JP2011524167A - ハイスループットアッセイのための3次元組織 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2008年6月5日に出願された米国仮特許出願第61/059,126号の優先権に対する利益を主張し、引用により全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、NIH/NCCAMによって授与されたR41助成金番号AT003984下の政府支援を得て行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
疾患状態に加えて、正常発生の間の生細胞中の多様な生体分子を特徴づける必要性から、細胞ベースのアッセイの開発が望まれている。ハイスループットの細胞ベースのアッセイは、今や生物医学研究の基礎をなすものである。これらのアッセイは、細胞の成分およびプロセスの発見などの基礎研究ならびに薬物開発などの応用研究の両方において使用される。例えば、細胞ベースのアッセイは、細胞生存率、細胞増殖、遺伝子発現、ならびに細胞内シグナル伝達および細胞間シグナル伝達などの細胞活動および細胞機能のモニタリングのために開発されている。かかるアッセイはハイスループット(HTP)スクリーニング適用のために有用である。しかしながら、検出感度またはシグナル強度が低すぎるので、多くの細胞ベースのアッセイは、ハイスループットスクリーニングに適合可能ではない。さらに、ハイスループットの細胞ベースのアッセイは単層の細胞に対してルーチンに行なわれ、これらのアッセイは組織中の細胞の挙動を適切に表現しない。細胞ベースのアッセイをハイスループット適用に適合させることができるように、感度の増加およびシグナル強度を増加させる必要がある。
直径1mmのステンレス鋼ワイヤーで作製した三角形フレームを、再構成組織が形成されるスキャフォールドとして用いた。ウェルは底部に向かってわずかにテーパーがかかり、フレームは、ウェルの底部の1mm上方に確実に位置決めされる(図1a)。細胞および適切な細胞培養培地を含有する未重合コラーゲン溶液をウェルの中へ注ぎ、底部の上方に3mmのレベルまでウェルを充填した(図1bおよび3)。図3中の8ウェルプレートを5%CO2で37℃でインキュベーションした。インキュベーションの間に、細胞は多孔性コラーゲンマトリックスから液体を絞り出すことによってコラーゲンマトリックスを圧縮した。ワイヤーフレームなしでは、再構成組織は組織培養培地中で小さな球体浮遊物へと収縮した。異なる形状のワイヤーフレームの利用によって、コラーゲンマトリックスはフレームの形状に対応する形状へと圧縮されることが見出された。例示的に、図1a中で示されるように、三角形のワイヤーフレームは3つの縁部の中で膜状の広がりを生じた。他のワイヤーフレーム形状(図1b中で示されるものなどの)は、異なる幅を持つ組織ストリップを生じた。マジックテープなどの多孔性支持材料は、ワイヤーの非多孔性ステンレス鋼表面への組織接着を促進するためにさえも必要とされなかった。コラーゲンは膜またはストリップの外側部でより高い程度まで圧縮された。したがって、膜のこの外側部は細胞によって生み出された応力に耐えることができ、膜がワイヤーフレームから裂けることを防止した。
ラット胎仔線維芽細胞(REF−52)は、10%ウシ胎仔血清(FBS、S11050、アトランタ・バイオロジカルズ(Atlanta Biologicals)社、ローレンスヴィル、ジョージア)を追加したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、MT10013CM、フィッシャー・サイエンティフィック(Fisher Scientific)社、ピッツバーグ、ペンシルバニア)中で培養された。細胞は2乃至3日ごとに継代培養した。ヒドロゲル組織構築物(HTC)を製作するために、REF−52細胞(継代40乃至70の間)は、10乃至15分間0.05%トリプシン(MT−25−025−CI、フィッシャー・サイエンティフィック社)で処理することによって培養プレートから解離した。次いで細胞を1000gで10分間遠心分離した。トリプシン溶液をデカントし、細胞沈殿を10%FBS含有DMEM培地中で再懸濁した。1mlあたり8×105細胞の最終濃度を達成するように、この細胞懸濁液をHTC組織溶液中で希釈した。HTC組織溶液は、10%FBS含有DMEM、0.02N酢酸中の1mg/mlの1型コラーゲン(354249、BDバイオサイエンス(BD Biosciences)社、サンホセ、カリフォルニア)、コラーゲン中の酸を中和するのに十分な水酸化ナトリウム、ならびにコラーゲンおよびNaOHの体積を補うのに十分な5×DMEMからなっていた。早期コラーゲン重合を防止するために、HTC組織溶液はカスタムメイド組織モールドの中に分配するまで冷凍した(図3)。モールドは各々、2本の作りつけの水平方向の支持棒を持つ8個の分離したHTC形成ウェルを含有する。300マイクロリットルのHTC組織溶液をこれらのモールド中の各々のウェルの中へ小分けし、次いで37℃および5%CO2で30分間インキュベーションした。インキュベーション期間後に、350mlの10%FBS含有DMEM培地を各々のウェルに加え、モールドをさらに48時間インキュベーションした。この時、溶液が収縮してウェル中の支持棒に広がるHTCを形成する。
パルペーター(商標)(米国特許第7,449,306号中に記載され、その全体は参照することにより本明細書に組み入れられる)を、HTCの収縮性を定量するために使用した。モールドを、パルペーター(商標)(各々のウェルの中へプローブを自動的に挿入し、個々のHTCを引き伸ばす)のステージ上に配置した。プローブは、力変換器(引き伸ばしに応答してHTCで誘導された抵抗力を測定し、記録のためにコンピューターへ値をエクスポートする)に接続された。カスタムマトラボ(Matlab)アルゴリズムを使用して力データーを処理およびアッセイし、HTC中の活性細胞力を表す数値パラメータを報せる。HTC収縮力の安定した測定を得るために、実際の力測定の前の3回の引き伸ばしによるHTCのプレコンディショニングが必要であった。後続する力測定が前の引き伸ばしの30分以内であったならば、プレコンディショニングは必要ではなかった。処理後24時間のHTCは、力測定の前に常にプレコンディショニングした。
テトラメチルローダミンのエチルエステル(TMRE、T−669、インビトロゲン(Invitrogen)社、カールズバッド、カリフォルニア)を使用してHTCのミトコンドリア電位を定量した。HTCを30分間100nMのTMRE中でインキュベーションし、次いで60分間フェノールレッド不含10%FBS含有DMEM中でインキュベーションした。TMRE蛍光読み取りに対する妨害を防止するために、フェノールレッド不含培地を使用した。標識後に、HTCを3回の引き伸ばしによりプレコンディショニングし、次いでバックグラウンド力を測定した。次いでHTCのTMREシグナルをシナジーHTプレートリーダー(バイオテック・インストルメンツ(Biotek Instruments)社、ウィヌースキー、バーモント)で読み取った。カスタムメイドの取付板を使用してプレートリーダーのプレート保持ラック上に組織のモールドの位置決めをする。蛍光シグナルは、543/590の励起/放射フィルターセットおよび50のゲイン設定を使用して底部から読み取った。薬物処理後に所定時間点で各々の力を測定し、続いてTMRE蛍光強度も読み取った。
すべて化学物質は、特に断りのない限り、シグマ(シグマ−アルドリッチ(Sigma−Aldrich)社、セント・ルイス、ミズーリ)からのものである。サイトカラシンD(CD、C8273)およびロテノン(ROT、R8875)、2,4−ジニトロフェノール(DNP、D198501)およびRhoキナーゼ阻害剤1(RKI1、555550、カルビオケム(Calbiochem)社、ギブスタウン、ニュージャージー)は、保存のためにジメチルスルホキシド(DMSO、D4540)中で懸濁した。1mMのCD、ROTおよびRKI1のストック溶液を、フェノールレッド、FBS、グルコースまたはピルベートなしの(−F/P/G)DMEM中で100μM、10μMおよび1μMへ連続的に希釈した。DNPはDMSO中で1Mに希釈し、次いで−F/G/PのDMEM中で100mM、10mMおよび1mMに希釈した。HTCプレコンディショニングおよびバックグラウンド力(すなわち薬物処理前)測定に続いて、50μlの適切な薬物希釈物を各々のウェルに加えて所望の処理濃度を達成する。50マイクロリットルの−F/G/PのDMEMを対照ウェルに加えた。薬物添加に際して、ウェル中の培地を4回のピペッティングによって混合した。
REF−52細胞を10%FBS培地(2ml)中で35mm培養用ディッシュ(50,000細胞)でプレーティングした。細胞を一晩インキュベーションし、次いで化合物により処理する。濃縮液のCD、RKI1、DNPおよびROTを−F/G/P培地中で溶解し、次いで細胞の各々のプレートの中に10×で希釈する(2mlの培地あたり220μl)。固定の24時間前に、細胞を薬物と共にインキュベーションした。固定するために、処理した細胞を2mlのリン酸緩衝食塩水(PBS、D5652)で1回すすぎ、次いで1mlの4%パラホルムアルデヒド(シグマ)溶液(PBS中)中で30分間インキュベーションした。固定した細胞を2回すすぎ、次いで2mlのPBS中で保存した。
固定したREF−52細胞を、1mlの0.1%トリトン(BP151、フィッシャー・サイエンティフィック社)溶液(PBS中)中で15分間インキュベーションすることによって透過性にした。透過性にした細胞は、1mlのTBSTバッファーで2回すすぎ、次いで1mlのTBST中の5%ヤギ血清で1時間ブロックした。次いで1ミリリットルの2%ヤギ血清含有TBST中で1:200に希釈したアレクサ568コンジュゲートファロイジン(A12380、インビトロゲン社)を、細胞に加えた。この染色溶液は400nMのDAPI(D9564)も含有した。細胞を30分間染色し、次いでTBSTで2回すすいだ。標識した細胞を、ベクタシールド(Vectashield)(ベクター・ラボラトリーズ(Vector Laboratories)社、バーリンゲーム、カリフォルニア)によりマウントし、カバースライドで覆い、次いでマニキュア液で密封した。次いでプレートをライカSP5共焦点顕微鏡(ライカ・マイクロシステムス(Leica Microsystems)社、バノックバーン、イリノイ)の上で裏返しにし、63倍水浸対物レンズでイメージングした。アレクサ568は543のレーザー線を使用して励起し、DAPIはマイタイ(MaiTai)多光子レーザーを使用して励起した。
スチューデントのt検定を使用して対照HTCに対するCD処理したHTCの蛍光シグナルの減少を検定する(図1h)。Z因子を使用してパルペーター(図1fおよび1g)、TMRE(図2aおよび2b)およびMTT(図3a)のアッセイのシグナル対ノイズ比を評価した。MTTアッセイにおいて、10%DMSOを陽性対照として使用した。
化合物スクリーニングについて細胞力学を測定するために、我々は、小型化されたヒドロゲル組織構築物(HTC)を製作する技術、および組織の力学的特性を定量するハイスループットスクリーニングシステム(パルペーター(商標))(図5a、5b、5c)を開発した。3次元HTCはより自然な微小環境を提供し、細胞はよりインビボの形態および生理を模倣することができる。さらに、自己支持型HTCは細胞力学の測定のための力プローブを使用して引き伸ばすことができる(図6d)。このシステムを使用すると、HTCの力学的特性は、細胞標識、高度な顕微鏡検査、またはイメージアッセイなしに、定量的に測定することができる(図6e)。
Claims (15)
- 薬剤に対する組織の応答を検出する方法であって、
(a)生体人工組織は細胞および細胞外マトリックスを含み、生体人工組織は組織接着を促進する留め具なしのスキャフォールド支持体上に形成され、スキャフォールド支持体はウェルの底部の上方に位置決めされて、薬剤と生体人工組織を接触させる段階と、
(b)生体人工組織を使用してアッセイを行ない、アッセイでインディケーターを産生する段階と、
(c)薬剤に対する生体人工組織の応答を表す、ウェル中のインディケーターのレベルを検出する段階と、
を含む方法。 - 前記細胞が、筋細胞、非筋細胞、内皮細胞および心臓細胞からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記ウェルがマルチウェルプレート内に位置決めされる、請求項1または2のいずれか一項に方法。
- 前記マルチウェルプレートが2乃至10,000のウェルを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記スキャフォールド支持体がワイヤーフレームである、請求項1〜2のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ワイヤーがステンレス鋼ワイヤーである、請求項5に記載の方法。
- 前記細胞が疾患に関与することが既知である細胞を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インディケーターが、発色測定用インディケーターまたは蛍光測定用インディケーターである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インディケーターのレベルが顕微鏡を使用して検出される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インディケーターが放射性標識である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インディケーターのレベルがシンチレーターを使用して検出される、請求項10に記載の方法。
- 前記インディケーターのレベルがマルチウェルプレートリーダーを使用して検出される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アッセイが、細胞増殖アッセイ、細胞死アッセイ、アポトーシスアッセイ、タンパク質発現アッセイ、遺伝子発現アッセイ、酵素的アッセイおよび細胞シグナリングアッセイからなる群から選択される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記薬剤が候補医薬品である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法がハイスループットスクリーニング方法である、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
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