JP2012120696A - 血管様構造物を含む三次元細胞培養物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(a)コア部の解離性ゲルファイバ及びシェル部の細胞接着性ゲルを含み、血管構築用細胞を含むアシェル型ゲルファイバを製造する工程;(b)該ゲルファイバを培養し、シェル部の細胞接着性ゲルに血管構築用細胞の培養物を含むコアシェル型ゲルファイバを得る工程;及び(c)コア部の解離性ゲルファイバを除去して中空の血管様構造物を得る工程;及び(d)該血管様構造物を組織構築用細胞で包埋して培養を行ない、中空の血管様構造物を内部に含む三次元細胞培養物を得る工程を含む方法。
【選択図】図1
Description
(a)少なくともコア部の解離性ゲルファイバ及びシェル部の細胞接着性ゲルを含むコアシェル型ゲルファイバであって、血管構築用細胞を含むゲルファイバを製造する工程;
(b)上記工程(a)で得られたゲルファイバを培養し、シェル部の細胞接着性ゲルに血管構築用細胞の培養物を含むコアシェル型ゲルファイバを得る工程;及び
(c)上記工程(c)で得られたコアシェル型ゲルファイバのコア部の解離性ゲルファイバを除去して、血管構築用細胞の培養物を含む細胞接着性ゲルからなる中空の血管様構造物を得る工程
を含む方法が提供される。
(a)少なくともコア部の解離性ゲルファイバ及びシェル部の細胞接着性ゲルを含むコアシェル型ゲルファイバであって、血管構築用細胞を含むゲルファイバを製造する工程;
(b)上記工程(a)で得られたゲルファイバを培養し、シェル部の細胞接着性ゲルに血管構築用細胞の培養物を含むコアシェル型ゲルファイバを得る工程;及び
(c)上記工程(c)で得られたコアシェル型ゲルファイバのコア部の解離性ゲルファイバを除去して、血管構築用細胞の培養物を含む細胞接着性ゲルからなる中空の血管様構造物を得る工程;及び
(d)上記工程(c)で得られた血管様構造物を組織構築用細胞で包埋して培養を行ない、血管構築用細胞の培養物を含む細胞接着性ゲルからなる中空の血管様構造物を内部に含む三次元細胞培養物を得る工程
を含む方法が提供される。
(a)少なくともコア部の解離性ゲルファイバ及びシェル部の細胞接着性ゲルを含むコアシェル型ゲルファイバであって、血管構築用細胞を含むゲルファイバを製造する工程;
(b)上記工程(a)で得られたゲルファイバを組織構築用細胞で包埋して培養を行ない、シェル部の細胞接着性ゲルに血管構築用細胞の培養物を含むコアシェル型ゲルファイバが包埋された三次元細胞培養物を得る工程;及び
(c)上記工程(b)で得られた培養物中に包埋されたゲルファイバのコア部の解離性ゲルファイバを除去して、血管構築用細胞の培養物を含む細胞接着性ゲルからなる中空の血管様構造物を内部に含む三次元細胞培養物を得る工程
を含む方法が提供される。
(a)少なくともコア部の解離性ゲルファイバ及びシェル部の細胞接着性ゲルを含むコアシェル型ゲルファイバであって、血管構築用細胞を含むゲルファイバを製造する工程;
(b)上記工程(a)で得られたゲルファイバを培養し、シェル部の細胞接着性ゲルに血管構築用細胞の培養物を含むコアシェル型ゲルファイバを得る工程;及び
(c)上記工程(c)で得られたコアシェル型ゲルファイバのコア部の解離性ゲルファイバを除去して、血管構築用細胞の培養物を含む細胞接着性ゲルからなる中空の血管様構造物を得る工程
を含むことを特徴としている。
(a)少なくともコア部の解離性ゲルファイバ及びシェル部の細胞接着性ゲルを含むコアシェル型ゲルファイバであって、血管構築用細胞を含むゲルファイバを製造する工程;
(b)上記工程(a)で得られたゲルファイバを組織構築用細胞で包埋して培養を行ない、シェル部の細胞接着性ゲルに血管構築用細胞の培養物を含むコアシェル型ゲルファイバが包埋された三次元細胞培養物を得る工程;及び
(c)上記工程(b)で得られた培養物中に包埋されたゲルファイバのコア部の解離性ゲルファイバを除去して、血管構築用細胞の培養物を含む細胞接着性ゲルからなる中空の血管様構造物を内部に含む三次元細胞培養物を得る工程
を含む方法によって製造することもできる。
例1
(a)アルギン酸ゲルファイバの作製
同軸フロー型マイクロ流路デバイスの内管と外管にそれぞれ1.5 w/v%アルギン酸ナトリウム水溶液と100 mM塩化カルシウム水溶液を流し、直径が100-500 μmの間で均一なアルギン酸ゲルファイバを作製した。
上記(a)で作製したアルギン酸ゲルファイバを0.24%コラーゲン溶液とともに内径1 mmのシリコーンチューブ内へシリンジを用いて吸引した。シリコーンチューブの両端を内容物が漏れないようにクリップで固定し、37℃で10分間加温してコラーゲンゲルをゲル化させた。クリップを取り外し、シリンジで押し出して、コラーゲンゲルで被覆されたアルギン酸ゲルファイバを培養液中に回収した。さらに、回収物を内径2 mmのシリコーンチューブ内で同様にコラーゲン溶液と共に吸引してゲル化させ、アルギン酸ゲルファイバがコラーゲンゲルで二重に被覆されたゲルファイバを作製した。
アルギン酸リアーゼを0.1 mg/mLの濃度となるように上記のコアシェル型ゲルファイバを含む培養液中に添加した。37℃で1時間シェーカーで揺動させてコア部のアルギン酸ゲルを完全に溶解させ、内腔が貫通した管状コラーゲンゲルを作製した。
例1と同様にしてアルギン酸ゲルファイバを調製した。そのファイバを血管内皮細胞(新生児由来ヒト臍帯静脈細胞)の培養物を満たした培養皿に入れ、シェル部のコラーゲンゲルの外側に2×105〜8×106 cells/cm2の細胞密度となるように血管内皮細胞を播種した。得られたコアシェル型ゲルファイバを37℃で24時間培養し(図2)、例1と同様にしてアルギン酸リアーゼを作用させてコア部のアルギン酸ゲルを溶解することにより、管状のコラーゲンゲル中に血管内皮細胞を含む血管様構造体を得た(図3及び4)。培養後の細胞密度は1×105〜2×105 cells/cm2程度のコンフルエントであった。
例1と同様にしてアルギン酸ゲルファイバを調製する。その際、アルギン酸ナトリウム水溶液に例2で用いた血管内皮細胞を1×106〜1×107 cells/cm2の細胞密度となるように添加する。その後、例1と同様にしてアルギン酸ゲルファイバをコラーゲンゲルで被覆し、ただしコラーゲンゲルの被覆は単一の被覆としてコアシェル型ゲルファイバを調製する。
例1と同様にしてアルギン酸ゲルファイバを調製する。その後、例1と同様にしてアルギン酸ゲルファイバをコラーゲンゲルで二重に被覆してコアシェル型ゲルファイバを調製する。その際、第一のコラーゲンゲル被覆用のコラーゲン溶液に例2で用いた血管内皮細胞を例3と同様に添加する。
例1と同様にしてアルギン酸ゲルファイバを調製する。その後、例1と同様にしてアルギン酸ゲルファイバをコラーゲンゲルで二重に被覆してコアシェル型ゲルファイバを調製する。その際、第一のコラーゲンゲル被覆用のコラーゲン溶液に例2で用いた血管内皮細胞を例3と同様に添加し、第二のコラーゲン被覆用のコラーゲン溶液には血管平滑筋細胞(ヒト由来)を1×105 cells/mL〜1×108 cells/mLとなるように添加する。
例2で得られた血管様構造体に生理食塩水を充填して、チャンバー内に配置した後に細胞スフェロイド(細胞数100〜1,800個程度、直径60〜160μm程度)を加えて37℃で24時間培養する。スフェロイド由来の細胞同士が接着して一体化した三次元細胞培養物が得られ、その細胞培養物の内部にはあらかじめ配置した血管様構造体が中空のまま保存される。スフェロイドに代えて細胞ビーズ(細胞をコラーゲンゲルビーズの表面に接着させたもの、例えばProceedings of uTAS, pp.2014-2016, 2010、直径100μm程度)を用いて同様に培養を行うことにより三次元細胞培養物が得られる。この三次元細胞培養物も同様に血管様構造体が中空のまま保存されている。
顕微鏡下において例2で得られた血管様構造体の両端に外径300 μmのステンレス管を挿入し、直径100-200 μmの縫合糸で縛ることで結合させた。これを還流デバイス内の直径300 μm流路内に挿入し、血管様構造体をデバイス内へ配置させた。シリンジポンプを用いて、1-70 μL/minで培養液を送液できることを確認した後、例6と同様にして細胞ビーズをチャンバー内へモールディングし、その後、還流培養を行ない三次元細胞培養物を得た。
例1と同様にしてアルギン酸ゲルファイバを調製する。その際、アルギン酸ナトリウム水溶液に例2で用いた血管内皮細胞を例3と同様に添加する。その後、例1と同様にしてアルギン酸ゲルファイバをコラーゲンゲルで二重に被覆してコアシェル型ゲルファイバを調製する。得られたコアシェル型ゲルファイバをチャンバー内に配置した後に例6と同様にしてスフェロイド及び培地を加えて37℃で24時間培養して三次元細胞培養物を得る。得られた三次元細胞培養物にアルギン酸リアーゼ(0.1 mg/mL)を37℃で2時間を作用させてコアシェル型ゲルファイバのコア部のアルギン酸ゲルを溶解することにより、管状コラーゲンゲル中に血管内皮細胞を含む血管様構造体を内部に含む三次元細胞培養物を得る。
Claims (10)
- 血管様構造物の製造方法であって、下記の工程:
(a)少なくともコア部の解離性ゲルファイバ及びシェル部の細胞接着性ゲルを含むコアシェル型ゲルファイバであって、血管構築用細胞を含むゲルファイバを製造する工程;
(b)上記工程(a)で得られたゲルファイバを培養し、シェル部の細胞接着性ゲルに血管構築用細胞の培養物を含むコアシェル型ゲルファイバを得る工程;及び
(c)上記工程(c)で得られたコアシェル型ゲルファイバのコア部の解離性ゲルファイバを除去して、血管構築用細胞の培養物を含む細胞接着性ゲルからなる中空の血管様構造物を得る工程
を含む方法。 - 血管構築用細胞が血管内皮細胞である請求項1に記載の方法。
- 解離性ゲルファイバがアルギン酸ゲルファイバであり、細胞接着性ゲルがコラーゲンゲルである請求項1又は2に記載の方法。
- 血管様構造物を含む三次元細胞培養物の製造方法であって、下記の工程:
(a)少なくともコア部の解離性ゲルファイバ及びシェル部の細胞接着性ゲルを含むコアシェル型ゲルファイバであって、血管構築用細胞を含むゲルファイバを製造する工程;
(b)上記工程(a)で得られたゲルファイバを培養し、シェル部の細胞接着性ゲルに血管構築用細胞の培養物を含むコアシェル型ゲルファイバを得る工程;及び
(c)上記工程(b)で得られたコアシェル型ゲルファイバのコア部の解離性ゲルファイバを除去して、血管構築用細胞の培養物を含む細胞接着性ゲルからなる中空の血管様構造物を得る工程;及び
(d)上記工程(c)で得られた血管様構造物を組織構築用細胞で包埋して培養を行ない、血管構築用細胞の培養物を含む細胞接着性ゲルからなる中空の血管様構造物を内部に含む三次元細胞培養物を得る工程
を含む方法。 - 血管様構造物を含む三次元細胞培養物の製造方法であって、下記の工程:
(a)少なくともコア部の解離性ゲルファイバ及びシェル部の細胞接着性ゲルを含むコアシェル型ゲルファイバであって、血管構築用細胞を含むゲルファイバを製造する工程;
(b)上記工程(a)で得られたゲルファイバを組織構築用細胞で包埋して培養を行ない、シェル部の細胞接着性ゲルに血管構築用細胞の培養物を含むコアシェル型ゲルファイバが包埋された三次元細胞培養物を得る工程;及び
(c)上記工程(b)で得られた培養物中に包埋されたゲルファイバのコア部の解離性ゲルファイバを除去して、血管構築用細胞の培養物を含む細胞接着性ゲルからなる中空の血管様構造物を内部に含む三次元細胞培養物を得る工程
を含む方法。 - 血管構築用細胞が血管内皮細胞である請求項4又は5に記載の方法。
- 解離性ゲルファイバがアルギン酸ゲルファイバであり、細胞接着性ゲルがコラーゲンゲルである請求項5又は6に記載の方法。
- 組織構築用細胞として細胞ビーズ、細胞スフェロイド、細胞シート、又は細胞とプレゲル溶液との混合物のいずれか又はそれらの組み合わせを用いる請求項4ないし7のいずれか1項に記載の方法。
- 血管構築用細胞の培養物を含む細胞接着性ゲルからなる中空の血管様構造物。
- 血管構築用細胞の培養物を含む細胞接着性ゲルからなる中空の血管様構造物を内部に含む三次元細胞培養物。
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