変異体である、請求項12に記載の改変されたラン藻。
- 前記光合成微生物が、ラン藻であり、前記ラン藻がSynechococcus sp.PCC 7002である、請求項2から10のいずれかに記載の改変された光合成微生物。
- 前記光合成微生物が、ラン藻であり、前記ラン藻がSynechocystis sp.PCC 6803である、請求項2から10のいずれかに記載の改変された光合成微生物。
- グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の1つまたは複数の遺伝子の発現が低下している、請求項1から15のいずれかに記載の改変された光合成微生物。
- グリコーゲン分解経路の1つまたは複数のタンパク質、またはその機能的断片もしくは変異体をコードしている1つまたは複数の導入されたポリヌクレオチドを含む、請求項1から15のいずれか一項に記載の改変された光合成微生物。
- トリグリセリドまたは脂質の生合成に関連する1つまたは複数の酵素をコードしている1つまたは複数の導入されたポリヌクレオチドを含む、請求項1から17のいずれかに記載の改変された光合成微生物。
- 前記1つまたは複数の酵素がアシルトランスフェラーゼ(DGAT)を含む、請求項18に記載の改変された光合成微生物。
- 前記1つまたは複数の酵素がホスファチジン酸ホスファターゼを含む、請求項18に記載の改変された光合成微生物。
- 前記1つまたは複数の酵素がアシルトランスフェラーゼ(DGAT)およびホスファチジン酸ホスファターゼを含む、請求項18に記載の改変された光合成微生物。
- 前記1つまたは複数のポリヌクレオチドが1つまたは複数の発現ベクター中に存在する、請求項18から21のいずれかに記載の改変された光合成微生物。
- 野生型光合成微生物と比較して、ストレス条件下で低下した量のグリコーゲンを蓄積する改変された光合成微生物を作製する方法であって、前記方法は:
(a)グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の1つまたは複数の遺伝子の発現レベルが、野生型光合成微生物における前記1つまたは複数の遺伝子の発現レベルと比較して低下しているように、光合成微生物を改変する工程、および/あるいは
(b)光合成微生物内に、グリコーゲン分解経路の1つまたは複数のタンパク質またはその機能的断片もしくは変異体をコードしている1つまたは複数のポリヌクレオチドを導入する工程
を含む、方法。 - 前記光合成微生物がラン藻である、請求項23に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の遺伝子が、グルコース−1−リン酸アデニルトランスフェラーゼ(glgC)遺伝子、ホスホグルコムターゼ(pgm)遺伝子、およびグリコーゲンシンターゼ(glgA)遺伝子から選択される、請求項23または請求項24に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の遺伝子が前記glgC遺伝子を含む、請求項25に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の遺伝子が前記pgm遺伝子を含む、請求項25に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の遺伝子が前記glgA遺伝子を含む、請求項25に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の遺伝子が前記glgC遺伝子および前記pgm遺伝子を含む、請求項25に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の遺伝子が完全または部分的な遺伝子欠失を含む、請求項23から29のいずれかに記載の方法。
- 前記光合成微生物がSynechococcus elongatusである、請求項23から30のいずれかに記載の方法。
- 前記Synechococcus elongatusがPCC 7942株である、請求項31に記載の方法。
- 前記Synechococcus elongatusがSynechococcus elongatus PCC 7942株の塩耐性変異体である、請求項32に記載の方法。
- 前記光合成微生物がSynechococcus sp.PCC 7002である、請求項23から30のいずれかに記載の方法。
- 前記光合成微生物がSynechocystis sp.PCC 6803である、請求項23から30のいずれかに記載の方法。
- グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の1つまたは複数の遺伝子の発現レベルが、野生型光合成微生物における前記1つまたは複数の遺伝子の発現レベルと比較して低下しているように、光合成微生物を改変する工程を含む、請求項23から35のいずれかに記載の方法。
- 前記光合成微生物内に、グリコーゲン分解経路の1つまたは複数のタンパク質またはその機能的断片もしくは変異体をコードしている1つまたは複数のポリヌクレオチドを導入する工程を含む、請求項23から35のいずれかに記載の方法。
- グリコーゲン以外の炭素ベースの生成物を産生させる方法であって、前記方法は、改変された光合成微生物中で前記炭素ベースの生成物を産生させる工程を含み、前記改変された光合成微生物は:
(a)グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の1つまたは複数の遺伝子の発現が低下している、および/あるいは
(b)グリコーゲン分解経路のタンパク質またはその機能的断片もしくは変異体をコードしている、導入されたポリヌクレオチド
を有する、方法。 - 前記光合成微生物がラン藻である、請求項38に記載の方法。
- 前記光合成微生物が、野生型光合成微生物と比較して、ストレス条件下で低下した量のグリコーゲンを蓄積する、請求項38または請求項39に記載の方法。
- 前記光合成微生物が、野生型光合成微生物と比較して、増加した量の前記炭素ベースの生成物を蓄積する、請求項38から40のいずれかに記載の方法。
- 前記1つまたは複数の遺伝子が、グルコース−1−リン酸アデニルトランスフェラーゼ(glgC)遺伝子、ホスホグルコムターゼ(pgm)遺伝子、およびグリコーゲンシンターゼ(glgA)遺伝子から選択される、請求項38から41のいずれかに記載の方法。
- 前記1つまたは複数の遺伝子が前記glgC遺伝子を含む、請求項42に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の遺伝子が前記pgm遺伝子を含む、請求項42に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の遺伝子が前記glgA遺伝子を含む、請求項42に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の遺伝子が前記glgC遺伝子および前記pgm遺伝子を含む、請求項42に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の遺伝子が完全または部分的な遺伝子欠失を含む、請求項38から46のいずれかに記載の方法。
- 前記光合成微生物がSynechococcus elongatusである、請求項38から47のいずれかに記載の方法。
- 前記Synechococcus elongatusがPCC 7942株である、請求項48に記載の方法。
- 前記Synechococcus elongatusがSynechococcus elongatus PCC 7942株の塩耐性変異体である、請求項49に記載の方法。
- 前記光合成微生物がSynechococcus sp.PCC 7002である、請求項38から47のいずれかに記載の方法。
- 前記光合成微生物がSynechocystis sp.PCC 6803である、請求項38から47のいずれかに記載の方法。
- 前記炭素ベースの生成物が脂質を含む、請求項38から52のいずれかに記載の方法。
- 前記脂質が脂肪酸である、請求項53に記載の方法。
- 前記炭素ベースの生成物がトリグリセリドである、請求項38から52のいずれかに記載の方法。
- 前記光合成微生物が、トリグリセリドまたは脂質の生合成に関連する1つまたは複数の酵素をコードしている1つまたは複数のポリヌクレオチドを含み、前記1つまたは複数のポリヌクレオチドが前期光合成微生物の天然のゲノムに対して外因性である、請求項38から55のいずれかに記載の方法。
- 前記1つまたは複数の酵素がジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT)を含む、請求項56に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の酵素がホスファチジン酸ホスファターゼを含む、請求項56に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のポリヌクレオチドが1つまたは複数の発現ベクター中に存在する、請求項56から58のいずれかに記載の方法。
- 前記炭素ベースの生成物が、生物燃料または他の特殊化学製品の供給原料である、請求項38から59のいずれかに記載の方法。
- 前記炭素ベースの生成物が、生物燃料または他の特殊化学製品である、請求項38から59のいずれかに記載の方法。
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