JP2012232911A - 尿素誘導体及びその医薬用途 - Google Patents

Abstract

【課題】ＮＡＳＨの治療に有効な新規な作用メカニズムを有する化合物及びその医薬用途を提供すること。
【解決手段】本発明は、下記の一般式（Ｉ）で表される尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩を提供する。

【選択図】なし

Description

本発明は、尿素誘導体及びその医薬用途に関する。

非アルコール性脂肪性肝炎（Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ Ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；以下、ＮＡＳＨ）は、アルコールを摂取しないにも関わらず、アルコール性肝炎の組織所見に類似した肝炎や線維化が起こり、重症化すると肝硬変や肝癌へと進行し得る重大な病態である。ＮＡＳＨの発症機序としては、「Ｔｗｏ Ｈｉｔ Ｔｈｅｏｒｙ」が提唱されており（非特許文献１）、正常な肝が脂肪酸生合成の亢進や脂肪酸燃焼などの障害によって脂肪肝となった後に（第一のヒット）、脂質過酸化、肝内に蓄積する鉄、エンドトキシン、炎症性サイトカインなどに起因する酸化ストレスが加わることで（第二のヒット）、ＮＡＳＨが発症するとされている。

ここで酸化ストレスとは、酸化反応と抗酸化反応のバランスが崩れ、酸化反応側に傾くことによって生じる生体にとって好ましくない状態のことをいう。生体の構造や機能を担う脂質及びタンパク質や遺伝情報を担う遺伝子等の生体成分は、活性酸素種やフリーラジカルによって酸化され損傷を受けるため、酸化ストレスは、細胞損傷や細胞死の原因となり、最近では、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病、関節リウマチ等の病気の進行にも関与しているとも言われている。

近年では、生活習慣の欧米化に伴い、脂肪肝の原因となる肥満、糖尿病、高脂血症などのインスリン抵抗性の所見数が増加しており、これに応じてＮＡＳＨ患者数も増加している。ＮＡＳＨ罹患率は、米国では人口の約３％、日本では人口の約１％（１００万人程度）となっており、その数はさらに増加傾向にあると言われている（非特許文献２）。

また最近の研究では、ＮＡＳＨの病態モデルラットを用いた実験において、酸化ストレスにより肝臓ミトコンドリアからの活性酸素ラジカルの産生の亢進が認められること（非特許文献３）、ビタミンＥやベタインなどの酸化ストレスに対して抑制効果を示す物質が、ＮＡＳＨの治療に対して有効であること（非特許文献４）、が報告されている。さらに、酸化ストレスに対する生体の防御機構の１つとして、抗酸化剤応答配列（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ；以下、ＡＲＥ）の転写活性化があると報告されている（非特許文献５）。

Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１９９８年、１１４巻、ｐ．８４２−８４５ Ｏｋａｎｏｕｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２０１１年、２６巻、ｐ．１５３−１６２ Ｔａｋａｙａｍａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２００６年、１００巻、Ｎｏ．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １、ｐ．１６４Ｐ、Ｐ１Ｌ−１６ Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００３年、９８巻、ｐ．２４８５−２４９０ Ｃｈｅｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ、２００４年、１０巻、ｐ．８７９−８９１

しかしながら、ＮＡＳＨの発症機序は未だ明らかになっておらず、ＮＡＳＨが重篤な肝障害をもたらす疾患であるにもかかわらず、有効な治療薬が見出されていないのが現状である。現在、糖尿病治療薬であるメトホルミン塩酸塩や動脈硬化症治療薬であるイコサペント酸エチルをＮＡＳＨ治療薬として開発する試みがあるが、これらの薬物がどのような作用メカニズムでＮＡＳＨ対して薬効を示すのかについては明らかになっていない。

そこで本発明は、ＮＡＳＨの治療に有効な新規な作用メカニズムを有する化合物及びその医薬用途を提供することを目的とする。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＡＲＥの活性化作用を有する尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩が、ＮＡＳＨに対して優れた治療効果を示すことを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、下記の一般式（Ｉ）で示される尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩を提供する。

［式中、Ａは、一般式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）で表される置換基であり、

Ｒは、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルコキシ基又は置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリールオキシ基である。］

上記の一般式（Ｉ）で示される尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩において、Ａは、一般式（ＩＩａ）で表される置換基であることが好ましく、一般式（ＩＩｂ）で表される置換基である場合には、Ｒは塩素原子又はメトキシ基であることが好ましい。

また本発明は、上記の一般式（Ｉ）で表される尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、医薬を提供する。この医薬は、ＡＲＥの活性化作用を有することが好ましく、非アルコール性脂肪性肝炎の治療剤又は予防剤であることがさらに好ましい。

本発明の尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩は、ＡＲＥの活性化作用を有しており、ＮＡＳＨに対して作用メカニズムに基づいた顕著な治療効果及び予防効果を発揮する。

正常ラットへの実施例１の化合物の投与による、肝臓中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノン酸化還元酵素１（ＮＱＯ１）遺伝子の発現の変化を示した図である。 コリン欠乏アミノ酸置換（ＣＤＡＡ）食飼育ラットへの実施例１の化合物の投与による、肝臓中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノン酸化還元酵素１（ＮＱＯ１）遺伝子の発現の変化を示した図である。 コリン欠乏アミノ酸置換（ＣＤＡＡ）食飼育ラットへの実施例１の化合物の投与による、肝臓中のＩ型コラーゲンα鎖（ＣＯＬ１Ａ１）遺伝子及びβ１型トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β１）遺伝子の発現の変化を示した図である。 コリン欠乏アミノ酸置換（ＣＤＡＡ）食飼育ラットへの実施例１の化合物の投与による、肝臓中の膠原線維領域比率の変化を示した図である。

本発明の尿素誘導体は、下記の一般式（Ｉ）で示されることを特徴としている。

［式中、Ａは、一般式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）で表される置換基であり、

Ｒは、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルコキシ基又は置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリールオキシ基である。］

上記のハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子が好ましく利用されるが、塩素原子がより好ましい。

「炭素数１〜４のアルコキシ基」とは、単結合の末端のエーテル結合を介して結合された、炭素原子を１〜４個有する直鎖状の炭化水素基又は炭素原子を３〜４個有する分岐鎖状の炭化水素基を意味する。直鎖状の炭化水素基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基又はブチル基が挙げられ、分岐鎖状の炭化水素基としては、例えば、イソプロピル基、イソブチル基又はｔｅｒｔ−ブチル基が挙げられる。

「置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリールオキシ基」とは、単結合の末端のエーテル結合を介して結合された、置換基を有していてもよい炭素数６〜１２の芳香族炭化水素基を意味する。置換基としては、例えば、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシ基が挙げられ、芳香族炭化水素基としては、例えば、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、２−ビフェニリル基又は３−ビフェニリル基が挙げられる。

一般式（ＩＩｂ）におけるＲは、水素原子、ハロゲン原子若しくは炭素数１〜４のアルコキシ基又はメトキシ基で置換されたフェニルオキシ基が好ましく、水素原子、塩素原子又はメトキシ基がより好ましく、塩素原子又はメトキシ基がさらに好ましい。

上記の尿素誘導体の好ましい化合物の具体例を表１に示す。

なお、上記の尿素誘導体に不斉炭素が存在する場合は、全ての鏡像異性体及びそれらの混合物が含まれ、立体異性体が存在する場合は、全ての立体異性体及びそれらの混合物が含まれる。

上記の尿素誘導体の薬理学的に許容される塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩若しくは臭化水素酸塩などの無機酸塩又はシュウ酸塩、マロン酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、グルコン酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩若しくはケイ皮酸塩などの有機酸塩が挙げられる。

また、上記の尿素誘導体及びその薬理学的に許容される塩は、水和物若しくは溶媒和物又は結晶多形を形成してもよい。

上記の尿素誘導体は、例えば、以下に記載する製造方法に従って製造することができる。その際、原料化合物はその塩を用いてもよい。

得られた尿素誘導体は、公知の方法、例えば、溶媒抽出、再結晶及び／又はクロマトグラフィーによって単離精製でき、公知の方法又はそれに準じる方法によって目的とする塩に変換でき、尿素誘導体が塩の状態で得られた場合には、公知の方法又はそれに準ずる方法によって、尿素誘導体又はその目的とする他の塩に変換できる。

製造方法１： 尿素誘導体の製造方法

［式中、Ｌは、脱離基であり、例えば、アルコキシ基又はアリールオキシ基が挙げられる。Ａは、上記の定義と同義である。］

一般式（Ｉ）で示される尿素誘導体（以下、尿素誘導体（Ｉ））は、例えば、塩基の存在下又は非存在下、１，３，４−オキサジアゾリルアミン誘導体（ＩＩＩ）とアミン誘導体（ＩＶ）との縮合反応により製造できる。

アミン誘導体（ＩＶ）の使用量は、１，３，４−オキサジアゾリルアミン誘導体（ＩＩＩ）１モルに対して０．４〜２モルが好ましく、０．８〜１．５モルがより好ましい。

塩基の使用量は、１，３，４−オキサジアゾリルアミン誘導体（ＩＩＩ）１モルに対して１．０〜３．０モルが好ましく、１．０〜２．０モルがより好ましい。

上記の縮合反応で用いる塩基としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム若しくは炭酸セシウムなどの金属炭酸塩類、水酸化ナトリウム若しくは水酸化カリウムなどの無機塩基類、ピリジン若しくはルチジンなどの芳香族アミン類、トリエチルアミン、トリイソプロピルアミン、トリブチルアミン、シクロヘキシルジメチルアミン、４−ジメチルアミノピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルピロリジン若しくはＮ−メチルモルホリンなどの第３級アミン類、水素化ナトリウム若しくは水素化カリウムなどのアルカリ金属水素化物類、ナトリウムアミド、リチウムジイソプロピルアミド若しくはリチウムヘキサメチルジシラジドなどの金属アミド類又はナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド若しくはカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドなどの金属アルコキシド類が挙げられ、好ましく使用できる。

上記の縮合反応は溶媒中で行われ、縮合反応を阻害しない溶媒が適宜選択される。このような溶媒としては、例えば、ピリジンなどの芳香族アミン類、ジクロロメタン若しくは１，２−ジクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素類、ヘプタン若しくはヘキサンなどの脂肪族炭化水素類、トルエン、クロロベンゼン若しくはキシレンなどの芳香族炭化水素類、テトラヒドロフラン若しくは１，４−ジオキサンなどのエーテル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド若しくはＮ−メチルピロリドンなどのアミド類又はアセトニトリル若しくはプロピオニトリルなどの脂肪族ニトリル類が挙げられるが、ピリジン、トルエン又はプロピオニトリルが好ましい。ピリジンなどの芳香族アミン類を溶媒として選択した場合は、塩基非存在下にて反応を行うことができる。

上記の縮合反応の温度は、６０〜２００℃が好ましく、９０〜１３０℃がより好ましく、縮合反応の時間は、３時間〜７２時間が好ましく、６時間〜２４時間がより好ましい。

１，３，４−オキサジアゾリルアミン誘導体（ＩＩＩ）は、公知の方法又はこれらに準じた方法に従って製造することができる。例えば、市販されている２−アミノ−５−（２−フリル）−１，３，４−オキサジアゾールより、Ｍｉｓｈｒａらの方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０００年、４８巻、ｐ．５４６５−５４６８）又はこれに準ずる方法に従って製造できる。

アミン誘導体（ＩＶ）は、市販品をそのまま用いることができ、Ｗｉｎｔｅｒｆｅｌｄらの方法（Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ Ｂｅｒｉｃｈｔｅ、１９５９年、９２巻、ｐ．２４０−２４４）又はこれらに準じた方法に従って製造できる。Ａが、２位の水素原子がＲ’で置換されたピリジン−３−イル基であるアミン誘導体（ＶＩＩＩ）は、例えば、以下に記載する製造方法に従って製造できる。

製造方法２ ： アミン誘導体（ＶＩＩＩ）の製造方法

［式中、Ｒ’は、炭素数１〜４のアルコキシ基又は置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリールオキシ基である。］

（工程１）
ニコチノニトリル誘導体（ＶＩＩ）は、例えば、塩基の存在下又は非存在下、２−クロロニコチノニトリル（Ｖ）にアルコール誘導体（ＶＩ）を作用させるアルキル化反応により製造できる。

アルコール誘導体（ＶＩ）の使用量は、２−クロロニコチノニトリル（Ｖ）１モルに対して０．８〜５．０モルが好ましく、１．２〜３．０モルがより好ましい。

塩基の使用量は、２−クロロニコチノニトリル（Ｖ）１モルに対して０．８〜５．０モルが好ましく、１．２〜３．０モルがより好ましい。

上記のアルキル化反応で用いる塩基としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム若しくは炭酸セシウムなどの金属炭酸塩類、水酸化ナトリウム若しくは水酸化カリウムなどの無機塩基類、水素化ナトリウム若しくは水素化カリウムなどのアルカリ金属水素化物類又はカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドなどの金属アルコキシド類が挙げられ、好ましく使用できる。

上記のアルキル化反応は溶媒中で行われ、アルキル化反応を阻害しない溶媒が適宜選択される。このような溶媒としては、例えば、トルエン、クロロベンゼン若しくはキシレンなどの芳香族炭化水素類、テトラヒドロフラン若しくは１，４−ジオキサンなどのエーテル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド若しくはＮ−メチルピロリドンなどのアミド類又はアセトニトリル若しくはプロピオニトリルなどの脂肪族ニトリル類が挙げられるが、トルエン又はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドが好ましい。

上記のアルキル化反応の温度は、６０〜２００℃が好ましく、９０〜１３０℃がより好ましく、アルキル化反応の時間は、１５分〜２４時間が好ましく、３０分〜１２時間がより好ましい。

（工程２）
アミン誘導体（ＶＩＩＩ）は、例えば、ニコチノニトリル誘導体（ＶＩＩ）を公知の方法で還元する還元反応により製造できる。

還元反応としては、例えば、還元剤としてジイソブチルアルミニウムヒドリド、リチウムアルミニウムヒドリド、ナトリウムビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムヒドリド若しくはボラン錯体などの金属水素化物を用いる方法又は水素雰囲気下で遷移金属触媒を用いる方法が挙げられる。該遷移金属触媒としては、例えば、パラジウム−炭素、水酸化パラジウム又は４価酸化白金が挙げられる。

上記の尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩がＡＲＥの活性化作用を有することは、ＡＲＥ制御下にある遺伝子の発現促進作用又はＡＲＥの下流に配した遺伝子のタンパク質（遺伝子産物）の産生亢進作用若しくは活性促進作用を測定することで評価できる。例えば、公知の方法に従って（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、２００３年、３７４巻、ｐ．３３７−３４８）、ＡＲＥの下流にルシフェラーゼ遺伝子を組み込んで作製した発現ベクターを培養細胞に導入し、こうして得られた形質導入細胞を用いてルシフェラーゼの活性を指標にＡＲＥの活性化を測定するレポーターアッセイ法や、細胞や生体組織に存在すＡＲＥ制御下の遺伝子の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法などの方法で定量してＡＲＥの活性化を測定する方法が挙げられる。

上記の尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩がＮＡＳＨの治療又は予防に有効であることは、病態モデル動物を用いて評価できる。ＮＡＳＨ病態モデル動物としては、例えば、コリン欠乏Ｌ−アミノ酸置換（Ｃｈｏｌｉｎｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ，Ｌ−Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ−ｄｅｆｉｎｅｄ；以下、ＣＤＡＡ）食飼育マウス又はラット（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９２年、５２巻、ｐ．５０４２）、高脂肪食の摂取と薬剤（例えば、ストレプトゾトシン又はテトラサイクリン系抗生物質）の投与を併用することで誘発される病態マウス又はラット（特開第２００９／１７８１４３号；国際公開第２００６／０３０７９２号）、低酸素環境で飼育することで誘発される病態マウス又はラット（国際公開第２００８／０１８１９１号）、単一遺伝子が改変されたことにより病態を呈する肝細胞特異的Ｐｔｅｎ欠損マウス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、２００４年、１１３巻、ｐ．１７７４−１７８３）又はレプチン受容体欠損マウス（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２００４年、２８７巻、ｐ．Ｇ１０３５−Ｇ１０４３）が挙げられる。

上記の病態モデル動物を用いた上記の尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩のＮＡＳＨの治療又は予防に対する有効性の薬効評価は、例えば、ＮＡＳＨの特徴的な病変である肝線維化の抑制作用を測定することにより行うことができる。肝線維化の評価は、例えば、肝線維化関連遺伝子であるＩ型コラーゲンα鎖（ａｌｐｈａ−１ ｔｙｐｅＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ；以下、ＣＯＬ１Ａ１）遺伝子やβ１型トランスフォーミング増殖因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ１；以下、ＴＧＦ−β１）遺伝子の発現量を測定したり、肝臓中の膠原線維領域を測定したりすることで実施できる。

上記の尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩は、優れたＡＲＥの活性化作用及びＮＡＳＨの動物モデルに対する有効性を有していることから、医薬として用いることができ、ＮＡＳＨの治療剤又は予防剤として特に好ましく用いることができる。

ここでＮＡＳＨ（Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ Ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）とは、アルコールを摂取しないにも関わらず、脂肪蓄積、炎症性壊死又は線維化などの肝組織所見を示し、肝硬変や肝癌へ進行する可能性のある病態を意味する（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１９９８年、１１４巻、ｐ．８４２−８４５）。肝線維化の肝組織所見は、ＮＡＳＨの特徴的な病変であり、単純性脂肪肝と大きく異なる点であることから、Ｍａｔｔｅｏｎｉによる非アルコール性脂肪性肝疾患の分類において、ＮＡＳＨの診断項目とされている（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１９９９年、１１６巻、ｐ．１４１３−１４１９）。

ＮＡＳＨの発症に関与する重要な因子の一つには、酸化ストレスがある。この酸化ストレスは、酸化反応と抗酸化反応とのバランスが崩れて酸化反応側に傾くことによって起こり、生体内の抗酸化システムで処理しきれなくなって生じる活性酸素種やフリーラジカルが、生体の構造や機能を担う脂質やタンパク質（酵素）及び遺伝情報を担う遺伝子（ＤＮＡ）を酸化し、これらに損傷を与えることで、ＮＡＳＨの発症に関与している。

ＡＲＥ（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ）とは、生体内における抗酸化因子の遺伝子上流に存在し、遺伝子発現を調節しているプロモーター（転写調節領域）群の総称である。各ＡＲＥの塩基配列は、制御下にある遺伝子により異なるが、各ＡＲＥ間で相同性が高いことが知られている。ＡＲＥの活性化によって抗酸化因子の発現が上昇するため、ＡＲＥの活性化は、酸化ストレスに対する重要な細胞の防御機構の一つとされている。

ＡＲＥ制御下にある抗酸化因子の遺伝子としては、例えば、ヘムオキシゲナーゼ−１、肝臓グルタチオンＳ−転移酵素Ｙａサブユニット、肝臓グルタチオンＳ−転移酵素Ｙｃサブユニット、グルタチオンＳ−転移酵素Ｙｂサブユニット、グルタチオンＳ−転移酵素Ｙｃ１サブユニット又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノン酸化還元酵素（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：ｑｕｉｎｏｎｅ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ １；以下、ＮＱＯ１）の遺伝子が挙げられる。

ＮＱＯ１は、主に高反応分子であるキノン若しくはその誘導体（以下、キノン類）の１電子又は２電子還元を触媒する酸化還元酵素である。キノン類に基づくフリーラジカルは、酸化ストレスの原因因子の一つであり、ＮＱＯ１による触媒作用は酸化ストレスを抑制する。ＮＱＯ１遺伝子のＡＲＥは、転写因子Ｎｒｆ２によって制御されており、Ｎｒｆ２遺伝子欠損動物ではＮＡＳＨの病態が悪化することが報告されている（Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１０年、４８巻、ｐ．３５７−３７１）。

上記の尿素誘導体及びその薬理学的に許容される塩は、ＡＲＥの活性化作用を有することから、ＮＡＳＨの発症の引き金となる酸化ストレスを抑制できる。さらに、上記の尿素誘導体及びその薬理学的に許容される塩は、ＮＡＳＨの病態モデル動物であるＣＤＡＡ食飼育ラットにおいて、ＡＲＥ制御下にあるＮＱＯ１遺伝子の発現を促進する作用を有し、肝臓中の膠原線維領域比率を低下させる薬理作用を有していることから、ＮＡＳＨの治療又は予防に好ましく用いることができる。

上記の尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル又はヒト）、特にヒトに対して投与した場合に、ＡＲＥの活性化を抑制し、酸化ストレスに起因する病態の改善、特にＮＡＳＨに対する治療効果又は予防効果を発揮できる。

上記の尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩の投与形態としては、無添加の状態で又は医薬として許容される担体を配合して、経口的又は非経口的に投与できる。

上記の尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩を含有する製剤を経口投与する場合の剤形としては、例えば、錠剤（糖衣錠及びフィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤及びマイクロカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤又は懸濁剤が挙げられ、非経口投与する場合の剤形としては、例えば、注射剤、注入剤、点滴剤又は坐剤が挙げられる。また、上記の尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩は、適当な基剤（例えば、酪酸の重合体、グリコール酸の重合体、酪酸−グリコール酸の共重合体、酪酸の重合体とグリコール酸の重合体との混合物又はポリグリセロール脂肪酸エステル）と組み合わせて、徐放性製剤とすることも可能であり、ＮＡＳＨの治療に有効である。

上記の尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬の剤形は、製剤分野で一般的に用いられている方法に従って調製できる。この場合、必要に応じて、製剤分野において一般的に用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、甘味剤、界面活性剤、懸濁化剤、乳化剤等を含有させて調製できる。

錠剤の調製は、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤又は滑沢剤を含有させて行うことができ、丸剤及び顆粒剤の調製は、例えば、賦形剤、結合剤又は崩壊剤を含有させて行うことができる。また、散剤及びカプセル剤の調製は、例えば、賦形剤を、シロップ剤の調製は、例えば、甘味剤を、乳剤及び懸濁剤の調製は、例えば、界面活性剤、懸濁化剤又は乳化剤を含有させて行うことができる。

賦形剤としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、デンプン、ショ糖、微結晶セルロース、カンゾウ末、マンニトール、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム又は硫酸カルシウムが挙げられる。結合剤としては、例えば、デンプンのり液、アラビアゴム液、ゼラチン液、トラガント液、カルボキシメチルセルロース液、アルギン酸ナトリウム液又はグリセリンが挙げられる。崩壊剤としては、例えば、デンプン又は炭酸カルシウムが挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム又は精製タルクが挙げられる。甘味剤としては、例えば、ブドウ糖、果糖、転化糖、ソルビトール、キシリトール、グリセリン又は単シロップが挙げられる。界面活性剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート８０、ソルビタンモノ脂肪酸エステル又はステアリン酸ポリオキシル４０が挙げられる。懸濁化剤としては、例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース又はベントナイトが挙げられる。乳化剤としては、例えば、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン又はポリソルベート８０が挙げられる。

さらに、上記の尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩を含有する製剤を上記の剤形に調製する場合は、製剤分野において一般的に用いられる、着色剤、保存剤、芳香剤、矯味剤、安定剤、粘稠剤等を添加することができる。

以下、実施例及び参考例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

以下の記載において、ＮＭＲデータ中の溶媒名は、測定に使用した溶媒を示している。また、４００ ＭＨｚ ＮＭＲスペクトルは、ＪＮＭ−ＡＬ４００型核磁気共鳴装置（日本電子製）を用いて測定した。ケミカルシフトは、テトラメチルシランを基準としてδ（単位：ｐｐｍ）で表し、シグナルはそれぞれｓ（一重線）、ｄ（二重線）、ｔ（三重線）、ｑ（四重線）、ｑｕｉｎｔ（五重線）、ｓｅｐｔ（七重線）、ｍ（多重線）、ｂｒ（幅広）、ｄｄ（二重二重線）、ｄｔ（二重三重線）、ｄｄｄ（二重二重二重線）、ｄｑ（二重四重線）、ｔｄ（三重二重線）又はｔｔ（三重三重線）で表した。ＩＲスペクトルは、ＦＴ／ＩＲ−４１０（日本分光製）を用い、ＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＺＱ２Ｋ（Ｗａｔｅｒｓ製）又は１２００ＬＣ／ＭＳＤ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）を用いて測定した。溶媒は全て市販のものを用い、フラッシュクロマトグラフィーはＹＦＬＣ Ｗ−ｐｒｅｐ２ＸＹ（山善製）を用いた。

一般式（Ｉ）で表される尿素誘導体（以下、尿素誘導体（Ｉ））の原料及び中間体は、以下の参考例に記載する方法で合成した。なお、参考例化合物の合成に使用される化合物で合成法の記載のないものについては、市販の化合物を使用した。

（参考例１）２−（４−メトキシフェノキシ）ニコチノニトリル

４−メトキシフェノール（２６９ｍｇ、２．１６ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（４５０ｍｇ、３．２５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）溶液に、２−クロロニコチノニトリル（１５０ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）を加えて１３０℃に加熱し、１時間撹拌を継続しは後に室温へと放冷した。得られた反応溶液をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、２−（４−メトキシフェノキシ）ニコチノニトリルを白色固体として得た（２４４ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ、９９％）。
¹H‐NMR (400 MHz, CDCL₃) δ: 3.79 (3H, s), 6.92‐6.94 (2H, m), 7.05 (1H, dd, J=4.8, 7.6 Hz), 7.09‐7.11 (2H, m), 7.97 (1H, dd, J=2.0, 7.6 Hz), 8.28 (1H, dd, J=2.0, 4.8 Hz)
ESI‐MS: m/z= 227 (M+H)⁺

（参考例２）（２−（４−メトキシフェノキシ）ピリジン−３−イル）メタンアミン

２−（４−メトキシフェノキシ）ニコチノニトリル（２４４ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）のメタノール（３ｍＬ）溶液に、４価酸化白金（３０．０ｍｇ）を加え、反応系を水素雰囲気下とし、８時間撹拌を継続した後に反応系をアルゴン雰囲気下とし、セライトによりろ過して反応液を減圧下濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、（２−（４−メトキシフェノキシ）ピリジン−３−イル）メタンアミンを白色固体として得た（２０８ｍｇ、０．９０３ｍｍｏｌ、８３％）。
¹H‐NMR (400 MHz, CDCL₃) δ: 3.13 (2H, brs), 3.80 (3H, s), 4.40 (2H, d, J=6.0 Hz), 6.62 (1H, dd, J=7.2, 7.2 Hz), 6.88‐6.90 (2H, m), 7.01‐7.03 (2H, m), 7.45 (1H, dd, J=1.6, 7.2 Hz), 7.98 (1H, dd, J=1.6, 7.2 Hz)
ESI‐MS: m/z= 231 (M+H)⁺

（実施例１）１−（５−（２−フリル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（２−ピリジニルメチル）ウレア

２−アミノ−５−（２−フリル）−１，３，４−オキサジアゾール（６．００ｇ、３９．７ｍｍｏｌ）のピリジン（１５０ｍＬ）溶液に、トリエチルアミン（９．９６ｍＬ、７１．５ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸エチル（４．５４ｍＬ、４７．６ｍｍｏｌ）を室温で加え、１１５℃で２．５時間撹拌した後に反応液を室温まで冷却し、減圧濃縮した。

そこに酢酸エチル（２５０ｍＬ）及び１Ｎ塩酸水溶液（６２．５ｍＬ）を加えて撹拌し、分離した有機層を１Ｎ塩酸水溶液（７５ｍＬ）にて３回洗浄した。水層については、全量を合わせ、再度、酢酸エチル（１５０ｍＬ）で抽出した。その後、有機層を全量合わせ、そこに１０％塩化ナトリウム水溶液（７５ｍＬ）を加えて撹拌して洗浄し、再分離した有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、濾過後の濾液を減圧濃縮した。こうして得られた残渣にプロピオニトリル（１７０．５ｍＬ）を加えて溶解し、４−ジメチルアミノピリジン（４．１６ｇ、３４．１ｍｍｏｌ）及び２−（アミノメチル）ピリジン（３．６８ｇ、３４．１ｍｍｏｌ）を室温で加え、９５℃で１６時間撹拌した後に反応液を室温まで冷却し、減圧濃縮して得た濃縮液をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール）で精製した。クロロホルム：メタノール＝１０：１の溶媒で溶出された画分を回収して減圧乾固し、クロロホルム（２５０．０ｍＬ）で溶解後に６５℃の条件でｎ−ヘキサン（１００ｍＬ）を加えて室温まで冷却し、再度、６５℃の条件でｎ−ヘキサン（１５０ｍＬ）を加えて今度は０℃まで冷やし、撹拌することで白色固体を析出させた。その後、析出した白色固体を濾取し、クロロホルム（１２．５ｍＬ）及びｎ−ヘキサン（１２．５ｍＬ）の混合溶液で洗浄し、室温で１６時間乾燥させることにより、１−（５−（２−フリル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（２−ピリジニルメチル）ウレアを白色固体として得た（４．８３ｇ、１６．９ｍｍｏｌ、４３％）。
¹H‐NMR (400 MHz, DMSO‐d₆) δ: 4.53 (2H, d, J=5.6 Hz), 6.77 (1H, dd, J=1.6, 3.6 Hz), 7.18 (1H, brd, J=3.6 Hz), 7.29 (1H, brdd, J=5.6, 8.0 Hz), 7.37 (1H, brd, J=8.0 Hz), 7.79 (1H, ddd, J=1.6, 8.0, 8.0 Hz), 8.01 (1H, brd, J=1.6 Hz), 8.23 (1H, brs), 8.54 (1H, brd, J=5.6 Hz), 11.12 (1H, s)
IR (KBr, cm^‐1): 3242, 3180, 3038, 1721, 1681, 1603, 1570, 1527, 1287, 1227, 1048, 747
Mp: 176 ℃
HRMS (ESI‐MS): calc.: 308.0760 (C13H11N5O3Na1), found: 308.0760

（実施例２）１−（５−（２−フリル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（３−ピリジニルメチル）ウレア
実施例１と同様の手順により、以下の実施例２の化合物を合成した。

¹H‐NMR (400 MHz, DMSO‐d₆) δ: 4.44 (2H, d, J=6.0 Hz), 6.76 (1H, dd, J=2.0, 3.6 Hz), 7.18 (1H, brd, J=3.6 Hz), 7.37 (1H, dd, J=4.8, 8.0 Hz), 7.74 (1H, brd, J=8.0 Hz), 8.01 (1H, brs), 8.10 (1H, t, J=6.0 Hz), 8.47 (1H, dd, J=2.0, 4.8 Hz), 8.55 (1H, brd, J=2.0 Hz), 11.01 (1H, s)
ESI‐MS: m/z= 286 (M+H)⁺ ,284 (M‐H)⁺

（実施例３）１−（５−（２−フリル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（２−クロロ−３−ピリジニルメチル）ウレア
実施例１と同様の手順により、以下の実施例３の化合物を合成した。

¹H‐NMR (400 MHz, DMSO‐d₆) δ: 4.47 (2H, d, J=6.0 Hz), 6.77 (1H, dd, J=1.6, 3.2 Hz), 7.19 (1H, brd, J=3.2 Hz), 7.45 (1H, dd, J=4.8, 7.6 Hz), 7.81 (1H, brd, J=7.6 Hz), 8.00 (1H, brd, J=1.6 Hz), 8.15 (1H, brs), 8.33 (1H, dd, J=1.6, 4.8 Hz), 11.17 (1H, s)
ESI‐MS: m/z= 320 (M+H)⁺ ,318 (M‐H)⁺

（実施例４）１−（５−（２−フリル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（２−メトキシ−３−ピリジニルメチル）ウレア
実施例１と同様の手順により、以下の実施例４の化合物を合成した。

¹H‐NMR (400 MHz, DMSO‐d₆) δ: 3.92 (3H, s), 4.34 (2H, d, J=6.0 Hz), 6.76 (1H, dd, J=2.0, 4.0 Hz), 6.99 (1H, dd, J=5.2, 7.2 Hz), 7.17 (1H, brd, J=4.0 Hz), 7.60 (1H, dd, J=2.0, 7.2 Hz), 8.00 (1H, brd, J=2.0 Hz), 8.04 (1H, brs), 8.08 (1H, dd, J=2.0, 5.2 Hz), 11.17 (1H, s)
ESI‐MS: m/z= 316 (M+H)⁺ ,314 (M‐H)⁺

（実施例５）１−（５−（２−フリル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（２−（４−メトキシフェノキシ）−３−ピリジニルメチル）ウレア
実施例１と同様の手順により、以下の実施例５の化合物を合成した。

¹H‐NMR (400 MHz, CDCL₃) δ: 3.81 (3H, s), 4.70 (2H, d, J=6.0 Hz), 6.59 (1H, dd, J=1.6, 3.6 Hz), 6.90‐6.95 (3H, m), 7.08 (1H, dd, J=0.8, 3.6 Hz), 7.12‐7.14 (2H, m), 7.63 (1H, dd, J=0.8, 1.6 Hz), 7.74 (1H, dd, J=2.0, 7.2 Hz), 8.06 (1H, dd, J=2.0, 5.2 Hz), 8.72 (1H, brs), 9.42 (1H, s)
ESI‐MS: m/z= 408 (M+H)⁺

（比較例１）１−（５−（２−フリル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（４−ピリジニルメチル）ウレア
参考例１及び２並びに実施例１〜５と同様の手順により、以下の比較例１の化合物を合成した。

¹H‐NMR (400 MHz, DMSO‐d₆) δ: 4.43 (2H, d, J=5.6 Hz), 6.76 (1H, dd, J=2.0, 3.6 Hz), 7.17 (1H, brd, J=3.6 Hz), 7.30 (2H, d, J=5.6 Hz), 8.00 (1H, brd, J=2.0 Hz), 8.11 (1H, t, J=5.6 Hz), 8.50 (2H, d, J=5.6 Hz), 11.11 (1H, s)
ESI‐MS: m/z= 286 (M+H)⁺ ,284 (M‐H)⁺

（比較例２）１−（５−（２−フリル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（６−メチル−２−ピリジニルメチル）ウレア
参考例１及び２並びに実施例１〜５と同様の手順により、以下の比較例２の化合物を合成した。

¹H‐NMR (400 MHz, CDCL₃) δ: 2.57 (3H, s), 4.69 (2H, d, J=5.6 Hz), 6.50 (1H, dd, J=2.0, 3.6 Hz), 7.07 (1H, brd, J=7.6 Hz), 7.11 (1H, brs), 7.13 (1H, dd, J=1.6, 3.6 Hz), 7.53 (1H, brd, J=8.0 Hz), 7.57 (1H, dd, J=7.6, 8.0 Hz), 7.71 (1H, brd, J=1.6, 2.0 Hz), 8.04 (1H, s)
ESI‐MS: m/z= 300 (M+H)⁺

（比較例３）１−（５−（２−フリル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（６−ブロモ−２−ピリジニルメチル）ウレア
参考例１及び２並びに実施例１〜５と同様の手順により、以下の比較例３の化合物を合成した。

¹H‐NMR (400 MHz, CDCL₃) δ: 4.70 (2H, d, J=6.0 Hz), 6.51 (1H, dd, J=1.6, 3.2 Hz), 7.15 (1H, dd, J=0.8, 3.2 Hz), 7.33 (1H, brd, J=7.6 Hz), 7.41 (1H, brd, J=7.6 Hz), 7.48(1H, dd, J=0.8, 1.6 Hz), 7.53 (1H, dd, J=7.6, 7.6 Hz), 7.94 (1H, brs), 8.07 (1H, brs)
ESI‐MS: m/z= 364 (M+H)⁺

（比較例４）１−（５−（２−フリル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（（２−モルホリノピリジン−３−イル）メチル）ウレア
参考例１及び２並びに実施例１〜５と同様の手順により、以下の比較例４の化合物を合成した。

¹H‐NMR (400 MHz, CDCL₃) δ: 3.18 (4H, t, J=4.4 Hz), 3.90 (4H, t, J=4.4 Hz), 4.68 (2H, d, J=6.0 Hz), 6.53 (1H, dd, J=2.0, 4.0 Hz), 7.00 (1H, dd, J=4.8, 7.2 Hz), 7.17 (1H, brd, J=4.0 Hz), 7.30-7.31 (1H, m), 7.39 (1H, s), 7.45-7.46 (1H, m), 7.60-7.62 (1H, m), 8.29 (1H, dd, J=1.6, 4.8 Hz)
ESI‐MS: m/z= 371 (M+H)⁺ ,369 (M‐H)⁺

（比較例５）１−（（２−（シクロヘキシルアミノ）ピリジン−３−イル）メチル）−３−（５−（フラン−２−イル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ウレア
参考例１及び２並びに実施例１〜５と同様の手順により、以下の比較例５の化合物を合成した。

¹H‐NMR (400 MHz, CDCL₃) δ: 1.14-1.67 (10H, m), 3.95-4.00 (1H, m), 4.11-4.15 (1H, m), 4.48 (2H, d, J=6.4 Hz), 5.53 (1H, t, J=6.4 Hz), 6.48 (1H, dd, J=5.2, 7.6 Hz), 6.57 (1H, dd, J=1.6, 3.2 Hz), 7.07 (1H, brd, J=3.2 Hz), 7.30 (1H, dd, J=1.6, 7.6 Hz), 7.60 (1H, brs), 8.07 (1H, dd, J=1.6, 5.2 Hz), 8.33 (1H, s)
ESI‐MS: m/z= 383 (M+H)⁺ ,381 (M‐H)⁺

（比較例６）１−ベンジル−３−（５−（２−フリル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ウレア
参考例１及び２並びに実施例１〜５と同様の手順により、以下の比較例６の化合物を合成した。

ESI‐MS: m/z= 320 (M+H)⁺ ,318 (M‐H)⁺.

（実施例６）ＡＲＥの活性化作用の評価
尿素誘導体（Ｉ）が有するＡＲＥ活性化作用をレポーター遺伝子アッセイ法により評価した。

１．実験手法
ＮＱＯ１遺伝子の発現を制御するプロモーターであるＡＲＥの下流に、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝子を作動可能に連結し、こうして得られるＤＮＡ断片をｐＧＬ４．３２（プロメガ社製）のＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位に組み込み、発現プラスミドを作製した。ＮＱＯ１は、キノン類の１電子又は２電子還元を触媒する酸化還元酵素であり、キノン類のフリーラジカルを消滅させる活性を有しているため、ＮＱＯ１の発現は酸化ストレスに対して抑制的に働き、抗酸化ストレス活性の指標にすることができる。また、ＮＱＯ１遺伝子のＡＲＥの塩基配列は、公知文献（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、２００３年、３７４巻、ｐ．３３７−３４８）に記載のものを用いた。

作製した発現プラスミドは、リポフェクション法によりヒト肝癌由来細胞株Ｈｕｈ−７．５に遺伝子導入し、限界希釈法によるクローニングを行い、ＡＲＥ活性化作用の評価に使用する安定発現細胞株（Ｈｕｈ−７．５−ＡＲＥ−Ｌｕｃ株）を樹立した。

Ｈｕｈ−７．５−ＡＲＥ−Ｌｕｃを９６ウェル培養プレートに播種し（２．０×１０^４ ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ウェル）、３７℃の条件下、５％ＣＯ_２インキュベーター内で約６時間培養し、引き続き培養培地で希釈して調製した被験化合物溶液を１ウェル当たり１００μＬ添加して１６時間培養した。その際、被験化合物溶液の代わりに被験化合物を含まない培養培地を１ウェル当たり１００μＬ添加したウェルを設け、化合物非処置コントロールとした。その後、ＰＢＳを加えてウェル及び張り付いている細胞を洗浄し、Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ社製）を添加し、室温で暗所にて１０分間反応させ、細胞が放つ発光強度（ＲＬＵ）をＦｕｓｉｏｎα（パーキンエルマー社製）で測定した。

各被験化合物溶液を添加したそれぞれウェルのＲＬＵの平均値から細胞及び被験化合物溶液を入れずに同様の処理を行ったウェルのＲＬＵの平均値を引いた値を各被験化合物のＡＲＥ活性化の指標とし、化合物非処置コントロールのＲＬＵの平均値から細胞及び被験化合物溶液を入れずに同様の処理を行ったウェルのＲＬＵの平均値を引いた値に対する割合をＡＲＥ活性化率（％）として算出し評価した。その際、ＡＲＥ活性化率を２倍（２００％）に上昇させる化合物濃度としてＥＣ_２００とし、ＡＲＥ活性化率２００％に最も近い化合物濃度及びそれを挟む２濃度の計３点で直線回帰することにより算出した。

２．結果
結果を表２に示す。

実施例１〜５の化合物は、いずれも０．５４７〜５．７１μｍｏｌ／ＬのＥＣ_２００値を示した。比較例１〜５はいずれも最大３０μｍｏｌ／Ｌにおいて２００％以上のＡＲＥ活性化率を示さなかった。また、メトホルミン塩酸塩は最大１０００μｍｏｌ／Ｌの濃度において２００％以上のＡＲＥ活性化率を示さなかった。これらの結果から、尿素誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩が、優れたＡＲＥの活性化作用を有することが明らかとなった。

（実施例７）正常ラットにおけるＡＲＥの活性化作用の評価
実施例１の化合物を正常ラットに単回又は２回経口投与した場合における肝臓中のＮＱＯ１遺伝子の発現量の変化を調べ、ｉｎ ｖｉｖｏにおける実施例１の化合物のＡＲＥの活性化作用を評価した。

１．実験手法
雄のＦｉｓｃｈｅｒ３４４ラット（日本チャールス・リバー社）を６週齢で入荷し、１週間馴化した。馴化後のラットをｎ＝３〜４となるように無作為に群分けし、実施例１の化合物の０．５％カルボキシメチルセルロース（Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；以下、ＣＭＣ）懸濁液を６０ｍｇ／ｋｇの用量で１日１回経口投与及び１日２回経口投与した。１日１回経口投与した群のラットを単回投与群ラットとし、１回目の経口投与から１０時間後に２度目の経口投与を行った群のラットを２回投与群ラットとした。一方で、馴化後のラットに、実施例１の化合物の０．５％ＣＭＣ懸濁液の代わりに０．５％ＣＭＣ溶液を経口投与した群を、単回投与群及び２回投与群に対する対照群とし、それらの群のラットを対照群ラットとした。

単回投与群ラット及びその対照群ラットに関しては投与から８時間又は２４時間後に、２回投与群ラット及びその対照群ラットに関しては初回投与から２４時間後に、それぞれのラットをイソフルラン吸入麻酔下にて放血致死させて肝臓を摘出し、直ちに液体窒素で凍結して−８０℃で保存した。

摘出した肝臓からは、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。

このｃＤＮＡを鋳型とし、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社製）及び７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを蛍光色素としたインターカレーター法ＰＣＲにより、ＮＱＯ１遺伝子の発現量を定量した。なお、ＮＱＯ１遺伝子の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；以下、ＧＡＰＤＨ）の発現量で補正し、標準化した。

上記のＰＣＲにおいて、ＮＱＯ１遺伝子の定量には、センスプライマーとして５’−ＡＧＣＧＣＴＴＧＡＣＡＣＴＡＣＧＡＴＣＣ−３’（配列番号１）を、アンチセンスプライマーとして５’−ＣＡＡＴＣＡＧＧＧＣＴＣＴＴＣＴＣＡＣＣ−３’（配列番号２）を用いた。なお、上記のプライマーは、ＮＱＯ１遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＢＣ０８３５４２）に基づき設計した。また、ＧＡＰＤＨ遺伝子の定量には、センスプライマーとして５’−ＴＴＧＴＧＡＴＧＧＧＴＧＴＧＡＡＣＣＡＣ−３’（配列番号３）を、アンチセンスプライマーとして５’−ＴＴＣＡＧＣＴＣＴＧＧＧＡＴＧＡＣＣＴＴ−３’（配列番号４）を用いた。

インターカレーター法ＰＣＲにより定量されＧＡＰＤＨの発現量で補正された各群の肝臓におけるＮＱＯ１遺伝子の発現量を示す値は、同様に補正された対照群ラットのＮＱＯ１遺伝子の発現量を示す値で除して相対発現量とし、この相対発現量に基づいて実施例１の化合物のＡＲＥの活性化作用を評価した。なお、統計解析は、等分散性の確認（Ｆ検定）の結果に従って、等分散の場合はｔ検定を行い、不等分散の場合はＷｅｌｃｈ検定を行った。図中の＊は、単回投与群とその対照群との比較又は２回投与群とその対照群との比較で有意である（ｐ＜０．０５）ことを示す。

２．結果
結果を図１に示す。単回投与群ラットでは、投与８時間後の肝臓でＮＱＯ１遺伝子の発現が対照群と比較して統計学的に有意に上昇した。また、単回投与群ラットでは、投与２４時間後にＮＱＯ１遺伝子の発現上昇作用が減弱したが、２回投与群ラットでは、初回投与２４時間後においてもＮＱＯ１遺伝子の発現上昇作用は維持された。これらの結果から、尿素誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩が、正常ラットの肝臓においてＡＲＥの活性化作用を有することが明らかとなった。

（実施例８）ＣＤＡＡ食飼育ラット（ＮＡＳＨ病態モデルラット）における薬効評価
実施例１の化合物をＣＤＡＡ食飼育ラットに経口投与した場合における肝臓中のＮＱＯ１遺伝子の発現量の変化（ＡＲＥの活性化作用）、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子及びＴＧＦ−β１遺伝子の発現量の変化並びに肝臓中の膠原線維領域比率変化（肝線維化抑制作用）を調べ、ｉｎ ｖｉｖｏにおける実施例１の化合物のＮＡＳＨに対する薬効を評価した。

１．実験手法
雄のＦｉｓｃｈｅｒ３４４ラット（日本チャールス・リバー社）を６週齢で入荷し、１週間馴化した。馴化後のラットにはＣＤＡＡ食（リサーチダイエット社製）を計３週間給餌し、ＣＤＡＡ食誘発性肝炎を引き起こしたＮＡＳＨ病態モデルラットを作製した。給餌開始の１週間後、ＣＤＡＡ食飼育ラットは、血中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びＡＳＴ／ＡＬＴ比に基づいてｎ＝６となるように群分けし、実施例１の化合物の０．５％ＣＭＣ懸濁液を６０ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回ずつ計１４日間経口投与した群（化合物投与群）のラットを化合物投与群ラットとした。また、給餌開始の１週間後から０．５％ＣＭＣ溶液を１日２回ずつ計１４日間経口投与した群（対照群）のラットを対照群ラットとした。一方、馴化後のラットに通常食（ＣＲＦ−１、日本チャールス・リバー社製）を３週間給餌し、かつ、給餌開始の１週間後から０．５％ＣＭＣ溶液を１日２回ずつ計１４日間経口投与した群（正常群）を設け、この群のラットを正常群ラットとした。

経口投与１４日目に最後の投与を終えた翌日には、各群のラットをイソフルラン吸入麻酔下にて放血致死させて肝臓を摘出し、直ちに液体窒素で凍結して−８０℃で保存した。

摘出した肝臓からは、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ１（キアゲン社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。

このｃＤＮＡを鋳型とし、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社製）及び７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを蛍光色素としたインターカレーター法ＰＣＲにより、ＮＱＯ１遺伝子、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子及びＴＧＦ−β１遺伝子の発現量を定量した。なお、各遺伝子の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現量で補正し、標準化した。

上記のＰＣＲにおいて、ＮＱＯ１遺伝子及びＧＡＰＤＨ遺伝子の定量には、実施例７と同じものを用いた。また、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の定量には、センスプライマーとして５’−ＴＣＣＴＧＧＣＡＡＧＡＡＣＧＧＡＧＡＴ−３’（配列番号５）を、アンチセンスプライマーとして５’−ＣＡＧＧＡＧＧＴＣＣＡＣＧＣＴＣＡＣ−３’（配列番号６）を用い、ＴＧＦ−β１遺伝子の定量には、センスプライマーとして５’−ＣＣＴＧＧＡＡＡＧＧＧＣＴＣＡＡＣＡＣ−３’（配列番号７）を、アンチセンスプライマーとして５’−ＣＡＧＴＴＣＴＴＣＴＣＴＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡ−３’（配列番号８）を用いた。なお、上記のプライマーは、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＢＣ１３３７２８）及びＴＧＦ−β１遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＢＣ０７６３８０）に基づき設計した。

インターカレーター法ＰＣＲにより定量されＧＡＰＤＨの発現量で補正された各群の肝臓における各遺伝子の発現量を示す値は、同様に補正された正常群ラットの対応する遺伝子の発現量を示す値で除して相対発現量とした。ＮＱＯ１遺伝子の相対発現量に基づいて実施例１の化合物のＡＲＥの活性化作用を、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子及びＴＧＦ−β１遺伝子の相対発現量に基づいて実施例１の化合物の肝線維化抑制作用をそれぞれ評価した。

膠原線維領域定量に当たっては、肝臓を１０％緩衝ホルマリン液に浸透させて固定し、固定した肝臓を密閉式自動固定包埋装置（サクラファインテック社製）でパラフィン包埋した後、薄切片を作製して０．０５％シリウスレッドを含む飽和ピクリン酸中で染色を行った。染色像の膠原線維領域比率（シリウスレッド染色領域／解析対象組織領域×１００％）の定量には、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ ＸＤ（デフィニエンス社製）を用い、各個体のランダムに選んだ３視野（倍率５倍）について定量を行った。

なお、統計解析は、等分散性の確認（Ｆ検定）の結果に従って、等分散の場合はｔ検定を行い、不等分散の場合はＷｅｌｃｈ検定を行った。図中の＊は、化合物投与群と対照群との比較で有意である（ｐ＜０．０５）ことを示す。

２．結果
結果を図２、３及び４に示す。図２に示すように、実施例１の化合物の投与によって、肝臓中のＮＱＯ１遺伝子の発現は対照群と比較して統計学的に有意に上昇した。この結果から、尿素誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩が、ＣＤＡＡ食誘発性肝炎を引き起こしたＮＡＳＨ病態モデルラットにおいてもＡＲＥの活性化作用を有することが明らかとなった。

また、図３及び４に示すように、対照群では、線維化に関与するタンパク質であるＣＯＬ１Ａ１及びＴＧＦ−β１をコードする遺伝子の発現量及び肝臓中の膠原線維領域比率が正常群と比較して統計学的に有意に上昇した。この結果は、ＣＤＡＡ食の給餌によって対照群ラットの肝臓に線維化が引き起こされていることを意味している。一方、実施例１の化合物の投与によって、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子及びＴＧＦ−β１遺伝子の発現量及び膠原線維領域比率が対照群と比較して統計学的に有意に低下していた。これらの結果から、尿素誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩が、ＮＡＳＨの特徴的な進行型病変である肝線維化に対して薬効を示すことが明らかとなった。

尿素誘導体（Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩は、医薬の分野において、ＡＲＥの活性化作用に基づく医薬、特にＮＡＳＨの治療薬又は予防薬として利用できる。

配列番号１〜８：ＰＣＲプライマーである。

Claims (6)

1. 一般式（Ｉ）で示される、尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩。
   

   

   ［式中、Ａは、一般式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）で表される置換基であり、
   

   

   Ｒは、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルコキシ基又は置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリールオキシ基である。］
2. Ａは、一般式（ＩＩｂ）で表される置換基である、請求項１記載の尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩。
3. Ｒは、塩素原子又はメトキシ基である、請求項１又は２記載の尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩。
4. 請求項１〜３のいずれか一項記載の尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、医薬。
5. 抗酸化剤応答配列の活性化作用を有する、請求項４記載の医薬。
6. 非アルコール性脂肪性肝炎の治療剤又は予防剤である、請求項４又は５記載の医薬。

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