JP2012060914A - C型肝炎ウイルス株の評価方法およびその利用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】C型肝炎ウイルスのNS3タンパク質のアミノ末端領域における第56位および第86位のアミノ酸残基を検出する工程を含み、上記第56位のアミノ酸残基がチロシンであり、かつ第86位のアミノ酸残基がグルタミンであることを、高発癌性の指標とするC型肝炎ウイルス株の評価方法。
【選択図】なし
Description
(i)配列番号2に記載の塩基配列において、166〜168位に位置する塩基配列を含む16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド(ただし、当該ヌクレオチドがRNAである場合、配列表中の塩基記号「t」は「u」に読み替えるものとする)にハイブリダイズする16〜500塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドあるいはその標識物;
(ii)配列番号2に記載の塩基配列において、256〜258位に位置する塩基配列を含む16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド(ただし、当該ヌクレオチドがRNAである場合、配列表中の塩基記号「t」は「u」に読み替えるものとする)にハイブリダイズする16〜500塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドあるいはその標識物;
(iii)配列番号2に記載の塩基配列において、166〜168位に位置するヌクレオチドを含む16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド(ただし、当該ヌクレオチドがRNAである場合、配列表中の塩基記号「t」は「u」に読み替えるものとする)にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための15〜35塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物;
(iv)配列番号2に記載の塩基配列において、256〜258位に位置するヌクレオチドを含む16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド(ただし、当該ヌクレオチドがRNAである場合、配列表中の塩基記号「t」は「u」に読み替えるものとする)にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための15〜35塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物。
(v)配列番号4に示す塩基配列において、208〜210位に位置する塩基配列を含む16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド(ただし、当該ヌクレオチドがRNAである場合、配列表中の塩基記号「t」は「u」に読み替えるものとする)にハイブリダイズする16〜500塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドあるいはその標識物;
(vi)配列番号4に示す塩基配列において、208〜210位のヌクレオチドを含む16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド(ただし、当該ヌクレオチドがRNAである場合、配列表中の塩基記号「t」は「u」に読み替えるものとする)にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための15〜35塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物。
本発明に係るC型肝炎ウイルス株の評価方法は、C型肝炎ウイルスのNS3タンパク質のアミノ末端領域における第56位および第86位のアミノ酸残基を検出する工程を含み、上記第56位のアミノ酸残基がチロシンであり、かつ第86位のアミノ酸残基がグルタミンであることを、高発癌性の指標とするものであればよく、その他の構成は限定されるものではない。
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、NS3タンパク質のアミノ末端領域の機能(例えば、セリンプロテアーゼ酵素活性)を有するタンパク質;
(c)配列番号2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるタンパク質;
(d)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、NS3タンパク質のアミノ末端領域の機能(例えば、セリンプロテアーゼ酵素活性)を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(f)配列番号2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(g)上記(d)〜(f)のポリヌクレオチドのうちいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
(a’)配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b’)配列番号3に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、コアタンパク質としての機能を有するポリペプチド;
(c’)配列番号4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるタンパク質;
(d’)配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e’)配列番号3に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、コアタンパク質としての機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(f’)配列番号4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(g’)上記(d’)〜(f’)のポリヌクレオチドのうちいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
本発明に係る肝癌の発症リスクを予測するためのデータ取得方法は、C型肝炎ウイルス感染者から分離した生体サンプルを用いて、上述したC型肝炎ウイルス株の評価方法を行う工程を含むものであればよく、その他の具体的な構成は限定されない。
(a)被験者(HCV感染患者)の生体試料からHCV由来のポリヌクレオチド(ゲノムRNAおよびその逆転写DNA産物等)を抽出する工程、および;
(b)上記HCV株の評価方法を実施する工程。
本発明に係るC型肝炎ウイルス株の評価キットは、C型肝炎ウイルスのNS3タンパク質のアミノ末端領域における第56位および第86位のアミノ酸残基を検出するための試薬を含むものであればよく、その他の構成は特に限定されない。さらに、C型肝炎ウイルスのコアタンパク質における第70位のアミノ酸残基を検出するための試薬を含むものであることが好ましい。
目的とするNS3タンパク質のアミノ末端領域の第56位と第86位のアミノ酸残基の検出には、当該タンパク質をコードする塩基配列(配列番号2)の166〜168位の塩基配列または256〜258位の塩基を含むオリゴまたはポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、当該塩基配列または塩基を検出することができるオリゴまたはポリヌクレオチドを用いることができる。また、コアタンパク質の第70位のアミノ酸残基の検出には、当該タンパク質をコードする塩基配列(配列番号4)の208〜210位の塩基配列の塩基を含むオリゴまたはポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、当該塩基配列または塩基を検出することができるオリゴまたはポリヌクレオチドを用いることができる。かかるオリゴまたはポリヌクレオチドは、上記塩基配列を含む16〜500塩基長、好ましくは20〜200塩基長、より好ましくは20〜50塩基長の連続した遺伝子領域と特異的にハイブリダイズするように、上記塩基長を有するオリゴまたはポリヌクレオチドとして設計される。
本発明に係る評価キットに用いられるプライマー(オリゴヌクレオチド)は、NS3タンパク質のアミノ末端領域をコードする遺伝子(配列番号2)において、その塩基配列の166〜168位または256〜258位のヌクレオチドを含む連続したオリゴまたはポリヌクレオチドの一部に特異的にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための15〜35塩基長、好ましくは18〜30塩基長程度のオリゴヌクレオチドとして設計される。また、コアタンパク質をコードする遺伝子(配列番号4)において、その塩基配列の208〜210位のヌクレオチドを含む連続したオリゴまたはポリヌクレオチドの一部に特異的にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための15〜35塩基長、好ましくは18〜30塩基長程度のオリゴヌクレオチドとして設計される。増幅するオリゴまたはポリヌクレオチドの長さは、用いられる検出方法に応じて適宜設定されるが、一般的には15〜1000塩基長、好ましくは20〜500塩基長、より好ましくは20〜200塩基長である。
上記本発明のプローブまたはプライマーには、遺伝子異常検出のための適当な標識物、例えば蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等が付加されたものが含まれる。
(1)患者と血清:
HCV感染肝癌患者および非癌患者の血清を用いた。肝癌の診断は臨床的および組織学的に行って確定した。血清中の抗HCV抗体は市販の検査キット(Ortho HCV Ab ELISA Test III;Ortho Diagnostics)を用いて、B型肝炎ウイルス抗原は検査キット(AUSAB(登録商標) EIA;Abbott Diagnostics)を用いて常法に従って測定した(Doi, H., C. Apichartpiyakul, K. Ohba, M. Mizokami, and H. Hotta. J.Clin. Microbiol. 34:569-574. 1996.)。C型肝炎ウイルス陽性かつB型肝炎ウイルス陰性の患者を解析対象とした。
血清(140μl)から、市販のキット(RNeasyMini kit;Qiagen)を用いて、RNA(ゲノム)を抽出した。得られたRNAと市販のキット(Superscript One-Step RT-PCR with Platinum Taq;Gibco BRL)およびNS3領域用に開発した外側プライマーセット(配列番号5,6)を用いて、逆転写反応およびファーストPCRを行った。上記PCR法の反応条件は、まず45℃で30分間の逆転写反応を行い、94℃ 2分間で反応を停止した後、94℃、55℃、72℃それぞれ1分間のPCR反応を40サイクル行った。さらに、Pfu DNAポリメラーゼ(Promega)と内側プライマーセット(配列番号7,8)を用いて、94℃で1分間、55℃で1.5分間、72℃で3分間のPCR反応を35サイクル行った(特許文献1)。
上記と同様の方法で、血清からRNAを抽出した。得られたRNAについて、HCVのコアタンパク質用に開発した外側プライマーセット(配列番号9,10)を用いて、上記と同じ条件で逆転写反応およびファーストPCRを行った。さらに、Pfu DNAポリメラーゼ(Promega)と内側プライマーセット(配列番号11,12)を用いて、上記と同じ条件でPCR反応を行った。
得られたデータはχ2テスト独立性の検定、Studentのt検定、Welchのt検定およびMann−Whitney検定により統計処理を行い、P値が0.05以下の場合を有意差ありと判定した。
(1)肝癌患者及び非癌患者から得られたHCVNS3アミノ末端領域のアミノ酸配列の比較:
肝癌患者(122症例)及び非癌患者(102症例)から得られた検体から増幅されたHCVのNS3タンパク質のアミノ末端領域における配列を調べた。肝癌患者122症例のうち72症例(59%)について、NS3タンパク質のアミノ末端領域における56位および86位のアミノ酸残基がそれぞれチロシンおよびグルタミンであるウイルス株(NS3−Y56/Q86)であった(表1)。
肝癌患者(125症例)及び非癌患者(101症例)から得られた検体から増幅されたHCVのコアタンパク質領域の配列を調べた。肝癌患者125症例のうち60症例(48%)がコアタンパク質の第70位のアミノ酸がグルタミンであるウイルス株(Core−Q70)であった(表3)。
肝癌患者(122症例)及び非癌患者(100症例)から得られた検体から増幅されたHCVのNS3タンパク質のアミノ末端領域およびコアタンパク質領域の配列を調べ、両者を組み合わせて肝癌との相関を検討した。肝癌患者122症例のうち99症例(81%)がNS3−Y56/Q86株またはCore−Q70株の感染であった(表5)。
Claims (9)
- C型肝炎ウイルスのNS3タンパク質のアミノ末端領域における第56位および第86位のアミノ酸残基を検出する工程を含み、
上記第56位のアミノ酸残基がチロシンであり、かつ第86位のアミノ酸残基がグルタミンであることを、高発癌性の指標とすることを特徴とするC型肝炎ウイルス株の評価方法。 - さらに、C型肝炎ウイルスのコアタンパク質における第70位のアミノ酸残基を検出する工程を含み、
上記第70位のアミノ酸残基がグルタミンであることを、高発癌性の指標とすることを特徴とする請求項1に記載のC型肝炎ウイルス株の評価方法。 - 上記NS3タンパク質のアミノ末端領域をコードするポリヌクレオチドにおいて、第56位および第86位のアミノ酸残基をコードする塩基配列を検出する工程であることを特徴とする請求項1に記載のC型肝炎ウイルス株の評価方法。
- 上記コアタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、第70位のアミノ酸残基をコードする塩基配列を検出する工程であることを特徴とする請求項2に記載のC型肝炎ウイルス株の評価方法。
- C型肝炎ウイルス感染者から分離した生体サンプルを用いて、請求項1〜4のいずれかに記載のC型肝炎ウイルス株の評価方法を行う工程を含むことを特徴とする肝癌の発症リスクを予測するためのデータ取得方法。
- C型肝炎ウイルスのNS3タンパク質のアミノ末端領域における第56位および第86位のアミノ酸残基を検出するための試薬を含むことを特徴とするC型肝炎ウイルス株の評価キット。
- 以下の(i)〜(iv)いずれかに記載の試薬を含むことを特徴とする請求項6に記載のC型肝炎ウイルス株の評価キット。
(i)配列番号2に記載の塩基配列において、166〜168位に位置する塩基配列を含む16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド(ただし、当該ヌクレオチドがRNAである場合、配列表中の塩基記号「t」は「u」に読み替えるものとする)にハイブリダイズする16〜500塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドあるいはその標識物;
(ii)配列番号2に記載の塩基配列において、256〜258位に位置する塩基配列を含む16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド(ただし、当該ヌクレオチドがRNAである場合、配列表中の塩基記号「t」は「u」に読み替えるものとする)にハイブリダイズする16〜500塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドあるいはその標識物;
(iii)配列番号2に記載の塩基配列において、166〜168位に位置するヌクレオチドを含む16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド(ただし、当該ヌクレオチドがRNAである場合、配列表中の塩基記号「t」は「u」に読み替えるものとする)にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための15〜35塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物;
(iv)配列番号2に記載の塩基配列において、256〜258位に位置するヌクレオチドを含む16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド(ただし、当該ヌクレオチドがRNAである場合、配列表中の塩基記号「t」は「u」に読み替えるものとする)にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための15〜35塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物。 - さらに、C型肝炎ウイルスのコアタンパク質における第70位のアミノ酸残基を検出するための試薬を含むことを特徴とする請求項6または7に記載のC型肝炎ウイルス株の評価キット。
- 以下の(v)または(vi)に記載の試薬を含むことを特徴とする請求項8に記載のC型肝炎ウイルス株の評価キット。
(v)配列番号4に示す塩基配列において、208〜210位に位置する塩基配列を含む16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド(ただし、当該ヌクレオチドがRNAである場合、配列表中の塩基記号「t」は「u」に読み替えるものとする)にハイブリダイズする16〜500塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドあるいはその標識物;
(vi)配列番号4に示す塩基配列において、208〜210位のヌクレオチドを含む16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド(ただし、当該ヌクレオチドがRNAである場合、配列表中の塩基記号「t」は「u」に読み替えるものとする)にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための15〜35塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物。
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