JP2012509079A - Fretに基づく病原体の迅速診断 - Google Patents
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Abstract
Description
マーカー1-(リンカー)-X1-X2-(リンカー)-マーカー2または
マーカー1-(リンカー)-X1-X2-X3-(リンカー)-マーカー2
ここでX1、X2またはX3の1つ、例えばX1がD-アミノ酸であり、残りのアミノ酸、例えばX2およびX3が任意のD-またはL-アミノ酸であってもよい。
FITC-Ahx-X1-X2-(X3)-Lys-DABCYL
ここでX1、X2およびX3は上で定義されており、リンカー分子Ahxはアミノヘキソン酸、リンカー分子Lysはアミノ酸のリジンである。
AcNH-Cys(S-Ac)-X1-X2-Cys(S-Ac)-OHまたは
AcNH-Cys(S-Ac)-X1-X2-X3-Cys(S-Ac)-OH
ここでX1、X2およびX3は上で定義されたものである。
(実施例1)
材料と方法
細菌
Brain Heart Infusion(BHI)培地または70%ヒト血清(HuS)中、適切な増殖温度で細菌を一晩増殖させた。翌日、細菌を10分間10000rpmでの遠心分離によりペレット化した。上清を0.22uMフィルター(MilliPore)での濾過により滅菌した。質量分析の解析ならびにインビトロおよびエクスビボの結果の確認のため、B.アンスラシス感染を受けたマウスの血清をWaters Sep-Pak classic cartridge WAT051910 C18カラムで濾過した。
FRETペプチドはPepScan(オランダ)により合成した。同一性および純度を質量分析および逆相HPLCにより確認した。炭疽菌致死因子(LF)はList Laboratoriesから購入した。サーモリシン、クロストリジウム由来コラゲナーゼおよびリゾスタフィンはSigmaから購入した。ビブリオ由来コラゲナーゼ/ディスパーゼはRocheから購入した。LF阻害剤12155はPyxis(オランダ)により合成した。9つの試験ペプチドを合成し、FITCおよびDABCYLと反応させて、以下の試薬を形成した。
アッセイ反応は、黒色ウェルで底部が透明の96ウェルプレート(Corning)中で行った。酵素アッセイのため、上述の試薬各々10uMを37℃でサーモリシン(1ug)、クロストリジウム由来コラゲナーゼ(10ug)、ビブリオ由来コラゲナーゼ/ディスパーゼ(5ug)またはLF(1ug)の存在下でインキュベートした。細菌上清中の酵素活性は、16uMのFRETペプチドを100uLの濾過された上清とともに37℃でインキュベートすることにより決定した。濾過されたBHI培地または70% HuSを対照として用いた。プレートは10分間隔でCytofluor 4000(Applied Biosystems)上で、485nmフィルターを用いた励起および530nmフィルターを用いた発光で読み取った。結果を図1、2および3に示す。
BikKam1のSepPak画分(Waters Sep-pak classic cartridge C18)を1)BHI中でB.アンスラシスを添加しておよび添加しないで、2)感染および対照マウスの血清とともにインキュベートしたものについて、[FITC]-Ahx-Leu-D-Leuおよび[dabcyl]-K(NH2)の存在を分析した。
カラム:PepMap C18;3μm;15cmx1mm サイズ:10 en 50μl
材料と方法
B.セレウスおよびB.グロビギ細胞を5mlのBHI培地中で37℃で一晩増殖させた。翌日、細菌をBHI中で1:10に希釈して0.01MのBikKam1(PepScan、オランダ)存在下で増殖させた。増殖中、細胞試料を1時間間隔で採取した。細胞試料をPBSで2回洗浄し、20uLのPBSで再構成してガラススライド上にスポットした。陰性対照として、BikKam1を添加せずに16時間増殖させた細菌を用いた。蛍光顕微鏡検査はLeitz Orthoplan顕微鏡で1000倍の倍率を用いて行った。
2時間のインキュベーション後、蛍光のBikKam1断片をB.セレウスの細胞質中で検出できた(図5B)。4時間時では、蛍光のBikKam1断片は細胞質中に加えて、新たに分裂した側の細胞壁(側壁)中にも存在していた(図5C)。最終的に16時間のインキュベーション後、全てのBikKam1断片がB.セレウスの細胞質から側壁に移動した(図5D)。細菌B.グロビギはBikKam1基質を切断できないことから、陰性対照として用いた。予想された通り、BikKam1存在下で培養したB.グロビギは蛍光細菌にならなかった。また0時間時およびBikKam1を添加せずに増殖させた試料において、蛍光細菌を検出できなかった(図5A)。これらの結果は前述のFRETアッセイ、細菌酵素の検出に加えて、BikKam1基質を用いると細菌の可視化も可能であることを示す。
Claims (23)
- 微生物、より具体的にはB.アンスラシスを検出するための基質であって、任意選択でリンカー分子またはリンカー部分を用いて、アミノ酸X1およびX2、またはX1、X2およびX3からなるジまたはトリペプチドに連結した一組の分子マーカーを含み、前記アミノ酸の1つ、例えばX1がD-アミノ酸であり、残りのアミノ酸、例えばX2およびX3が任意のD-またはL-アミノ酸であってもよい、基質。
- D-アミノ酸が、中性アミノ酸、好ましくはDLeu、DVal、DIle、DGlyまたはDAla、より好ましくはDLeu、DValまたはDIleである、請求項1に記載の基質。
- Lアミノ酸1つまたはLアミノ酸2つのうち1つがLeuである、請求項1または2に記載の基質。
- 前記一組の分子マーカーが、蛍光標識、好ましくはFITC(フルオレセイン-5-イソチオシアネート)および前記蛍光標識の消光物質、好ましくはDABCYL(4-((-4-(ジメチルアミノ)-フェニル)-アゾ)-安息香酸)を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載のバチルス・アンスラシスを蛍光検出するための基質。
- リンカーがアミノヘキソン酸(FITC用)およびリジン(DABCYL用)である、請求項4に記載の基質。
- FITC-Ahx-X1-X2-X3-Lys-DABCYL(ここでX1、X2およびX3は請求項1に定義されており、X3は存在しなくてもよく、Lysはリジンを表し、Ahxはアミノヘキソン酸を表す)である、請求項5に記載の基質。
- 次の表1からなる群から選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の基質。
- 前記一組の分子マーカーが末端アセチル化システインを2つ含み、リンカーが存在しない、請求項1から3のいずれか一項に記載のバチルス・アンスラシスを検出するための基質。
- AcNH-Cys(S-Ac)-X1-X2-X3-Cys(S-Ac)-OH(ここでX1、X2およびX3は請求項3に定義されており、X3は存在しなくてもよく、Cys(S-Ac)はチオールアセチル化システインを表し、AcNHはアセチル化アミノ末端を表す)である、請求項8に記載の基質。
- 次の表2からなる群から選択される、請求項8または9に記載の基質。
- 試料中の微生物、特にバチルス・アンスラシスを検出するための方法であって、請求項1から10のいずれか一項に記載の基質を試料に添加する段階と、蛍光または色のシフトを検出する段階とを含む方法。
- 蛍光シグナルが微生物細胞において細胞内に位置する、請求項11に記載の方法。
- 試料が、体液、粉末、水、食品、培地または任意の他の生物学的マトリックスから選択される、請求項11または12に記載の方法。
- 試料中のバチルス・アンスラシスPXO1+を同定するための方法であって、請求項1から10のいずれか一項に記載の基質を試料に添加する段階と、蛍光、色のシフトもしくは特異的な質量スペクトルを検出するまたはキャピラリー電気泳動により検出を達成する段階とを含む方法。
- バチルス・アンスラシスを検出および診断するための、請求項1から10のいずれか一項に記載の基質の使用。
- 微生物、より具体的にはP.エルギノーサを検出するための基質であって、任意選択でリンカー分子またはリンカー部分を用いて、グリシンアミノ酸からなるトリ、テトラまたはペンタペプチドに連結した一組の分子マーカーを含む、基質。
- 前記一組の分子マーカーが、蛍光標識、好ましくはFITC(フルオレセイン-5-イソチオシアネート)および前記蛍光標識の消光物質、好ましくはDABCYL(4-((-4-(ジメチルアミノ)-フェニル)-アゾ)-安息香酸)を含む、請求項16に記載の基質。
- リンカーがアミノヘキソン酸(FITC用)およびリジン(DABCYL用)である、請求項17に記載の基質。
- 次の表3からなる群から選択される、請求項16に記載の基質。
- 試料中の微生物、特にシュードモナス・エルギノーサを検出するための方法であって、請求項16から19のいずれか一項に記載の基質を試料に添加する段階と、蛍光または色のシフトを検出する段階とを含む方法。
- 蛍光シグナルが微生物細胞において細胞内に位置する、請求項20に記載の方法。
- 試料が、体液、粉末、水、食品、培地または任意の他の生物学的マトリックスから選択される、請求項20または21に記載の方法。
- シュードモナス・エルギノーサを検出および診断するための、請求項16から19のいずれか一項に記載の基質の使用。
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