JP2012111780A - 慢性リンパ性白血病細胞に由来するポリペプチドおよび抗体、ならびにそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、癌を処置するための方法であって、癌に罹患している被験体に対して、i)CD200とCD200レセプターとの間の相互作用を妨害して、それによりCD200の免疫抑制効果を阻害し、かつii)OX−2/CD200またはOX−2/CD200レセプターに結合する部分を含むポリペプチド融合分子を使用して癌細胞を殺す治療組成物を投与する工程を包含する方法を提供する。
【選択図】図1
Description
本出願は、2005年6月30日に提出された米国特許出願第11/171,567号に対する優先権を主張する。この米国特許出願第11/171,567号は、2004年11月23日に提出された米国特許出願第10/996,316号の一部継続である。米国特許出願第10/996,316号は、2004年7月20日に提出された米国特許出願第10/894,672号の一部継続である。米国特許出願第10/894,672号は、2003年12月15日に提出された米国特許出願第10/736,188号の一部継続である。米国特許出願第10/736,188号は、次に、2001年12月10日に提出されたPCT/US01/47931の一部継続である。PCT/US01/47931は、2000年12月8日に提出された米国仮出願第60/254,113号に対する優先権を主張する国際出願である。米国仮出願第60/254,113号は、2003年3月4日に提出された米国特許出願第10/379,151号の一部継続である。上述の米国出願、国際出願および仮出願の開示全体は、参考として本明細書中に援用される。
2つの機構の組合せを提供する療法を使用する癌処置を開示する。さらに詳細には、本開示は:1)免疫抑制を遮断して、それにより癌細胞の根絶を促進するために、CD200とそのレセプターとの間の相互作用を妨害する;2)a)補体媒介性または抗体依存性細胞傷害、あるいはb)CD200標的部分を含む融合分子を使用して細胞を標的化することのどちらかによって、癌細胞を直接殺す療法を使用して、癌を処置することに関する。
慢性リンパ球性白血病(CLL)は、白血球の疾患であり、西半球における白血病の最も一般的な形である。CLLは、ゆっくり増殖するが、長い寿命を持つ悪性リンパ球の増殖に関連する疾患の別の群を示す。CLLは、たとえば古典型および混合型のB細胞慢性リンパ球性白血病(B−CLL)、B細胞およびT細胞前リンパ球性白血病、ヘアリー細胞白血病、および大顆粒リンパ球性白血病を含む各種のカテゴリーに分類される。
CLLのすべての異なる種類のうち、B−CLLは全白血病の約30パーセントを占める。50歳を超えた個人でより頻繁に発生するが、より若年者にも次第に見られるようになっている。B−CLLは、形態的に正常であるが、生物学的に未成熟であり、機能損失につながるBリンパ球の蓄積を特徴とする。リンパ球は正常には、感染と戦うように機能する。しかしながらB−CLLでは、リンパ球が血液および骨髄に蓄積して、リンパ節の腫れを引き起こす。正常な骨髄および血液細胞の生成が減少して、患者は重篤な貧血はもちろんのこと、血小板数の減少もしばしば経験する。このことは、生命を脅かす出血の危険および白血液細胞数の減少による深刻な感染の発現をもたらす可能性がある。
1つの実施形態において、EBVによる不死化によって確立されていない悪性起源のCLL細胞株が提供される。細胞株は一次CLL細胞に由来し、ATCCアクセション番号PTA−3920で寄託されている。好ましい実施形態において、細胞株はCLL−AATである。CLL−AATはB−CLL一次細胞に由来するB−CLL細胞株である。
なおさらなる局面において、抗体は、一次CLL細胞、またはそれに由来する抗原を用いて抗体ライブラリーをパニングすることによって産生でき、そしてCLL細胞株、たとえば本明細書で述べるCLL細胞株を使用してさらにスクリーニングおよび/または特徴付けできる。したがって、CLL細胞株への抗体の結合を評価することを含む、CLLに特異性の抗体を特徴付ける方法が提供される。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
癌を処置するための方法であって、
癌に罹患している被験体に対して、
i)CD200とCD200レセプターとの間の相互作用を妨害して、それによりCD200の免疫抑制効果を阻害し、かつ
ii)OX−2/CD200またはOX−2/CD200レセプターに結合する部分を含むポリペプチド融合分子を使用して癌細胞を殺す
治療組成物を投与する工程;
を包含する、方法。
(項目2)
前記治療組成物を投与する工程が、前記被験体に対して、OX−2/CD200に結合する抗体を投与することを包含する、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記治療組成物を投与する工程が、前記被験体に対して、OX−2/CD200に結合するモノクローナル抗体を投与することを包含する、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記治療組成物を投与する工程が、前記被験体に対して、OX−2/CD200レセプターに結合する抗体を投与することを包含する、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記治療組成物を投与する工程が、前記被験体に対して、OX−2/CD200レセプターに結合するモノクローナル抗体を投与することを包含する、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記癌に罹患している被験体が、CLL患者である、項目1に記載の方法。
(項目7)
前記融合分子が、毒素を含む、項目1に記載の方法。
(項目8)
前記融合分子が、高エネルギー放射線エミッターを含む、項目1に記載の方法。
(項目9)
前記融合分子が、細胞傷害性T細胞活性またはNK細胞活性を増強するサイトカインもしくはケモカインを含む、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記融合分子が、T細胞を誘引するケモカインを含む、項目1に記載の方法。
(項目11)
癌を処置するための方法であって、
CD200に結合する抗体を投与する工程;
を包含し、
a)CD200とそのレセプターとの間の相互作用が遮断され、
b)CD200を発現する癌細胞が殺される、
方法。
(項目12)
癌を処置するための方法であって、
CD200に結合する抗体を投与する工程;
を包含し、
a)CD200とそのレセプターとの間の相互作用が遮断され、
b)該癌に対する細胞傷害性T細胞活性またはNK細胞活性が増強される、
方法。
(項目13)
前記細胞傷害性T細胞活性またはNK細胞活性の増強が、IL−2、IL−12、IL−18、IL−13、およびIL−5からなる群より選択されるサイトカインと融合したCD200に結合する抗体によって達成される、項目12に記載の癌を処置するための方法。
(項目14)
癌を処置するための方法であって、
CD200に結合する抗体を投与する工程;
を包含し、
a)CD200とそのレセプターとの間の相互作用が遮断され、
b)T細胞が腫瘍細胞に誘引される、
方法。
(項目15)
T細胞誘引が、MIG、IP−10およびI−TACからなる群より選択されるケモカインと融合したCD200に結合する抗体によって達成される、項目14に記載の癌を処置するための方法。
(項目16)
OX−2/CD200抗原を保持する細胞を標的とする第一の部分と;
細胞の死を促進する第二の部分と;
を含む、融合分子。
(項目17)
前記第一の部分が、OX−2/CD200に結合する抗体を含む、項目16に記載の融合分子。
(項目18)
前記第一の部分が、OX−2/CD200に結合するモノクローナル抗体を含む、項目16に記載の融合分子。
(項目19)
癌を処置するための方法であって、
癌患者に対して、
(i)CD200とCD200レセプターとの間の相互作用を妨害して、それによりCD200の免疫抑制効果を阻害し、かつ
(ii)補体媒介性細胞傷害または抗体依存性細胞傷害によって癌細胞を殺す、
抗体を投与する工程;
を包含する、
方法。
(項目20)
(i)CD200とCD200レセプターとの間の相互作用を妨害して、それによりCD200の免疫抑制効果を阻害し、かつ(ii)補体媒介性細胞傷害または抗体依存性細胞傷害によって癌細胞を殺す、抗体。
(項目21)
項目20に記載の抗体と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、組成物。
(項目22)
前記治療組成物を投与する工程が、配列番号5、12および13からなる群より選択される配列を有する軽鎖CDR1領域を含む抗体を投与することを包含する、項目1に記載の方法。
(項目23)
前記治療組成物を投与する工程が、配列番号21および23からなる群より選択される配列を有する軽鎖CDR2領域を含む抗体を投与することを包含する、項目1に記載の方法。
(項目24)
前記治療組成物を投与する工程が、配列番号29、37および38からなる群より選択される配列を有する軽鎖CDR3領域を含む抗体を投与することを包含する、項目1に記載の方法。
(項目25)
前記治療組成物を投与する工程が、配列番号50、55および56からなる群より選択される配列を有する重鎖CDR1領域を含む抗体を投与することを包含する、項目1に記載の方法。
(項目26)
前記治療組成物を投与する工程が、配列番号69、74および75からなる群より選択される配列を有する重鎖CDR2領域を含む抗体を投与することを包含する、項目1に記載の方法。
(項目27)
前記治療組成物を投与する工程が、配列番号88、93および94からなる群より選択される配列を有する重鎖CDR3領域を含む抗体を投与することを包含する、項目1に記載の方法。
(項目28)
前記第一の部分が、配列番号5、12、13、21、23、29、37、38、50、55、56、69、74、75、88、93および94からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、項目16に記載の融合分子。
(項目29)
前記治療組成物が、ヒト化抗体を含む、項目2〜5のいずれかに記載の方法。
(項目30)
前記治療組成物が、Fv、scFv、Fab’およびF(ab’) 2 を含む、項目2〜5のいずれかに記載の方法。
(項目31)
前記抗体が、ヒト化抗体を含む、項目11〜15のいずれかに記載の方法。
(項目32)
前記抗体が、Fv、scFv、Fab’およびF(ab’) 2 を含む、項目11〜15のいずれかに記載の方法。
(項目33)
前記抗体が、ヒト化抗体を含む、項目17〜18のいずれかに記載の融合分子。
(項目34)
前記抗体が、Fv、scFv、Fab’およびF(ab’) 2 を含む、項目17〜18のいずれかに記載の融合分子。
(項目35)
前記治療組成物が、ヒト化抗体を含む、項目22〜27のいずれかに記載の方法。
(項目36)
前記治療組成物が、Fv、scFv、Fab’およびF(ab’) 2 を含む、項目22〜27のいずれかに記載の方法。
(項目37)
前記抗体が、ヒト化抗体を含む、項目21に記載の組成物。
(項目38)
前記抗体が、Fv、scFv、Fab’およびF(ab’) 2 を含む、項目21に記載の組成物。
(項目39)
前記ポリペプチドが、ヒト化抗体を含む、項目28に記載の融合分子。
(項目40)
前記ポリペプチドが、Fv、scFv、Fab’およびF(ab’) 2 を含む、項目28に記載の融合分子。
(項目41)
配列番号111〜199からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、CD200を発現する細胞に結合する抗体。
(項目42)
配列番号111、114、118、133、136、140、141、149、155、162、163、165、174、181、187、188、189、195および199からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、項目41に記載の抗体。
(項目43)
配列番号200〜211からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、項目41に記載の抗体。
(項目44)
前記抗体が、ヒト化抗体を含む、項目41に記載の抗体。
(項目45)
前記抗体が、Fv、scFv、Fab’およびF(ab’) 2 を含む、項目41に記載の抗体。
(項目46)
癌を処置するための方法であって、
癌に罹患している被験体に対して、CD200を発現する細胞に結合する抗体を含有する治療組成物を投与する工程;
を包含し、該抗体は、1つ以上のTh1サイトカインの生成を促進するのに十分な量で存在する、方法。
(項目47)
前記抗体が、配列番号111〜199からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、項目46に記載の方法。
(項目48)
前記抗体が、配列番号111、114、118、133、136、140、141、149、155、162、163、165、174、181、187、188、189、195および199からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、項目46に記載の方法。
(項目49)
前記抗体が、配列番号200〜211からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、項目46に記載の方法。
(項目50)
前記抗体が、ヒト化抗体を含む、項目46に記載の方法。
(項目51)
前記抗体が、Fv、scFv、Fab’およびF(ab’) 2 を含む、項目46に記載の方法。
(項目52)
前記癌が、CLLである、項目46に記載の方法。
(項目53)
腫瘍細胞を殺すための方法であって、
癌に罹患している被験体に対して、CD200を発現する細胞に結合する抗体を含む治療組成物を投与する工程;
を包含し、該抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を引き起こすのに十分な量で存在する、方法。
(項目54)
前記抗体が、配列番号111〜199からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、項目53に記載の方法。
(項目55)
前記抗体が、配列番号111、114、118、133、136、140、141、149、155、162、163、165、174、181、187、188、189、195および199からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、項目53に記載の方法。
(項目56)
前記抗体が、配列番号200−211からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、項目53に記載の方法。
(項目57)
前記抗体が、ヒト化抗体を含む、項目53に記載の方法。
(項目58)
前記抗体が、Fv、scFv、Fab’およびF(ab’) 2 を含む、項目53に記載の方法。
(項目59)
前記癌が、CLLである、項目53に記載の方法。
(項目60)
OX−2/CD200抗原を保持する細胞を標的とする第一の部分であって、配列番号111〜199からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む第一の部分と;
細胞の死を促進する第二の部分と;
を含む、融合細胞。
(項目61)
前記第一の部分が、配列番号111、114、118、133、136、140、141、149、155、162、163、165、174、181、187、188、189、195および199からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、項目60に記載の融合分子。
(項目62)
前記第一の部分が、配列番号200〜211からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、項目61に記載の融合分子。
(項目63)
配列番号111〜199からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む抗体と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、組成物。
(項目64)
前記抗体が、ヒト化抗体を含む、項目63に記載の組成物。
(項目65)
前記抗体が、Fv、scFv、Fab’およびF(ab’) 2 を含む、項目63に記載の組成物。
(項目66)
癌を処置するための方法であって、
癌に罹患している被験体に対して、CD200を発現する細胞に結合する抗体を含む治療組成物を投与する工程;
を包含し、該抗体は、1つ以上のTh1サイトカインの生成を促進するのに十分な量、かつ補体媒介性細胞傷害または抗体依存性細胞傷害を引き起こすのに十分な量で存在する、方法。
(項目67)
配列番号200〜211からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、CD200を発現する細胞に結合するキメラ抗体。
(項目68)
OX−2/CD200が被験体においてアップレギュレートされるかどうかを判定する工程;および
該被験体に対して、免疫反応を向上させる療法を投与する工程;
を包含する、方法。
(項目69)
前記療法が、OX−2/CD200に結合するかまたはOX−2/CD200レセプターに結合するポリペプチドを投与することを包含し、該ポリペプチドは、OX−2/CD200の免疫抑制効果を阻害するのに十分な量で投与される、項目68に記載の方法。
(項目70)
前記被験体が、癌患者である、項目68に記載の方法。
(項目71)
前記被験体が、CLL患者である、項目68に記載の方法。
(項目72)
前記ポリペプチドが、抗体を含む、項目69に記載の方法。
(項目73)
前記ポリペプチドが、ヒト化抗体を含む、項目69に記載の方法。
(項目74)
前記ポリペプチドが、Fv、scFv、Fab’およびF(ab’) 2 を含む、項目69に記載の方法。
(項目75)
前記OX−2/CD200が被験体においてアップレギュレートされるかどうかを判定する工程が、
癌患者から組織を取得すること;
CD200レベルが、対応する正常組織で見出されたレベルの少なくとも2倍であるかどうかを評価すること;
を包含する、項目68に記載の方法。
(項目76)
血液が、前記癌患者から取得される組織である、項目75に記載の方法。
(項目77)
組織が生検を行うことによって癌患者から取得される、項目75に記載の方法。
(項目78)
CD200レベルが、抗CD200抗体を癌細胞マーカーと組合せて使用するFACS分析を実施することによって評価される、項目75に記載の方法。
(項目79)
前記癌細胞マーカーが、CD38またはCD19である、項目75に記載の方法。
(項目80)
前記患者が、造血癌に罹患している、項目75に記載の方法。
(項目81)
前記患者が、CLLに罹患している、項目75に記載の方法。
(項目82)
前記療法が、OX−2/CD200に結合するかまたはOX−2/CD200レセプターに結合するポリペプチドを投与する前に既存の調節T細胞を排除することを包含し、該ポリペプチドは、OX−2/CD200免疫抑制効果を阻害するのに十分な量で投与される、項目69に記載の方法。
(項目83)
前記療法が、抗CD25抗体およびシクロホスファミドからなる群より選択される試薬の調節T細胞排除量を投与することを包含する、項目82に記載の方法。
(項目84)
前記療法が、骨髄切除療法を投与することをさらに包含する、項目69に記載の方法。
(項目85)
前記療法が、骨髄移植をさらに包含する、項目84に記載の方法。
(項目86)
前記療法が、CLL反応性T細胞の移動をさらに包含する、項目84に記載の方法。
(項目87)
前記療法が、癌ワクチンを投与することをさらに包含する、項目69に記載の方法。
(項目88)
前記癌ワクチンが、CLL細胞を負荷した樹状細胞;CLL細胞を負荷した樹状細胞に由来するタンパク質、ペプチドまたはRNA;患者由来熱ショックタンパク質タンパク質;腫瘍ペプチド;および腫瘍タンパク質;からなる群より選択される、項目87に記載の方法。
(項目89)
前記療法が、免疫賦活化合物の有効免疫刺激量を投与することをさらに包含する、項目69に記載の方法。
(項目90)
前記免疫賦活化合物が、CpG、toll様レセプターアゴニストおよび抗CTLA−4抗体からなる群より選択される、項目89に記載の方法。
(項目91)
前記療法が、抗PDL1抗体、抗PDL1抗体、抗IL−10抗体および抗IL−6抗体からなる群より選択される化合物の有効免疫抑制性遮断量を投与することをさらに包含する、項目69に記載の方法。
(項目92)
前記療法が、T細胞または抗原提示細胞の負の調節を遮断可能な因子の有効量を投与することを包含する、項目69に記載の方法。
(項目93)
前記因子が、抗CTLA4抗体、抗PD−L1抗体、抗PDL−2抗体および抗PD−1抗体からなる群より選択される、項目92に記載の方法。
(項目94)
前記療法が、T細胞の正の副刺激を増強可能な因子の有効量を投与することを包含する、項目69に記載の方法。
(項目95)
前記因子が、抗CD40抗体および抗4−1BB抗体からなる群より選択される、項目94に記載の方法。
(項目96)
前記療法が、癌ワクチンを投与することを包含する、項目69に記載の方法。
(項目97)
前記癌ワクチンが、CLL細胞を負荷した樹状細胞;CLL細胞を負荷した樹状細胞に由来するタンパク質、ペプチドまたはRNA;患者由来熱ショックタンパク質タンパク質;腫瘍ペプチド;および腫瘍タンパク質;からなる群より選択される、項目96に記載の方法。
(項目98)
前記療法が、先天免疫系のレセプターを活性化可能な因子の有効量を投与することを包含する、項目69に記載の方法。
(項目99)
前記因子が、CpG、Luivac、Biostim、Ribominyl、Imudon、Bronchovaxomからなる群より選択される、項目98に記載の方法。
(項目100)
前記療法が、サイトカインの有効な免疫増強量を投与することを包含する、項目69に記載の方法。
(項目101)
前記サイトカインが、IL−2、GM−CSFおよびIFN−γからなる群より選択される、項目100に記載の方法。
(項目102)
治療処置の進行をモニターするための方法であって、
被験体に対して、免疫調節療法を投与する工程;および
該療法の有効性を判定するために、被験体において少なくとも2倍のOX−2/CD200レベルを判定する工程;
を包含する、方法。
(項目103)
前記被験体におけるOX−2/CD200レベルが、前記免疫調節療法の投与前に判定され、次に、該被験体におけるOX−2/CD200レベルが、該療法の少なくとも1回の後に判定される、項目102に記載の方法。
(項目104)
前記免疫調節療法の投薬量または頻度を調整する工程をさらに包含する、項目102に記載の方法。
(項目105)
OX−2/CD200レベルが、OX−2/CD200と相関するマーカーを検出することによって判定される、項目102に記載の方法。
(項目106)
癌細胞によって発現される分子の免疫調節効果を評価するための方法であって、
被験体に対して、癌細胞によって自然に発現された分子、癌細胞およびリンパ球を投与する工程;および
該癌細胞の増殖の速度をモニターする工程;
を包含し、
該癌細胞およびドナーリンパ球のみが投与された場合の増殖速度と比較して、該癌細胞の増殖速度に何らかの変化が観察された場合に、該分子は免疫調節効果を有すると見なされる、方法。
(項目107)
前記癌細胞およびドナーリンパ球のみが投与された場合の増殖速度と比較して該癌細胞の増殖の速度の低下が観察される場合に、前記分子は、免疫増強性であると見なされる、項目106に記載の方法。
(項目108)
前記癌細胞およびドナーリンパ球のみが投与された場合の増殖速度と比較して該癌細胞のより高い増殖速度が観察される場合に、前記分子は、免疫抑制性であると見なされる、項目106に記載の方法。
(項目109)
前記癌細胞によって自然に発現される分子が、該化合物を自然に発現する細胞を注射することによって投与される、項目106に記載の方法。
(項目110)
前記癌細胞によって自然に発現される分子が、該分子を発現するように操作された細胞を注射することによって投与される、項目106に記載の方法。
(項目111)
前記癌細胞によって発現される分子をデータベースから同定する工程をさらに包含する、項目106に記載の方法。
(項目112)
前記癌細胞によって発現される分子を実験的に同定する工程をさらに包含する、項目106に記載の方法。
(項目113)
前記リンパ球が、ヒトである、項目106に記載の方法。
(項目114)
前記ヒトリンパ球が、末梢血リンパ球(PBL)、T細胞、B細胞、および樹状細胞からなる群より選択される、項目113に記載の方法。
(項目115)
前記リンパ球が、ヒト末梢血リンパ球(PBL)である、項目106に記載の方法。
(項目116)
前記投与されるリンパ球の数が、癌細胞の増殖速度を低下させるのには不十分である、項目106に記載の方法。
(項目117)
前記投与されるリンパ球の数が、投与される癌細胞の数よりも少ない、項目106に記載の方法。
(項目118)
前記投与されるリンパ球の数が、約100万細胞〜約200万細胞である、項目106に記載の方法。
(項目119)
前記投与されるリンパ球の数が、癌細胞の増殖速度を低下させるのに十分である、項目106に記載の方法。
(項目120)
前記投与されるリンパ球の数が、投与される癌細胞の数以上である、項目106に記載の方法。
(項目121)
前記投与されるリンパ球の数が、約500万細胞〜約1,000万細胞である、項目106に記載の方法。
(項目122)
前記癌細胞の投与が、RAJIおよびNamalwaからなる群より選択される少なくとも1つのリンパ腫細胞株を前記被験体に対して注射することを包含する、項目106に記載の方法。
(項目123)
前記被験体が、免疫不全マウスである、項目106に記載の方法。
(項目124)
前記投与されるリンパ球の数が、前記癌細胞の増殖を減速するのに十分であり、前記癌細胞により発現される分子は、前記癌細胞およびリンパ球のみが投与された場合の増殖速度と比較して観察される癌細胞の増殖速度が高い場合に、免疫抑制性であると見なされる、項目106に記載の方法。
(項目125)
前記投与されるリンパ球の数が、癌細胞の増殖を減速するのに不十分であり、前記癌細胞によって発現される分子は、前記癌細胞およびリンパ球のみが投与された場合の増殖速度と比較して観察される癌細胞の増殖速度が低い場合に、免疫増強性であると見なされる、項目106に記載の方法。
(項目126)
リンパ球および癌細胞のみを対照被験体に投与することによって、前記癌細胞の増殖速度を判定する工程;
をさらに包含する、項目106に記載の方法。
(項目127)
前記癌細胞によって発現される分子を投与する前に、リンパ球および癌細胞のみを前記被験体に対して投与することによって、前記癌細胞の増殖速度を判定する工程;
をさらに包含する、項目106に記載の方法。
(項目128)
化合物の免疫調節効果を評価するための方法であって、
被験体に対して、評価される化合物、癌細胞およびリンパ球を投与する工程;および
前記癌細胞の増殖の速度をモニターする工程;
を包含し、
該癌細胞およびドナーリンパ球のみが投与された場合の増殖速度と比較して、該癌細胞の増殖速度に何らかの変化が観察された場合に、該化合物は、免疫調節効果を有すると見なされる、方法。
(項目129)
前記癌細胞およびドナーリンパ球のみが投与された場合の増殖速度と比較して前記癌細胞の増殖の速度の低下が観察される場合に、前記化合物は、免疫増強性であると見なされる、項目128に記載の方法。
(項目130)
前記化合物の存在下での前記癌細胞の増殖速度が、前記癌細胞およびドナーリンパ球のみが投与される場合の増殖速度よりも高い場合に、該化合物は、免疫抑制性であると見なされる、項目128に記載の方法。
(項目131)
前記評価される化合物が、抗体である、項目128に記載の方法。
(項目132)
前記癌細胞の投与が、前記被験体に対して、RAJIおよびNamalwaからなる群より選択される少なくとも1つのリンパ腫細胞株を注射することを包含する、項目128に記載の方法。
(項目133)
前記投与される癌細胞が、免疫抑制分子を発現する、項目128に記載の方法。
(項目134)
前記投与される癌細胞が、CD200を発現する、項目128に記載の方法。
(項目135)
CD200の発現が、前記投与される癌細胞によってアップレギュレートされる、項目128に記載の方法。
(項目136)
前記リンパ球が、ヒトである、項目128に記載の方法。
(項目137)
前記ヒトリンパ球が、末梢血リンパ球(PBL)、T細胞、B細胞、および樹状細胞からなる群より選択される、項目136に記載の方法。
(項目138)
前記リンパ球が、ヒト末梢血リンパ球(PBL)である、項目128に記載の方法。
(項目139)
前記投与されるヒトPBLの数が、投与される癌細胞の数よりも少ない、項目138に記載の方法。
(項目140)
前記投与されるヒトPBLの数が、約100万細胞〜約200万細胞である、項目138に記載の方法。
(項目141)
前記投与されるヒトPBLの数が、投与される癌細胞の数以上である、項目138に記載の方法。
(項目142)
前記投与されるヒトPBLの数が、約500万細胞〜約1,000万細胞である、項目138に記載の方法。
(項目143)
前記被験体が、免疫不全マウスである、項目128に記載の方法。
(項目144)
前記投与されるリンパ球の数が、前記癌細胞のみと投与された場合に該癌細胞の増殖速度を減速するのに十分であり、前記化合物は、該化合物の存在下での該癌細胞の増殖速度が、前記癌細胞およびドナーリンパ球のみが投与された場合の増殖速度よりも大きい場合に、免疫抑制性であると見なされる、項目128に記載の方法。
(項目145)
前記投与されるリンパ球の数が、前記癌細胞のみと投与された場合に該癌細胞の増殖速度を減速するのには不十分であり、前記化合物は、前記癌細胞およびドナーリンパ球のみが投与された場合の増殖速度と比較して該癌細胞の増殖の速度の低下が観察される場合に、免疫増強性であると見なされる、項目128に記載の方法。
(項目146)
化合物の免疫調節効果を評価するための方法であって、
評価される化合物、癌細胞および約2×10 6 個未満のリンパ球を、被験体に対して投与する工程;および
該癌細胞の増殖の速度をモニターする工程;
を包含し、
該癌細胞およびドナーリンパ球のみが投与された場合の増殖速度と比較して該癌細胞の増殖の速度の低下が観察される場合に、該化合物は、免疫増強性であると見なされる、方法。
(項目147)
前記投与される癌細胞が、免疫抑制分子を発現する、項目146に記載の方法。
(項目148)
前記投与される癌細胞が、CD200を発現する、項目146に記載の方法。
(項目149)
CD200の発現が、前記投与される癌細胞によってアップレギュレートされる、項目146に記載の方法。
(項目150)
化合物の免疫調節効果を評価するための方法であって、
評価される化合物、癌細胞および約5×10 6 個のリンパ球を被験体に対して投与する工程;および
該癌細胞の増殖の速度をモニターする工程;
を包含し、
該化合物の存在下での該癌細胞の増殖の速度が、該癌細胞およびドナーリンパ球のみが投与される場合の増殖速度よりも高い場合に、該化合物は、免疫抑制性であると見なされる、方法。
(項目151)
前記投与される癌細胞が、免疫抑制分子を発現する、項目150に記載の方法。
(項目152)
前記投与される癌細胞が、CD200を発現する、項目150に記載の方法。
(項目153)
CD200の発現が、前記投与される癌細胞によってアップレギュレートされる、項目150に記載の方法。
本開示により、OX−2/CD200が被験体においてアップレギュレートされるかどうかを判定して、そうならば被験体に免疫反応を増強する療法を投与するための方法を提供する。適切な免疫調節療法の説明例は、T細胞または抗原提示細胞の負の調節を遮断する因子(たとえば抗CTLA4抗体、抗PD−L1抗体、抗PDL−2抗体、抗PD−1抗体など)の投与、あるいはT細胞の正の副刺激を増強する因子(たとえば抗CD40抗体または抗4−1BB抗体)の投与、あるいNK細胞数またはT細胞活性を増加させる因子(たとえば単独の、あるいはIMiD、サリドマイド、またはサリドマイド類似物質などのインヒビタと組合された、抗CD200抗体)の投与を含む。さらに免疫調節療法は、癌ワクチン、たとえば腫瘍細胞、腫瘍RNAまたは腫瘍DNAを負荷(load)した樹状細胞、腫瘍タンパク質または腫瘍ペプチド、患者由来熱ショックタンパク質(hsp)あるいはCpG、Luivac、Biostim、Ribominyl、Imudon、Bronchovaxomなどの免疫系を各種のレベルで刺激する一般的なアジュバントあるいは先天免疫系のレセプター(たとえばtoll様レセプター)を活性化する他の任意の化合物でありうる。また免疫調節療法は、IL−2、GM−CSFおよびIFN−γなどのサイトカインによる処置を含むことができる。
細胞株は、当業者に公知の確立された方法に従って生成できる。一般に細胞株は、患者に由来する一次細胞を、培養物中に不死化細胞が自発的に産生されるまで培養することによって生成される。これらの細胞を次に単離して、さらに培養してアポトーシスに対して耐性を示すクローン細胞個体群または細胞を生成する。
組換えDNA技術は、本開示によって生成された抗体を改良するために使用できる。それゆえキメラ抗体は、診断または治療用途においてその免疫原性を低下させるために構成できる。さらに免疫原性は、CDRグラフト、そして場合によりフレームワーク修飾によって抗体をヒト化することによって最小限にできる。その内容が参考として本明細書中に援用されるU.S.Patent No.5,225,539を参照。
and Lane,Antibodies:a Laboratory Manual,(1988)Cold Spring Harborで議論されている。組換え抗体分子の調製技法は、上の参考文献に、またたとえばWO97/08320;U.S.Patent No.5,427,908;U.S.Patent No.5,508,717;Smith,1985,Science,Vol.225,pp 1315−1317;Parmley and Smith,1988,Gene 73,pp 305−318;De La Cruz et al.,1988,Journal of Biological Chemistry,263 pp 4318−4322;U.S.Patent No.5,403,484;U.S.Patent No.5223409;WO88/06630;WO92/15679;U.S.Patent No.5780279;U.S.Patent No.5571698;U.S.Patent No.6040136;Davis et al.,1999,Cancer Metastasis Rev.,18(4):421−5;Taylor,et al.,Nucleic Acids Research 20(1992):6287−6295;Tomizuka et al.,Proc.Natl.Academy of Sciences USA 97(2)(2000):722−727にも述べられている。これらのすべての参考文献の内容は、参考として本明細書中に援用される。
本抗体/ポリペプチドの使用
本明細書で利用するポリペプチドおよび/または抗体は、特に診断および治療用途のために示されている。
as Radiopharmaceuticals for the Localization of Human Carcinoma Xenografts in Athymic Mice”,Meth.Enzymol.121:802−816(1986)も参照。
in Antibody Imaging”,Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy,R.W.Baldwin et al.,(eds.),pp.65−85(Academic
Press 1985)を参照。あるいは、Brookhaven National
Laboratoryに配置されているPet VIと呼ばれるような陽電子放出横断断層撮影スキャナを放射性標識が陽電子(たとえば11C、18F、15O、および13N)を放出するところで使用できる。
the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy”,Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy,R.W.Baldwin et al.(eds.),pp 303−316(Academic Press 1985)を参照。他の適切な放射性同位体は、α−エミッター、たとえば212Bi、213Bi、および211At、ならびにβ−エミッター、たとえば186Reおよび90Yを含む。
CLL細胞株は、CLL、癌、およびOX−2/CD200のアップレギュレートされたレベルを特徴とする他の疾患状態、たとえばメラノーマの診断および処置を開発するための重要なツールを提供するため、その開発には多くの利点がある。
I.Su et al.,“Molecular Classification of Human Carcinomas by Use of Gene Expression Signatures.”Cancer Research 61:7388−7393,2001)、およびリンパ腫/白血病分子プロファイリングプロジェクト(http://llmpp.nih.gov/lymphoma/)(Alizadeh
et al.,Nature 403:503−11,2000)を含む。
(細胞株CLL−AATの単離)
(細胞株の確立)
CLLと診断された患者から末梢血を採取した。WBCカウントは1.6×108/mlであった。単核細胞をHistopaque−1077密度勾配遠心分離(Sigma
Diagnostics,セントルイス、ミズーリ州)によって単離した。細胞を10%熱不活性化ウシ胎仔血清(FBS)を添加したイスコーブ変法ダルベッコ培地(IMDM)で2回洗浄して、氷冷IMDM/10% FBS 5ml中で再懸濁させた。トリパンブルーで染色することによって生細胞をカウントした。細胞を同じ体積の85% FBS/15% DMSOと混合して、貯蔵するために液体窒素中で1mlの分割量として凍結させた。
フローサイトメトリーによる細胞株の免疫表現型検査は、IgM、カッパ軽鎖、CD23、CD38、およびCD138の高い発現、CD19およびCD20の中程度の発現、そしてIgDおよびCD5の弱い発現を示した。細胞株はラムダ軽鎖、CD4、CD8、およびCD10に対して陰性であった。
細胞株の免疫表現型検査も、全細胞ELISAによって、一次B−CLL細胞への特異性結合のために選択されたウサギscFv抗体のパネルを使用して実施した。これらのCLL特異性scFv抗体はすべて、CLL−AAT細胞株も認識した。これに対して、scFvの大多数は、B細胞リンパ腫に由来する2つの細胞株:バーキットリンパ腫細胞株のRamos、および非ホジキンリンパ腫細胞株のRLに結合しなかった。
(抗体ファージ提示および細胞表面パニングを使用する、B−CLL特異性細胞表面抗原に対するscFv抗体の選択)
(免疫化およびscFv抗体ライブラリー構成)
末梢血単核細胞(PBMC)をScripps Clinic(ラホーヤ、カリフォルニア州)にてCLL患者から採取した血液から単離した。ウサギ2匹をCLLの異なるドナー10名からプールしたPBMC 2×107個によって免疫化した。3回の免疫化、すなわち2回の皮下注射と、それに続く1回の静脈内注射を3週間の間隔で実施した。血清力価は、フローサイトメトリーを使用して血清IgGの一次CLL細胞への結合を測定することによって確認した。最後の免疫化の5日後に、該動物から脾臓、骨髄、およびPBMCを採取した。Tri−Reagent(Molecular Research Center,Inc)を使用して、全RNAをこれらの組織から単離した。単鎖Fv(scFv)抗体ファージ提示ライブラリーを前に述べたように構成した(Barbas et al.,(2001)Phage Display:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州)。細胞表面パニングでは、再増幅ライブラリーからのファージミド粒子をポリエチレングリコー(PEG)によって沈降させ、1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含有するリン酸緩衝食塩水(PBS)で再懸濁させて、PBSで一晩透析した。
ライブラリーは、Siegelら(1997,J.Immunol.Methods 206:73−85)によって述べられているように、磁気活性化細胞分離装置(MACS)を用いた正負の選択によりCLL細胞表面特異性抗体について濃縮した。簡潔には、scFv抗体ライブラリーからのファージミド粒子をMPBS(2%脱脂粉乳、PBS中0.02%アジ化ナトリウムPBS、pH7.4)中で1時間、25℃にてプレインキュベートして、非特異性結合部位を遮断した。一次CLL細胞約107個を常磁性マイクロビーズ(Miltenyi Biotec,サニーベール、カリフォルニア州)に結合したマウス抗CD5 IgGおよびマウス抗CD19 IgGで標識した。未結合マイクロビーズを洗浄によって除去した。標識CLL細胞(「標的細胞」)を過剰な「抗原−負のアブゾーバ細胞」と混合して、ペレット化して、ファージ粒子50μl(cfu 1010〜1011cfu)中へ再懸濁させた。アブゾーバ細胞は、細胞表面に非特異的に付着するファージはもちろんのこと、標的およびアブゾーバ細胞の両方に存在する「共通」抗原に対して特異性のファージも吸収するように作用する。使用したアブゾーバ細胞は、免疫磁気的負の選択(StemSep system,StemCell Technologies,バンクーバー、カナダ)によって末梢血から単離されたTF−1細胞(ヒト赤白血病細胞株)または正常ヒトB細胞のどちらかであった。アブゾーバ細胞の標的細胞に対する比は体積で約10倍であった。25℃での30分間のインキュベーションの後、細胞/ファージ混合物をMiniMACS MS+分離カラムに移した。カラムをMPBS 0.5mlで2回、そしてPBSで1回洗浄して、未結合ファージおよびアブゾーバ細胞を除去した。標的細胞をPBS 1ml中でカラムから溶出させて、最高速度の微量遠心機で15秒間に渡ってペレット化した。捕獲されたファージ粒子は、酸溶出緩衝液(グリシンによってpHを2.2に調整した0.1N HCl、および1mg/ml BSA)200μl中で標的細胞を再懸濁させることによって溶出させた。25℃での10分間のインキュベーションの後、緩衝液を2M Tris塩基、pH10.5 12μLによって中和して、溶出したファージを次回のパニングの間に、E.coli中で増幅した。各回のパニングでは、インプットおよびアウトプットファージ力価を決定した。インプット力価は、標的細胞/アブゾーバ細胞混合物に添加した再増幅ファージ粒子の数であり、アウトプット力価は、標的細胞から溶出した捕獲ファージの数である。濃縮因子(E)は、式E=(Rnアウトプット/Rnインプット)/(R1アウトプット/R1インプット)、式中、R1=1回およびRn=2、3、または4回を使用して計算する。大半の場合、102〜103倍の濃縮因子は、3回目または4回目に達成されるはずである。
3〜5回のパニングの後、捕獲ファージのプールをCLL細胞への結合について、フローサイトメトリーおよび/または全細胞ELISAによってアッセイした:
1.HA−tagged溶解性抗体の形で全体のプールを生成するために、非サプレッサ系のE.coli(たとえばTOP10F’)2mlにファージミド粒子1μl(cfu 109〜1010)を感染させた。元のパニングされていないライブラリーを負の対照として使用した。カルベニシリンを最終濃度10μMまで添加して、培養物を37℃にて250rpmで振とうしながら1時間インキュベートした。50μg/mlカルベニシリンを含有するSB培地8mlを添加して、培養物を〜0.8のOD 600まで培養した。IPTGを最終濃度1mMまで添加して、LacプロモータからscFv発現を誘発して、37℃での振とうを4時間継続した。培養物を3000xgにて15分間遠心分離にかけた。溶解性抗体を含有する上澄みを濾過して、−20℃にて1mlの分割量で貯蔵した。
パニング後に個別scFvクローンをスクリーニングするために、TOP10F’細胞にファージプールを上述のように感染させて、カルベニシリンおよびテトラサイクリンを含有するLBプレートに散布して、37℃にて一晩インキュベートした。個別のコロニーを、ウェル当たりSB−カルベニシリン培地を0.6〜1.0ml含有する深96ウェルプレートへ接種した。培養物をHiGro振とうインキュベータ(GeneMachines,サンカルロス、カリフォルニア州)で520rpmおよび37℃にて6〜8時間培養した。この時点で、各ウェルから90μlの分割量をDMSO 10μlを含有する深96ウェルプレートに移した。この複製プレートを−80℃にて貯蔵した。元のプレートにIPTGを最終濃度1mMまで添加して、振とうを3時間継続した。プレートを3000xgにて15分間遠心分離にかけた。溶解性scFv抗体を含有する上澄みを別の深96ウェルプレートに移して、−20℃にて貯蔵した。
1.ELISAプレートをコンカナバリンA(0.1M NaHCO3、pH8.6、0.1mM CaCl2中10mg/ml)でコーティングする。
複数のscFv抗体の結合特異性を3色フローサイトメトリーによって分析した(図7)。正常ドナーから単離したPBMCをFITC結合抗CD5およびPerCP結合抗CD19によって染色した。scFv抗体による染色は、ビオチン結合抗HAを二次抗体として、そしてPE結合ストレプトアビジンを使用して行った。3つの抗体、すなわちscFv−2、scFv−3、およびscFv−6は、CD19+Bリンパ球個体群を特異的に認識することが見出された(データは示さず)。第4の抗体scFv−9は、2つの別個の細胞個体群:CD19+Bリンパ球およびCD5+Tリンパ球のサブセットを認識した(図7)。T細胞サブセットのさらなる特徴付けは、それがCD4+CD8−TH細胞のサブ個体群であることを示した(データは示さず)。
これらの抗体に対する抗原を同定するために、scFvを使用して、細胞表面ビオチン化CLL−AAT細胞のミクロソーム画分から調製した溶解物から抗原を免疫沈降させた(図12)。免疫沈降された抗原をSDS−PAGEによって精製して、マトリックス支援レーザーイオン化質量分光分析(MALDI−MS)または毛細管逆相HPLCナノ電子スプレータンデム質量分光分析(μLC/MS/MS)によって同定した(データは示さず)。scFv−2は、110kd抗原をRLおよびCLL−AAT細胞の両方から免疫沈降させた(図12)。この抗原をMALDI−MSによってB細胞特異性マーカーCD19として同定した。scFv−3およびscFv−6はどちらも、45kd抗原をCLL−AAT細胞から免疫沈降させた(示さず)。この抗原はMALDI−MSによって、CLLおよび活性化B細胞の公知のマーカーであるCD23として同定された。scFv−9は、50kd抗原をCLL−AAT細胞から免疫沈降させた(図12)。この抗原はμLC/MS/MSによって、B細胞、活性化CD4+T細胞、および胸腺細胞の公知のマーカーであるOX−2/CD200として同定された。OX−2/CD200は、一部の非リンパ球細胞、たとえばニューロンおよび内皮細胞でも発現される。
OX−2/CD200を発現する細胞が、サイトカイン反応をTh1反応(IL−2、IFN−γ)からTh2反応(IL−4、IL−10)に変化させる能力を、ドナー1名からの単球由来マクロファージ/樹状細胞および別のドナーからの血液由来T細胞を用いた混合リンパ球反応にて評価した。OX−2/CD200発現細胞源として、以下で述べるOX−2/CD200トランスフェクションEBNA細胞またはCLL患者サンプルのどちらかを使用した。
293−EBNA細胞(Invitrogen)を100mm皿に2.5×106個にて播種した。24時間後、Polyfect試薬(QIAGEN)をメーカーの説明書に従って使用して、細胞を一過性トランスフェクションした。細胞を、ベクターpCEP4(Invitrogen)中のOX−2/CD200 cDNA 7.2μgおよびpAdVAntageベクター(Promega)0.8μgと同時トランスフェクションした。負の対照として、空のpCEP4ベクターおよびpAdVAntageと同時トランスフェクションした。トランスフェクションの48時間後、scFv−9抗体を用いたフローサイトメトリーで決定されたように、細胞の約90%がOX−2/CD200をその表面で発現した。
軟膜をSan Diego Blood Bankから取得し、Ficollを使用して一次血液リンパ球(PBL)を単離した。2%ヒト血清を含有するイーグル最小必須培地(EMEM)中で細胞を1時間に渡って付着させ、続いてPBSによって激しく洗浄した。細胞をGM−CSF、IL−4およびIFN−γまたはM−CSFのいずれかの存在下で、3日後にリポポリサッカライド(LPS)を添加して、または添加せずに5日間培養した。成熟した細胞を収集して、γ−照射器(Shepherd Mark I Model 30照射器(Cs137))を使用して2000RADを照射した。
混合リンパ球反応は、24ウェルプレートに樹状細胞/マクロファージ500,000およびレスポンダ細胞1×106個を使用して構成した。レスポンダ細胞は、Ficollを使用して末梢血から精製したT細胞濃縮リンパ球であった。T細胞は、細胞を組織培養フラスコ内で1時間インキュベートして、非付着性細胞画分を取ることによって濃縮した。OX−2/CD200トランスフェクションEBNA細胞またはCLL細胞500,000個を抗CD200抗体(完全IgGに変換されたscFv−9)30μg/mlの存在下または非存在下で、リンパ球添加の2〜4時間前にマクロファージ/樹状細胞に添加した。上澄みを48時間および68時間後に採取して、サイトカインの存在について分析した。
scFv−9の軽鎖および重鎖V遺伝子をオーバーラップPCRによって、各遺伝子の可変領域をヒトラムダ軽鎖定常領域遺伝子、およびヒトIgG1重鎖定常領域CH1遺伝子とそれぞれ連結するプライマーを用いて増幅した。scFv−9の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子の可変領域は、特異性プライマーによって増幅して、ヒトラムダ軽鎖定常領域遺伝子およびIgG1重鎖定常領域CH1遺伝子は以下のような特異性プライマーによって個別に増幅した:
完全IgGに変換されたscFv−9の、混合リンパ球反応におけるサイトカインプロフィールに対する効果を判定した。
抗CD200の腫瘍拒絶に対する効果を試験するための動物モデル
RAJIリンパ腫の腫瘍増殖がPBLの同時注射によって防止されるモデルを確立した。NOD/SCIDマウスにRAJI細胞4×106個、異なるドナーからのヒトPBL
1×106、5×106または10×106細胞の存在下または非存在下のどちらかで皮下注射した。腫瘍の長さおよび幅はもちろんのこと、体重も週に3回測定した。すべての群の腫瘍体積の平均+/−SDを図17AおよびBに示す。2つのパラメトリック検定(Student t検定およびWelchの検定)および1つのノンパラメトリック検定(Wilcox検定)を使用して、統計分析を実施した。統計分析の結果は図18に見出される。RAJI細胞は許容される変動の皮下腫瘍を形成する。拒絶は、特定のドナーおよびPBL細胞数に依存する。PBL 1×106個は腫瘍増殖を防止するには不十分であった。第22〜43日がPBL 5×106個のドナー2および第36日から開始するPBL 5×106または1×107個のドナー3は、腫瘍増殖を著しく低減した。ドナー4は、第48日以降はほとんど有意である。
(ライブラリー構成)
マウスは、マウスIgG Fcに融合されたバキュロウイルス発現組換えCD200細胞外ドメイン(CD200−Fc)(Orbigen Inc.,サンディエゴ、カリフォルニア州)および全長CD200を含有するベクターを一過性トランスフェクションされた293−EBNA細胞によって交互に免疫化した。全RNAは、マウス脾臓からTRI試薬(Molecular Research Center,Inc.,シンシナティ、オハイオ州)をメーカーのプロトコルに従って使用して調製した。メッセンジャRNA(mRNA)は、Oligotex(QIAGEN Inc.,バレンシア、カリフォルニア州)をメーカーのマニュアルに従って使用して精製した。第1鎖cDNAはSuperScript II RTase(Invitrogen Life Technologies,カールスバッド、カリフォルニア州)をメーカーのプロトコルに従って使用して合成した。第1鎖cDNAを制限エンドヌクレアーゼによって消化して、第2鎖cDNAを、2003年3月27日に公開された、公開PCT application WO03/025202A2で十分に説明されている方法に従って合成した。第2鎖cDNAをPCR精製キット(QIAGEN)によって浄化して、シングルプライマー増幅を2003年3月27日に公開された、公開PCT application WO03/025202A2に述べられている方法に従って実施した。増幅生成物をプールして、PCR精製キットによって精製した。カッパ軽鎖をXba IおよびBspE Iで消化して、IgG1およびIgG2a重鎖をXho IおよびBin Iによって消化した。消化した断片はゲル抽出キット(QIAGEN)を用いてアガロースゲルから精製して、2004年9月16日に公開された公開PCT application WO/04078937A2で述べられているように、PAX313m/hGベクター内へクローニングした。
ライブラリー(IgG1カッパおよびIgG2aカッパ)は、マイクロタイター(Costar Group,ベテスダ、メリーランド州)に直接コーティングされた、またはヤギ抗マウスIgG Fc特異性抗体(Sigma−Aldrich Corp.,セントルイス、ミズーリ州)によって捕獲されたいずれかのCD200−Fcにパニングした。ライブラリーファージの調製では、エレクトロコンピテントXL1−Blue細胞(Stratagene、ラホーヤ、カリフォルニア州)をライブラリーDNAによって電気穿孔して、SOC培地中で1時間、そしてSB培地中で2時間、カルベニシリンを用いて培養した。ファージ生成は、VCS M13ヘルパーファージ(Amersham Biosciences Corp.,ピスカタウェイ、ニュージャージー州)および1mM
IPTGの添加により、30℃にて一晩に渡って誘発させた。培養物を遠沈させて、ファージを4%ポリエチレングリコールおよび3% NaClによって沈降させた。ファージを遠沈させて、関係のない抗原である、マウスIgG Fcに融合されたバキュロウイルス発現細胞外ドメイン(FLJ32028−Fc)であるFLJ32028(Orbigen,サンディエゴ)を溶解性競合物として含有する、1% BSA/PBSに再懸濁させた。直接コーティングしたCD200−Fcに対するパニングでは、4つのウェルをCD200−Fc(0.1M NaHCO3 pH8.6の5μg/ml)100μlによって4℃にて一晩コーティングした。ウェルをリン酸塩緩衝食塩水(PBS)、pH7.0で5回洗浄して、1%ウシ血清アルブミン(BSA)/PBSによって37℃にて1時間に渡って遮断した。ヤギ抗マウスIgG Fcに捕獲されたCD200−Fcに対するパニングでは、4つのマイクロタイターウェルをヤギ抗マウスIgG Fc 100μl(PBS中20μg/ml)によって4℃にて一晩コーティングした。ウェルをPBSによって5回洗浄して、CD200−Fc(PBS中の20μg/ml)100μlによって37℃にて1時間に渡ってインキュベートした。ウェルをPBSによって5回洗浄して、1% BSA/PBSによって37℃にて1時間に渡って遮断した。パニングの直接コーティングおよび捕獲方法では、ブロッカーは別のライブラリー(その開示全体が参考として本明細書中に援用される、2004年6月2日に提出されたPCT application serial No.PCT/US04/17118(未公開)の実施例3に述べたライブラリー)のFLJ32028に対するパニングから得られた溶解性Fabの混合物によって置換されて、マウスIgG Fcのエピトープをマスクして、ウェルを37℃にて30分間インキュベートした。これらのマスキングFabは、CD200−Fcにも結合することが示されている。ライブラリーファージをマスキングFabの上部に添加して、ウェルを37℃にて約1.5時間インキュベートした。未結合ファージをPBSによって厳密性を増強しながら洗浄して(1回目は3回、2回目は5回、3回目および4回目は10回)、各洗浄のたびに5分間のインキュベーションならびにピペットによる出し入れ5回を行った。結合ファージは、1mg/ml BSAを含む0.1M HCl
100μl、pH2.2によって2回溶出させ、2M Tris塩基、pH11.5で中和した。新しく培養したER2738細胞を溶出させたファージによって感染させて、カルベニシリンおよびグルコースを含有するLBアガロースプレート上へ滴定した。次回のパニングのために、残りのファージをVCS M13ヘルパーファージおよび1mM IPTGの添加によって30〜37℃にて一晩増殖させる。
3および4回目の滴定プレートからの95コロニーを12.5μg/mlテトラサイクリンおよび50μg/mlカルベニシリンを含有するSB 1ml中で37℃にて約6時間培養した。VCS M13ヘルパーファージを添加して、培養物を37℃にて2時間インキュベートした。1mM IPTGおよび70μg/mlカナマイシンを添加して、Fab−ファージ生成を30℃にて一晩誘発した。マイクロタイターウェルをウサギ抗マウスIgG F(ab’)2(PBS中4μg/ml)50μl、CD200−Fc(0.1M NaHCO3中4μg/ml、pH8.6)、またはFLJ32028−Fc(0.1M NaHCO3中4μg/ml、pH8.6)によって4℃にて一晩コーティングした。ウェルをPBSによって3回洗浄して、1% BSA/PBS 100μlによって37℃にて1時間遮断した。培養物を遠沈させた。Fab−ファージを含有する培養物上澄みとブロッカーを交換して、ウェルを37℃にて1.5〜2時間インキュベートした。残りのFab−ファージは、フローサイトメトリーのために−80℃にて貯蔵した。プレートをPBSで3回洗浄して、アルカリホスファターゼ(AP)結合ヤギ抗マウスIgGF(ab’)2抗体50μl(Pierce)(1% BSA/PBS中1:500)によって37℃にて1時間に渡って検出した。プレートをPBSによって3回洗浄して、AP基質(Sigma−Aldrich)によってpNPP緩衝液中で展開した。3回目からのクローンのほぼすべてがすでに、CD200に対して特異的に陽性である(図19A〜D)。クローンを高スループットフローサイトメトリー分析によってもスクリーニングした。CD200(1×105細胞)を含む293細胞一過性トランスフェクション100マイクロリットルを96ウェルプレート(Costar)に分割した。Fab−ファージ50マイクロリットルを細胞に添加して、ピペット操作によって混合して、氷上で30分間インキュベートした。細胞を0.01% NaN3を含有する1% BSA/PBSによって2回洗浄した。細胞を0.01% NaN3を含有する1% BSA/PBS中のPE結合ヤギ抗マウスIgG抗体100μl(Sigma−Aldrich)中に再懸濁させて、氷上で30分間インキュベートした。細胞を0.01% NaN3を含有する1% BSA/PBSによって2回洗浄して、PBS中1%パラホルムアルデヒド200μlに再懸濁させた。CD200発現細胞への陽性結合を示す代表的なクローンを図20A〜Dに示す。
さらなる分析のために23個のクローンを選択した。それらはcG2aR3B5、dG1R3A5、cG2aR3A2、dG2aR3B2、dG1R3A1、cG2aR3Al、cG2aR3B、dG1R3B、cG1R3A、cG1R3A、cG1R3A1、dG1R3B、dG1R3B、cG1R3C、dG2aR3C、dG2aR3A1、cG2aR3B、cG2aR3B、dG1R3B、cG2aR3B、cG2aR3C、dG1R3H、およびdG2aR3A6であった。選択したFabのDNAをSpe I/Nhe Iによって、遺伝子III除去および溶解性Fab発現および精製のために消化した。精製したFabは、CD200とそのレセプター(CD200R)との間の相互作用を遮断するその能力について蛍光ビーズアッセイで評価した。TransFluoSpheresカルボキシラート修飾ミクロスフェア(488/645)(Molecular Probes Invitrogen Detection Technologies,ユージーン、オレゴン州)にストレプトアビジンを、続いてビオチン標識抗ヒトFc抗体および暴露ウイルス生成CD200−Fcタンパク質ををコーティングした。293個の細胞にCD200Rを一過性トランスフェクションした。細胞表面発現をFACS分析によって確認した。CD200コーティングビーズ100万個を各種の量の抗CD200FabまたはキメラIgGによって10分間プレインキュベートしてから、CD200Rトランスフェクション細胞50,000個を添加した。37℃でのインキュベーションの30分後、1% BSAを含有するTris緩衝液によって細胞を洗浄して、FACS Caliburを使用して分析した。Fabのc1A10、c2aB7、およびd1A5は、Fab 6.7μg/mlにてCD200およびCD200Rの相互作用の最善の遮断を示した(図22)。これらのクローンは、図21Aおよび/またはBにおいてそれぞれcG1R3A10、cG2aR3B7およびdG1R3A5と呼ばれる。
キメラ化およびIgG変換のために6つの抗体を選択した(図23を参照)。それらはc1A10(cG1R3A10)、c2aA10(cG2aR3A10)、c2aB7(cG2aR3B7)、d1A5(dG1R3A5)、d1B5(dG1R3B5)、およびd1B10(dG1R3B10)であった。キメラ化のために、オーバーラップPCRを実施して、マウスカッパ鎖可変領域およびヒトカッパ鎖定常領域を連結した。マウス重鎖可変領域をクローニングのために、部分ヒトIgG1定常領域およびApa I部位を含有する3’プライマーによって増幅した。増幅されたカッパ鎖断片および重鎖断片を、カッパ軽鎖ではXba I/Not Iに、重鎖断片ではXho I/Apa IにヒトIgG1定常領域を含有するPAX243hGKベクター内へクローニングした(公開されたInternational Application WO 2004/078937を参照)。キメラFabのCD200への結合は、ELISAおよびフローサイトメトリーによって確認した。Not I/Xho Iでの重鎖発現、次に軽鎖および重鎖の、Xba I/Pin AI部位におけるヒトIgG1発現ベクター内への移動のために、これらのキメラFabは、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモータ(hCMV IE Pro)配列の挿入によって、IgGへ変換される。このベクターは、哺乳類細胞での軽鎖発現のために、追加のhCMV IE Pro配列上流Xba I部位を含む。DNA配列を確認して、哺乳類細胞トランスフェクションのためにHiSpeed Maxi prepカラム(QIAGEN)を使用してmaxi prep DNAを調製した。293−EBNA細胞での一過性トランスフェクションをEffectene(QIAGEN)をメーカーのプロトコルに従って使用し、pAdVAntageベクター(Promega US,マジソン、ウィスコンシン州)を添加して実施した。NS0細胞への安定な細胞株トランスフェクションは、Effecteneをメーカーのプロトコルに従って使用して実施した。小規模一過性トランスフェクションの後、各抗体の培養物上澄みをELISAによって試験した(図24)。大規模一過性トランスフェクションの後、各IgGを培養物上澄みから、FPLCを用いた抗ヒトIgG F(ab’)2アフィニティカラム(Amersham Biosciences)によって精製した。
CD200のそのレセプターとの間の相互作用の遮断も、CD200の存在下での混合リンパ球反応で観察されたTh1からTh2へのサイトカイン移動を防止するかどうかを評価した。San Diego Blood Bankから軟膜を取得して、Histopaque(Sigma− Aldrich)を使用して血液リンパ球(PBL)を単離した。2%ヒト血清を含有するEMEM中で細胞を1時間に渡って付着させ、続いてPBSによって激しく洗浄した。細胞をGM−CSF、IL−4およびIFN−γの存在下で5日間培養した。成熟した細胞を収集して、γ−照射器(University of California San Diego)を使用して2000RADを照射した。混合リンパ球反応は、24ウェルプレートに樹状細胞/マクロファージ500,000個およびレスポンダ細胞1×106個を使用して構成した。レスポンダ細胞は、Histopaqueを使用して末梢血から精製したT細胞濃縮リンパ球であった。T細胞は、細胞を組織培養フラスコ内で1時間インキュベートして、非付着性細胞画分を取ることによって濃縮した。CD200発現一次照射CLL細胞500000個を、各種の量の抗CD200抗体の存在下または非存在下で樹状細胞に、リンパ球添加の2〜4時間前に添加した。上澄みを48時間および68時間後に採取して、IL−2、IFN−γ、IL−4、IL−10およびIL−6などのサイトカインをELISAを使用して定量した。各サイトカインの一致した捕獲および検出抗体の対をR+D Systems(ミネアポリス、ミネソタ州)から取得して、組換えヒトサイトカインを使用して各サイトカインの標準曲線を作成した。抗サイトカイン捕獲抗体をPBS中のプレートに最適濃度にてコーティングした。一晩のインキュベーションの後、プレートを洗浄して、1% BSAおよび5%スクロースを含有するPBSによって1時間遮断した。0.05% Tweenを含有するPBSによる3回の洗浄の後、1% BSAを含有するPBS中の指示された希釈物に上澄みを添加した。捕獲サイトカインを適切なビオチン化抗サイトカイン抗体によって検出して、アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジンおよびSigmaS基質の添加を続けた。呈色は、ELISAプレートリーダー(Molecular Devices Corp.,サニーベール、カリフォルニア州)によって評価した。図26AおよびBに示すように、CLL細胞の存在は、混合リンパ球反応で観察されたIFN−γおよびIL−2生成の大半を完全に排除した。いずれかの抗体の存在は、Th1サイトカインの生成を許容した(図26AおよびB)。これに対して、IL−10の生成は、抗体の存在下でダウンレギュレートされた(図26Cを参照)。
さらに6つのキメラマウス抗CD200抗体を、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性アッセイ(ADCC)でCD200発現腫瘍細胞を殺すその能力について評価した。CD200をトランスフェクションされた293−EBNA細胞に培地0.5ml中、37℃にて、100μCi/100万細胞で標識した。3回の洗浄後、細胞をカウントして、培地(10% ヒトAB血清を添加したRPMI)中で20万/mlにて再懸濁させて、50μl(10,000細胞/ウェル)を3つずつ、96ウェル丸底プレートに分配した。最終濃度20μg/mlを達成するために、抗CD200抗体20μlを各ウェルに分配した。末梢血単核細胞(エフェクター細胞)をFicoll勾配で単離して、赤血球を塩化アンモニウムによって溶解させ、洗浄して、培地に再懸濁させて、細胞50μlを各ウェルに分配した。アッセイプレートを回転させて(1,500rpm/5分/弱ブレーキ)、細胞培養インキュベータに移した。4時間後、アッセイプレートを前と同様に回転させた。上澄み36μlをピコプレートに移して、microscint−20カクテル250μlと混合して、オービタルシェーカーに2分間置いて、Top countで読み取った。図27に示すように、CD200陽性細胞と培養したときに、マウスキメラCD200抗体すべてが同様の溶解レベルを生じた。CD200陰性細胞では溶解は観察されなかった。加えて溶解の程度は、アイソタイプ対照抗体d2A6(抗FLJ32028抗体)と比較したときに、統計的に有意であった(p<0.05)。
(Raji/PBLモデル)
NOD.CB17−Prkdc<scid>マウス(Jackson Laboratory)に、RAJI細胞4×106個(ATCC)を含有するRPMI 200μlをPBL 0、100万、500万または1000万個と共に皮下注射した。各群にマウス9または10匹を入れた。PBLを全塩化アンモニウム250mlから単離した。腫瘍増殖は、カリパスで長さおよび幅を測定することによって、週3回モニターした。腫瘍増殖は、長さx幅x幅/2に基づいて計算した。
NOD.CB17−Prkdc<scid>マウス(Jackson Laboratory、バーハーバー、メイン州)に、Namalwa細胞4×106個(ATCC)を含有するRPMI 200μlを、PBL 0、200万または1000万個と共に皮下注射した。各群にマウス9または10匹を入れた。PBLを全血250mlからhistopaque勾配で単離して、0.9%塩化アンモニウムを使用して赤血球溶解を続けた。腫瘍増殖は、カリパスで長さおよび幅を測定することによって、週3回モニターした。腫瘍増殖は、長さx幅x幅/2に基づいて計算した。
安定なCD200発現RajiおよびNamalwa細胞株は、Virapower Lentiviral Expression System(Invitrogen,カールスバッド、カリフォルニア州)を使用して産生した。CD200 cDNAを一次CLL細胞からRT−PCRによって、フォワードプライマー5’−GACAAGCTTGCAAGGATGGAGAGGCTGGTGA−3’(配列番号212)およびリバースプライマー5’−GACGGATCCGCCCCTTTTCCTCCTGCTTTTCTC−3’(配列番号213)を使用して単離した。PCR生成物をGatewayエントリベクターpCR8/GW/TOPO−TAへクローニングして、個々のクローンを配列決定した。正しい配列のクローンをセンスおよびアンチセンス方向の両方でレンチウイルスベクターpLenti6/V5/DESTおよびpLenti6/UbC/V5/DEST内へ、Gateway技術(Invitrogen,カールスバッド、カリフォルニア州)を用いて組込んだ。この2つのベクターの主な相違は、CD200発現を引き起こすために使用されたプロモータである:pLenti6/V5/DESTがヒトCMV前初期プロモータを含有するのに対して、pLenti6/UbC/V5/DESTはヒトユビキチンCプロモータを含有する。
開示した方法に従って、CD200をCLL細胞でアップレギュレートされることを証明した。この分子のアップレギュレーションは、潜在的に免疫抑制性でありうる。CD200を発現する癌細胞が免疫系に癌細胞を根絶させるかどうかを試験するために、通常はCD200を発現しないRAJI細胞に、CD200をコードするレンチウイルスベクター系を上述のように感染させた。CD200を安定して発現するRAJIクローンを選択した。ベクター感染の効果を確実なくすための対照として、CD200の逆転非機能形(CD200rev)を発現するクローンも選択した。CD200を発現するRAJI細胞、CD200REVまたは親RAJI細胞をNOD.CB17−Prkdc<scid>マウスに皮下注射した。試験には以下の群を含めた:
群1:RAJI 4×106個、皮下;マウス9匹
この群は、レンチウイルス形質導入細胞が親細胞と同様の増殖を示すようにする必要があった。
この群は、CD200形質導入細胞が親細胞と同様の増殖を示すようにする必要があった。またこの群は、最大の腫瘍増殖を与えるであろう。群3および群4をこの群と比較した。
このPBL数は、以前の実験で一部のマウスの腫瘍増殖を低減することが示されている。拒絶は、細胞1000万個ほど強力ではないが、CD200がある数の細胞のみに影響を及ぼしうるかどうか判定するためであり、5×106個は、拒絶を得るために使用できるPBLの最小量である;拒絶は、CD200の存在によって防止されるはずである。
これはRAJI/PBLモデルで拒絶を確認するための、PBLの最適数である。目的は、CD200発現がこの拒絶を防止するということである。
この群は、レンチウイルス形質導入細胞が親細胞と同様の増殖を示すようにする必要があった。
この数のPBLは、強力な拒絶または腫瘍増殖の低減を生じるはずがない。これは群3および群4(最大予想腫瘍増殖)の正の対照である。この群で拒絶がない場合、ドナーPBLは過剰に活性化されて、CD200による効果の不足を説明できるほうから開始する。
CD200群3で観察されたすべての効果がCD200に実際に関連しており、レンチウイルス形質導入には関連していないという対照。
CD200群4で観察されたすべての効果がCD200に実際に関連しており、レンチウイルス形質導入には関連していないという対照。
RAJI/PBLモデルで見られる効果が他の腫瘍モデルでも見られるかどうかを評価するために、Namalwa腫瘍細胞もレンチウイルスCD200系によって感染させて、安定なクローンを選択した。ベクター感染の効果を確実なくすための対照として、CD200の逆転非機能形(CD200rev)を発現するクローンも選択した。NOD.CB17−Prkdc<scid>マウスに、以下のスキームに従って図31(a)〜(d)に示すように注射した:
群1:Namalwa 4×106個、皮下;マウス9匹
この群は、レンチウイルス形質導入細胞が親細胞と同様の増殖を示すようにする必要があった。
この群は、CD200形質導入細胞が親細胞と同様の増殖を示すようにする必要があった。またこの群は、最大の腫瘍増殖を与えるであろう。群3および群4をこの群と比較した。
このPBL数は、以前の実験で一部のマウスの腫瘍増殖を低減することが示されている。拒絶は、細胞1000万個ほど強力ではないが、CD200がある数の細胞のみに影響を及ぼすことが可能で、これが最小PBLである場合、拒絶を得るために使用できる;拒絶はCD200の存在によって防止されるであろう。
これはNamalwa/PBLモデルで拒絶を確認するための、PBLの最適数である。これはCD200発現がこの拒絶を防止することを示すために実施した。
この群は、レンチウイルス形質導入細胞が親細胞と同様の増殖を示すようにする必要があった。
この数のPBLは、強力な拒絶または腫瘍増殖の低減を生じるはずがない。これは群3および群4(最大予想腫瘍増殖)の正の対照である。この群で拒絶がない場合、ドナーPBLは過剰に活性化されて、CD200による効果の不足を説明できるほうから開始する。
この群は、CD200に関連するが、レンチウイルス形質導入には関連しないCD200群3の任意の効果を検出するための対照として必要であった。
この群は、CD200に関連するが、レンチウイルス形質導入には関連しないCD200群4の任意の効果を検出するための対照として必要であった。
抗CD200抗体が腫瘍細胞で発現されたCD200の免疫抑制効果を遮断できるかどうかを評価するために、CD200が形質導入されたRAJI細胞をNOD.CB17−Prkdc<scid>マウスに皮下注射して、キメラ抗CD200抗体d1B5およびc2aB7ならびに腫瘍細胞を結合しない抗体(alxn4100)の存在下または非存在下でPBLが腫瘍増殖を低減する能力を評価した。抗体を最初に腫瘍細胞と共に10mg/kgまた2.5mg/kgで、次に以下に示す濃度で週2回静脈内投与した。以下の群を構成した:
1.RAJICD200 4×106個;マウス10匹
2.RAJICD200 4×106個+PBL 5×106個;マウス10匹
3.RAJICD200 4×106個+PBL 5×106個+100mg/kg d1B5;マウス12匹
4.RAJICD200 4×106個+PBL 5×106個+20mg/kg d1B5;マウス9匹
5.RAJICD200 4×106個+PBL 5×106個+100mg/kg c2aB7;マウス11匹
6.RAJICD200 4×106個+PBL 5×106個+20mg/kg c2aB7;マウス9匹
7.RAJICD200 4×106個+PBL 5×106個+100mg/kg alxn4100;マウス9匹。
RAJI/PBLモデルにおいて抗CD200抗体によって見られた効果が他の腫瘍モデルでも観察できるかどうかを評価するために、CD200が形質導入されたRAJI細胞をNOD.CB17−Prkdc<scid>マウスに皮下注射して、キメラ抗CD200抗体d1B5およびc2aB7ならびに腫瘍細胞を結合しない抗体(alxn4100)の存在下または非存在下でPBLが腫瘍増殖を低減する能力を評価した。以下に示す濃度の抗体を最初に腫瘍細胞と共に、次に腫瘍0.5cm以内では週2回、皮下投与した。以下の群を構成した(別途記載しない限り、マウス10匹/群):
1.NamalwaCD200 4×106個
2.NamalwaCD200 4×106個+PBL 5×106個;マウス12匹
3.NamalwaCD200 4×106個+PBL 5×106個+10mg/kg d1B5;マウス12匹
4.NamalwaCD200 4×106個+PBL 5×106個+2.5mg/kg d1B5
5.NamalwaCD200 4×106個+PBL 5×106個+10mg/kg c2aB7;マウス12匹
6.NamalwaCD200 4×106個+PBL 5×106個+2.5mg/kg c2aB7
7.NamalwaCD200 4×106個+PBL 5×106個+10mg/kg alxn4100。
CD3カラム(Miltenyi)を使用してPBLから単離したT細胞を、AZND1(抗DC−SIGN抗体)の腹水調製物または対照抗体(BB5)の腹水調製物と共にインビトロでインキュベートした。NOD.CB17−Prkdc<scid>マウスに次のスキームに従って注射した:
群6:マウス8匹、RAJI 4×106個+AZND1増強T細胞0.8×106+PBL 2×106皮下
群5:マウス10匹、RAJI 4×106個、皮下
群4:マウス8匹、RAJI 4×106個+PBL 8×106個、皮下
群3:マウス8匹、RAJI 4×106個+新しいT細胞0.8×106個、皮下
群2:マウス8匹、RAJI 4×106個+AZND1増強T細胞0.8×106個、皮下
群1:マウス8匹、RAJI 4×106個+BB5.1増強T細胞0.8×106個、皮下
腫瘍の長さおよび幅を3回/週で測定した。
(CLL患者でのCD200アップレギュレーションの判定)
CLL患者15名からのリンパ球をFITC結合抗CD5(e−bioscience)、APC結合抗CD19(e−bioscience)およびPE結合抗CD200(Serotec)によって染色した。健常ドナーからのリンパ球をそれに従って染色した。CD5+CD19+細胞でのCD200発現を判定した。以下の表に示すように、CD200発現のレベルはCLL患者サンプル間で変化したが、すべてのCLLサンプルが、正常B細胞でのCD200発現と比較して、上昇したレベル(1.6〜4倍の範囲)のより高いCD200発現を示した。上昇したレベルのCD200発現を示すCCL患者を、本明細書で述べる方法によるCD200処置のために選択した。
以下の参考文献は、本発明が関係する最新技術をより十分に説明するために、参考として本明細書中に援用される。以下のこのような刊行物または上で参照により組み入れられたものと、本開示との不一致は、本開示を支持して解決されるものとする。
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- 本願明細書に記載された発明。
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