JP2012512406A5

JP2012512406A5 -

Info

Publication number: JP2012512406A5
Application number: JP2011541315A
Authority: JP
Filing date: 2009-12-07
Publication date: 2013-01-10

Claims

エリトロポエチンを産生する真核細胞の発酵の培養上澄みをインプロセス制御する方法であって、次の工程：
ａ）エリトロポエチンを含有する試料を、エリトロポエチンを産生する真核細胞の培養上澄みから得る工程；
ｂ）エリトロポエチンを含有する試料をゲル中で、下限が２．５〜３．５であり、かつ上限が５〜８であるｐＨ範囲にわたって等電点電気泳動させる工程；
ｃ）ゲル中に含まれ、かつ分離されたタンパク質を膜上へ転写する工程；
ｄ）前記膜に結合したエリトロポエチンを特異的抗体により検出する工程、その際に、エリトロポエチンのアイソフォーム組成が得られ；
ｅ）前記試料中のエリトロポエチンの含量を、好ましくはＥＬＩＳＡを用いて決定する工程；
ｆ）必要に応じて発酵溶液を精製する工程
を有し、その際に、工程ｄ）において前記膜をエリトロポエチン向けの第一の抗体と共にインキュベーションした後に、１つ又はそれ以上の洗浄工程を行い、引き続き改めて前記膜をエリトロポエチン向けの第一の抗体と共にインキュベーションし、
前記膜をエリトロポエチン向けの第一の抗体と共にインキュベーションした後に続く洗浄工程の際に使用される少なくとも１つの溶液が、水性媒体中の有機酸を含有する
ことを特徴とする、培養上澄みをインプロセス制御する方法。
工程ｄ）においてエリトロポエチン向けの第一の抗体が、前記膜に結合したエリトロポエチンに結合し、かつ前記膜に結合したエリトロポエチンへの第一の抗体の結合を検出する一方で、第一の抗体が、前記膜に結合したエリトロポエチンに結合している、請求項１記載の方法。
前記膜に結合したエリトロポエチンへの第一の抗体の結合の検出を、第一の抗体向けの第二の抗体により行う、請求項２記載の方法。
工程ｄ）においてエリトロポエチン向けの第一の抗体が、前記膜に結合したエリトロポエチンに結合し、かつ第一の抗体向けの第二の抗体が、エリトロポエチンに結合した第一の抗体に結合する、請求項１記載の方法。
酵素、好ましくはアルカリホスファターゼが、基質の触媒反応により呈色反応を発生させる第二の抗体に共有結合されている、請求項３又は４記載の方法。
前記溶液が、有機酸を０．１〜１．５質量％、好ましくは０．５〜１質量％、特に好ましくは０．６〜０．８質量％含有する、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
有機酸が、モノカルボン酸、ジカルボン酸又はトリカルボン酸であり、好ましくは酢酸、プロピオン酸、乳酸、コハク酸、アスコルビン酸、アジピン酸又はクエン酸からなる群から選択され、かつ特に好ましくは酢酸である、請求項６記載の方法。
膜としてポリフッ化ビニリデン膜を使用する、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
等電点電気泳動のために、不活性な支持体フィルムに取り付けられているポリアクリルアミドゲルを使用する、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
前記ゲルのｐＨ値の調節のために、前記ゲル中での等電点電気泳動中にｐＨ３〜ｐＨ６のｐＨ範囲に調節するアンフォラインを使用する、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
エリトロポエチンを含有する試料が、灌流反応器中に保持されたエリトロポエチンを産生する真核細胞の培養上澄みに由来する、請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。
エリトロポエチンを含有する試料を、等電点電気泳動の前に脱塩し、かつ必要に応じて濃縮する、請求項１１記載の方法。
エリトロポエチンのアイソフォーム組成の決定を発酵中に行う、請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。