JP2012501674A

JP2012501674A - 特徴的なマーカー作製方法

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Publication number: JP2012501674A
Application number: JP2011526822A
Authority: JP
Inventors: イェルン・ニコラス・アルベルト・マリア・ラウペ・ファン・デル・フォールト; アンカー・プレベン・セレンセン
Original assignee: キージーン・エン・フェー
Priority date: 2008-09-11
Filing date: 2009-09-04
Publication date: 2012-01-26
Anticipated expiration: 2029-09-04
Also published as: CN102159711A; WO2010030171A8; US20110258711A1; JP5973533B2; AU2009292297A1; JP2015037428A; CN102159711B; IL211424A0; RU2011113978A; BRPI0913477A2; CA2737303A1; MX2011002617A; AU2009292297B2; JP5653921B2; EP2998397B1; CA2737303C; EP2342337A1; EP2342337B1; WO2010030171A1; KR20110094268A

Abstract

本発明は、形質と関連するマーカーの選択、生殖質内の一つのセットのマーカー内でのヌクレオチドレベルでの既存のバリエーション同定、および、標的ヌクレオチド交換を使用した、マーカーの一定の領域のある位置への一つまたは複数のヌクレオチド導入を用いた選択可能なマーカーの導入による、既存の繁殖材料内でのユニークな分子マーカーの作製の方法に関する。

Description

本発明は、生物の特徴的分子マーカー、特に特徴的なマーカーの作製方法に関する。前記方法は、生物の生殖質における、選択可能マーカーの導入、および、例えば植物などの繁殖プロセスにおける前記マーカーの使用に関する。

ここ１０年の間、ＤＮＡマーカー技術は、表現型を追跡することがしばしば困難である場合に代わって、マーカーを簡便に検定する方法を基礎とした選別を許容することにより、劇的な植物繁殖効率の向上をもたらしている。しかし、このような特徴的なマーカーの作製、および、適用されたこれらマーカーを有効にするにはたびたび困難が伴い、時間がかかる。最初に、特徴的なマーカーの作製は以下から始まるプロセスの後に続いて行われる：
1) 興味のある形質の基礎をなす遺伝子の遺伝的位置の地図作成
2) 隣接したマーカーの同定
3) 密接に連鎖したマーカーの同定による遺伝子の細密な地図作成
4) 最も連鎖するマーカーのＤＮＡマーカー配列の決定
5) 標的遺伝子の地図を作成するのに用いた親株ライン間のマーカー遺伝子座の配列多型の決定
6) 簡便なPCR解析の開発
7) 特徴的なマーカーをテストする、植物材料の遺伝的バックグラウンド（生殖質）における予測値のテスト。

本願明細書で用いている生殖質は遺伝的な資源を示す、またはさらに正確には生物のＤＮＡおよびその物質の集合物を示す言葉である。育種家は、単語「生殖質」を、変種植物を産生するのに使用することができる遺伝物質の集合物を示すのに使用する。

幸運なことに、最近の作製は特に一遺伝子性の形質を扱う場合、著しく工程１〜４を加速してきた（Morgante and Salamini 2003 Curr. Opinion in Biotechnol 14: 214-219; Varshney et.al. 2005 TiPS 10: 621-630）。工程５〜６は特徴的な検定の開発に用いる配列多型（ＳＮＰｓ）の周囲に一連のユニークなＤＮＡのマーカー配列がどの程度出現するかに依存する。植物ゲノムには反復性の配列が多く分散しており、それらは特徴的なマーカーの開発の可能性を著しく妨げている。特に農作物はゲノムのサイズが大きいためにコピー数の少ないＤＮＡ断片の同定は干草が積み重なる中で針を探すようなものである。最後に、工程7は1) 植物の交配システム、および、2) 農作物のゲノム内の遺伝的な可変性レベルに、非常に依存している。機能的な変異が起こったとき、この変異は他にもともと存在していたＤＮＡ多型のハプロタイプとなる。形質は無作為な交配により引き続き生じる世代を通じて伝達されるため、多くの組み換えが起こり、独自のハプロタイプを小さな連鎖ブロックへとしてしまう。このことにより、形質遺伝子が、本来のハプロタイプの特有の対立遺伝子の大部分から分離されることとなる。この結果、非常に緊密に形質遺伝子に連鎖したDNA多型だけでなく、原因となる多型それ自身が、有用なＤＮＡマーカーへと転用され利用される可能性がある。例えば、非近交系無作為交配集団において、組み換えおよび組み換えにおける高い交換率は、（理論的には）非常に小さい、形質を含む領域を、結果として生じる。そのため、完全に遺伝子に関連するＤＮＡマーカーは非常に見つけにくい。反対に、例えば、自殖はホモ接合性を増し、そのため、組換えによってシャッフルされうる。ヘテロ接合体の数は制限されるので、近交系集団の連鎖ブロックは比較的に大きくなる傾向がある。しかし、栽培された種の遺伝的な基礎が非常に限定される農作物にとっては、比較的大きな連鎖ブロックが存在するにも関わらず、ＤＮＡマーカー作製のスタート地点としてＤＮＡ多型を同定することは難しい。

Morgante and Salamini 2003 Curr. Opinion in Biotechnol 14: 214-219 Varshney et al. 2005 TiPS 10: 621-630

本発明者は以上の問題から解放される選択可能なマーカーを作成する方法を作製することを立案した。

本願出願においては、自然に生じる配列多型の作製および同定の代わりに、ターゲット領域にユニークで人工的で選択できるマーカーを導入することを示す方法を記載する。この方法の論理的な根拠は、候補マーカー遺伝子座の配列情報に基づき、ユニークなマーカーをデザインし、関心のある形質を内部に持つラインに導入することができることである。このようなマーカーの適応が好まれるのは、新しく導入されたマーカーが多世代を経て関心のある形質と持続的に共に分離するからである。本発明者は、広い予測価値を有するマーカーとして有用であるように、標的領域にマーカーを導入する方法を発見した。

本発明者は、関心のある形質と密接に連鎖した（すなわち、この形質と共に分離する、前もって定義された一致性で）ＤＮＡ切片の同定および/または選別、ならびに、標的変異（targeted mutagenesis）、標的ヌクレオチド交換（targeted nucleotide exchange）(ＴＮＥ）のための方法を用いた、この選別の選択可能なマーカーへの変換を基礎とする戦略を発見し、上記の困難を克服した。特に、本発明者は、どの置換をするべきかを決定するための、および、遺伝的な多型を最小限にし、マーカーの質、すなわち、関連した形質についての予測価値が生殖質内で最適であるが、マーカーを元々作製した異なる生殖質の中でも利用できるように、望むマーカーをデザインするための方法を見出した。

本発明は、生殖質における、一つまたは複数の（ユニークで選択可能な）分子マーカーの導入方法に関し、このマーカーは、密接に関心のある形質と連鎖しており、目的の形質と連鎖しているが適正なマーカー情報は含んでいないゲノム上に位置している。このＤＮＡ配列中には、事後的に選択可能な分子マーカーとして利用することができる人工的でユニークな多型がＴＮＥを用いて作成される。本発明はまた、生物内にユニークで選択可能なマーカーを作成するためのＴＮＥの使用にも関する。

そのため、第一の態様においては、本発明は、以下の工程を含む、生物内に特徴的なマーカーを作製する方法に関する：
―関心のある形質を選択する工程；
―形質に関連する遺伝子座を決定する工程；
―前記遺伝子座の遺伝子地図位置を決定する工程；
―前記遺伝子座から遺伝学的な距離の範囲に位置するマーカーを同定する工程；
―集団の各個体が前記マーカーを含む生物の集団を提供する工程；
―集団の各個体のマーカーのヌクレオチド配列を決定する工程；
―マーカーのヌクレオチド配列を整列する工程；
―集団のすべてのマーカーで同じヌクレオチドを含む、マーカー配列中の少なくとも一つの位置を選択する工程；
―前記少なくとも一つの位置の両側に近接するマーカー配列にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドをデザインする工程であって、前記オリゴヌクレオチドが、前記少なくとも一つの位置で、マーカー中の前記少なくとも一つの位置のヌクレオチドとは異なるヌクレオチド（マーカーヌクレオチド）を更に含む、工程；
―生物のＤＮＡ中に前記マーカーヌクレオチドを、前記オリゴヌクレオチドを用いた標的ヌクレオチド交換を使用して導入し、それにより形質と関連するマーカー中にユニークで選択可能なＳＮＰを導入する工程。

従って、関心のある形質に関連した遺伝子と密接に連鎖したＤＮＡ切片（マーカー）であり、その一部が生殖質中で実質的に一定のヌクレオチド組成（低い多型性である）であるＤＮＡ切片の同定、前記のＤＮＡ切片中のヌクレオチドレベル（Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ）でのバリエーション決定（または、生殖質中のマーカー中の一定のヌクレチド組成である領域の決定）、その位置において低いレベルの、好ましくは最も低いレベルのバリエーションを含む切片内の位置の選択、前記の位置で生じるヌクレオチド（切片内でのいかなるバリエーションも含む）と異なるヌクレオチド、すなわち前記の位置で最も低い出現率であるヌクレオチドの選択、前記の位置の両端に隣接した配列とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドのデザイン、および、標的ヌクレオチド交換により生物のＤＮＡ中の前記の位置で選択されたヌクレオチド（マーカーヌクレオチド）の導入は、（生殖質の中で）ユニークで、選択可能なマーカー作製を提供する。

標的ヌクレオチド交換（Targeted nucleotide exchange）（ＴＮＥ）は変異誘発のプロセスであり、当該変異はオリゴヌクレオチド配列にデザインされたミスマッチな塩基によって導入される。ＴＮＥは植物、動物、酵母細胞において詳述されてきた。最初のＴＮＥレポートはいわゆるキメラに利用され、前記のキメラは前記の染色体の標的サイトにインターカレートするようにデザインされた自己相補的なオリゴヌクレオチドから成っていた。前記のキメラは、染色体の標的に変異を導入するための鋳型を形成するミスマッチなヌクレオチドを含んでいる。ＴＮＥイベントを選択するために、ほとんどの研究は除草剤抵抗性につながる内在性遺伝子内の一塩基変異の導入を試みる。キメラを使用する最初の例はヒト細胞に由来する（総説Rice et al. Nat. Biotech. 19: 321-326を参照せよ）。キメラの使用は、植物種タバコ、コメ、トウモロコシにおいて成功してきた（Beetham et al. 1999 Proc Natl. Acad. Sci. USA 96: 8774-8778; Kochevenko et al. 2003 Plant Phys. 132: 174-184; Okuzaki et al. 2004 Plant Cell Rep. 22: 509-512）。一本鎖（ss）オリゴヌクレオチドのＴＮＥ活性もまた試験されてきた。これらは小麦、酵母およびヒト細胞にさらに再現性のある結果を与えることが認められてきた（Liu et al. 2002 Nuc. Acids Res. 30: 2742-2750; review, Parekh-Olmedo et al. 2005 Gene Therapy 12: 639-646; Dong et al. 2006 Plant Cell Rep. 25: 457-65）。標的変異（Targeted mutagenesis ）（ＴＮＥ）はまた多くの特許出願、例えばＷＯ2005108622、ＷＯ2005049795、ＷＯ2004033708、ＷＯ03075856、ＷＯ03027765、ＷＯ0210364、ＷＯ0192512、ＷＯ0187914、ＷＯ0173002、ＷＯ0114531、ＷＯ9515972において詳述されている。ＴＮＥは今まではノックインやノックアウトにより遺伝子発現を変える目的のために詳述されてきた。これら従来技術は、生殖質へのユニークで選択可能なマーカーの導入のためにＴＮＥを使用する有効な方法を提供していない。

前記方法の第一の工程において、関心のある形質が選択される。当該形質は、一遺伝子性もしくは複遺伝子性形質、または、遺伝子の複合体、病気抵抗性に関連した形質もしくは収穫高に関連した形質によって制御されている一つの形質でありうる。

第二の工程では、関心のある形質に関連した遺伝子座、または遺伝子領域が選択される。もちろん、前記の形質が複遺伝子性の場合、遺伝子座の一つが選択されうる。

次に、遺伝子地図上の遺伝子の位置または遺伝子の領域が決定される。

前記の遺伝子地図位置の決定は、連鎖解析または遺伝子地図作製（Griffths AJF et al. 2005 Introduction to Genetic Analysis, 8^th ed. W.H. Freeman and Cie, New York pp. 115-137の例を参照せよ）と称される遺伝的手法を含む。遺伝子地図作製の必須の条件の一つは、関心のある前記形質が異なっており、前記形質が子孫内で分離する集団を得ることができる、二つの親ラインの遺伝子地図作製集団である。代わりに、単遺伝子形質の場合、bulked segment analysis ＢＳＡ（Michelmore et al. 1991 PNAS 88: 9828-9832）を用いることにより、形質の間隔で非常にズームインできうる。ＢＳＡを適用することによって、遺伝子地図作製の必要がない。

遺伝子の（事前に決定された）遺伝子距離内に、すなわち形質の周辺中に位置する候補マーカー配列は、関心のある生殖質（繁殖のために使われうる遺伝的可変性を含む、生物集団）中に同定される。典型的には、これは遺伝子の1 ｃＭ以内であるが、農作物間では異なっているかもしれない。このようなマーカーは隣接したマーカーとしても示される。関心のある形質の周辺の分子マーカーの遺伝子地図作成および同定は、好ましくは多重マーカー技術によって行われる。多重マーカー技術は、単一の検定内で多くのマーカーの同定を許容する。様々な総説が分子マーカー技術に関して存在する（現時点では、Raflaski A. 2002 Curr Opin. Plant Biol. 5 94-100, Peters J. et al. 2003 TiPS 8 484-491, Varsheny R. et al. 2005 TiPS 10 621-630）。

取り組まれるべき付加的な特性は、内在するマーカー配列のコピー数である。大部分の植物ゲノムは、反復配列に富んでおり（Kumar and Bennetzen JL 1999 Ann Rev Genet 33: 479-532）、同定された最初のマーカーの、通常目的での簡便な検定のためのマーカーへの転換が成功するかどうかは、低いコピーのＤＮＡに依存する。いくつかの方法が、反復配列による問題を克服するために開発されてきた。コピー数の決定は、サザンブロッティングのようなハイブリダイゼーション技術によって達成されうる。他の方法は、ｃＤＮＡ配列の利用、低速度でアニーリングする高濃度のＣｏｔＤＮＡ（Yuan et al. 2003 Plant J 34:249-255）の単離、メチル化ろ過（Rabinowicz PD 2003 Meth. Mol Biol 236 21-36）のような、遺伝子改良戦略に焦点を当てている。

本発明に述べられている方法におけるユニークなマーカーの導入は、新規の独創的な方法において、ゲノム中の複数のマーカー配列間を区別する課題もまた解決し、ゲノム中に単一コピーのマーカーを作製する方法を提供する。

適切な分子マーカー技術には、たとえばＡＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＳＳＲ、ＳＦＰおよびＳＮＰがある。単一または組み合わせでのこれらの技術の使用により、関心のある遺伝子に隣接する大量のマーカーのセットが、同定されることが可能になる。

前記の隣接したマーカーのセットは、形質の周辺または（典型的にはｃＭで表される）少なくとも前記遺伝子から望まれた距離内に位置するマーカーを決定する選択プロセスに供される。別の選択肢として、例えば論文に由来する、既知のマーカーも使われうる。

前記生物の集団は、典型的に育種家の生殖質の、または、大多数のメンバーがマーカーを含む、または含まないであろう別の適した集団の形態で提供される。前記の集団はマーカーの存在についてプレスクリーニングされるであろう。

前記マーカーを含む集団のメンバーから、前記マーカーは分離され（例えば電気泳動ゲルから切り出されて）、配列決定され、すなわちヌクレオチド配列が決定される。選択されたマーカーのセットのＤＮＡ配列の決定は、例えば、サンガージデオキシ配列決定法によって行われるが、他の配列決定方法でも実施することができる。

そのため、前記マーカーの選別の後で、マーカーの多様性を獲得するために、同一の生物の他のメンバーから、前記マーカーは同定され、分離される。これらのマーカーのそれぞれ、または少なくとも一部から、前記配列は決定される。当該配列は整列され、これらのマーカーのＤＮＡ組成中の任意のバリエーションが決定される。これは、前記マーカー配列のどの位置においてもＡ、Ｃ、ＴまたはＧのそれぞれの出現率が既知であることを示している。

マーカーが配列決定される集団のメンバー数は少なくとも２、好ましくは少なくとも５、さらに好ましくは少なくとも１０である。特定の実施態様において前記の数は２５または５０でありえ、集団のサイズおよび、生殖質中に多型が起こる程度に依存する。

前記配列の整列は手動で、または広く利用可能なソフトウェアツールを用いて実施されうる。前記配列の整列は、集団の異なるメンバーのマーカー配列間の差異に関する情報を提供し、すなわち、マーカー配列自身中の、多型またはその欠如の同定を可能とする。そうすることによって、前記マーカー中の他の領域と比較すると変化が少ない（または全くない）前記マーカー配列中の領域に関する情報が得られる。このような領域内においては、この領域中の他のヌクレオチドと比較して（相対的に）一定である（より変化が少ない）一つまたは複数のヌクレオチドが、選ばれうる。解析されたマーカーの中には、一定の組成であるマーカー配列中の領域が存在することさえあり得る。

前記を説明するため、以下のスキームを提供する：

集団メンバー、１、３、４および７は、マーカー内に遺伝的バリエーションを含む。これはマーカーそれ自身を生み出す多型では必ずしもなくともよいが、恐らくは、単なる遺伝的（バックグラウンド）バリエーションであろう。前記配列内には、（解析された集団内において）遺伝的バリエーションを含まない「ＯＸＱＹＸＯＱＹＹＱＹＯＸＱＹＹＱＸＯＹＹＸ」部分があるため、当該領域は、調査した生殖質中で、最も低い遺伝的バリエーションの領域としてもしくは前記ヌクレオチド内で最も低いバリエーションを伴う領域として、または低い可変性の領域もしくは一定のヌクレオチド組成の領域としてさえ、示されうる。このことは、図示した例において、一定の領域中「ＯＸＱＹＸＯＱＹＹＱＹＯＸＱＹＹＱＸＯＹＹＸ」部分の各ヌクレオチドが、ユニークなマーカーヌクレオチド導入のための位置として適任であることを示している。

その後の工程で、候補となるマーカーヌクレオチドの位置に隣接する位置でマーカー配列とハイブリダイズが可能なオリゴヌクレオチドがデザインされる。上記の図示した例においては、候補となるマーカーヌクレオチドの位置は、例えばＸＯＱＹＹＱＹＯＸ中の二番目のＹ（下線が引かれている）でありうる。マーカー配列とハイブリダイズでき、且つ、この位置でＯを含むオリゴヌクレオチド（ＹＱＯＸＯＯＸＱＹ）をデザインし、ならびに、ＴＮＥを用いることによって、ゲノム中の指示された位置への相補的なＯの導入により、ユニークなマーカー配列、すなわち、ＯＸＱＹＸＯＱＹＯＱＹＯＸＱＹＹＱＸＯＹＹＸ’を作製する。前述のユニークなＤＮＡ配列（少なくとも調査された集団内の）は特異的でユニークなマーカー配列を前述の種のゲノム中に作製する。ゲノム中へのこの特異的なマーカーの導入は以前から知られていたマーカーよりも高い正確性で望まれた形質を選択する育種に使われうる。

図３は、マーカーの形質へのｃＭ距離の変化に対する、ＢＣ１とＦ２集団内で予想された組み換え体の数を示している。単一のマーカーの場合、少なくとも一つの組み換え体（マーカーが形質なしで存在する、またはその逆）が、それぞれ、１００または５０植物毎に予想された。数千の植物の中で選別を行う、育種プログラムについては、前記の割合は、特徴的なマーカーが形質に十分に関連していることを保障する限界である。従来のマーカー作製方法において、かなり細密な地図作製の努力が、１ｃＭ間隔以内に十分なマーカーを同定するために要求された。従って、好ましくは、選択された隣接するマーカーセット中のマーカーが、最大で２ｃＭの距離に、好ましくは、最大で１ｃＭの距離に、さらに好ましくは最大で０．５ｃＭの距離に位置する。

しかし、二つ以上のマーカーが利用できる場合は、１００植物につき一つの組み換え体の割合は、ＢＣ１およびＦ２集団それぞれについて約１０ｃＭおよび約５ｃＭの間隔サイズの適用によって達成されうる。従って、本発明の方法により導入された二つのマーカーの使用は、本方法の有効性を有意に増加させる。選び抜かれた生殖質における形質の遺伝子移入に関しては、戻し交配する戦略が好まれ（図４を参照せよ）、ＴＮＥによるマーカー作製のためのマーカー選択の判断基準は、典型的には、形質の間隔が最大で１０ｃＭ以内でマーカーを少なくとも二つ設定する。

二つ以上のマーカーが作製される一つの実施態様では、隣接したマーカーの選択された（二つの）セットの距離は、図３から参照されうるように、好ましくは最大で１０ｃＭ、さらに好ましくは最大で５ｃＭと、有意に高くなりうる。

前述のオリゴヌクレオチドは、前記で概要を述べたように標的変異 (ＴＮＥ)を用いて、関心のある遺伝子座を持つ、生物のゲノムに導入される。得られた生物は、特異的に導入された、関心のある遺伝子座に密接に連鎖したゲノム配列の置換を含む。前記の特異的に導入された置換は、マーカーとして使われることができ、および、任意の従来の方法、分子マーカー技術、ＰＣＲアッセイ、ＳＮＰアッセイ、例えばＳＮＰＷａｖｅまたは他の手法、例えば配列解析によってアッセイされることができる。

従って、言い換えれば、マーカー配列内において、求まる限りでは、調査される生物内の調査される生殖質中に起こらないか、または起こったとしても稀であるユニークなヌクレオチドが導入される。

従って作製された前述のユニークなマーカーはＰＣＲアッセイのような単純な検定を用いてすぐに検定されうる。市販されている関連する遺伝的バックグランド（生殖質）のマーカー遺伝子座におけるＤＮＡ配列のバリエーションの決定は、サンガーデオキシ配列決定法によって、生殖質パネルのような集団においてＰＣＲでマーカー配列を増幅することによって達成される。前述の生殖質パネルは、例えば、適切な農作物の市販されている切片中の形質遺伝子座における遺伝的バリエーションを代表するものに、または育種家の生殖質を代表するものになりうる。一つの例として、９０の繁殖ラインに関して、ＤＮＡ配列を、マーカー遺伝子座Ｍ１について決定する（添付の図も参照）。ＤＮＡ配列の１０４の位置でシトシン（Ｃ）、またはグアニン（Ｇ）のいずれかが検出される。前述の知識に基づいて、前記の生殖質に存在していなさそうなユニークな一連のＤＮＡを作製するために、ＴＮＥによって導入されるヌクレオチドとして、アデニン（Ａ）が選択される。

ＴＮＥによる、ドナー植物ラインへのデザインされた配列変異の導入は、詳述された方法（Liu et al. 2002 Nuc. Acid. Res. 30: 2742-2750; review, Parekh-Olmedo et al. 2005 Gene Therapy12: 639-646; Dong et al. 2006 Plant Cell Rep. 25: 457-65）により行われる。ＴＮＥを用いて、マーカー遺伝子座Ｍ１でユニークなＤＮＡ配列を持つ繁殖ライン（従ってＭ１^＊と称される）が作製される。

表１は、本発明に述べた新規の方法と比較した、植物における特徴的なマーカー作製の、従来方法における全体のタイムスパンを示す。新規方法の利点を、以下に示すが、制限することを意図するものではない
―従来の特徴的なマーカーの作製のタイムスパンはかなり不確かであり、１２〜３６ヶ月が必要となる可能性があり、形質の遺伝子座と植物種に依存する。対照的に、本発明方法によるマーカー作製には１３〜１６ヶ月かかる。
―ＴＮＥにより人工的に導入したマーカーはユニークで、自然には存在しない。本方法では、前記形質およびマーカーを含む遺伝子移入切片は、知的財産の保護そのものの対象となりえ、ならびにそれらの利用と応用は市場でモニターしうる。
―任意の多型のマーカーが見つけにくい、綿、大豆、栽培されるトマト、スイカ、キュウリのような低い多型の農作物にとって、マーカーは前記に述べられた方法によって作製しうる。
―ＴＮＥは、繁殖プロセスの経過中に、植物材料内にマーカーの導入を可能にし、既存の優良な材料にマーカーを作製することさえ可能にする。

表１：植物繁殖のために作製された従来方法の特徴的なマーカーと、本発明に記載された新規の方法の比較。タイムスパンは、一遺伝子形質のためのマーカー作製過程の、それぞれ別個の工程の見積もりである。
１）従来方法の工程２におけるＢＳＡによる細密な地図作製は、１ｃＭ間隔以内のマーカーを同定するために必要とされる。異なる遺伝子座の対立遺伝子間の相関が一般的に低い（すなわち、連鎖不平衡の全体の範囲が低い）農作物においては、形質遺伝子座と非常に密接に連鎖したＤＮＡバリアントだけが有意に形質に関連する可能性がある。いくつかの場合では、対応する遺伝子それ自身のクローニングが必要とされうる。
２）単純なＰＣＲ検定のデザイン、および構築は、マーカー変換のための標的としてのコピー数の低いＤＮＡ配列を同定することが可能かどうかに依存する。特に大きなゲノムを伴う農作物、小麦、大麦、トウモロコシ、コショウおよびレタスにおいては、コンカレントなマーカー(concurrent marker)作成のための、コピー数の少ない配列の同定は簡単ではない。

図１は、外来性のバックグラウンドから遺伝子導入された形質についての、Ｍ１およびＭ２遺伝子座におけるマーカー作製の模式図である。棒は、一本の染色体を表す。図２は、形質Ｒについての検定に使用された、マーカーＭ１^＊およびＭ２^＊を作製する、Ｍ１およびＭ２遺伝子座における新規配列バリアントの概念図である。図３ａと３ｂは、形質へのマーカーのｃＭ距離に対する、ＢＣ１とＦ２集団内に予想された組み換え体の数を表す。組み換え体の数は、前記集団内の植物数と組み換え体が見つかる可能性を乗じることによって計算された。組み換え体が見つかる確率は、適した集団タイプ内の一つの組み換え体配偶子の偶然な発生率を乗じた、Kosamiのマップ関数を利用して、前記ｃＭ距離を組み換え率へ変換することにより決定された。Kosambiのマップ関数は、物理的な距離が異なる時の二重交差の割合に関する、経験的なデータを基礎とする。Kosambiの関数は、遺伝的距離を、二重交差の割合を変化させる干渉に基づいて、調整する。Kosambi, D. D. 1944 “The estimation of map distances from recombination values.”Ann. Eugen. 12; 172-75。図４は、選び抜かれたバックグラウンド内への形質Ｒの導入についてのＢＣ１選択の例である。この例において、形質Ｒのヘテロ接合体であるドナー親が使用された。植物タイプにつき相同染色体上の２セット（染色体１＝ラージ、染色体２＝スモール）を描画した。選択されたＢＣ１植物は染色体１でヘテロ接合の形状で形質Ｒを含んでおり、一方で、染色体２の組成は反復親の組成と同一である。図５は、感受性の、半抵抗性の、および完全抵抗性の植物のライン２５をクロロスルフロン処理後、２５日観察した結果を示す。図６を参照

本発明の理論的な根拠は、関心のある形質の近傍にマーカーを作製することである。前記のマーカーは生殖質中でユニークであり、選択された一連のＤＮＡについて利用可能な配列情報に基づいてデザインされた。

開始状況の最初の実施例として、ＳＴＳマーカーＭ１およびＭ２を、標的植物の野生型原種由来の、病気耐性形質Ｒのために作製した（図１）。前記病気耐性形質Ｒはアジア系登録（タイプ５）に由来し、栽培されたヨーロッパバックグラウンドへと遺伝子移入され、ヨーロッパ繁殖ライン（タイプ４）を作製した。前記のＳＴＳマーカーＭ１およびＭ２は、前記Ｒ遺伝子に隣接した、マーカー遺伝子座Ｍ１およびＭ２の配列に基づいて作製された。マーカーＭ１のみが、標的植物のヨーロッパで市販されている切片内にある形質Ｒについて、良好な予測値を持っている。ヨーロッパバックグラウンド中にアジア系耐性ハプロタイプを含む連鎖ブロックは、比較的大きい。

Ｍ１およびＭ２が、アジア系市販切片内の標的農作物の耐性、および、感受性材料を試験するために使われる時、マーカーと病気形質の間に貧弱な相関が認められた。アジア系バックグラウンド内に耐性ハプロタイプを含む連鎖ブロックは、比較的小さい。この開始状況においてマーカーを作製するために、当業者ならば、前記遺伝子にさらに密接に連鎖するマーカーを探索するか、または、農作物内での連鎖不平衡の程度に依存して、形質Ｒの原因となる多型を最終的に検定するための対応する遺伝子をクローン化しただろう。

本発明は、マーカー同定の再スタート、およびアジア系生生殖質中のＲについての変換プロセスの代わりに、マーカー遺伝子座Ｍ１およびＭ２における配列情報の利用を記載する。マーカー遺伝子座Ｍ１およびＭ２における配列バリエーションの情報は、完全に形質Ｒと関連するユニークな配列コンビネーションのデザインや作製に使われうる。繁殖ライン「タイプ５」が、病気耐性遺伝子形質Ｒと組み合わさって、標的農作物の生殖質中でユニークである遺伝子座Ｍ１およびＭ２に新しい配列変異体を有する繁殖ライン「タイプ８」を作製するのに使用される、仮想的状況を図２に描写する。新しく生じたマーカーＭ１^＊およびＭ２^＊は、ヨーロッパ系およびアジア系生殖質の両方で形質Ｒをスクリーニングするのに、理想的なツールである。前記のマーカーは人工的に作られたため、それらが偶然、自然に出現する確率は無視しうる。従って、マーカーＭ１^＊およびＭ２^＊は、マーカーＭ１^＊およびＭ２^＊が導入されたラインの子孫の中で形質Ｒをスクリーニングするのに、理想的な特徴的なマーカーである。

《タバコゲノムのための、予め定義されたＳＮＰマーカーアッセイ作製》

（プロトプラストの分離）
タバコ、ニコチアナタバキュム（Nicotiana tabacum）の品種、ぺティハバナ（Petet Havana）ラインＳＲ１のin vitro 茎培養物を、0.8％のDifco寒天を含むMS20培地上、高ガラス広口瓶で、2000 luxの16/8時間明期、25℃、および60〜70 ％の相対湿度において維持した。MS20培地は、2（w/v）％スクロースを含み、追加のホルモンを含まず、0.8%のDifco寒天を含む、基本的なMurashigeとSkoogの培地（Murashige, T. and Skoog, F., Physiologia Plantarum, 15: 473-497, 1962）である。3〜6週の成長した茎培養物の、十分に広がった葉を、回収した。前記の葉は１ mmの条片にスライスされ、45 ml MDE基本培地を含む、大きな（100 mm×100 mm）ペトリ皿に移され、30分間の前原形質分離処理をした。MDE基本培地は、総容量900 ml中に0.25 g KCl、1.0 g MgSO₄.7H₂O、0.136 g KH₂PO₄、2.5 g ポリビニルピロリドン (分子量 10,000)、6 mg ナフタレン酢酸および2 mg 6−ベンジルアミノプリンを含んでいた。前記の溶液の浸透圧はソルビトールで600 mOsm.kg^‐1、pHは5.7に調整された。5 mlの酵素ストックSR1がその後に添加された。酵素ストックは、100 mlにつき、750 mg セルローゼオノズカR10、500 mg ドライセラーゼ（driselase）および250 mgマセロザイム（macerozyme）R10から成り、ワットマンろ紙と滅菌フィルターでろ過した。葉組織の消化は25℃暗所で終夜行われた。消化された葉は50 umナイロンシーブで、滅菌したビーカーへろ過した。等量の冷KCl洗浄培地を、シーブをリンスするために使用し、プロトプラストの懸濁液とともにプールした。KCl洗浄培地は、540 mOsm.kg^-1の浸透圧をもたらすために、リットルあたり2.0 g CaCl₂.2H₂Oおよび十分な量のKClから成っていた。懸濁液は10 mLチューブに移され、およびプロトプラストは10分間85×g、4℃でペレットにされた。上清は除去され、プロトプラストのペレットは、5 mLの、冷MLm洗浄培地へ注意深く再懸濁した。MLm洗浄培地は、MS 培地（Murashige, T. and Skoog, F., Physiologia Plantarum, 15: 473-497, 1962）の多量栄養で、通常の濃度の半分、リットルあたり2.2 g of CaCl₂.2H₂O および、540 mOsm.kg^-1の浸透圧をもたらす量のマンニトールを含む。2チューブの内容物は組み合わされて、10分間、85×g、4℃で遠心分離された。前述の上清は除去され、およびプロトプラストのペレットは5 mLの、スクロースでマンニトールを置換したMLm培地である、冷MLs洗浄培地に注意深く再懸濁された。

MLs洗浄培地中のプロトプラストの2チューブの内容物はプールされ、下層を妨げないように注意しながら、上記のスクロース溶液に1 mLのKCl洗浄培地が添加された。その後プロトプラストはもう一度10分間、85×g、4℃で遠心分離された。生存しているプロトプラストを含んでいる、スクロースとKClの間の中間層は、注意深く集められた。等量のKCl洗浄培地が添加されて、注意深く混合された。前記のプロトプラスト密度は血球計算板を用いて計測した。

（オリゴヌクレオチド）
オリゴヌクレオチドはEurogentec (Seraing, Belgium)により合成され、逆相ＨＰＬＣによって精製され、滅菌ミリＱ水に再懸濁された。使用する前に、オリゴヌクレオチドは5分間、95℃まで熱せられた。オリゴヌクレオチド06Q262は、タバコのＳｕｒA遺伝子（寄託番号 X07644）に、コドン位置P194で、CCAからCAA（P194Q）の変換をもたらす一塩基ミスマッチ（下線を引かれたヌクレオチド）を導入するために、デザインされた。同様に他のオリゴヌクレオチドも、CCAからCTA（P194L）、またはCCAからCGA（P194R）の変換を作製するためにデザインされた（オリゴヌクレオチド 06Q263 および 06Q264）。
06Q262 5’ TCAGTACCTATCATCCTACGTTGCACTTGACCTGTTATAG [配列番号1]
06Q263 5’ TCAGTACCTATCATCCTACGTAGCACTTGACCTGTTATAG [配列番号2]
06Q264 5’ TCAGTACCTATCATCCTACGTCGCACTTGACCTGTTATAG [配列番号3]

（プロトプラストのPEG形質転換）
プロトプラスト懸濁液は85×g、10分間、5℃で遠心分離された。上清は除去され、プロトプラストのペレットはKCl洗浄培地中、終濃度10⁶.mL^-1になるように再懸濁された。10 mLチューブ中で、プロトプラスト懸濁液250 uL、オリゴヌクレオチド1.6 nmol、PEG溶液250uLはおだやかに、しかし徹底的に混合された。室温で20分インキュベーションした後、5 mL 冷0.275M Ca(NO₃)₂がドロップワイズで添加された。プロトプラスト懸濁液は10分、85×g、4℃で遠心分離された。上清は除去され、ペレットのプロトプラストは、50 ug.mL^-1セフォタキシムおよび50 ug.mL^‐1バンコマイシンの添加された1.25 mL To培養培地中で注意深く再懸濁された。To培養培地は、（リットルあたり、pH 5.7）950 mg KNO₃、825 mg NH₄NO_3、220 mg CaCl₂.2H₂O、185 mg MgSO₄.7H₂O、85 mg KH₂PO_4、27.85 mg FeSO₄.7H₂O、37.25 mg Na₂EDTA.2H₂O、Hellerの培地 (Heller, R., Ann Sci Nat Bot Biol Veg 14: 1-223, 1953)による多量養素、MorelとWetmoreの培地 (Morel, G. and R.H. Wetmore, Amer. J. Bot. 38: 138-40, 1951)によるビタミン、 2% (w/v) スクロース、3 mg ナフタレン酢酸、1 mg 6-ベンジルアミノプリン、540 mOsm.kg^-1の浸透圧をもたらす量のマンニトールを含んでいた。

前述の沈殿は35 mmペトリ皿に移された。等量のToアガロース培地が添加され、穏やかに混合された。サンプルは25℃、暗所でインキュベートされ、さらに以下のように培養された。

（プロトプラスト培養）
10日間の培養の後で、アガローススラブは6個に均等に切り、20 nM クロルスルフロンが追加された22.5 mL MAP1AO培地を含むペトリ皿に移された。この培地は（リットルあたり、pH 5.7） 950 mg KNO₃、825 mg NH₄NO₃、220 mg CaCl₂.2H₂O、185 mg MgSO₄.7H₂O、85 mg KH₂PO₄、27.85 mg FeSO₄.7H₂O、37.25 mg Na₂EDTA.2H₂O、MurashigeとSkoogの培地(Murashige, T. and Skoog, F., Physiologia Plantarum, 15: 473-497, 1962) による、独自濃度の10分の1の多量養素、MorelとWetmoreの培地(Morel, G. and R.H. Wetmore, Amer. J. Bot. 38: 138-40, 1951) によるビタミン, 6 mg ピルベート、それぞれ12 mgのリンゴ酸、フマル酸およびクエン酸、3% (w/v) スクロース、6% (w/v) マンニトール、0.03 mg ナフタレン酢酸および0.1 mg 6-ベンジルアミノプリンから成っていた。サンプルは6〜8週間、25℃、弱光でインキュベートされた。その後、成長するカルスはＭＡＰ１培地に移され、さらに2〜3週間成長を促された。MAP₁培地はMAP₁AO培地と同じ組成を持つが、６％の代わりに3％ (w/v)マンニトール、および46.2 mg.l⁻¹ヒスチジン (pH 5.7)を伴う。前記の培地は0.8% (w/v) Difco agarで固形化した。

クロルスルフロン耐性のカルスはその後滅菌されたピンセットでRP培地に移された。RP培地は(リットルあたり、pH 5.7) 273 mg KNO₃、416 mg Ca(NO₃)₂.4H₂O、392 mg Mg(NO₃)₂.6H₂O、57 mg MgSO₄.7H₂O、233 mg (NH₄)₂SO₄、271 mg KH₂PO₄, 27.85 mg FeSO₄.7H₂O、37.25 mg Na₂EDTA.2H₂O、MurashigeとSkoogの培地による、公開された濃度の5分の1の濃度の多重養素、MorelとWetmoreの培地(Morel, G. and R.H. Wetmore, Amer. J. Bot. 38: 138-40, 1951)によるビタミン、0.05%(w/v)スクロース、1.8%(w/v)マンニトール, 0.25 mg ゼアチンおよび41nMクロロスルフロン、から成っており、0.8% (w/v) Difco agarを用いて固形化された。2〜3週間後、2 cmよりも高い、明らかに葉と頂端の成長点が見える成熟した苗条は、いかなる成長制御因子も含まないMS20培地から成る、根形成培地に移された。

（ＡＬＳのＰＣＲ増幅と配列決定）
ＤＮＡはクロロスルフロン耐性のタバコカルスからDNeasyキット（Qiagen）を用いて分離し、ＰＣＲ反応の鋳型として使用した。タバコSurA遺伝子中の標的コドンの変換は、プライマー5’GGTCAAGTGCCACGTAGGAT [配列番号4] および 5’GGGTGCTTCACTTTCTGCTC [配列番号 5]を用いて、前記遺伝子中のコドン194を含む、776 bpのフラグメントを増幅し、検出された。除草剤耐性のタバコカルスのヌクレオチド変換はＰＣＲ産物のpCR2.1::TOPO（Invitrogen）へのクローニング、および個々のプラスミドの配列決定によって確認された。タバコはＡＬＳの二つの対立遺伝子（SurAおよびSurB）を含んでいる。これら遺伝子座のいずれかのP194コドンにおけるヌクレオチドの変換は、クロロスルフロンに対する耐性を与えるのに十分である。タバコは異質四倍体であるので、タバコには、標的変異が生じた可能がある8カ所の標的が存在する可能性がある。8個のSur対立遺伝子のうち一つでも変化を経験すれば、クロロスルフロン耐性を獲得することが予想される。従って、七個の野生型相同遺伝子は変化がない配列を伴い、検出されるだろう。この点に従って、コドン194の塩基の変換を有するものを検出するために、ＰＣＲ産物を含むプラスミドクローンを10よりも多く配列決定する必要があった。この方法を用いて、いくつかのタバコプロトプラスト形質移入実験からのクロロスルフロン耐性カルスにおいて、SurAまたはSurBのいずれかにおいて異なる塩基に変化した、6個のユニークなカルスを同定することが可能であった（表１）。

（自家受粉、種の回収、表現型決定）
種は表１に示した前記のラインの三つから得た。これら３つのラインそれぞれから自家受粉した96個の種（Ｍ１）は土壌にまかれ、グリーンハウスで育てられた。植え付け36日後、ＤＮＡ単離のために、タバコラインにつき48植物から、葉材料が回収された。37日齢の植物はその後再び、0.2 % Tween-20、10 % アセトンおよび140 uM クロロスルフロンの溶液を散布された。クロロスルフロンは、SurAおよびSurB遺伝子座によってコードされた、アミノ酸Leu、Ile、およびValの合成を導く最初の生合成工程を触媒する、酵素（アセト乳酸合成酵素（acetolactate synthase; ＡＬＳ））を阻害する。ＡＬＳのP194変異は、クロロスルフロン非感受性である、ＡＬＳの酵素の変化形態を導く。散布された全ての植物は、散布されなかった植物に比較していくらか黄色に変化し、いくつかの葉はモザイクパターンを示したが、これは以前に報告された一時的な現象（イエローフラッシュ（yellow flash））であった。散布20日後、植物は３つのクラスに分類されることができた：感受性、半感受性、および、完全感受性（図１）。感受性植物は散布後成長せず、死ぬ植物さえあった。半感受性植物は成長が減少し、新しく形成される葉は「靴ひも」のような形状を示した。完全感受性の植物は表現型的には散布していないコントロール植物と同一であった。表現型決定のデータは表２に示されている。

三つのタバコラインの表現型スコアはメンデル遺伝に適合する（表２）。

（定量的ＰＣＲＳＮＰマーカーアッセイの作製）
SurA遺伝子内に作製した異なる変異に基づいて、対立遺伝子特異的な配列の多型由来（AD SPD）プライマーであり、前記プライマーの3’末端に一つの対立遺伝子選択的なＬＮＡ塩基を有することを特徴とするプライマーを、AlleleIDソフトウェアを用いてデザインし、Eurogentecから購入した。ＬＮＡ（下線が引かれている）を含む対立遺伝子特異的なアンチセンスプライマーは：
野生型Ｃ対立遺伝子を検出する
Sur-581-C: 5’GCATCAGTACCGATCATCCTACGTG 3’
ならびに、変異したＧ、ＴおよびＡ対立遺伝子をそれぞれ検出する
Sur-581-G: 5’GCATCAGTACCGATCATCCTACGTC 3’,
Sur-581-T: 5’GCATCAGTACCGATCATCCTACGTA 3’
および
Sur-581-A: 5’GCATCAGTACCGATCATCCTACGTT 3’
であった。

前記の対立遺伝子特異的なプライマーは、フォワードプライマー、Sur-F: 5’ CGCCACCAATCTCGTCAG 3’と組み合わせて、全ての子孫の植物のゲノムＤＮＡのフラグメント増幅に使用された。ＰＣＲは384ウェルＰＣＲブロックで、LightCycler 480 real time PCR systemを用いて実施された。反応には、10 ul ＰＣＲ反応中に、5 ul 2 × SYBR green master mix (Roche)、25〜50 ng ゲノムDNA、各プライマー5 uMを含んでいた。使用した反応条件は、95℃10分、18サイクルの95℃10秒、66℃20秒（各サイクルごとに-0.5℃）、72℃20秒、次に、22サイクルの95℃10秒、59℃20秒、72℃20秒であった。

増幅の後で、溶解曲線が作製され、作製された産物の特異性を確認した。Ｃｔ値（サイクル閾値）はその後解析に使用した。

（SNPマーカーアッセイを用いたM1集団の検定および表現型の関連付け）
定量的PCRのための対立遺伝子特異的なプライマーはSurA配列に基づいてデザインされ、および、SurB配列内の（ALS変異サイトから13ヌクレオチド離れた）一ヌクレオチドが異なっていた。SurBに変異を含んでいるライン06および13からの定量的PCRの結果は、野生型対立遺伝子（CAA）と変異した対立遺伝子（CAA/CTA）の増幅を示した。これらSurAに基づくプライマーを使用すると、SurBにおける導入変異について、ヘテロ接合性とホモ接合性のどちらの植物かを区別できなかった。ライン25からの定量PCRの結果は、野生型対立遺伝子（CCA）および変異した対立遺伝子（CAA）の増幅を示しただけでなく、ヘテロ接合耐性とホモ接合耐性植物を区別することも可能であった。ホモ接合耐性植物の前記定量PCRの結果は、ヘテロ接合耐性植物のCt値と比較して、変異した対立遺伝子においてより低いCt値、野生型対立遺伝子においてより高いCt値を示した。

三つのタバコラインの対立遺伝子特異的定量PCRスコアはメンデル遺伝に適合する（表３）。加えて、植物の遺伝子型（導入した変異について、ホモまたはヘテロ接合性）と、除草剤処理後のこのような植物の表現型との間には、変異についてヘテロ接合性の半抵抗性植物、および、変異についてホモ接合性の完全耐性植物というように、明確な相関があった。

植物あたりの表現型スコア化は定量的PCRの結果と比較され、これらの結果は98％相関した（表４）。表４の非常に低いカイ二乗値は、表現型のスコアと定量的PCRの結果が相関していることを示している。従って、個々の表現型は、配列のユニークな部分へ意図的に導入されたマーカーの解析によって、正確に予測することが可能であり、逆もまた同じである。

要約すると、我々は、ＤＮＡマーカーが、特異的な植物対立遺伝子に導入されうること、良好に確立されたＳＮＰ検出方法を用いて検出されうること、および、次世代において予期されるように、表現型分離の予測／選択に役立ちうることを、示してきた。

Claims

以下の工程を含む、生物内に特徴的なマーカーを作製する方法：
―関心のある形質を選択する工程
―形質と関連する遺伝子座を決定する工程；
―前記遺伝子座の遺伝子地図位置を決定する工程；
―前記遺伝子座からの遺伝的距離の範囲に位置するマーカーを同定する工程；
―集団の各個体が前記マーカーを含む生物の集団を提供する工程；
―集団の各個体のマーカーのヌクレオチド配列を決定する工程；
―マーカーのヌクレオチド配列を整列する工程；
―集団のすべてのマーカーで同じヌクレオチドを含む、マーカー配列中の少なくとも一つの位置を選択する工程；
―前記少なくとも一つの位置の両側に近接するマーカー配列にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドをデザインする工程であって、前記オリゴヌクレオチドが、前記少なくとも一つの位置で、マーカー内の前記少なくとも一つの位置のヌクレオチドとは異なるヌクレオチド（マーカーヌクレオチド）を更に含む、工程；
―生物のＤＮＡ中に前記マーカーヌクレオチドを、前記オリゴヌクレオチドを用いた標的ヌクレオチド変換を使用して導入し、それにより形質と関連するマーカー内にユニークで選択可能なＳＮＰを導入する工程。
前記マーカーが分子マーカー技術によって同定される、請求項１に記載の方法。
前記マーカーが、前記形質から最大1 cM、好ましくは最大0.1 cMの距離で位置している、請求項１または２に記載の方法。
独立して形質から最大2 cM、好ましくは最大0.2cMに位置して、二つ以上のマーカーが作製される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
前記生物が植物、動物または微生物である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
前記生物が、低い多型生物、例えば、綿（Gossipyum hirsutum）、大豆（Glycine max）、栽培されたトマト（Solanum esculentum）、スイカ（Citrullus lanatus）、キュウリ（Cucumis sativa）である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
前記分子マーカー技術が、多重マーカー技術、好ましくはAFLP、RAPD、SSR、SFPおよび／またはSNPから成る群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
AFLP、RAPD、SSR、SFPおよび／またはSNPから成る群に由来する多重マーカー技術を用いて、少なくとも二つの分子マーカーが独立して得られる、請求項４に記載の方法。
前記生物のDNAが繁殖に適したドナーライン由来である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
ユニークで選択可能なマーカーを、多コピーなDNA切片に導入するための、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
既存の繁殖材料に、一つまたは複数の人工的なマーカーを作製する方法の使用。
遺伝的に改変させた材料に一つまたは複数のマーカーを導入する方法の使用。
繁殖材料にユニークなマーカーを作製するためのTNEの使用。