JP2012194170A - ペプチドの検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ペプチドと式(I)
(式中、Rは、ハロゲン原子、カルボキシC1−6アルキルまたはカルボキシルを示す)で表される化合物とを、ホウ酸溶液中、酸化剤存在下、20〜50℃で反応させて蛍光体を製造することを特徴とする、ペプチドの検出方法。
【選択図】なし
Description
現在、公知のコラーゲン定量法としてELISA法や比色法、o−フタルアルデヒドを用いた蛍光法等に基づく技術が知られており、その技術に基づくキットが市販されている。しかし、ELISA法は抗原抗体反応に依存するため、高価なキットになっている。また比色法によれば、コラーゲンと色素の相互作用に基づく吸収の変化を測定するために感度が低く、また多くの試料を必要とすること、特異性が低いこと、などの欠点があった。またo−フタルアルデヒドを用いる方法(非特許文献2参照)では、アミノ末端を検出するという特徴から、サンプル中に含まれるコラーゲン(またはコラーゲン由来のペプチド)以外のタンパク質やペプチド、アミノ基を有するペプチド側鎖をも検出してしまい、ブランクが非常に高いという欠点があった。
さらに特定のカテコール類縁化合物によれば、コラーゲンに由来するペプチドを上記条件で選択的に蛍光誘導体に変換可能なことも明らかにした。
本発明者らはこれらの知見に基づいてさらに鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。
[1]ペプチドと式(I)
[2]反応が、pH7〜8で行われる、[1]に記載の方法;
[3]酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムである、[1]または[2]に記載の方法;
[4]式(I)で表される化合物が、3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸、3,4−ジヒドロキシ安息香酸および4−ハロゲン化カテコールから選択される、[1]〜[3]のいずれか一に記載の方法;
[5]式(I)で表される化合物が、3,4−ジヒドロキシ安息香酸であり、ペプチドが、N末端がプロリンであるペプチドである、[1]〜[4]のいずれか一に記載の方法;
[6]式(I)で表される化合物が、3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸であり、ペプチドが、グリシンを含むペプチドである、[1]〜[4]のいずれか一に記載の方法;
[7]式(I)で表される化合物が、3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸であり、ペプチドが、試料のコラゲナーゼ処理により得られるペプチドである、[1]〜[4]のいずれか一に記載の方法;
[8]試料中のコラーゲンを検出する方法である、[7]に記載の方法;
[9]試料中のコラーゲンを定量する方法である、[7]に記載の方法;
[10]式(I)
[11]酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムである、[10]に記載の試薬;
[12]式(I)で表される化合物が、3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸、3,4−ジヒドロキシ安息香酸および4−ハロゲン化カテコールから選択される、[10]または[11]に記載の試薬;
[13]式(I)で表される化合物が、3,4−ジヒドロキシ安息香酸であり、ペプチドが、N末端がプロリンであるペプチドである、[10]〜[12]のいずれか一に記載の試薬;
[14]式(I)で表される化合物が、3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸であり、ペプチドが、グリシンを含むペプチドである、[10]〜[12]のいずれか一に記載の試薬;
[15]式(I)で表される化合物が、3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸であり、ペプチドが、試料のコラゲナーゼ処理により得られるペプチドである、[10]〜[12]のいずれか一に記載の試薬;
[16]コラーゲンの検出試薬である、[15]に記載の試薬;
[17]ペプチドと式(I)
[18]反応が、pH7〜8で行われる、[17]に記載の方法;
[19]酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムである、[17]または[18]に記載の方法;
[20]式(I)で表される化合物が、3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸、3,4−ジヒドロキシ安息香酸および4−ハロゲン化カテコールから選択される、[17]〜[19]のいずれか一に記載の方法。
特に本発明のペプチド検出方法は、アミノ酸の種類や隣接するペプチド結合を認識して、特定のペプチド(例えば、N末端がプロリンであるペプチドや、グリシンを含むペプチド)を高選択的に蛍光体化することができる。特にグリシンを含むペプチドの検出は、コラゲナーゼの使用と組み合わせて、コラーゲン検出方法として応用することができる点で有用である。
また当該コラーゲン検出方法によれば、コラーゲンを定量的に測定することも可能であるし、コラーゲンをバイオマーカーとする疾患の診断を行うことも可能である。
さらに本発明のペプチド検出方法は、従来のペプチド蛍光体形成反応に比べてよりマイルドな温度条件で、短時間にペプチドを高選択的に蛍光検出できるので、各種プロテアーゼの酵素活性の測定方法など、生化学や病態検査学の分野にも応用することが可能である。
本発明における「ペプチド」とは、後述する蛍光体形成反応により蛍光体化される限りその配列は特に限定されず、例えばアミノ酸数が2以上のペプチドが挙げられる。
コラゲナーゼを用いる場合の反応条件、コラゲナーゼの量などは、当業者であれば適宜選択することができる。またコラゲナーゼの種類は、検出・定量したいコラーゲンの種類に合わせて適宜選択することが可能である。
酸化剤の添加量は、後述する蛍光体形成反応を進行させ、特定の波長で発光する蛍光体が形成される限り特に限定されるものではない。しかしながら、反応系中に酸化剤と反応するような物質が存在する場合や、後述する蛍光体形成を妨げるような物質が存在する場合は、酸化剤が消費されて実質的に工程(1)で用いられる酸化剤の量が減少するので、酸化剤の量を増やす必要がある。例えば検出に用いられるサンプルが血液や血清であった場合、本工程において血液や血清中の物質によって酸化剤が消費される場合がある。このような場合は、通常よりも酸化剤の量を増やすことで本工程を進行させることができる。
このような酸化剤の量は、当業者であれば適宜決定することが可能である。
特に後述する蛍光体形成反応において、化合物(I)としてRがカルボキシルである化合物(3,4−ジヒドロキシ安息香酸)またはRがハロゲン原子である化合物(4−ハロゲン化カテコール)を用いた場合は、N末端がプロリンであるペプチドを高選択的に蛍光体化することができる。
一方、化合物(I)としてRがカルボキシル−C1−6アルキルである化合物(例えば、3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸)を用いた場合は、ランダムなアミノ酸配列を有するペプチドに対して蛍光を与えるが、後述する実施例1および2で示されるように、特にグリシンを含むペプチドに対して蛍光を与える(図1参照)。
コラーゲンは、グリシン−アミノ酸(X)−アミノ酸(Y)という、グリシンが3残基ごとに繰り返される一次構造を有しており、各種コラゲナーゼによってグリシンをN末端に含むペプチド断片に分解することができる。コラゲナーゼとしては、検出したいコラーゲンの種類に合わせて選択すればよく、したがって、例えばI型コラーゲンを検出する場合は、コラーゲンを含む試料をI型コラゲナーゼ(I型コラーゲンを消化するコラゲナーゼ)で消化すればよい。得られたペプチド断片はI型コラーゲン由来であるので、このペプチド断片を検出することでI型コラーゲンを特異的に検出することになる。コラゲナーゼの反応条件、量などは、当業者であれば適宜選択可能である。
よって上記工程を経て得られた蛍光体を、後述する工程(2)において蛍光スペクトロメーター等に付し、蛍光強度を測定するのみで、試料中に存在するコラーゲンを検出することができる。
現在のところ、このような蛍光法に基づくコラーゲン測定キットは市販されておらず、本発明は簡便かつ高感度なコラーゲンの蛍光検出・定量法と成り得るものである。
よって本発明のコラーゲン検出・定量方法によれば、これらの疾患を発見・診断することも可能となる。
本工程は、工程(1)で得られた蛍光体を検出することで、サンプル中に存在するペプチドを検出する工程である。
また夾雑物が蛍光測定の妨げになる場合は、自体公知の方法によって、蛍光体以外の成分を除く操作を行うか、あるいは上記HPLCのような蛍光体を分離する操作を行えばよい。このような方法は、当業者に公知である。
40μMの各ペプチド溶液250μLに、0.5mMの化合物(I) 375μL、100mM H3BO3−NaOH(pH 8.0)312μL、5mM NaIO4 63μLを加え(終濃度としてペプチド10μM、Na3BO3 31mM、NaIO4 315μM)、37℃で10分間反応を進行させた。その後反応液を10分間氷冷し、蛍光スペクトロメーター(励起波長370nm、蛍光波長465nm)によって蛍光強度を測定した。結果を図1〜図3に示す。
蛍光光度分析:
機種:日本分光 FP−6300 Spectrofluorometer
スリット幅:10nm、10nm
感度:medium
レスポンス:medium
実施例1で得られた反応液をHPLCによって分析した。
HPLC条件:移動層;15−80%メタノール+5% 0.25M pH7.0 H3BO3−NaOH(0−40min linear gradient)、励起波長370〜450nm,蛍光波長465〜540nm,カラムODS−80Ts(150mm×4.6mm i.d,pore size 5mm,Tosoh)。
コラーゲンを含む各タンパク質(20nM)またはHeLa細胞抽出物(全タンパク質量15.2μg/tube;4×105cells/tube)を、5mM CaCl2を含む50mMホウ酸緩衝液(pH7.5)中、微生物由来コラゲナーゼ(2.0μg/tube,ナカライテスク社製)と37℃で1時間反応させた。その後、315μM NaIO4と31.2mMホウ酸緩衝液の存在下、187μM 3,4−DHPAAと37℃で10分間反応させ、蛍光体を製造した。その後、反応液を10分間氷冷し、蛍光スペクトロメーター(実施例1参照)によって、励起波長370nm、蛍光波長465nmで、得られた蛍光体を含む溶液の蛍光強度を測定した。結果を図4に示す。
本発明のコラーゲン検出方法によれば、コラーゲンを特異的に検出できることが明らかとなった。
ヒトまたはウシコラーゲン−I(シグマ社製)を、5mM CaCl2を含む50mMホウ酸緩衝液(pH 7.5)中、微生物由来コラゲナーゼ(2.0μg/tube,ナカライテスク社製)と37℃で1時間反応させた。その後、315μM NaIO4と31.2mMホウ酸緩衝液の存在下、187μM 3,4−DHPAAと37℃で10分間反応させ、蛍光体を製造した。その後、反応液を10分間氷冷し、蛍光スペクトロメーター(実施例1参照)によって、励起波長370nm、蛍光波長465nmで、得られた蛍光体を含む溶液の蛍光強度を測定した。得られた結果を、ヒトまたはウシコラーゲン−I量との関係でプロットし、検量線を作成した。結果を図5に示す。
特に本発明のペプチド検出方法は、アミノ酸の種類や隣接するペプチド結合を認識して、特定のペプチド(例えば、N末端がプロリンであるペプチドや、グリシンを含むペプチド)を高選択的に蛍光体化することができる。特にグリシンを含むペプチドの検出は、コラゲナーゼの使用と組み合わせて、コラーゲン検出方法として応用することができる点で有用である。
また当該コラーゲン検出方法によれば、コラーゲンを定量的に測定することも可能であるし、コラーゲンをバイオマーカーとする疾患の診断を行うことも可能である。
さらに本発明のペプチド検出方法は、従来のペプチド蛍光体形成反応に比べてよりマイルドな温度条件で、短時間にペプチドを高選択的に蛍光検出できるので、各種プロテアーゼの酵素活性の測定方法など、生化学や病態検査学の分野にも応用することが可能である。
Claims (20)
- ペプチドと式(I)
- 反応が、pH7〜8で行われる、請求項1に記載の方法。
- 酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項1または2に記載の方法。
- 式(I)で表される化合物が、3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸、3,4−ジヒドロキシ安息香酸および4−ハロゲン化カテコールから選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 式(I)で表される化合物が、3,4−ジヒドロキシ安息香酸であり、ペプチドが、N末端がプロリンであるペプチドである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 式(I)で表される化合物が、3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸であり、ペプチドが、グリシンを含むペプチドである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 式(I)で表される化合物が、3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸であり、ペプチドが、試料のコラゲナーゼ処理により得られるペプチドである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 試料中のコラーゲンを検出する方法である、請求項7に記載の方法。
- 試料中のコラーゲンを定量する方法である、請求項7に記載の方法。
- 式(I)
- 酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項10に記載の試薬。
- 式(I)で表される化合物が、3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸、3,4−ジヒドロキシ安息香酸および4−ハロゲン化カテコールから選択される、請求項10または11に記載の試薬。
- 式(I)で表される化合物が、3,4−ジヒドロキシ安息香酸であり、ペプチドが、N末端がプロリンであるペプチドである、請求項10〜12のいずれか一項に記載の試薬。
- 式(I)で表される化合物が、3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸であり、ペプチドが、グリシンを含むペプチドである、請求項10〜12のいずれか一項に記載の試薬。
- 式(I)で表される化合物が、3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸であり、ペプチドが、試料のコラゲナーゼ処理により得られるペプチドである、請求項10〜12のいずれか一項に記載の試薬。
- コラーゲンの検出試薬である、請求項15に記載の試薬。
- ペプチドと式(I)
- 反応が、pH7〜8で行われる、請求項17に記載の方法。
- 酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項17または18に記載の方法。
- 式(I)で表される化合物が、3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸、3,4−ジヒドロキシ安息香酸および4−ハロゲン化カテコールから選択される、請求項17〜19のいずれか一項に記載の方法。
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