KR20110094268A

KR20110094268A - 진단 마커 개발 방법

Info

Publication number: KR20110094268A
Application number: KR1020117008309A
Authority: KR
Inventors: 예뢴 니콜라스 알베르트 마리아 루뻬 반 데어 부르트; 앙커 프레벤 소렌슨
Original assignee: 키진 엔.브이.
Priority date: 2008-09-11
Filing date: 2009-09-04
Publication date: 2011-08-23
Also published as: US20110258711A1; AU2009292297B2; CN102159711B; CN102159711A; JP2015037428A; JP2012501674A; JP5973533B2; BRPI0913477A2; EP2342337A1; WO2010030171A1; EP2998397B1; CA2737303C; MX2011002617A; WO2010030171A8; AU2009292297A1; EP2342337B1; IL211424A0; EP2998397A1; CA2737303A1; JP5653921B2

Abstract

본 발명은 형질에 관련된 마커를 선별하고, 생식질 내에서 마커의 세트 내에서 뉴클레오티드 수준에 기존의 변이를 확인하며 그리고 표적 뉴클레오티드 교환에 의해 상기 마커의 불변 부위의 위치들에서 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 도입으로 선별가능한 마커를 도입하는 기존의 번식 물질에서 고유한 분자 마커들의 생성을 위한 방법에 관한 것이다.

Description

진단 마커 개발 방법{METHOD FOR DIAGNOSTIC MARKER DEVELOPMENT}

본 발명은 생물에서 분자 마커, 특히 진단 마커의 개발 방법에 관한 것이다. 더욱이 상기 방법은 생물의 생식질에, 선별가능한 마커의 도입 및, 예를 들어, 식물의 번식 과정에서 상기 마커의 용도에 관한 것이다.

지난 10년이래로, DNA 마커 기술은 종종 형질을 표현형화하는 어려움 대신에 마커들을 분석하는 용이함에 기초하여 선별이 가능하게 함으로써 식물 육종의 효율을 극적으로 높여 왔다. 그러나, 그러한 진단 마커들의 개발과 이 마커들을 적용하는 것의 유효성은 종종 노력과 시간이 소요되는 과정이다

첫번째로, 진단 마커들의 개발은 하기로 시작하는 과정에 따른다

1) 대상 형질의 근본적인 유전자(들)의 유전적 위치를 지도 작성(mapping),

2) 인접한 마커들을 확인,

3) 강하게 연관된(linked) 마커들의 확인에 의한 상기 유전자(들)의 상세한 지도 작성,

4) 가장 연관된 마커들의 DNA 마커 서열의 결정,

5) 표적 유전자를 지도 작성하는 데 사용된 부모 계통들(parent lines) 간의 마커 좌위들에서 서열 변이를 결정,

6) 간단한 PCR 실험의 개발,

7) 진단 마커가 시험될 식물 물질의 유전적 배경(생식질)에서 예측 값을 시험.

본 발명에서 사용되는, 생식질은 유전적 자원, 또는 좀더 정확히는 생물의 DNA 및 그 물질의 집합을 설명하는데 사용되는 용어이다. 육종하는 사람들은 품종(varieties)들을 만들기 위해 이끌어 낼 수 있는 것으로부터 유전적 물질의 집합을 나타내기 위하여 용어인 생식질을 사용한다.

다행스럽게도, 최근의 개발들은, 특히 단일 유전의 형질들을 다룰 때, 단계 1 - 4를 상당히 속도를 높여왔다(Morgante and Salamini 2003 Curr. Opinion in Biotechnol 14: 214 - 219; Varshney et al. 2005 TiPS 10: 621 - 630). 단계 5 - 6은 진단 분석을 개발하는 데 사용되는 서열 변이(SNP들) 주변의 고유한 DNA 마커 서열들의 구간이 존재하는 것에 의존한다. 식물 게놈들은 진단 마커 분석의 개발 가능성을 상당히 방해하는 반복 서열들이 상당히 퍼져있다. 특히 게놈 크기가 큰 작물들들에서, 적은 카피 DNA 단편을 확인하는 것은 건초 더미에서 바늘을 찾는 것으로 설명될 수 있다. 마지막으로, 단계 7은 1) 작물의 교배 시스템 및 작물 게놈에서 유전적 다양성의 수준에 매우 많이 의존한다. 기능적 돌연변이가 발생하면, 이런 돌연변이는 다른 기존의 DNA 다형성의 일배체형(haplotype)에 존재할 것이다. 상기 형질이 무작위적 교배의 다음 세대들로 전달되면, 많은 재조합 사건이 발생하여 본래의 일배체형을 작은 연관 블록으로 만들게 될 것이다. 이것은 형질 유전자이 본래의 일배체형의 대부분 특이적 대립형질들(alleles)로부터 분리되는 원인이 될 것이다. 이것의 중요성은 상기 형질 유전자에 극도로 밀접한 연관을 갖는 DNA 다형성뿐만 아니라 심지어 원인이 되는 다형성 자체가 유용한 DNA 마커들로 전환되어 활용될 수 있다는 것이다. 이계교배된(outbred) 무작위적 교배 집단들에서의 예로서, 재조합 및 재조합 사건의 높은 교환 비율은 (이론상으로) 극도로 작은 형질-보유 영역을 낳는 결과가 된다. 이런 이유로, 유전자들과 완벽히 관련된 DNA 마커들을 찾기가 매우 어려울 것이다. 반대되는 예로서, 동계 교배된(inbred) 집단들에서의 연관 블록(linkage block)은 자가수정(selfing)이 동형 접합성을 증가시키고, 그럼으로써 재조합으로 섞여질 수 있는 이형 접합체의 수가 제한적이기 때문에 다소 큰 경향이다. 그러나, 경작된 종들에 대한 유전적 기초가 매우 좁은 작물들에 대해서는, 다소 큰 연관 블록의 존재에도 불구하고, DNA 마커 개발을 위한 시작점으로서 어떤 DNA 다형성들을 확인하는 것은 어려울 것이다.

본 발명자들은 상기 문제들로 고생하지 않고 선별가능한 마커들을 만드는 방법을 개발하기로 하였다.

본 발명에서, 자연적으로 발생한 서열 변이체들을 확인하고 활용하는 대신에 고유하고, 인공적이며 선별가능한 마커들을 표적 부위에 도입하는 방법을 설명한다. 이 방법에 대한 근거는, 가능성이 있는 마커 좌위들에 대한 서열 정보를 기초로, 고유한 마커들을 디자인하고 대상 형질을 포함하는 계통(들)에 도입할 수 있다는 것이다. 그러한 마커들의 바람직한 적용은 신규 도입된 마커들이 대상 형질과 수 세대를 걸쳐 지속적으로 함께 분리(co-segregate)되는 것이다. 본 발명자들은 폭넓은 예측적인 값을 갖는 마커들과 같이 유용한 방법으로 표적 영역들 내로 마커들을 도입하는 방법을 찾아내었다.

본 발명자들은 대상 형질 또는 형질들에 밀접하게 연관된(즉 미리 정의된 함께 분리되는 일관성으로) DNA의 부분(section)을 확인 및/또는 선별하고 그리고 이러한 부분을 표적 돌연변이 생성(targeted mutagenesis), 표적 뉴클레오티드 교환(targeted nucleotide exchange, TNE)의 방법을 사용하여 선별가능한 분자 마커로 전환하고, 그렇게 함으로써 상기 문제점들을 극복하는 전략을 발견하였다. 특히, 본 발명자들은 변화가 만들어지고 요구되는 마커를 디자인하는 것을 결정하는 방법을 찾았고 그 결과 어떠한 유전적 가변성이 최소한으로 감소하고 마커의 질, 즉 관련된 형질에 대해 예측되는 값이 생식질 내에서 최적이 되고, 그러나 또한 마커가 본래 개발된 것으로부터 보다는 다른 생식질에서 유용할 수도 있는 것일지도 모른다.

이렇게 본 발명은 생식질에서 하나 또는 그 이상의(고유하고 선별가능한) 분자 마커들의 도입 방법에 관한 것이고, 상기 마커들은 대상 형질에 밀접하게 연관되어있으며 상기 마커들은 요구되는 형질에 밀접하게 연관되어 있음에도 불구하고 충분한 마커 정보를 포함하지 않았던 게놈의 자리에 위치된다. DNA의 이 부위에서 인공적이고 고유한 다형성이 TNE를 사용하여 만들어지고 그 뒤에 선별가능한 분자 마커로서 제공될 수 있다. 또한 본 발명은 생물에서 고유하고 선별가능한 마커들의 생성을 위한 TNE의 용도에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 첫번째 측면은 하기의 단계들을 포함하는 생물에서의 진단 마커 개발 방법에 관련된다:

- 대상 형질을 선별하는 단계;

- 상기 형질과 관련된 좌위(locus)를 결정하는 단계;

- 상기 좌위의 유전적 지도 위치를 결정하는 단계;

- 상기 좌위로부터 유전적 거리 사이에 위치한 마커를 확인하는 단계;

- 집단의 각 구성요소가 상기 마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물의 집단을 제공하는 단계;

- 상기 집단의 구성요소 각각에 대해 상기 마커의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계;

- 상기 마커들의 뉴클레오티드 서열을 배열하는(aligning) 단계;

- 상기 집단의 모든 마커들에서 동일한 뉴클레오티드를 포함하는 마커들의 서열에서 적어도 하나의 위치를 선별하는 단계;

- 적어도 하나의 위치의 양 측면에 인접한 마커 서열에 혼성화할 수 있고 추가로 상기 마커에서 적어도 하나의 위치에서 뉴클레오티드가 다른 적어도 하나의 위치에서 뉴클레오티드(마커 뉴클레오티드)를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 디자인하는 단계;

- 상기 올리고뉴클레오티드와 표적 뉴클레오티드 교환을 이용하여 생물의 DNA에 마커 뉴클레오티드를 도입함으로써, 형질과 관련된 마커에 고유하고 선별가능한 SNP를 도입하는 단계.

따라서 대상 형질과 관련된 유전자에 밀접하게 연관되고 부분이 생식질 내에서 상당히 일정한 뉴클레오티드 조성(낮은-다형성인)의 일부를 포함하는 DNA(마커)의 부분의 확인, DNA 부분에서 뉴클레오티드 수준(A, C, T 또는 G)에서 변이의 결정(또는 생식질 내에서 마커의 일정한 뉴클레오티드 조성의 부위의 결정), 낮은 수준, 바람직하게는 위치에서 변이가 가장 낮은 수준을 포함하는 부분에서 위치의 선별, 그 위치, 즉 그 위치에서 가장 낮은 존재를 갖는, 그 위치에 발생하는 뉴클레오티드가 다른(그 안에 어떤 변이를 포함하는) 뉴클레오티드를 선별하는 것, 그 위치의 양 측면에 인접한 서열에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 디자인하는 것 그리고 표적 뉴클레오티드 교환에 의해 생물의 DNA에 그 위치에 선별된 뉴클레오ㅌ티드(마커 뉴클레오티드)를 도입하는 것은 고유한 (생식질 내에서) 선별가능한 마커들을 생성을 제공한다.

표적 뉴클레오티드 교환(Targeted nucleotide exchange, TNE)는 돌연변이가 올리고뉴클레오티드의 서열에 디자인된 미스매치 염기(mismatch base)에 의해 유도된 표적 돌연변이 생성 과정이다. TNE는 식물, 동물 및 효모 세포에서 설명되어 왔다. 첫번째 TNE 보고들은 염색체의 표적 위치에서 사이에 끼워지도록(intercalate) 디자인된 자기-상보적 올리고뉴클레오티드로 구성된 소위 키메라를 사용하였다. 상기 키메라는 염색체의 표적에 돌연변이를 도입하기 위하여 주형을 형성하는 미스매치된 뉴클레오티드를 포함한다. TNE 사건을 선별하기 위하여, 대부분의 연구는 제초제 저항성을 유도하는 내재적 유전자에 단일 뉴클레오티드 치환을 도입하려고 시도하였다. 키메라를 사용한 첫번째 예는 인간 세포에서 비롯되었다(Rice et al. Nat. Biotech. 19: 321-326 참고). 또한 키메라의 사용은 식물 종 토마토, 쌀 및 옥수수에서 성공적이었다(Beetham et al. 1999 Proc. Natl. Acad. ScL USA 96: 8774-8778; Kochevenko et al. 2003 Plant Phys. 132: 174-184; Okuzaki et al. 2004 Plant Cell Rep. 22: 509-512). 또한 단일 가닥(single stranded, ss) 올리고뉴클레오티드의 TNE 활성이 시험되었다. 밀, 효모 및 인간 세포에서 좀더 재생할 수 있는 결과들을 주는 것을 발견하였다(Liu et al. 2002 Nuc.Acids Res. 30: 2742-2750; review, Parekh-Olmedo et al. 2005 Gene Therapy 12: 639-646; Dong et al.2006 Plant Cell Rep. 25; 457-65). 또한 표적 돌연변이 생성(Targeted mutagenesis, TNE)는 WO2005108622, WO2005049795, WO2004033708, WO03075856, WO03027765, WO0210364, WO0192512, WO0187914, WO0173002, WO0114531, WO9515972와 같은 다수의 특허출원에서 설명되었다. TNE는 여태까지는 유전자를 녹인(knocking in) 또는 녹아웃(knocking out)시킴으로써 유전적 발현을 바꾸는 목적으로 설명되어왔다. 선행 기술은 생식질에서 고유한 선별가능한 마커들의 도입을 위하여 TNE의 용도에 대한 실행가능한 방법을 아직 제공한 적이 없었다.

상기 방법의 첫번째 단계에서, 대상 형질이 선별되었다. 상기 형질은 단일 유전자의(monogenic) 또는 다유전자의(multigenic) 형질 또는 복합 유전자들에 의하여 지배되는 형질, 질병 저항성 관련 형질 또는 수확량 관련 형질 등일 수 있다.

두번째 단계에서, 상기 좌위(locus), 또는 대상 형질과 연관된 유전적 부위가 선별된다. 물론, 상기 형질이 다유전자(multigenic)일 때, 상기 좌위들 중 하나가 선별될 수 있다.

다음으로, 유전적 지도에서 상기 유전자 또는 유전적 영역의 위치가 결정된다.

유전적 지도 위치의 결정은 연관 분석(linkage analysis) 또는 유전적 지도작성(genetic mapping)과 같이 언급되는 포괄적인 방법들을 포함한다(Griffiths AJF et al. 2005 Introduction to Genetic Analysis, 8th ed. W. H. Freeman and Cie, New York pp. 115 - 137의 예를 참조). 유전적 지도 작성을 위한 전제조건 중 하나는 대상 형질이 다르고 집단은 대상 형질이 자손에서 분리되는 곳에서 얻어질 수 있는 두 부모 계통들(parent lines)의 유전적 지도작성 집단이다. 대안적으로, 단일 유전자의 형질의 경우에, 집단 분리 분석(bulked segregant analysis) BSA의 사용으로 형질 간격에 매우 효과적으로 집중할 수 있다(Michelmore et al. 1991 PNAS 88: 9828 - 9832). BSA를 적용함으로써, 유전적 지도의 제작을 필요가 없다.

가능성이 있는 마커 서열이 유전자의 (미리 결정된) 유전적 거리, 즉 형질 부근 사이에 위치한 대상 생식질(번식에 사용될 수 있는 유전적 가변성을 포함하는 생물의 집단) 내에서 확인된다. 일반적으로, 이것은 상기 유전자의 1cM 내에 있지만, 이는 작물들 간에 다를 수 있다. 또한 그러한 마커는 인접 마커로 표시된다. 대상 형질의 부근에서 분자 마커들의 유전적 지도 작성 및 확인은 복합적인 마커 기술들에 의하여 우선적으로 실행된다. 복합적인 마커 기술들은 많은 마커들을 단일 분석으로 확인하는 것이 가능하게 한다. 분자 마커 기술에 대한 다양한 리뷰들이 있다(a. o. Rafalski A. 2002 Curr Opin. Plant Biol. 5 94 - 100, Peters J. et al. 2003 TiPS 8 484 - 491, Varshney R. et al. 2005 TiPS 10 621 - 630).

다루어질 필요가 있는 추가적인 특징은 기초를 이루는 마커 서열들의 복제 수이다. 대부분의 식물 게놈들은 반복 서열이 많고(Kumar and Bennetzen JL 1999 Ann Rev Genet 33: 479 - 532) 그리고 통상적인 목적으로 분석하기 쉬운 마커로 화인된 처음의 마커의 성공적인 전환이 낮은 복제 DNA 서열들에 의존한다. 반복적인 DNA에 의해 제기된 문제를 극복하기 위해 몇가지 방법들이 개발되었다. 복제 수의 결정은 서던 블로팅(Southern boltting)과 같은 혼성화 기술들로 달성될 수 있다. 다른 방법들은 cDNA 서열들을 이용하는 것, 서서히 어닐링하는(annealing) 높은 Cot DNA의 분리(Yuan et al. 2003 Plant J 34: 249 - 255) 및 메틸화 여과(Rabinowicz PD 2003 Meth. MoI Biol 236 21-36)와 같은 유전자-증폭 전략에 촛점을 맞춘다. 또한 본 발명에서 설명된 방법으로 고유한 마커의 도입은 새롭고 진보적인 방법으로 게놈에서 마커 서열의 다수 복제들 간을 구별하는 이러한 문제를 해결하고 게놈에서 단일 복제 마커들의 발생을 위한 방법을 제공한다.

적절한 분자 마커 기술들은 예를 들어 AFLP, RAPDs, SSRs, SFPs 및 SNPs이다. 이러한 기술들을 사용하여, 단독 또는 조합으로, 마커들의 큰 세트가 대상 유전자에 인접하는 지를 확인할 수 있다.

인접한 마커들의 세트는 형질의 부근에 또는 적어도 유전자로부터 원하는 거리(일반적으로 cM으로 표시되는) 내에서 위치하는 마커를 결정하는 선별 과정을 거치기 쉽다. 대안적으로서, 예를 들어 문헌으로부터, 알려진 마커들이 사용될 수 있다.

생물의 집단은 일반적으로 육종자의 생식질의 형태로, 또는 상기 마커를 포함하거나 또는 포함하지 않는 여러 구성원들을 포함하는 또다른 적당한 집단으로 제공된다. 이 집단은 상기 마커의 존재를 미리-검색될 수 있다.

상기 마커를 포함하는 집단의 구성원들로부터, 상기 마커들이 분리되고(예를 들어 전기영동한 겔에서 잘라냄) 서열분석되어, 즉 그 뉴클레오티드 서열이 결정된다. 한 세트의 선별된 마커들의 DNA 서열의 결정은 예를 들어, 생어 다이디옥시-서열분석 방법(Sanger dideoxy-sequencing method)에 의하여 실행되지만 다른 서열분석 방법도 충분할 것이다.

따라서, 마커를 선별한 후, 또한 상기 마커는 다양한 마커들을 얻기 위해 동일한 생물의 다른 구성원들에서 확인되고, 그것으로부터 분리된다. 이 마커들 각각 또는 적어도 일부로부터, 상기 서열이 결정된다. 상기 서열들이 배열되고(aligned) 이 마커들의 DNA 구성에서의 변이가 결정된다. 이것은 상기 마커 서열의 어떠한 위치에서, A, C, T 또는 G 각각의 존재가 알려진다는 것을 의미한다. 마커들이 서열분석된 집단의 구성원의 수는 적어도 2이고, 바람직하게는 적어도 5이며, 더욱 바람직하게는 적어도 10이다. 본 발명의 실시예에서, 이 숫자는 집단의 크기 및 다형성이 생식질에서 발생하는 정도에 따라, 25 또는 50일 수 있다.

상기 서열들의 배열(alignment)는 수동 또는 폭넓게 이용가능한 소프트웨어 도구로 수행될 수 있다. 상기 서열들의 배열(alignment)는 상기 집단의 다른 구성원들의 마커 서열들 간의 차이점에 대한 정보를 제공하여, 즉 마커 서열 자체에서 다형성의 확인, 또는 그것의 결여를 확인하게 한다. 그렇게 함으로써, 상기 마커에서 다른 영역들과의 비교하여 더 적은(또는 전혀 없는) 변이를 포함하는 마커 서열에서의 영역들에 대한 정보가 얻어진다. 이러한 영역에서, 그 부위에서 다른 뉴클레오티드들과 비교하여 (상대적인) 일정한(덜 가변적인) 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드들이 선별될 수 있다. 심지어 조사된 마커들 속에서 일정한 조성을 가진 마커 서열에 영역이 존재하는 것일 수 있다.

이것을 보여주기 위해, 하기의 계획이 제공된다:

집단 구성원 1, 3, 4, 및 7은 상기 마커에서 유전적 변이를 포함한다. 이것은 마커 자체를 만드는 다형성이어야 하는 것은 아니지만, 그러나 단지 유전적(배경) 변이일 것 같다. 상기 서열에서 (조사된 집단에서) 어떠한 유전적 변이도 포함하지 않는 'OXQYXOQYYQYOXQYYQXOYYX' 부분, 영역이 존재하는 서열에 있어서, 이 영역은 가장 낮은 유전적 변이의 영역으로 또는 뉴클레오티드들에서 가장 낮은 변이를 갖는 영역으로, 또는 낮은-가변성 영역으로 또는 심지어 시험된 생식질 내에서 불변의(constant) 뉴클레오티드 조성의 영역으로 그려질 수 있다. 이것은, 도식적인 예에서, 불변 영역에서 각각의 뉴클레오티드들, 'OXQYXOQYYQYOXQYYQXOYYX' 부분은 고유한 마커 뉴클레오티드의 도입을 위한 위치로서 자격을 준다는 것을 의미한다.

다음 단계에서, 올리고뉴클레오티드는 가능성이 있는 마커 뉴클레오티드 위치에 인접한 위치에 있는 마커 서열에 혼성화할 수 있도록 디자인된다. 상기 도식적인 예에서 이 가능성 있는 마커 뉴클레오티드 위치는 예를 들어, XOQYYQYOX에서 두번째 Y(밑줄)일 수 있다. 상기 마커 서열에 혼성화할 수 있고 이 위치에 하나의 O를 포함하는(YQOXOOXQY) 올리고뉴클레오티드를 디자인하고, TNE를 이용하여, 게놈에서 표시된 위치에 상보적인 O를 도입함으로써 이제 고유한 마커 서열 즉 OXQYXOQYOQYOXQYYQXOYYX'를 만든다. 이 고유한 DNA은 (적어도 조사된 집단 내에서) 그 종의 게놈에서 특이적이고 고유한 마커 서열을 만든다. 게놈에서 특이적인 마커의 이러한 도입은 기존에 알려진 마커 보다 더 높은 정확성으로 요구되는 형질을 선별하기 위해 이제 번식에 사용될 수 있다.

도 3은, BC1에서 예상되는 재조합체의 수와 형질에 대한 마커의 cM 거리에서 변이의 기능으로서 F2 집단을 보여준다. 단일 마커의 경우에, 적어도 하나의 재조합체(마커가 형질없이 존재하거나 반대로 임)는 각각 100 또는 50 식물 모두 예상된다. 수천 가지 식물들에서 선별이 수행되는 육종 프로그램을 위해서, 이 비율은 진단 마커가 형질과 충분히 연관된다는 것을 확인하기 위한 바깥 한계(outer limit)에 있다. 현재 마커 개발 방법들에서는, 1 cM 간격 내에서 충분한 마커들을 확인하기 위하여 상당한 상세 지도 작성 노력이 요구된다. 이런 이유로 선별된 인접 마커들의 세트에서 마커들은 많아야 2 cM, 바람직하게는 많아야 1 cM, 좀더 바람직하게는 많아야 0.5 cM의 거리에 위치하는 것이 바람직하다.

그러나, 둘 또는 그 이상의 마커들의 유용성의 경우에, 100 식물 당 1 재조합체의 비율은 BC1 및 F2 집단들 각각에 대해 약 10 cM 및 약 5 cM의 간격 크기를 적용하여 달성될 수 있다. 본 발명의 방법에 의하여 도입된 마커들 중 둘의 사용은 이런 이유로 상기 방법의 효율을 현저하게 증가시킨다. 엘리트(elite) 생식질에서 형질의 유전자 이입(introgression)을 위해서, 역교배(backcross) 방법이 바람직하기 때문에(도 4 참조), 그렇게 함으로써 TNE에 의한 마커 개발을 위해 마커들을 선별하는 기준은 일반적으로 최대한으로 형질의 10 cM 간격내에서 적어도 2 마커들로 만든다.

둘 또는 그 이상의 마커들이 개발된 일 실시예에서, 인접 마커들의 (둘) 선별된 세트에 대한 거리가, 도 3에서 보여질 수 있는 것처럼, 바람직하게는 많아야 10 cM, 더욱 바람직하게는 많아야 5 cM로 상당히 높을 수 있다.

올리고뉴클레오티드가 전에 본 발명에서 요약한 것처럼 표적 돌연변이 생성(targeted mutagenesis, TNE)를 사용하여 대상 좌위를 운반하는 생물의 게놈으로 도입된다. 결과로 얻는 생물은 대상 좌위에 밀접하게 연관된 그 유전적 서열의 특이적으로 도입된 변화를 포함한다. 이 특이적으로 도입된 변화는 이제 마커로 사용될 수 있고 어떤 종래의 방법, 분자적 마커 기술, PCR-분석, SNPWave와 같은 SNP-분석 또는 그 외에 의해서 든지, 예를 들어 서열분석에 의해 분석될 수 있다.

따라서, 다른 말로, 마커 서열에서, 고유한 뉴클레오티드는, 결정될 수 있을 때까지, 조사된 생물의 조사된 생식질에서 일어나지 않거나 또는 오직 거의 드물게 일어나도록 도입된다.

이렇게 만들어진 고유한 마커는 이제 PCR 분석과 같은 간단한 분석을 사용하요 분석될 수 있다. 상업적으로 의의가 있는 유전적 배경(생식질)에서 마커 좌위들에 DNA 서열 변이의 결정은 생어 다이디옥시-서열분석 방법(Sanger dideoxy-sequencing method)으로 생식질 패널과 같은 집단에서 PCR에 의하여 마커 서열들을 증폭함으로써 달성된다. 이 생식질 패널은 예를 들어 적절한 작물의 시장 부분(market segment)에서 형질 좌위에서 유전적 변이를 대표할 수 있거나 또는 육종하는 사람들의 생식질을 대표할 수 있다. 예로서, 90 육종 계통에 대해, DNA 서열들이 마커 좌위 M1를 위해 결정된다, 또한 첨부된 도면들을 참조한다. 상기 DNA 서열의 104 위치에서 시토신(cytosine, C) 또는 구아닌(guanine, G)이 관찰된다. 이런 지식을 기초로, 아데닌(adenine, A)이 생식질에 존재할 것 같지 않은 DNA의 고유한 구간을 만들기 위해 TNEfh 도입되는 뉴클레오티드로 선별된다.

TNE에 의해 공여자 식물 계(donor plant line)에 디자인된 서열 변이체의 도입은 공지된 방법으로 실행된다(Liu et al. 2002 Nuc.Acids Res. 30: 2742-2750; review, Parekh-Olmedo et a/. 2005 Gene Therapy 12: 639-646; Dong et a/.2006 Plant Cell Rep. 25: 457-65). TNE로, 마커 좌위 M1에 고유한 DNA 서열을 가져서, 그런 까닭에 M1^*으로 불리는, 육종 계통(breeding line)이 만들어 진다.

표 1은 본 발명에 설명된 신규한 방법과 비교하여 식물에서 진단 마커 개발의 종래 방법의 전반적인 기간을 보여준다. 한정적인 의도 없이, 상기 새로운 방법의 장점들이 하기에 설명된다.

- 종래의 진단 마커 개발의 시간 범위는 다소 불안정하고 형질 좌위와 작물 종에 따라, 12 - 26 개월이 필요할 수 있다. 이에 비교하여, 본 발명의 방법에 따른 마커 개발은 13 - 16 개월이 걸린다.

- TNE에 의해 인공적으로 도입된 마커들은 고유하고 자연에 존재하지 않는다. 이 방법에서, 상기 형질과 상기 마커들을 포함하는 유전자 이입 단편은 그 자체로 지적 재산 방어의 목적이 될 수 있고 그것의 용도와 적용은 시장에서 모니터될 수 있다.

- 어떠한 다형성 마커를 찾기 어려운 목화, 대두, 경작된 토마토, 수박 및 오이와 같이 낮은 다형성 작물들을 위하여, 마커들을 상기 방법으로 만들 수 있다.

- TNE는 번식 과정 동안 식물 물질에서 마커들의 도입을 가능하게 한다. 심지어 기존, 좋은 실행하는 물질에서 마커들을 생성하는 것이 가능하다.

본 발명에서 설명된 신규 방법과 진단 마커들을 식물 번식을 위해 개발하는 종래 방법의 비교. 상기 기간은 단일 유전자의 형질을 위한 마커 개발에서 각 개별 단계에 대한 추정치이다. 1^*) 종래 방법의 단계 2에서 BSA에 의한 상세한 지도 작성은 1 cM 간격 내에서 마커들을 확인하는 것이 요구된다. 다른 좌위들에서 대립형질들 간의 상관관계가 일반적으로 낮은 (즉 연관 불평형의 전체적인 정도가 낮은) 작물들에서 상기 형질 좌위에 극도로 단단한 연관을 갖는 DNA 변이체들만이 상기 형질에 상당히 관련될 것이다. 경우에 따라서는 경우에 이것은 상응하는 유전자 자체를 클로닝하는 것이 필요할 수 있다. 2^*) 간단한 PCR 분석의 디자인 및 구성은 마커 전환을 위한 표적으로서 낮은 카피의 DNA 서열에의 가능성에 따른다. 특히 밀, 보리, 옥수수, 후추 및 상추와 같은 큰 게놈들을 갖는 작물들에서, 동시 마커 개발을 위한 낮은 카피 서열들의 확인은 사소하지 않다.

단계	종래 방법	기간	신규 방법	기간
1	유전적 지도 작성/BSA	2 개월	유전적 지도 작성/BSA	2 개월
2	BSA에 의한 상세한 지도 작성	2 - 12 개월	마커 확인 및 카피 수 결정	1 개월
3	마커 확인 및 카피 수 결정	1 개월	부모 대립형질들을 서열 분석 및 SNP 확인	0.5 개월
4	부모 대립형질들을 서열 분석 및 SNP 확인	0.5 개월	마커 좌위들에서 서열 변이 결정	0.5 개월
5	간단한 PCR 분석의 디자인 및 구성	6 - 12 개월	공여자 계통(donor line)에서 고유한 마커 대립형질들 및 TNE 디자인	9 -12 개월
6	생식질에서 간단한 PCR 분석의 시험	1 개월
총 기간		12 - 36 개월		13 - 16 개월

도 1: 외래 배경으로부터 형질 유입된 형질을 위해 좌위 M1 및 M2에서의 마커 개발의 도해적 설명이다. 막대들은 단일 염색체를 나타낸다.
도 2: 형질 R을 위한 분석에 사용되는 마커 M1^* 및 M2^*를 만드는 좌위 M1 및 M2에서의 신규 서열 변이체의 도해적 설명이다.
도 3a 및 3b. BC1에서 예상되는 재조합체의 수와 형질에서 마커의 cM 거리의 기능으로서 F2 집단. 재조합체들의 수는 집단에서 식물의 수 중에 재조합체를 찾는 가능성을 곱하여 계산하였다. 재조합체를 찾는 가능성은 적절한 집단 형태에서 재조합된 생식 세포의 발생 기회로 곱해진 Kosambi 지도 작성 기능을 사용함으로써 재조합 비율로 cM 거리를 전환함으로써 결정하였다. Kosambi의 지도 작성 기능은 물리적 거리가 다르기 때문에 이중교차(crossover)의 비율을 고려한 실험적 데이타에 기초한다. Kosambi의 기능은 이중교차의 비율을 변화시키는 간섭에 기초한 지도 거리를 조정한다. Kosambi, D. D. 1944. "재조합 수치들로부터 지도 거리의 예측(The estimation of map distances from recombination values)." Ann. Eugen. 12:172-75.
도 4: 엘리트 배경에서 형질 R의 도입을 위한 BC1선별의 예. 이 예에서, 공여자 부모는 형질 R이 이형접합성인 것이 사용된다. 식물 종류당, 상동 염색체 2 세트(염색체 1 = 큰 것, 염색체 2 = 작은 것)이 그려져 있다. 선별된 BC1 식물은 염색체 1의 이형접합성 구조에서 형질 R을 포함하고 반면에 염색체 2의 조성은 반복된 부모의 조성과 동일하다.
도 5: 25 계통의 감한, 반-저항성인 및 완전히 저항성인 식물들을 클로설퓨란(chlorsulfuron) 처리 후 25일을 관찰하였다.
도 6: qPCR 결과이다.

본 발명에 대한 근거는 대상 형질의 부근에 마커들을 만드는 것이다. 이 마커들은 생식질(germplasm)에 고유하고 DNA의 선택된 구간(stretches)에 이용할 수 있는 서열 정보에 기초하여 디자인된다.

시작 상황을 묘사하는 첫번째 실시예로서, STS 마커들 M1 및 M2는 표적 작물들의 야생 조상으로부터 유래된 질병 저항성 형질 R을 위하여 개발되었다(도 1). 질병 저항성 형질 R은 아시아 등록("5 형")으로부터 유래되었고 유럽 육종 계통 "4 형"을 만들기 위해 경작된 유럽 배경에 유전자 이입(introgress) 되었다. 상기 STS 마커들 M1 및 M2는 R 유전자의 측면에 있는 마커 유전자위 M1 및 M2의 서열에 기초하여 개발되었다. 오직 마커 M1만이 표적 작물들의 유럽 상업적 부분에서 형질 R에 대한 좋은 예측 값을 갖는다. 유럽 배경에서 아시아 저항성 일배체형(일배체형)을 포함하는 연관 단위(linkage block)은 비교적 크다.

M1 및 M2가 아시아 상업적 부분에서 표적 작물들의 시험 저항성 및 민감한 물질을 시험하는데 사용될 때, 마커와 질병 형질 간의 약한 상관관계가 관찰되었다. 아시아 배경에서 저항성 일배체형을 포함하는 연관 단위는 비교적 작다. 시작 상황에서 마커 개발을 위하여, 유전자에 좀더 가깝게 연관된 마커들을 탐색하거나 또는, 작물들에서 연관 불균형의 정도에 따라, 형질 R을 위한 원인이 되는 다형성을 최종적으로 시험하기 위해 상응하는 유전자를 클론해야 한다.

본 발명은 아시아 생식질에서 R을 위한 마커 확인 및 개조 과정을 다시 시작하는 대신에 마커 좌위 M1 및 M2에서 서열 정보의 개발을 설명한다. 마커 좌위 M1 및 M2에서 서열 변이에 대한 정보는 형질 R과 완벽하게 연관된 고유한 서열 조합을 디자인하고 만들어내는데 사용될 수 있다. 도 2에서, 육종 계통 " 5 형"이 질병 저항성 형질 R과의 조합으로 표적 작물들의 생식질에서 고유한 좌위 M1 및 M2에 신규한 서열 변이체을 포함하는 육종 계통 "8 형"을 만드는데 사용되는 가상적인 상황을 그린다. 새롭게 만들어진 마커들인 M1^* 및 M2^*는 유럽과 아시아 생식질 모두에서 형질 R을 탐색하는 이상적인 도구이다. 그들이 인공적으로 만들어졌지 때문에, 자연에서 우연히 일어날 수 있는 가능성은 무시될 수 있다. 이런 이유로, 마커 M1^* 및 M2^*는 마커 M1^* 및 M2^*가 도입된 계통의 후손들 가운데 형질 R을 탐색하는 이상적인 진단 마커들이다.

실시예:

담배 게놈을 위하여 전-정의된 SNP 마커 분석을 생성

원형질 분리

시험관 내에서(In vitro) 담배 Nicotiana tabacum cv Petit Havana 계통 SR1의 새싹 배양은 25 ℃ 및 60-70% RH에서 2000 lux의 광주기로 높은 유리병에서 0.8% 디프코 아가(Difco agar)를 포함하는 MS20 배지에서 유지되었다. MS20 배지는 2% (w/v) 수크로스, 호르몬 무첨가 및 0.8% 디프코 아가를 포함하는 기본 Murashige 및 Skoog의 배지(Murashige, T. and Skoog, F., Physiologia Plantarum, 15: 473-497, 1962)이다. 3-6주 된 새싹 배양의 완전히 펼쳐진 잎들을 수확하였다. 잎들은 1 ㎜ 얇은 채로 자르고, 그 다음에 30분 동안의 전원형질분리(preplasmolysis) 처리를 위해 40 ㎖ MDE 기본 배지를 포함하는 큰 (100 ㎜ × 100 ㎜) 페트리 디쉬로 옮겼다. MDE 기본 배지는 900 ㎖의 총 부피에 0.25 g KCl, 1.0 g ㎎ SO₄.7H₂O, 0.136 g KH₂PO₄, 2.5 g 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone) (분자량 10,000), 6 ㎎ 나프탈렌 아세트산(naphthalene acetic acid) 및 2 ㎎ 6-벤질아미노퓨린(6-benzylaminopurine)을 포함하였다. 용액의 상투질 농도는 소르비톨(sorbitol)로 600 mOsm.㎏^-1로 조정되고, pH는 5.7로, 5 ㎖ 효소 스톡(stock) SR1이 그 다음에 첨가되었다. 효소 스톡은 100 ㎖당 750 ㎎ 셀룰라제 오조누카(Cellulase Onozuka) R10, 500 ㎎ 드리셀라제(driselase) 및 250 ㎎ 마세로자임(macerozyme) R1으로 구성되었고, 와트만 종이로 필터하며 필터-멸균되었다. 잎 조직 분해는 25℃에 어둠 속에 밤새 진행되게 두었다. 분해된 잎들은 50 ㎛ 나일론 체를 통해 멸균된 비커로 여과시켰다. 체를 헹구는 데 동량의 찬 KCl을 사용하고 그 다음에 원형질 현탁액으로 채웠다. KCl 세척 배지는 리터 당 2.0 g CaCl₂.2H₂O과 삼투질 농도 540 mOsm.㎏^-1을 만드는데 적절한 양의 KCl로 구성되었다. 상기 현탁액을 10 ㎖ 튜브로 옮기고 원형질은 4℃에서 85×g로 10 분간 침강시켰다. 상층액은 버리고 원형질 펠렛은 조십스럽게 5 ㎖ 찬 ㎖m 세척 배지로 재현탁시켰으며, 이것은 보통 농도의 절반, 리터 당 2.2 g CaCl₂.2H₂O과 삼투질 농도 540 mOsm.㎏^-1을 만드는데 적절한 양의 만니톨(mannitol)인 MS 배지의 대량-영양소이다(Murashige, T. and Skoog, F., Physiologia Plantarum, 15: 473-497, 1962). 그 튜브의 내용물을 합치고 4℃에서 85×g로 10 분간 원심분리하였다. 상층액을 버리고 원형질 펠렛은 만니톨을 수크로스로 바꾼 ㎖m 배지인 찬 ㎖m 세척 배지로 조심스럽게 재현탁하였다.

㎖m 세척 배지에 있는 원형질의 2 튜브의 내용물을 가득채우고 1 ㎖의 KCl 세척 배지를 낮은 층과 섞이지 않도록 조십스럽게, 수크로스 용액 위에 첨가하였다. 그 다음에 원형질을 4℃에서 85×g로 10 분간 다시 한번 원심분리하였다. 활성 원형질을 포함하는 수크로스와 KCl 용액 사이의 중간층을 조십스럽게 수집하였다. 동량의 KCl 세척 배지를 첨가하고 조심스럽게 섞었다. 원형질 농도는 해모사이토미터(haemocytometer)고 측정하였다.

올리고뉴클레오티드들

모든 뉴클레오티드들은 유로젠텍(Eurogentec, Seraing, Belgium)에서 합성하고, 역상 HPLC(reverse phase HPLC)로 정제하였으며 멸균된 milliQ 물로 재현탁하였다.

사용하기 전에, 올리고뉴클레오티드들은 5 분 동안 95℃까지 열을 가하였다. 올리고뉴클레오티드 06Q262는 CCA를 CAA (P194Q)로 치환되는 결과가 되는 코돈 위치 P194에서 담배 SurA 유전자 (등록 번호 X07644)에 단일 미스매치(밑줄 친 뉴클레오티드)를 도입하도록 디자인되었다. 유사하게, 다른 올리고뉴클레오티드들은 CCA를 CTA (P194L)로 또는 CCA를 CGA (P194R)로 치환 (올리고뉴클레오티드들 06Q263 및 06Q264)을 만들도록 디자인되었다.

06Q262 5' TCAGTACCTATCATCCTACGTTGCACTTGACCTGTTATAG [서열번호 1]

06Q263 5' TCAGTACCTATCATCCTACGTAGCACTTGACCTGTTATAG [서열번호 2]

06Q264 5' TCAGTACCTATCATCCTACGTCGCACTTGACCTGTTATAG [서열번호 3]

원형질의 PEG 형질전환

원형질 현탁액을 5℃에서 10 분간 85×g로 원심분리하였다. 상층액을 버리고 원형질 펠렛을 KCl 세척 배지를 10⁶.㎖^- ¹의 최종 농도로 재현탁시켰다. 10 ㎖ 튜브에, 250 ㎕의 원형질 현탁액, 1.6 nmole의 올리고뉴클레오티드 및 250 ㎕의 PEG 용액을 부드럽지만 완전히 섞었다. 20 분 후, 상온에서 인큐베이션하고, 5 ㎖ 찬 0.275 M Ca(NO₃)를 방울로 첨가하였다. 상기 원형질 현탁액을 4℃에서 85×g로 10 분간 원심분리하였다. 상층액을 버리고 상기 원형질 펠렛을 50 ㎍.㎖^-1 세포탁심(cefotaxime) 및 50 ㎍.㎖^-1 반코마이신(vancomycin)으로 보충된 1.25 ㎖ T₀ 배양 배지에 조심시럽게 재현탁하였다. T₀ 배양 배지는 (리터 당, pH 5.7) 950 ㎎ KNO₃, 825 ㎎ NH₄NO₃, 220 ㎎ CaCl₂.2H₂O, 185 ㎎ MgSO₄.7H₂O, 85 ㎎ KH₂PO₄, 27.85 ㎎ FeSO₄.7H₂O, 37.25 ㎎ Na₂EDTA.2H₂O, Heller의 배지에 따른 소량-영양소(Heller, R., Ann Sci Nat Bot Biol Veg 14: 1-223, 1953), Morel 및 Wetmore의 배지에 따른 비타민들(Morel, G. and R.H. Wetmore, Amer . J. Bot. 38: 138-40, 1951), 2% (w/v) 수크로스, 3 ㎎ 나프탈렌 아세트산(naphthalene acetic acid), 1 ㎎ 6-벤질아미노퓨린(6-benzylaminopurine) 및 삼투질 농도 540 mOsm.kg^-1가 되는 만니톨의 양을 포함하였다.

상기 현탁액을 35 ㎜ 페트리 디쉬로 옮겼다. T₀ 아가로스 배지를 첨가하고 부드럽게 섞었다. 시료들은 어둠 속에서 25 ℃에 인큐베이트하였고 추가로 하기와 같이 배양하였다.

원형질 배양( Protoplast cultivation )

배양 10일 후, 아가로스 판을 6 등분으로 자르고 20 nM 클로설퓨론(chlorsulfuron)을 보충된 22.5 ㎖ MAP1AO 배지를 포함하는 페트리 디쉬로 옮겼다. 이 배지는 (리터 당, pH 5.7) 950 ㎎ KNO₃, 825 ㎎ NH₄NO₃, 220 ㎎ CaCl₂.2H₂O, 185 ㎎ MgSO₄.7H₂O, 85 ㎎ KH₂PO₄, 27.85 ㎎ FeSO₄.7H₂O, 37.25 ㎎ Na₂EDTA.2H₂O, 원래 농도의 1/10로 Murashige 및 Skoog의 배지에 따른 소량-영양소(Murashige, T. and Skoog, F., Physiologia Plantarum, 15: 473-497, 1962), Morel 및 Wetmore의 배지에 따른 비타민들(Morel, G. and R.H. Wetmore, Amer . J. Bot. 38: 138-40, 1951), 6 mg 피루브산(pyruvate), 말산(malic acid), 푸마르산(fumaric acid) 및 시트르산(citric acid) 각각 12 mg, 3% (w/v) 수크로스, 6% (w/v) 만니톨(mannitol), 0.03 ㎎ 나프탈렌 아세트산(naphthalene acetic acid) 및 0.1 ㎎ 6-벤질아미노퓨린(6-benzylaminopurine)으로 구성되었다. 시료들은 6-8 주 동안 낮은 빛에서 25℃에 인큐베이트하였다. 그 다음에 성장하는 캘러스들은 MAP1 배지로 옮기고 다시 2-3주 동안 자라게 두었다. MAP₁ 배지는 MAP₁AO 배지와 같은 조성을 가졌지만, 6%, 및 46.2 mg.l^-1 히스티딘(histidine) (pH 5.7) 대신에 3% (w/v) 만니톨(mannitol)를 포함한다. 0.8% (w/v) 디프코 아가(0.8% (w/v))로 고체화시켰다.

그 다음에 클로설퓨론(Chlorsulfuron) 저항성 캘러스들은 멸균 포셉을 사용하여 RP 배지로 옮겼다. RP 배지는 (리터 당, pH 5.7) 273 ㎎ KNO₃, 416 ㎎ Ca(NO₃)₂.4H₂O, 392 ㎎ Mg(NO₃)₂.6H₂O, 57 ㎎ MgSO₄.7H₂O, 233 ㎎ (NH₄)₂SO₄, 271 ㎎ KH₂PO₄, 27.85 ㎎ FeSO₄.7H₂O, 37.25 ㎎ Na₂EDTA.2H₂O, 공지된 농도의 1/5로 Murashige 및 Skoog의 배지에 따른 소량-영양소, Morel 및 Wetmore의 배지에 따른 비타민들(Morel, G. and R.H. Wetmore, Amer . J. Bot. 38: 138-40, 1951), 0.05% (w/v) 수크로스, 1.8% (w/v) 만니톨, 0.25 ㎎ 제아틴(zeatin) 및 41 nM 클로설퓨론(Chlorsulfuron)으로 구성되고, 0.8% (w/v) 디프코 아가(Difco agar)로 고체화시켰다. 2-3 주 후, 크기가 > 2㎝ 높이이고 잎과 정단 분열조직(apical meristems)을 명확히 보이는 성숙한 새싹을 어떤 성장 조절자(growth regulators)도 없는 MS20 배지로 구성된 뿌리 배지로 옮겼다.

ALS 의 PCR 증폭 및 서열분석

DNeasy 키트(Qiagen)을 사용하여 클로설퓨론(Chlorsulfuron) 저항성 담배 캘러스들로부터 DMA를 분리하고, PCR 반응에서 주형으로 사용하였다. 담배 SurA 유전자에서 표적 코돈들의 치환(Conversions)은 코돈 194를 포함하는, 이 유전자의 776 bp 단편을 증폭시키는 프라이머 5'GGTCAAGTGCCACGTAGGAT [서열번호 4] & 5'GGGTGCTTCACTTTCTGCTC [서열번호 5]를 사용하여 검출하였다. 제초제 저항성 담배 캘러스에서 뉴클레오티드 치환은 PCR 산물을 pCR2.1::TOPO (Invitrogen)로 클로닝하고 각 플라스미드들을 서열분석함으로써 확인되었다. 담배는 ALS (SurA 및 SmB)의 두 대립형질을 포함한다. 이들 좌위들 중 어느 하나의 P.194 코돈에서 클레오티드 치환은 클로설퓨론에 대한 저항성을 부여하는데 충분하다. 담배가 이질사배체(allotetraploid) 종이기 때문에, 담배에서 표적 돌연변이 생성이 일어날 수 있는 것에 8개의 가능한 표적이 있다. 8개의 Sur 대립형질들 중에서 오직 하나가 클로설퓨론 저항성을 제공하는 변화를 겪었다고 기대된다. 그 결과, 7개의 야생형 대립형질들은 또한 변화하지 않은 서열로 검출될 것이다. 이것을 갖는 계통에서, 코돈 194 염기 치환을 갖는 것을 검출하기 위하여 PCR 산물을 포함하는 >10 플라스미드 클론들을 서열 분석하는 것이 필요하였다. 몇 가지의 담배 원형질 형질감염 실험으로부터 클로설퓨론 저항성 캘러스에 대한 이러한 방법을 사용하여, SurA 또는 SurB 중 어느 하나에 다른 염기 변화를 각각 갖는, 6개의 고유한 캘러스를 확인하는 것이 가능하였다(표 1A).

자가 수정, 씨 수확 및 표현형 구분( phenotyping )

씨는 표 1A에 기재된 세 개의 계통들에서 얻었다. 이 3 계통의 각각으로부터 96 자가수정된 씨(M1)을 흙에 심고 온실에서 키웠다. 심은 지 36일 후, DNA 분리를 위해 담배 계통당 48 식물들로부터 잎 물질을 수확하였다. 그 다음에 37일된 식물을 또한 0.2 % 트윈(Tween)-20, 10 % 아세톤(acetone) 및 140 ㎛ 클로설퓨론(chlorsulfuron)의 용액으로 스프레이하였다. 클로설퓨론은 SurA 및 SurB 좌위들에 의하여 암호화되는 효소(acetolactate synthase; ALS)를 저해한다; ALS는 아미노산 Leu, Ile 및 Val의 합성을 만드는 초기 생합성 단계를 촉매한다. P194 돌연변이 ALS는 클로설퓨론에 민감하지 않은 ALS 효소의 변형된 형태를 만든다. 모든 스프레이된 식불은 스프레이하지 않은 식물에 비교하여 다소 노랗게 변하였고 일부 잎들은 모자이크 패턴을 보였지만 이는 전에 설명된 일시적 현상이었다("노란 플래시(flash)"). 스프레이한지 20일 후에, 식물을 세 분류로 나눌 수 있었다: 민감성, 반-저항성 및 완전히 저항성(도 1). 상기 민감성 식물은 스프레이한 후에는 성장하지 않는 것을 보였고 일부 식물들은 심지어 죽었다. 상기 반-저항성 식물들은 성장이 감소하는 것을 보였고 새로 형성된 잎들은 형태처럼 누로 침식(shoe-string)을 보였다. 완전히 저항성 식물들은 표현형적으로 스프레이하지 않은 대조군 식물과 동일하였다. 표현형 구분 데이타(phenotyping data)는 표 2에 기재하였다.

클로설퓨론 처리 후 자가수정된 자손 담배 계통들을 기록한 표현형들의 수의 요약. 완전히 저항성 식물(F-R), 반-저항성 식물(S-R) 및 민감성 식물(S).

담배 계통	F-R 식물	S-R 식물	S 식물	시험 비율 (test ratio)	χ2 값	편차가 유의적이지 않다(P≤0.05)
25	11	29	8	1:2:1	2.46	그렇다
06	13	19	16	1:2:1	2.46	그렇다
13	7	29	12	1:2:1	3.13	그렇다

세 담배 계통들의 표현형 점수는 멘델 유전에 따른다(표 2)

qPCR SNP 마커 분석의 개발

SurA 유전자에서 만들어진 다른 돌연변이들에 기초로, 대립형질(allele)-특이적 서열 다형성-유래(allele-specific sequence polymorphism-derived, AS SPD) 프라이머, 단일 특징을 갖는, 3'-말단에 대립형질-선택적 LNA 염기가 AlleleID 소프트웨어를 사용하여 디자인되었고 유로젠텍(Eurogentec)으로부터 구입하였다.

대립형질 특이적인 안티센스 프라이머들을 포함하는 상기 LNA(밑줄 친)이다:

야생형 C 대립형질을 검출하는 Sur-581-C: 5' GCATCAGTACCGATCATCCTACGTG 3' 및

돌연변이된 G, T 및 A 대립형질들을 각각 탐지하는

Sur-581-G: 5' GCATCAGTACCGATCATCCTACGTC 3',

Sur-581-T: 5' GCATCAGTACCGATCATCCTACGTA 3' 및

Sur-581-A: 5' GCATCAGTACCGATCATCCTACGTT 3'.

정방향 프라이머 Sur-F: 5' CGCCACCAATCTCGTCAG 3'와의 조합하여 상기 대립형질 특이적 프라이머들을 모든 자손 식물들의 게놈 DNA로부터의 단편들을 증폭하는데 사용하였다. PCR은 384 dbof PCR 블록에 LightCycler 480 real time PCR system를 사용하여 수행하였다. 반응은 10 ㎕ PCR 반응에 5 ㎕ 2× SYBR 그린 마스터 믹스(Roche), 25-50 ng 게놈 DNA, 각 프라이머 5μM을 포함하였다. 사용된 반응 조건은 다음과 같다: 95℃에서 10 분, 95℃에서 10 초, 66℃에서 20 초의 18 사이클

(-0.5 ℃ 모든 사이클), 72℃에서 20초, 그 다음 95℃에서 10 초, 59℃에서 20 초, 72℃에서 20초의 22 사이클.

형성된 산물들의 특이성을 확인하기 위해 증폭 후에 융해 곡선을 만들었다. 그 다음에 Ct (사이클 역치, cycle treshold) 값을 분석을 위해 사용하였다.

SNP 마커 분헉과 M1 집단들을 분석 및 표현형과의 관련

qPCR을 위한 대립형질 특이적 프라이머들이 SurA 서열에 기초로 디자인되고SurB 서열과 일 뉴클레오티드(ALS 돌연변이 위치로부터 13 뉴클레오티드 떨어진)에서 다르다. SurB에 돌연변이를 포함하는, 계통 06 및 13으로부터 얻은 qPCR 결과는 야생형 대립형질들(CCA) 및 돌연변이된 대립형질(들)(CAA/CTA)의 증폭을 보여주었다. 이 SurA 기초 프라이머들을 사용하여 SurB에서 유도된 돌연변이를 위한 이형접합성과 동형접합성 중 하나의 식물들을 구분하는 것은 가능하지 않았다. 계통 25의 qPCR 결과는 야생형 대립형질들(CCA) 및 돌연변이된 대립형질(들)(CAA)의 증폭을 보여주었지만 그러나 또한 이형접합성의 저항성과 동형접합성의 저항성 식물들간을 구별할 수 있었다. 동형접합성의 저항성 식물의 qPCR 결과는 이형접합성의 저항성 식물의 Ct 값들과 비교하여 돌연변이된 대립형질에서 더 낮은 Ct 값을 보였고 야생형 대립형질에서 더 높은 Ct 값을 보였다.

대립형질 특이적 qPCR 데이타에 기초한 값. 동형접합성의 저항성 식물(Homozygous resistant plants, HO-R), 이형접합성의 저항성 식물(heterozygous resistent plants, HE-R) 및 민감성 식물(sensitive plants, S).

담배 계통	HO-R 식물	HE-R 식물	R 식물	S 식물	시험 비율 (test ratio)	χ2 값	편차가 유의적이지 않다(P≤0.05)
25	11	28	39	9	1:2:1	1.50	그렇다
06			32	16	3:1	1.78	그렇다
13			35	13	3:1	0.11	그렇다

세 담배 계통의 대립형질 특이적 qPCR 점수들은 멘델 유전에 따른다(표 3). 추가로, 식물의 유전형(유도된 돌연변이에 대해 동형- 또는 이형접합성인)과, 돌연변이에 대해 이형접합성인 반-저항성 식물과 돌연변이에 대해 동형접합성인 완전히 저항성인 식물들과의, 제초제 처리 후 그런 식물들의 표현형 간에 명확한 상관관계가 존재하였다.

식물당 표현형 점수 결과는 Q-PCR 결과들과 비교되고 이들 결과는 98 %로 상관관계가 있다(표 4). 또한 표 4에서 매우 낮은 카이-제곱(Chi-square) 값들은 표현형 값들과 Q-PCR 결과들이 상관관계가 존재한다는 것을 보여준다. 그러므로, 각각의 표현형은 서열의 고유한 부분에서 의도적으로 도입된 마커의 마커 분석으로 정확하게 예측될 수 있고, 역으로도 된다.

qPCR 점수들과 비교한 표현형 점수들

	표현형 점수들				대립형질 특이적 Q-PCR 결과들
계통	HO-R 식물	HE-R 식물	R 식물	S 식물	HO-R 식물	HE-R 식물	R 식물	S 식물	시험 비율 (test ratio)	χ2 값	편차가 유의적이지 않다(P≤0.05)
25	11	29	40	8	11	28	39	9	1:2:1	0.16	그렇다
6	13	19	32	16			32	16	3:1	0	그렇다
13	7	29	36	12			35	13	3:1	0.11	그렇다

요약하면, DNA 마커가 특이적인 식물 대립형질로 도입될 수 있고, 이것은 잘 확립된 SNP 검출 방법들을 사용하여 검출할 수 있으며 그리고 이 마커들은 다음 세대에서 기대되는 것처럼 표현형 분리의 예측/선별에 제공될 것이라는 것을 보여준다.

<110> Keygene NV <120> Method for diagnostic marker development <130> 11fpi-03-04 <150> US 61/096,054 <151> 2008-09-11 <150> PCT/NL 2009/000172 <151> 2009-09-04 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mismatch oligonucleotide <400> 1 tcagtaccta tcatcctacg ttgcacttga cctgttatag 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mismatch oligonucleotide <400> 2 tcagtaccta tcatcctacg tagcacttga cctgttatag 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mismatch oligonucleotide <400> 3 tcagtaccta tcatcctacg tcgcacttga cctgttatag 40 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 ggtcaagtgc cacgtaggat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 gggtgcttca ctttctgctc 20

Claims

하기의 단계를 포함하는 생물에서 진단 마커 개발 방법:
- 대상 형질(trait)을 선별하는 단계;
- 상기 형질과 관련된 좌위(locus)를 결정하는 단계;
- 상기 좌위의 유전적 지도 위치를 결정하는 단계;
- 상기 좌위로부터 유전적 거리 사이에 위치한 마커를 확인하는 단계;
- 집단의 각 구성요소가 상기 마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물의 집단을 제공하는 단계;
- 상기 집단의 구성요소 각각에 대해 상기 마커의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계;
- 상기 마커들의 뉴클레오티드 서열을 배열하는(aligning) 단계;
- 상기 집단의 모든 마커들에서 동일한 뉴클레오티드를 포함하는 마커들의 서열에서 적어도 하나의 위치를 선별하는 단계;
- 적어도 하나의 위치의 양 측면에 인접한 마커 서열에 혼성화할 수 있고 추가로 상기 마커에서 적어도 하나의 위치에서 뉴클레오티드가 다른 적어도 하나의 위치에서 뉴클레오티드(마커 뉴클레오티드)를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 디자인하는 단계;
- 상기 올리고뉴클레오티드와 표적 뉴클레오티드 교환을 이용하여 생물의 DNA에 마커 뉴클레오티드를 도입함으로써, 형질과 관련된 마커에 고유하고 선별가능한 SNP를 도입하는 단계.
제 1항에 있어서, 상기 마커는 분자적 마커 기술을 사용하여 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 마커는 상기 형질로부터 많아야 1 cM, 바람직하게는 상기 형질로부터 많아야 0.1 cM의 거리에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 둘 또는 그 이상의 마커들이 상기 형질로부터 많아야 2 cM, 바람직하게는 많아야 0.2 cM에서 독립적으로, 위치하도록 개발되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물은 식물, 동물 또는 미생물인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물은 목화(Gossipyum hirsutum), 대두(Glycine max), 경작된 토마토(Solanum esculentum), 수박(Citrullus lanatus), 오이(Cucumis sativa)와 같은, 낮은 다형성 생물인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자적 마커 기술은 복합적 마커 기술들, 바람직하게는 AFLP, RAPD, SSR, SFP 및/또는 SNP로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 적어도 두 분자적 마커들은 AFLP, RAPD, SSR, SFP 및/또는 SNP로 구성되는 군으로부터의 복합적 마커 기술들에 의하여 독립적으로 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물의 DNA는 번식에 적당한 공여자 계통(donor line)으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
다중-복사본(multi-copy) DNA 단편에서 고유하고 선별가능한 마커의 도입을 위한 상기 청구항들 중 어느 하나에 따른 방법.
기존의 번식 물질에 있어서 하나 또는 그 이상의 인공적인 마커들을 만드는 방법의 용도.
유전적으로 변형된 물질에서 하나 또는 그 이상의 마커들을 도입하는 방법의 용도.
번식 물질에서 고유한 분자적 마커들의 생산을 위한 TNE의 용도.