JP2012070729A - 固体培地プレート、及びそのプレートを用いるシアン化合物分解微生物のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】鉄シアノ錯体の固体微粒子を固体培地中及び/または固体培地上に分散させた固体培地プレート、そのプレートに微生物を塗付、培養してプレート上にハローを形成するシアン化合物分解微生物をスクリーニングする方法、スクリーニングされたシアン化合物分解能を有する微生物(FERM P−21791号、FERM P−21719号、FERM P−21790号、FERM P−21722号、FERM P−21721号)、及びこれらの微生物をシアン化合物含有土壌、排水または地下水に添加するシアン化合物含有土壌、排水または地下水の浄化方法。
【選択図】なし
Description
本発明の目的の1つは、シアン化合物分解微生物を効率的に取得できる固体培地プレート及びそれを用いたシアン化合物分解微生物のスクリーニング方法の提供にある。本発明の他の目的はシアン化合物分解微生物及びそれを用いたシアン化合物含有土壌、排水または地下水の浄化方法を提供することにある。
[1] 鉄シアノ錯体の固体微粒子が固体培地中及び/または固体培地上に分散していることを特徴とする固体培地プレート。
[2] 前記鉄シアノ錯体の固体微粒子が分散している固体培地が、前記鉄シアノ錯体を含まない支持培地上に積層されている前項[1]に記載の固体培地プレート。
[3] 前記鉄シアノ錯体が、Fe(III)4[Fe(II)(CN)6]3、Fe(II)3[Fe(III)(CN)6]2、及びFe(II)2[Fe(II)(CN)6]から選択される1種あるいは2種以上である前項[1]または[2]に記載の固体培地プレート。
[4] 前記鉄シアノ錯体の固体微粒子の濃度が1〜10g/Lである前項[1]〜[3]のいずれかに記載の固体培地プレート。
[5] 前記鉄シアノ錯体の固体微粒子が分散している固体培地の厚みが0.1〜3mmである前項[1]〜[4]のいずれかに記載の固体培地プレート。
[6] 前項[1]〜[5]のいずれかに記載の固体培地プレートの鉄シアノ錯体の固体微粒子が分散している固体培地上に微生物を塗付する工程、前記微生物を培養する工程、及びハローを形成する微生物を選抜する工程を有することを特徴とするシアン化合物分解微生物のスクリーニング方法。
[7] 前項[6]に記載のスクリーニング方法により選抜されたシアン化合物分解微生物。
[8] ロドコッカス(Rhodococcus)属、バチルス(Bacillus)属、アースロバクター(Arthrobacter)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、またはアシネトバクター(Acinetobacter)属に属する前項[7]に記載のシアン化合物分解微生物。
[9] ロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)BH0213株(受託番号:FERM P−21791)またはロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)BH0234株(FERM P−21719)であるシアン化合物分解微生物。
[10] バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)BH040101株(受託番号:FERM P−21790)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)BH040204株(受託番号:FERM P−21722)、またはバチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)BH040102株(受託番号:FERM P−21721)であるシアン化合物分解微生物。
[11] 前項[7]〜[10]のいずれかに記載のシアン化合物分解微生物の少なくとも1種を、シアン化合物含有土壌、排水または地下水に添加する、シアン化合物含有土壌、排水または地下水の浄化方法。
本発明の固体培地プレート(以下、「ハロープレート」、「ブルー培地」、「ブループレート」と称することがある。)は、濃青色の鉄シアノ錯体の固体微粒子が固体培地中及び/または固体培地上に分散していることを特徴とし、培地支持体、鉄シアノ錯体の固体微粒子及び栄養成分を主成分とする。
上記各成分を水に加えて分散させた液を固体培地液として調製する。
ハロープレートで行うスクリーニングは、微生物を含有する土壌の水懸濁液を直接ハロープレートに塗付して培養することもできるし、一旦、プレート培地及び/または液体培地で培養した培養液を適宜無菌液に希釈してハロープレートに塗付して培養することもできる。
選抜した菌株のシアン化合物分解能の評価は、菌株の培養液を、シアン化合物を含有する土壌や液体培地に接種して評価培養した後のシアン化合物の減少量を確認することにより行うことができる。接種する菌株の培養液は適当な栄養培地で増殖できるが、複数の菌株の優劣を比較する観点から、培養液中の菌数を適当な栄養培地プレートで測定した上、添加後の終濃度を揃えることができる。終濃度は、例えば108〜1010個/gの任意数値に設定することができる、
ニュートリエントブロス(NB;Netrient Broth)が8.9g/L、寒天が22g/Lになるように両成分を水に加えて分散した後、オートクレーブで121℃、20分滅菌した液(A液)と、0.45μmの除菌フィルターで除菌した、11.1g/LのK3[Fe(III)(CN)6]水溶液と濃度14.1g/LのFeSO4・7H2O水溶液を等量ずつ混合して10.0g/LのFe(II)3[Fe(III)(CN)6]2沈殿を含有する液(B液)を調製した後、B液及び水を、冷えて固まる前のA液に、表1に記載の各比率で無菌的に添加し混合して、Fe(II)3[Fe(III)(CN)6]2沈殿を1g/L、5g/L、10g/Lの各濃度含有する培地液(=ブルー培地)を作製した。
◎:ハローを形成し判別性が良好なもの、
○:ハローを形成しているもの、
×:ハローを形成していないもの。
特に、厚みが1mmでFe(II)3[Fe(III)(CN)6]2濃度が5g/Lのブループレートが、プレートの色調とハローの色抜けのコントラストが明瞭で判別性が最も良好であった(図1参照)。
土壌サンプル1gを、KH2PO4 0.7g/L、Na2HPO4 1.1g/L、MgSO4・7H2O 0.5g/L、FeSO4・7H2O 0.01g/L、グルコース 3g/L、K3[Fe(III)(CN)6] 1g/Lの組成の培地液(シアン錯体含有最小培地)100mLが入った500mLフラスコに添加して、35℃で3日間培養した。この培養液を、シアン錯体含有最小培地に1mL接収し35℃で3日間培養した培養液を滅菌水で適宜希釈した液0.1mLを、厚みが1mmでFe(II)3[Fe(III)(CN)6]2濃度が5g/Lのブループレートに塗付して35℃、5日間培養した。
本発明により分離されたシアン化合物分解微生物BH0213株の形態観察及び生理的性状は、以下の通りである。
形態:多形性桿菌、
グラム染色性:陽性、
胞子:形成せず、
運動性:なし、
酸素に対する態度:好気性、
オキシダーゼ:陰性、
カタラーゼ:陽性、
OF(Oxidation Fermentation)テスト:試験用培地に生育せず、
集落の色調:オレンジ系。
また、本菌株の同定は、PCR法により増幅した16SrRNA領域のDNAについて、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer[Applied Biosystems]を用いて塩基配列を解析し、得られた配列を国際塩基配列データベース(DDBJ/EMBL/GenBank)に登録されている配列及びMicroSeq Analysis Softwar[Applied Biosystems]のデータベースと相同性検索を行い、近縁種との系統樹をMicroSeq Analysis Softwarを用いて近接結合法(NJ法)により作成して行った。
その結果、本菌株は塩基配列の不一致率が0.09%でロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)に最近縁であると確認された。
本菌株はロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)BH0213株と命名し、平成21年3月19日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM P−21791号として寄託されている。
本発明により分離されたシアン化合物分解微生物BH0234株の形態観察及び生理的性状は、以下の通りである。
形態:多形性桿菌、
グラム染色性:陽性、
胞子:形成せず、
運動性:なし、
酸素に対する態度:好気性、
オキシダーゼ:陰性、
カタラーゼ:陽性、
OF(Oxidation Fermentation)テスト:試験用培地に生育せず、
集落の色調:オレンジ系。
また、本菌株の同定は、PCR法により増幅した16SrRNA領域のDNAについて、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer[Applied Biosystems]を用いて塩基配列を解析し、得られた配列を国際塩基配列データベース(DDBJ/EMBL/GenBank)に登録されている配列及びMicroSeq Analysis Softwar[Applied Biosystems]のデータベースと相同性検索を行い、近縁種との系統樹をMicroSeq Analysis Softwarを用いて近接結合法(NJ法)により作成して行った。
その結果、本菌株は塩基配列の不一致率が0.07%でロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)に最近縁であると確認された。
本菌株はロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)BH0234株と命名し、平成20年11月7日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM P−21719号として寄託されている。
本発明により分離されたシアン化合物分解微生物BH040101株の形態観察及び生理的性状は、以下の通りである。
形態:桿菌、
グラム染色性:陽性、
胞子:形成する(形:楕円形、位置:亜端立、胞子嚢:非膨出)、
運動性:あり、
酸素に対する態度:好気性、
カタラーゼ:陽性、
集落の色調:黄色系。
また、本菌株の同定は、PCR法により増幅した16SrRNA領域のDNAについて、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer[Applied Biosystems]を用いて塩基配列を解析し、得られた配列を国際塩基配列データベース(DDBJ/EMBL/GenBank)に登録されている配列及びMicroSeq Analysis Softwar[Applied Biosystems]のデータベースと相同性検索を行い、近縁種との系統樹をMicroSeq Analysis Softwarを用いて近接結合法(NJ法)により作成して行った。
その結果、本菌株は塩基配列の不一致率が0.16%でバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)に最近縁であると確認された。
本菌株はバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)BH040101株と命名し、平成21年3月19日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号:FERM P−21790号として寄託されている。
本発明により分離されたシアン化合物分解微生物BH040204株の形態観察及び生理的性状は、以下の通りである。
形態:桿菌、
グラム染色性:陽性、
胞子:形成する(形:楕円形、位置:中立〜亜端立、胞子嚢:非膨出)、
運動性:あり、
酸素に対する態度:好気性、
カタラーゼ:陽性、
集落の色調:黄色系。
また、本菌株の同定は、PCR法により増幅した16SrRNA領域のDNAについて、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer[Applied Biosystems]を用いて塩基配列を解析し、得られた配列を国際塩基配列データベース(DDBJ/EMBL/GenBank)に登録されている配列及びMicroSeq Analysis Softwar[Applied Biosystems]のデータベースと相同性検索を行い、近縁種との系統樹をMicroSeq Analysis Softwarを用いて近接結合法(NJ法)により作成して行った。
その結果、本菌株は塩基配列の不一致率が0.13%でバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)に最近縁であると確認された。
本菌株はバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)BH040204株と命名し、平成20年11月7日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM P−21722号として寄託されている。
本発明により分離されたシアン化合物分解微生物BH040102株の形態観察及び生理的性状は、以下の通りである。
形態:桿菌、
グラム染色性:陽性、
胞子:形成する(形:楕円形、位置:亜端立、胞子嚢:非膨出)、
運動性:あり、
酸素に対する態度:好気性、
カタラーゼ:陽性、
集落の色調:特徴的集落色素を生成せず。
また、本菌株の同定は、PCR法により増幅した16SrRNA領域のDNAについて、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer[Applied Biosystems]を用いて塩基配列を解析し、得られた配列を国際塩基配列データベース(DDBJ/EMBL/GenBank)に登録されている配列及びMicroSeq Analysis Softwar[Applied Biosystems]のデータベースと相同性検索を行い、近縁種との系統樹をMicroSeq Analysis Softwarを用いて近接結合法(NJ法)により作成して行った。
その結果、本菌株は塩基配列の不一致率が0.02%でバチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)に最近縁であると確認された。
本菌株はバチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)BH040102株と命名し、平成20年11月7日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM P−21721号として寄託されている。
実施例2によりスクリーニングされたシアン化合物分解微生物BH0213株、BH0234株、BH040101株、BH040204株、BH040102株を、直径18mm試験管のNB寒天培地(組成:NB8g/L、寒天20g/L)で35℃、24時間培養して、滅菌水10mLで懸濁した懸濁液1mLを、ペプトン 10g/L、酵母エキス 5g/L、K2HPO4 5g/L、MgSO4・7H2O 0.5g/L、グルコース 20g/Lの培地液100mLが入った500mLフラスコに添加して、35℃で1日間培養した培養液を作製し、適宜希釈した培養液をNB寒天培地プレートで35℃、24時間培養して培養液の菌数を測定した。
Claims (11)
- 鉄シアノ錯体の固体微粒子が固体培地中及び/または固体培地上に分散していることを特徴とする固体培地プレート。
- 前記鉄シアノ錯体の固体微粒子が分散している固体培地が、前記鉄シアノ錯体を含まない支持培地上に積層されている請求項1に記載の固体培地プレート。
- 前記鉄シアノ錯体が、Fe(III)4[Fe(II)(CN)6]3、Fe(II)3[Fe(III)(CN)6]2、及びFe(II)2[Fe(II)(CN)6]から選択される1種あるいは2種以上である請求項1または2に記載の固体培地プレート。
- 前記鉄シアノ錯体の固体微粒子の濃度が1〜10g/Lである請求項1〜3のいずれかに記載の固体培地プレート。
- 前記鉄シアノ錯体の固体微粒子が分散している固体培地の厚みが0.1〜3mmである請求項1〜4のいずれかに記載の固体培地プレート。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の固体培地プレートの鉄シアノ錯体の固体微粒子が分散している固体培地上に微生物を塗付する工程、前記微生物を培養する工程、及びハローを形成する微生物を選抜する工程を有することを特徴とするシアン化合物分解微生物のスクリーニング方法。
- 請求項6に記載のスクリーニング方法により選抜されたシアン化合物分解微生物。
- ロドコッカス(Rhodococcus)属、バチルス(Bacillus)属、アースロバクター(Arthrobacter)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、またはアシネトバクター(Acinetobacter)属に属する請求項7に記載のシアン化合物分解微生物。
- ロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)BH0213株(受託番号:FERM P−21791)またはロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)BH0234株(FERM P−21719)であるシアン化合物分解微生物。
- バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)BH040101株(受託番号:FERM P−21790)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)BH040204株(受託番号:FERM P−21722)、またはバチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)BH040102株(受託番号:FERM P−21721)であるシアン化合物分解微生物。
- 請求項7〜10のいずれかに記載のシアン化合物分解微生物の少なくとも1種を、シアン化合物含有土壌、排水または地下水に添加する、シアン化合物含有土壌、排水または地下水の浄化方法。
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