JP2011522684A - エナンチオ選択的両性イオン性イオン交換材料 - Google Patents
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Abstract
少なくとも一つのカチオン交換基と少なくとも一つのアニオン交換基とを含むキラルセレクター成分(SO)と、前記セレクター成分を保持しているキャリヤとを含むカチオン選択的両性イオン性イオン交換材料であって、前記キラルセレクター成分は非-大環状形状で前記イオン交換基を接続するための少なくとも一つのキラルリンカー部分を含み、前記キラルリンカー部分は少なくとも一つのπ-π相互作用部位を含有する、前記エナンチオ選択的両性イオン性イオン交換材料。
Description
本発明は、少なくとも一つのカチオン交換基と少なくとも一つのアニオン交換基とを含むキラルセレクター成分(chiral selector component：SO)と、前記セレクター成分を直接またはスペーサを介して保持するキャリヤとを含むエナンチオ選択的両性イオン性イオン交換材料に関する。
イオン交換体型キラル固定相(chiral stationary phase：CSP)を用いるエナンチオ選択的クロマトグラフィー分野では、反対に帯電したキラルセレクター(SO)と分析物質(analyte)とのエナンチオ選択的イオン対形成によって分離が起きる。概念的には、エナンチオ選択的イオン対形成のキラル分子認識プロセスは、主にそのキラルセレクター部分の中にイオン化可能な基を含むCSPごとで起きている可能性があり、これらは小さなSO分子-またはグリコペプチド-若しくはタンパク質-ベースの分離材料の一部であるかもしれない(非特許文献１〜４)。低分子量SOとして固定化シンコナ(cinchona)・アルカロイド誘導体をベースとするCSPは特に、SOと分析物質との間の主反応としてイオン対形成プロセスを使用する。その結果、H-結合形成及びπ-πスタッキング反応(interaction)などの二次反応が続き、最後にエナンチオ識別を導くことができる。十分に研究されたこのキラル弱アニオン交換体(WAX)種の中でも、SOとしてキニン及びキニジンのO9-tert-ブチルカルバメート誘導体をベースとするCSPは、多様なキラル酸に関して優れたエナンチオ分離能を提供する(非特許文献５及び６)。図１は、市販されているキニン型WAX CSPのSO構造を示す(SHIRALPAK QN-AX、Chiral Technologies、フランス)。
これらのWAX型CSPと相補的である、完全合成の低分子量弱及び強カチオン交換体(WCX及びSCX)をベースとする分離材料がイオン対形成駆動プロセスを介してキラル塩基性分析物質のエナンチオ選択用に開発され、研究されてきた(非特許文献７〜１２)。キラルスルホン酸ベースのSOをもつ図１に示されている典型例として、そのようなカチオン交換体CSPは、キャピラリーエレクトロクロマトグラフィー(capillary electrochromatography：CEC)、キャピラリー液体クロマトグラフィー(capillary liquid chromatography：CLC)及び高速液体クロマトグラフィー(HPLC)などの種々のエナンチオ選択的分離技術に適用されてきた(非特許文献１３)。ごく最近になって、マクロジオリド(macrodiolide)ボロマイシンから誘導した、より複雑であるが非常に興味深いボロン酸ベースのキラルカチオン交換体SOが報告され(非特許文献１４)、このことは、エナンチオ選択的クロマトグラフィーにおけるイオン交換体の重要性を示している。
しかしながら、カチオン及びアニオン交換体は、反対の符号の電荷を保持する分析物質だけに対応するという限界に直面している。
主に、相補的帯電基を含む固定相も文献に記載されてきたが(非特許文献１５〜１９)、無機カチオン及びアニオンの分離に主に適用されていた。キラル両性イオン性部分を使用する系も種々な目的に関して既に報告されてきたが(非特許文献２０〜２４)、エナンチオマー分離を想定していなかった。
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本発明の目的は、キラル酸、キラルアミン及びキラル両性イオン性化合物などの種々のキラル化合物の効率的なエナンチオマー分離用クロマトグラフィー材料を提供することである。
本発明のエナンチオ選択的両性イオン性イオン交換材料は、少なくとも一つのカチオン交換基と少なくとも一つのアニオン交換基とを含むキラルセレクター成分(SO)と、前記セレクター成分を保持するキャリヤとを含み、
前記キラルセレクター成分は非-大環状形状(non-macrocyclic fashion)で前記イオン交換基を接続するための少なくとも一つのキラルリンカー部分を含み、及び
前記キラルリンカー部分は少なくとも一つのπ-π相互作用部位(例えば選択的に電子吸引性または電子供与性置換基)を含有する。
前記キラルセレクター成分は非-大環状形状(non-macrocyclic fashion)で前記イオン交換基を接続するための少なくとも一つのキラルリンカー部分を含み、及び
前記キラルリンカー部分は少なくとも一つのπ-π相互作用部位(例えば選択的に電子吸引性または電子供与性置換基)を含有する。
「保持する(carrying)」なる用語の意味は、キャリヤのセレクター成分への直接結合と、スペーサを介する間接的な結合も含む。キャリヤまたは支持体は、標的化合物の結合に関して不活性(inert)であるが、分子識別材料の化学的及び物理的安定性を保証するための機能をもつ。クロマトグラフィーのような流水用途では、キャリヤのそれぞれの物理的特性が材料の力学的特性を決定する。キャリヤは無機、有機、または混合無機-有機ハイブリッド型材料であってもよい。そのような材料は、市販及び自社開発のビーズ、シリカ、アルミナ、ジルコニア、チタニア、ゾル-ゲル誘導材料を含むモノリス型若しくは連続材料、有機-無機シリカ質ハイブリッド材料、架橋されていてもよいポリシロキサン類、ビニルモノマーから得たポリマーのいずれか、架橋されていてもよいポリ(メタ)アクリレート類、架橋されていてもよいポリ(メタ)アクリレート類、架橋されていてもよいポリスチレン類、混合スチレン-(メタ)アクリレートポリマー、開環メタセシス重合体、多糖類、アガロース及びキラルセレクター成分を固定化できるように当業界で特別に官能基化したこれらの材料のいずれかを含む。中でも好ましい担体は、公知のようにセレクターの固定化用にペンダント反応基で変性されていてもよいシリカビーズ、ポリ(メタ)アクリレートポリマービーズ、ポリ(メタ)アクリルアミドビーズ、ポリ(メタ)アクリレートモノリス、ポリスチレン樹脂である。
スペーサは、セレクター成分をキャリヤに結合する機能を主にもつ。スペーサの長さと化学官能基は変動可能である。好ましい固定化の方策としては、ラジカル付加反応による、ビニル変性セレクタとチオール-変性キャリヤ、特にチオールプロピル-変性シリカとの反応が挙げられる。使用し得る他の固定化の概念としては、ジイソシアネートリンカーとアミノまたはヒドロキシアルキル-変性キャリヤとアミノまたはヒドロキシル-変性セレクター成分との反応、アミノ、ヒドロキシルまたはチオール-変性キャリヤとクロロ-またはブロモアルカノイル-誘導体化セレクターとの反応、アルコキシ-またはクロロオルカノシランと、セレクター成分へのカップリング用末端反応性官能基との反応、アルコキシ-またはクロロヒドロシランとビニル基含有セレクターとのヒドロシリル化反応(hydrosylation reaction)などが挙げられる。
イオン交換基を接続するキラルリンカー部分は、単一のエナンチオマー形のキラル化合物であるか、天然若しくは人工の、環式若しくは非環式アミノ酸、ヒドロキシルカルボン酸、アミノホスホン酸、アミノホスフィン酸、アミノスルホン酸、アミノスルフィン酸、アミノボロン酸、ヒドロキシホスホン酸、メルカプトホスホン酸、酒石酸誘導体、マンデル酸誘導体、カンファースルホン酸誘導体、線状若しくは環式天然及び人工ペプチド、線状若しくは環式スルホペプチド類、線状若しくは環式ホスホノペプチド類などのエナンチオマー的に純粋なキラルシントンから構築される。
好ましいエナンチオ選択性両性イオン性イオン交換材料は、前記少なくとも一つのカチオン交換基がpka＜5.5、好ましくは＜3.0をもち、且つ前記少なくとも一つのアニオン交換基がpka＞8.0、好ましくは＞8.0をもつことを特徴とする。
本発明のエナンチオ選択性両性イオン性イオン交換材料のさらに好ましい態様は、pka値＜5.5をもつ少なくとも二つの酸性基とpka＞8.0をもつ少なくとも一つの塩基性基とを含有するセレクター化合物SOを含む。
セレクター化合物SOは、pka値＞8.0をもつ少なくとも二つの塩基性基と、pka＜5.5をもつ少なくとも一つの酸性基とを含むのがより好ましい。
カチオン交換基はたとえば、カルボン酸、スルホン酸、スルフィン酸、燐酸、ホスホン酸またはホスフィン酸基である。
アニオン交換基はたとえば、一級、二級、三級または四級アミノ基である。
前記アニオン交換基はキニンまたはキニジン残基であり、前記カチオン交換基はスルホン酸基であるのがより好ましい。
また本発明は、本発明に従ったエナンチオ選択的両性イオン性イオン交換材料を使用する全てのクロマトグラフィー法、たとえば分取固-液または液-液クロマトグラフィー法、固-液または液-液抽出法、及び膜分離法に関する。同様に、カラム液体クロマトグラフィー、超臨界流体クロマトグラフィー、キャピラリーエレクトロクロマトグラフィー、チップ方法として、またはセンサ技術における分子認識材料及び感知層として統合された分析的方法論におけるこれらの使用も本発明の目的である。
たった一種であるが両性のイオン性セレクターモチーフを使用するキラルな酸性及び塩基性溶質のエナンチオ選択的クロマトグラフィーを説明するために、図２に示されているような新規両性イオン性SO及び対応するCSP1〜5の設計、合成及び評価を以下に記載する。さらに、そのような両性イオン性SOにより、同様の二重イオン対形成に依存するアミノ酸及びペプチドのような両性イオン性溶質のエナンチオ選択性分子認識プロセスも可能になる。直接アミノ酸エナンチオマー分離は既に、グリコペプチド-、クラウンエーテル-、CLEC-型CSP(文献25〜32)及び選択的用途におけるQN-AX(文献33、34)に関して報告があるが、全て異なる分子相互作用原理に基づく。それにもかかわらず、アルファ-、ベータ-及びガンマ-アミノ酸のクロマトグラフィーエナンチオマー分離は魅力的な課題であり、両性イオン性SOアプローチが新規且つ前途有望な見込みを提供するかもしれない。全体として以下において、好ましい両性イオン性CSP1〜5をキラル酸及びキラルアミンに対してだけでなく、アミノ酸及びジペプチドの様なキラル両性イオン性分析物質に対して、そのエナンチオ選択能に関して極性有機移動相条件で評価した。
一般情報
全ての化学反応は、他に記載しない限り、窒素雰囲気下及びオーブン乾燥済みガラス器具を使用して無水条件下で実施した。1H及び13C NMRスペクトルは、Bruker DRX 400MHz分光計で実施した。化学シフト(δ)は、内部標準としてテトラメチルシランを使用して100万部分の1(ppm)で表す。質量分析法は、標準電気スプレー源を装備したPESciex API365三連四重極質量分析計(Applied Biosystems/MDS Sciex、Concord、カナダ)上で実施した。特定の旋光度値は、PerkinElmer（Vienna、オーストリア）製Polarimeter341上、20℃で測定した。元素分析はCarlo Erba製EA 1108 CHNS-Oで実施した。薄層クロマトグラフィーは、Merck(Darmstadt、ドイツ)製TLCアルミニウムシートシリカゲル60 F254で実施した。フラッシュクロマトグラフィーは、Merck(Darmstadt、ドイツ)製シリカ60(0.040-0.063mm粒径)を使用して実施した。
全ての化学反応は、他に記載しない限り、窒素雰囲気下及びオーブン乾燥済みガラス器具を使用して無水条件下で実施した。1H及び13C NMRスペクトルは、Bruker DRX 400MHz分光計で実施した。化学シフト(δ)は、内部標準としてテトラメチルシランを使用して100万部分の1(ppm)で表す。質量分析法は、標準電気スプレー源を装備したPESciex API365三連四重極質量分析計(Applied Biosystems/MDS Sciex、Concord、カナダ)上で実施した。特定の旋光度値は、PerkinElmer（Vienna、オーストリア）製Polarimeter341上、20℃で測定した。元素分析はCarlo Erba製EA 1108 CHNS-Oで実施した。薄層クロマトグラフィーは、Merck(Darmstadt、ドイツ)製TLCアルミニウムシートシリカゲル60 F254で実施した。フラッシュクロマトグラフィーは、Merck(Darmstadt、ドイツ)製シリカ60(0.040-0.063mm粒径)を使用して実施した。
材料
チオール-変性シリカゲルは、既報手順(文献35)と同様に球形シリカゲル(Daisogel 120-5、孔径120Å、粒径５μm、Daiso Chemical Co.，Ltd.，日本)から製造した。チオール基グラフトレベル940μmol/gは、2,2'-ジチオジピリジンを使用する分光学的定量法により評価した（文献36）。トランス-2-アミノシクロヘキサンスルホン酸は、既報手順(文献13、37)に従って製造した。合成に使用した全ての薬品は、Sigma-Aldrich(Vienna、オーストリア)より購入の試薬等級の品質またはそれ以上であり、以下のものを除き、さらに精製することなく使用した。ジクロロメタン(Sigma-Aldrich、オーストリア)は、使用前に水素化カルシウムで蒸留し、キニンは、Buchler(Baunschweig、ドイツ)より入手した。HPLC用溶媒としてのメタノール及びアセトニトリルは、Merck(Darmstadt、ドイツ)製のHPLC-等級のものであった。移動相添加剤の酢酸(HOAc)、蟻酸(FA)、ジエチルアミン(DEA)及び酢酸アンモニウム(NH4OAc)は、分析等級(Sigma-Aldrich、オーストリア)のものであった。本明細書で使用するキラル塩基性分析物質及び両性イオン性アミノ酸分析物質は市販品であるか、または研究パートナーからの現物寄付であった。酸性分析物質としてのN-ブロック化アミノ酸は、市販品であるか、または文献手順(文献38)に従って合成した。
チオール-変性シリカゲルは、既報手順(文献35)と同様に球形シリカゲル(Daisogel 120-5、孔径120Å、粒径５μm、Daiso Chemical Co.，Ltd.，日本)から製造した。チオール基グラフトレベル940μmol/gは、2,2'-ジチオジピリジンを使用する分光学的定量法により評価した（文献36）。トランス-2-アミノシクロヘキサンスルホン酸は、既報手順(文献13、37)に従って製造した。合成に使用した全ての薬品は、Sigma-Aldrich(Vienna、オーストリア)より購入の試薬等級の品質またはそれ以上であり、以下のものを除き、さらに精製することなく使用した。ジクロロメタン(Sigma-Aldrich、オーストリア)は、使用前に水素化カルシウムで蒸留し、キニンは、Buchler(Baunschweig、ドイツ)より入手した。HPLC用溶媒としてのメタノール及びアセトニトリルは、Merck(Darmstadt、ドイツ)製のHPLC-等級のものであった。移動相添加剤の酢酸(HOAc)、蟻酸(FA)、ジエチルアミン(DEA)及び酢酸アンモニウム(NH4OAc)は、分析等級(Sigma-Aldrich、オーストリア)のものであった。本明細書で使用するキラル塩基性分析物質及び両性イオン性アミノ酸分析物質は市販品であるか、または研究パートナーからの現物寄付であった。酸性分析物質としてのN-ブロック化アミノ酸は、市販品であるか、または文献手順(文献38)に従って合成した。
器具類
クロマトグラフィー測定は、溶媒脱気装置、ポンプ、オートサンプラー、カラムサーモスタット及び、UV検出用に十分な発色団を含有する分析物質検出用の多波長UV-Vis検出器からなるAgilent Technologies(Waldbronn、ドイツ)製1100シリーズHPLCシステムで実施した。弱UV吸収特性の分析物質に関しては、ESA Biosciences，Inc.(Chelmford、アメリカ合衆国)製Corona(登録商標)帯電エアロゾル検出器（CAD:登録商標）を代わりに使用した。図及び表に示されているデータに関してUVまたはCAD検出を適用するかは、説明文で具体的に述べられる。データ取得及び分析は、Agilent Technologies製ChemStation(登録商標)クロマトグラフデータソフトウエアで実施した。選択した溶質のエナンチオマーの溶出順を評価するために、既知の絶対配置の単一エナンチオマーまたは具体的にエナンチオ富化(enantioenriched)サンプルを注入するか、あるいはJasco OR-990旋光度検出器(Jasco、Gross-Umstadt、ドイツ)をオンラインで使用した。溶出は、移動相流速１ml/分の定組成(isocratic)モードで実施した。他に記載しない限り、カラム温度は25℃であった。UV検出は、230〜280nmの間の選択波長で実施した。カラムの空隙容量は280nmでの検出でアセトンを注入することにより測定した。全ての分析物質は、0.5〜1.0mg/mlのメタノール性溶液として適用した。
クロマトグラフィー測定は、溶媒脱気装置、ポンプ、オートサンプラー、カラムサーモスタット及び、UV検出用に十分な発色団を含有する分析物質検出用の多波長UV-Vis検出器からなるAgilent Technologies(Waldbronn、ドイツ)製1100シリーズHPLCシステムで実施した。弱UV吸収特性の分析物質に関しては、ESA Biosciences，Inc.(Chelmford、アメリカ合衆国)製Corona(登録商標)帯電エアロゾル検出器（CAD:登録商標）を代わりに使用した。図及び表に示されているデータに関してUVまたはCAD検出を適用するかは、説明文で具体的に述べられる。データ取得及び分析は、Agilent Technologies製ChemStation(登録商標)クロマトグラフデータソフトウエアで実施した。選択した溶質のエナンチオマーの溶出順を評価するために、既知の絶対配置の単一エナンチオマーまたは具体的にエナンチオ富化(enantioenriched)サンプルを注入するか、あるいはJasco OR-990旋光度検出器(Jasco、Gross-Umstadt、ドイツ)をオンラインで使用した。溶出は、移動相流速１ml/分の定組成(isocratic)モードで実施した。他に記載しない限り、カラム温度は25℃であった。UV検出は、230〜280nmの間の選択波長で実施した。カラムの空隙容量は280nmでの検出でアセトンを注入することにより測定した。全ての分析物質は、0.5〜1.0mg/mlのメタノール性溶液として適用した。
両性イオン性、シンコナベースのCSP１〜５の合成（図３）
シンコナ活性化のための一般的な手順(文献39)
一般的に、シンコナ・アルカロイド１(5.0g，10mmol)をトルエン(150ml)に溶解し、ディーンスターク装置を使用してこの溶液を共沸により乾燥した。周囲温度に冷却した後、4-ニトロクロロフォーメート(2.0g，11mmol)を滴下添加した。得られた混合物を一晩攪拌した。薄黄色沈殿物が形成し、これを濾過により集めた。ｎ-ヘキサン(３×50ml)で洗浄し、減圧乾燥すると、薄黄色固体状の２(7.0g，殆ど定量的収率)が得られ、これをさらに精製することなく次段階で使用した。
シンコナ活性化のための一般的な手順(文献39)
一般的に、シンコナ・アルカロイド１(5.0g，10mmol)をトルエン(150ml)に溶解し、ディーンスターク装置を使用してこの溶液を共沸により乾燥した。周囲温度に冷却した後、4-ニトロクロロフォーメート(2.0g，11mmol)を滴下添加した。得られた混合物を一晩攪拌した。薄黄色沈殿物が形成し、これを濾過により集めた。ｎ-ヘキサン(３×50ml)で洗浄し、減圧乾燥すると、薄黄色固体状の２(7.0g，殆ど定量的収率)が得られ、これをさらに精製することなく次段階で使用した。
O9-(4-ニトロフェニル)オキシカルボニルキニン塩酸塩2a
MS(ESI、ポジティブ)：490.5[M＋H]+，979.5[2M＋H]+。
O9-(4-ニトロフェニル)オキシカルボニルキニジン塩酸塩2b
MS(ESI、ポジティブ)：490.5[M＋H]+，979.5[2M＋H]+。
MS(ESI、ポジティブ)：490.5[M＋H]+，979.5[2M＋H]+。
O9-(4-ニトロフェニル)オキシカルボニルキニジン塩酸塩2b
MS(ESI、ポジティブ)：490.5[M＋H]+，979.5[2M＋H]+。
通常、N,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミドBSA(4.0ml，12mmol)を、乾燥CH2Cl2(80ml)中の微細粉砕化アミノ酸(4.0mmol)の懸濁液に滴下添加した。得られた混合物を攪拌し、透明溶液が形成するまで還流下加熱した(最大36時間)。周囲温度に冷却した後、活性化シンコナ・アルカロイド２(2.5g，4.1mmol)を滴下添加し、溶液を一晩攪拌すると、僅かに黄色になった。MeOH(2ml)でクエンチした後、反応混合物をCH2Cl2で予備平衡させておいたシリカゲル(150g)床に直接移した。フラッシュクロマトグラフィー(CH2Cl2/MeOH 20/1〜5/1)で精製すると、両性イオン性SOが得られた。
N-[[[(8S,9R)-6'-メトキシシンコナン-9-イル]オキシ]カルボニル]-β-アラニン3
91％、薄茶色固体。
1H NMR[CD3OD]：δ=8.68(d，1H)，7.97(d，1H)，7.55(d，1H)，7.53(d，1H)，7.45(dd，1H)，6.93(d，1H)，5.75(m，1H)，5.09(d，1H)，5.01(d，1H)，4.02(s，3H)，3.75(m，1H)，3.64(m，1H)，3.53(m，1H)，3.48-3.33(m，2H)，3.27-3.14(m，2H)，2.73(m，1H)，2.47(m，2H)，2.21-2.08(m，2H)，2.03(m，1H)，1.84(m，1H)，1.71(m，1H)。13C NMR：δ=176.6(COOH)，160.4(Car)，156.2(C=O)，148.1(CarH)，145.0(Car)，143.6(Car)，139.4(CH=)，131.8(CarH)，127.4(Car)，123.9(CarH)，119.7(CarH)，117.1(CH2=)，102.5(CarH)，71.4(CH)，59.8(CH)，57.1(OMe)，55.7(CH2)，44.8(CH2)，38.6(CH)，38.5(CH2)，36.1(CH2)，28.3(CH)，25.2(CH2)，20.9(CH2).MS(ESI，ポジティブ)：440.4[M+H]+，462.4[M+Na]+，879.6[2M+H]+，901.5[2M+Na]+。
91％、薄茶色固体。
1H NMR[CD3OD]：δ=8.68(d，1H)，7.97(d，1H)，7.55(d，1H)，7.53(d，1H)，7.45(dd，1H)，6.93(d，1H)，5.75(m，1H)，5.09(d，1H)，5.01(d，1H)，4.02(s，3H)，3.75(m，1H)，3.64(m，1H)，3.53(m，1H)，3.48-3.33(m，2H)，3.27-3.14(m，2H)，2.73(m，1H)，2.47(m，2H)，2.21-2.08(m，2H)，2.03(m，1H)，1.84(m，1H)，1.71(m，1H)。13C NMR：δ=176.6(COOH)，160.4(Car)，156.2(C=O)，148.1(CarH)，145.0(Car)，143.6(Car)，139.4(CH=)，131.8(CarH)，127.4(Car)，123.9(CarH)，119.7(CarH)，117.1(CH2=)，102.5(CarH)，71.4(CH)，59.8(CH)，57.1(OMe)，55.7(CH2)，44.8(CH2)，38.6(CH)，38.5(CH2)，36.1(CH2)，28.3(CH)，25.2(CH2)，20.9(CH2).MS(ESI，ポジティブ)：440.4[M+H]+，462.4[M+Na]+，879.6[2M+H]+，901.5[2M+Na]+。
N-[[[(8S,9R)-6'-メトキシシンコナン-9-イル]オキシ]カルボニル]-タウリン4
55％、薄黄色固体。
1H NMR[CD3OD]：δ=8.73(d，1H)，8.00(d，1H)，7.64(d，1H)，7.50(s，1H)，7.48(d，1H)，6.94(s，1H)，5.78(m，1H)，5.14(d，1H)，5.05(d，1H)，4.05(s，3H)，3.87-3.74(m，2H)，3.65(m，2H)，3.50(m，1H)，3.37(m，2H)，3.01(m，2H)，2.84(m，1H)，2.30-2.19(m，2H)，2.13(m，1H)，1.99(m，1H)，1.75(m，1H)。13CNMR：δ=160.5(Car)，155.9(C=O)，147.8(CarH)，144.4(Car)，143.6(Car)，138.9(CH=)，131.4(CarH)，127.4(CarH)，124.3(CarH)，119.5(CarH)，117.4(CH2=)，102.3(CarH)，71.1(CH)，60.0(CH)，57.1(OMe)，55.8(CH2)，51.5(CH2)，45.5(CH2)，38.4(CH2)，38.3(CH)，28.2(CH)，25.0(CH2)，20.7(CH2).MS(ESI，ポジティブ)：476.4[M+H]+，498.4[M+Na]+。MS(ESI，ネガティブ)：474.2[M-H]~。
55％、薄黄色固体。
1H NMR[CD3OD]：δ=8.73(d，1H)，8.00(d，1H)，7.64(d，1H)，7.50(s，1H)，7.48(d，1H)，6.94(s，1H)，5.78(m，1H)，5.14(d，1H)，5.05(d，1H)，4.05(s，3H)，3.87-3.74(m，2H)，3.65(m，2H)，3.50(m，1H)，3.37(m，2H)，3.01(m，2H)，2.84(m，1H)，2.30-2.19(m，2H)，2.13(m，1H)，1.99(m，1H)，1.75(m，1H)。13CNMR：δ=160.5(Car)，155.9(C=O)，147.8(CarH)，144.4(Car)，143.6(Car)，138.9(CH=)，131.4(CarH)，127.4(CarH)，124.3(CarH)，119.5(CarH)，117.4(CH2=)，102.3(CarH)，71.1(CH)，60.0(CH)，57.1(OMe)，55.8(CH2)，51.5(CH2)，45.5(CH2)，38.4(CH2)，38.3(CH)，28.2(CH)，25.0(CH2)，20.7(CH2).MS(ESI，ポジティブ)：476.4[M+H]+，498.4[M+Na]+。MS(ESI，ネガティブ)：474.2[M-H]~。
ジアステレオマー(以下参照)のクロマトグラフィー分離により高純度の５及び６が得られた。
トランス(1"S，2"S)-N-[[[(8S，9R)-6'-メトキシシンコナン-9-イル]オキシ]カルボニル]-2"-アミノシクロ-ヘキサンスルホン酸5
64％、オフホワイト結晶。
1H NMR[CD3OD]：δ=8.70(d，1H)，7.95(d，1H)，7.60(d，1H)，7.40(dd，1H)，7.30(d，1H)，6.85(s，1H)，5.77(m，1H)，5.23(d，1H)，5.04(d，1H)，4.03(m，1H)，3.92(s，3H)，3.81(m，1H)，3.73(m，2H)，3.38(m，1H)，2.85(s，1H)，2.70(m，1H)，2.39(m，1H)，2.31(m，1H)，2.21(m，1H)，2.12(s，1H)，1.95(m，2H)，1.85-1.68(m，3H)，1.52(m，1H)，1.30(m，4H)。13CNMR：δ=160.3(Car)，155.6(C=O)，148.2(CarH)，145.0(Car)，143.1(Car)，139.2(CH=)，131.9(CarH)，127.1(Car)，123.6(CarH)，119.9(CarH)，117.3(CH2=)，102.2(CarH)，71.0(CH)，63.6(CH)，60.0(CH)，56.5(OMe)，56.0(CH2)，53.2(CH)，46.1(CH2)，38.5(CH)，35.0(CH2)，29.4(CH2)，28.2(CH)，26.1(2xCH2)，25.3(CH2)，20.8(CH2)。MS(ESI，ポジティブ)：530.5[M+H]+，552.3[M+Na]+，1059.7[2M+H]+，1081.7[2M+Na]+。
64％、オフホワイト結晶。
1H NMR[CD3OD]：δ=8.70(d，1H)，7.95(d，1H)，7.60(d，1H)，7.40(dd，1H)，7.30(d，1H)，6.85(s，1H)，5.77(m，1H)，5.23(d，1H)，5.04(d，1H)，4.03(m，1H)，3.92(s，3H)，3.81(m，1H)，3.73(m，2H)，3.38(m，1H)，2.85(s，1H)，2.70(m，1H)，2.39(m，1H)，2.31(m，1H)，2.21(m，1H)，2.12(s，1H)，1.95(m，2H)，1.85-1.68(m，3H)，1.52(m，1H)，1.30(m，4H)。13CNMR：δ=160.3(Car)，155.6(C=O)，148.2(CarH)，145.0(Car)，143.1(Car)，139.2(CH=)，131.9(CarH)，127.1(Car)，123.6(CarH)，119.9(CarH)，117.3(CH2=)，102.2(CarH)，71.0(CH)，63.6(CH)，60.0(CH)，56.5(OMe)，56.0(CH2)，53.2(CH)，46.1(CH2)，38.5(CH)，35.0(CH2)，29.4(CH2)，28.2(CH)，26.1(2xCH2)，25.3(CH2)，20.8(CH2)。MS(ESI，ポジティブ)：530.5[M+H]+，552.3[M+Na]+，1059.7[2M+H]+，1081.7[2M+Na]+。
トランス-(1''R，2''R)-N-[[[(8S，9R)-6'-メトキシシンコナン-9-イル]オキシ]カルボニル]-2''-アミノシクロ-ヘキサンスルホン酸6
55%，オフホワイト固体。
1H NMR[CD3OD]：δ=8.77(d，1H)，8.05(d，1H)，7.71(d，1H)，7.54(d，1H)，7.41(s，1H)，6.76(s，1H)，5.75(m，1H)，5.12(d，1H)，5.06(d，1H)，4.03(s，3H)，3.88(m，2H)，3.71(m，1H)，3.65(m，1H)，3.44(m，1H)，3.38(m，1H)，3.08(m，1H)，2.85(s，1H)，2.40-2.05(m，5H)，1.95(m，2H)，1.75(m，1H)，1.66(m，1H)，1.58(m，1H)，1.48(m，1H)，1.40-1.19(m，2H)。13C NMR：δ=160.0(Car)，155.3(C=O)，148.4(CarH)，144.4(Car)，142.7(Car)，138.7(CH=)，131.8(CarH)，126.8(Car)，123.7(CarH)，120.2(CarH)，117.2(CH2=)，101.9(CarH)，71.1(CH)，61.5(CH)，59.8(CH)，57.0(OMe)，55.6(CH2)，53.4(CH)，45.4(CH2)，37.7(CH)，33.4(CH2)，29.0(CH2)，27.5(CH)，25.8(CH2)，25.7(CH2)，24.8(CH2)，20.7(CH2)。MS(ESI，ポジティブ)：530.3[M+H]+，552.4[M+Na]+，1059.7[2M+H]+，1081.7[2M+Na]+。
55%，オフホワイト固体。
1H NMR[CD3OD]：δ=8.77(d，1H)，8.05(d，1H)，7.71(d，1H)，7.54(d，1H)，7.41(s，1H)，6.76(s，1H)，5.75(m，1H)，5.12(d，1H)，5.06(d，1H)，4.03(s，3H)，3.88(m，2H)，3.71(m，1H)，3.65(m，1H)，3.44(m，1H)，3.38(m，1H)，3.08(m，1H)，2.85(s，1H)，2.40-2.05(m，5H)，1.95(m，2H)，1.75(m，1H)，1.66(m，1H)，1.58(m，1H)，1.48(m，1H)，1.40-1.19(m，2H)。13C NMR：δ=160.0(Car)，155.3(C=O)，148.4(CarH)，144.4(Car)，142.7(Car)，138.7(CH=)，131.8(CarH)，126.8(Car)，123.7(CarH)，120.2(CarH)，117.2(CH2=)，101.9(CarH)，71.1(CH)，61.5(CH)，59.8(CH)，57.0(OMe)，55.6(CH2)，53.4(CH)，45.4(CH2)，37.7(CH)，33.4(CH2)，29.0(CH2)，27.5(CH)，25.8(CH2)，25.7(CH2)，24.8(CH2)，20.7(CH2)。MS(ESI，ポジティブ)：530.3[M+H]+，552.4[M+Na]+，1059.7[2M+H]+，1081.7[2M+Na]+。
N-[[[(8R，9S)-6'-メトキシシンコナン-9-イル]オキシ]カルボニル]-タウリン7
90%，黄色結晶。
1H NMR[CD3OD]：δ=8.79(d，1H)，7.96(d，1H)，7.78(d，1H)，7.56-7.50(m，2H)，7.11(s，1H)，6.14(m，1H)，5.33-5.24(m，2H)，4.01(s，3H)，3.87(m，1H)，3.65-3.51(m，5H)，3.37(m，1H)，3.02(m，2H)，2.77(m，1H)，2.42(m，1H)，2.06(m，1H)，2.02-1.83(m，2H)，1.47(m，1H)。13C NMR：δ=161.2(Car)，155.7(C=O)，146.8(Car)，145.8(CarH)，141.2(Car)，137.9(CH=)，128.8(CarH)，127.9(Car)，126.1(CarH)，120.1(CarH)，118.4(CH2=)，102.6(CarH)，71.4(CH)，59.8(CH)，57.4(OMe)，51.5(CH2)，51.0(CH2)，50.1(CH2)，38.5(CH2)，38.2(CH)，28.7(CH)，23.7(CH2)，20.4(CH2).MS(ESI，ポジティブ)：476.2[M+H]+，498.2[M+Na]+，951.4[2M+H]+，973.4[2M+Na]+。
90%，黄色結晶。
1H NMR[CD3OD]：δ=8.79(d，1H)，7.96(d，1H)，7.78(d，1H)，7.56-7.50(m，2H)，7.11(s，1H)，6.14(m，1H)，5.33-5.24(m，2H)，4.01(s，3H)，3.87(m，1H)，3.65-3.51(m，5H)，3.37(m，1H)，3.02(m，2H)，2.77(m，1H)，2.42(m，1H)，2.06(m，1H)，2.02-1.83(m，2H)，1.47(m，1H)。13C NMR：δ=161.2(Car)，155.7(C=O)，146.8(Car)，145.8(CarH)，141.2(Car)，137.9(CH=)，128.8(CarH)，127.9(Car)，126.1(CarH)，120.1(CarH)，118.4(CH2=)，102.6(CarH)，71.4(CH)，59.8(CH)，57.4(OMe)，51.5(CH2)，51.0(CH2)，50.1(CH2)，38.5(CH2)，38.2(CH)，28.7(CH)，23.7(CH2)，20.4(CH2).MS(ESI，ポジティブ)：476.2[M+H]+，498.2[M+Na]+，951.4[2M+H]+，973.4[2M+Na]+。
SO5及び6のHPLCセミ分取ジアステレオマー分離
ジアステレオマー5及び6の定組成セミ分取クロマトグラフィー分割は、自動化分別捕集用にUV検出器直後の流路と接続された、Agilient Technologies製12/13切り替えバルブと組み合わせた上記標準分析HPLC系で実施した。使用した固定相は、ステンレススチールカラム(150×4mm I.D.)に社内で充填したβ-アラニン-ベースのCSP1であった。移動相としてMeOH中25mM(0.142％，v/v)HOAcを使用し、フローは1.0mm/分に設定し、温度は25℃であった。アミノ酸ジアステレオマーを濃度100mg/mlでMeOHに溶解し、標準HPLCバイアルに分配した。カラムに注入したサンプル量はそれぞれ85μlまたは8.5mgであった。一連の注入において、ジアステレオマーを分離し、二つの画分に集め、これを真空乾燥した。集めたジアステレオマーの純度は、同様の条件(CSP1；MeOH中25mM HOAc)を使用して分析的に評価した。最初に溶離したジアステレオマー5は、シクロヘキサンスルホン酸サブユニット中で(1"S,2"S)-配置であると帰属されたので、二番目に溶離したジアステレオマー6は(1"R,2"R)-配置であると帰属された。これらの帰属のベースは、5における予備X-線結晶学的データである。
ジアステレオマー5及び6の定組成セミ分取クロマトグラフィー分割は、自動化分別捕集用にUV検出器直後の流路と接続された、Agilient Technologies製12/13切り替えバルブと組み合わせた上記標準分析HPLC系で実施した。使用した固定相は、ステンレススチールカラム(150×4mm I.D.)に社内で充填したβ-アラニン-ベースのCSP1であった。移動相としてMeOH中25mM(0.142％，v/v)HOAcを使用し、フローは1.0mm/分に設定し、温度は25℃であった。アミノ酸ジアステレオマーを濃度100mg/mlでMeOHに溶解し、標準HPLCバイアルに分配した。カラムに注入したサンプル量はそれぞれ85μlまたは8.5mgであった。一連の注入において、ジアステレオマーを分離し、二つの画分に集め、これを真空乾燥した。集めたジアステレオマーの純度は、同様の条件(CSP1；MeOH中25mM HOAc)を使用して分析的に評価した。最初に溶離したジアステレオマー5は、シクロヘキサンスルホン酸サブユニット中で(1"S,2"S)-配置であると帰属されたので、二番目に溶離したジアステレオマー6は(1"R,2"R)-配置であると帰属された。これらの帰属のベースは、5における予備X-線結晶学的データである。
SO固定化及びカラム充填
両性イオン性SO-ベースのCSPを調製するための一般的な手順
通常、オーブン乾燥したチオール-変性シリカゲル(2.20g)をMeOH(10ml)中に懸濁させた。それぞれMeOH(それぞれ5ml及び1ml)に溶解させたSO(380mg，0.89mmol)及びアゾビスイソブチロニトリルAIBN(30mg，0.18mmol)を添加した。懸濁液を還流下で6時間攪拌した。冷却及び濾過後、シリカゲルをMeOH(3×20ml)、ジエチルエーテル(2×20ml)で洗浄し、真空下60℃で乾燥すると、新しいCSPが得られた。SO被覆率は、元素分析により得られた窒素含有量より計算した：CSP 1(SO 3をベースとする)：w-%C 10.60，w-% H 1.85，w-% N 0.825，w-% S 2.56；196μmol SO/g CSP。CSP 2(SO 4をベースとする)：w-% C 10.48，w-% H 1.85，w-% N 0.863，w-% S 3.26；205μmol SO/g CSP。CSP 3(SO 5をベースとする)：w-% C 11.53，w-% H 1.96，w-% N 0.905，w-% S 3，19；215μmol SO/g CSP。CSP 4(SO 6をベースとする)：w-% C 11.83，w-% H 1.92，w-% N 0.961，w-% S 3.19；229μmol SO/g CSP。CSP 5(SO 7をベースとする)：w-% C 10.14，w-% H 1.78，w-% N 0.881，w-% S 3.15；210μmol SO/g CSP。CSP1〜5は社内またはVDS Optilab GmbH(ベルリン、ドイツ)のいずれかでステンレススチールカラム(150×4ｍｍI.D.)にスラリー充填した。
両性イオン性SO-ベースのCSPを調製するための一般的な手順
通常、オーブン乾燥したチオール-変性シリカゲル(2.20g)をMeOH(10ml)中に懸濁させた。それぞれMeOH(それぞれ5ml及び1ml)に溶解させたSO(380mg，0.89mmol)及びアゾビスイソブチロニトリルAIBN(30mg，0.18mmol)を添加した。懸濁液を還流下で6時間攪拌した。冷却及び濾過後、シリカゲルをMeOH(3×20ml)、ジエチルエーテル(2×20ml)で洗浄し、真空下60℃で乾燥すると、新しいCSPが得られた。SO被覆率は、元素分析により得られた窒素含有量より計算した：CSP 1(SO 3をベースとする)：w-%C 10.60，w-% H 1.85，w-% N 0.825，w-% S 2.56；196μmol SO/g CSP。CSP 2(SO 4をベースとする)：w-% C 10.48，w-% H 1.85，w-% N 0.863，w-% S 3.26；205μmol SO/g CSP。CSP 3(SO 5をベースとする)：w-% C 11.53，w-% H 1.96，w-% N 0.905，w-% S 3，19；215μmol SO/g CSP。CSP 4(SO 6をベースとする)：w-% C 11.83，w-% H 1.92，w-% N 0.961，w-% S 3.19；229μmol SO/g CSP。CSP 5(SO 7をベースとする)：w-% C 10.14，w-% H 1.78，w-% N 0.881，w-% S 3.15；210μmol SO/g CSP。CSP1〜5は社内またはVDS Optilab GmbH(ベルリン、ドイツ)のいずれかでステンレススチールカラム(150×4ｍｍI.D.)にスラリー充填した。
結果及び考察
セレクター設計
本発明は、正及び負の両方に帯電したキラル分析物質に対処するイオン交換体型キラル固定相の鋭意開発を目的とする。本目的は、本発明者らによりカチオン及びアニオン交換型エナンチオ選択的クロマトグラフィーで良好な低分子量SOとして既に使用されてきた酸性及び塩基性セレクター単位を新規両性イオン性セレクター構造体に融合させることであった。図１に示されているスルホン酸ベースのSCX CSPは、HPLCにおける種々のキラルアミンのエナンチオ分離用として報告されてきた。そのキラル部分はトランス-2-アミノシクロヘキサンスルホン酸によって表されるので、両性イオン性CSP用のカチオン交換部位として選択された。キニンtert-ブチルカルバメート誘導体WAX(図１参照)もキラルアニオン交換体CSPとして十分に確立されている。エナンチオ分離手法におけるシンコナ型受容体で報告されてきた綿密な研究から、エナンチオ選択的な特性が大きく変化せずに残ったままであるという条件のもとで、カルバメート結合を介してアミノスルホン酸を導入するためにキニンのO9-位置が提案されてきた。図２の新規両性イオン性CSPは、CSP3及び4がWAX-及びSCX同族の重要なモチーフとアルカロイド塩基及びシクロヘキサンスルホン酸と共に含む単一のセクターにカチオン及びアニオン交換部分を融合する概念を示す。エナンチオ選択的イオン相互作用プロセスのより詳細な研究用に、β-位置にアミノ酸をもつアキラルカルボン酸及びスルホン酸をCAP1、2及び5に含めた。またCSP5においては、アルカロイド塩基キニンはその擬似的エナンチオマーキニジンと置き換わり、これはエナンチオ分離の際に溶離順に影響すると予想されるので、根本的な分子認識プロセスの解明に役立った。
セレクター設計
本発明は、正及び負の両方に帯電したキラル分析物質に対処するイオン交換体型キラル固定相の鋭意開発を目的とする。本目的は、本発明者らによりカチオン及びアニオン交換型エナンチオ選択的クロマトグラフィーで良好な低分子量SOとして既に使用されてきた酸性及び塩基性セレクター単位を新規両性イオン性セレクター構造体に融合させることであった。図１に示されているスルホン酸ベースのSCX CSPは、HPLCにおける種々のキラルアミンのエナンチオ分離用として報告されてきた。そのキラル部分はトランス-2-アミノシクロヘキサンスルホン酸によって表されるので、両性イオン性CSP用のカチオン交換部位として選択された。キニンtert-ブチルカルバメート誘導体WAX(図１参照)もキラルアニオン交換体CSPとして十分に確立されている。エナンチオ分離手法におけるシンコナ型受容体で報告されてきた綿密な研究から、エナンチオ選択的な特性が大きく変化せずに残ったままであるという条件のもとで、カルバメート結合を介してアミノスルホン酸を導入するためにキニンのO9-位置が提案されてきた。図２の新規両性イオン性CSPは、CSP3及び4がWAX-及びSCX同族の重要なモチーフとアルカロイド塩基及びシクロヘキサンスルホン酸と共に含む単一のセクターにカチオン及びアニオン交換部分を融合する概念を示す。エナンチオ選択的イオン相互作用プロセスのより詳細な研究用に、β-位置にアミノ酸をもつアキラルカルボン酸及びスルホン酸をCAP1、2及び5に含めた。またCSP5においては、アルカロイド塩基キニンはその擬似的エナンチオマーキニジンと置き換わり、これはエナンチオ分離の際に溶離順に影響すると予想されるので、根本的な分子認識プロセスの解明に役立った。
CSP1〜5の製造
O9-位置におけるアミノ酸とのカルバメート型誘導体形成に関しては、キニン1a及びキニジン1bはそれぞれ、4-ニトロクロロホーメート[39]との反応により活性化し、すぐに塩酸塩2a及び2bが反応溶液から沈殿し、濾過により集めることができた(図３)。結合すべきアキラルなβ-アミノ酸はタウリン及びβ-アラニンのような市販品であったが、キラルトランス-2-アミノシクロヘキサンスルホン酸ビルディングブロックは、刊行文献[13，37]に従ってラセミ化合物として製造した。
O9-位置におけるアミノ酸とのカルバメート型誘導体形成に関しては、キニン1a及びキニジン1bはそれぞれ、4-ニトロクロロホーメート[39]との反応により活性化し、すぐに塩酸塩2a及び2bが反応溶液から沈殿し、濾過により集めることができた(図３)。結合すべきアキラルなβ-アミノ酸はタウリン及びβ-アラニンのような市販品であったが、キラルトランス-2-アミノシクロヘキサンスルホン酸ビルディングブロックは、刊行文献[13，37]に従ってラセミ化合物として製造した。
溶解性の問題を回避するため、ニトロフェニルエステル2a及び2bと反応させる前に、種々のアミノ酸をN,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミド[40]でそのトリメチルシリルエステルに転換した。両性SO3〜7はこれにより良好な収量と許容可能に迅速に製造できた。SOのチオール-変性シリカゲル上への固定化は、ラジカル付加反応[35]により達成され、150〜230μmol/グラムCSPのSO充填量をもつ新規CSP1〜5が生成した。CSP3及び4の場合には、SO立体異性体の高純度を保障するには固定化前のジアステレオマーSOの分取分離が必須であった。標準逆相(RP)及びWAX-型クロマトグラフィーは両方とも両性化合物の実現可能な分離できなかったが、新規CSP1、β-アラニン-キニンベースの両性イオン性材料を使用すると、MeOH中0.14％酢酸からなる容易に除去可能な移動相を使用しつつ、十分な分離(分析ラン：α=2.24，Rs=8.9)及び高充填能力(high loading capacity)(150×4mmカラムに注入したサンプル10mgまで)が得られた(データは示されていない)。ジアステレオマーは分離されるが、このことはこれらの新規キラル両性イオン性固定相の両性化合物の分取分離及び精製の適用性を示す。
CSP1〜5のクロマトグラフィー的評価
以下において、エナンチオマー分離用HPLCにおけるCSP1〜5のクロマトグラフィー的評価結果を示し、考察する。最初に、酸性分析物質種に関して、第二に塩基性アミン分析物質、そして最終的に両性イオン性分析物質に関して行う。極性有機移動相条件を、これらの測定に関して選択した。というのも、これらは親、純粋なアニオンまたはカチオンイオン交換体CSPに関して成功裏且つ広範囲に使用されてきたからである[13，41]。極性有機モードでは、メタノール及びアセトニトリルのような極性有機バルク溶媒(bulk solvent)を使用するが、酸性及び塩基性添加剤は共-イオン(co-ion)及び対イオンとして行動し、帯電したSOと溶質との間のイオン相互作用を調節する。
以下において、エナンチオマー分離用HPLCにおけるCSP1〜5のクロマトグラフィー的評価結果を示し、考察する。最初に、酸性分析物質種に関して、第二に塩基性アミン分析物質、そして最終的に両性イオン性分析物質に関して行う。極性有機移動相条件を、これらの測定に関して選択した。というのも、これらは親、純粋なアニオンまたはカチオンイオン交換体CSPに関して成功裏且つ広範囲に使用されてきたからである[13，41]。極性有機モードでは、メタノール及びアセトニトリルのような極性有機バルク溶媒(bulk solvent)を使用するが、酸性及び塩基性添加剤は共-イオン(co-ion)及び対イオンとして行動し、帯電したSOと溶質との間のイオン相互作用を調節する。
新規両性イオン性分離材料はより多目的なキラルイオン交換体の概念をそもそも説明するよい例となるべきであるので、両性イオンCSP1〜5のクロマトグラフィー的性能と親WAX-及びSCX CSPとの比較は、主なレベルでのみ行った。この点において、後者のCSP材料の重要な特徴は、極めて詳細に既に報告されている文献を参照とする[6，13，38]。
キラル酸のエナンチオ分離
一連の実験において、シンコナ型WAX CSPの主な特性−即ちN-保護化アミノ酸のようなキラル酸分析物質のエナンチオ分離が新規両性イオン性CSPで維持され得るかどうかを評価するために、CSP1〜5を種々のキラル酸のエナンチオ分離に関して試験した。この目的に関して、芳香族、脂肪族及び帯電側鎖をもつN-ブロック化アミノ酸を含み、通常使用されるN-保護基または誘導体形成基(derivatizating group)を使用する8つの小さいが代表的なセットを集めた。分析物質の構造並びにクロマトグラフィー的結果の両方を表１に列記する。
一連の実験において、シンコナ型WAX CSPの主な特性−即ちN-保護化アミノ酸のようなキラル酸分析物質のエナンチオ分離が新規両性イオン性CSPで維持され得るかどうかを評価するために、CSP1〜5を種々のキラル酸のエナンチオ分離に関して試験した。この目的に関して、芳香族、脂肪族及び帯電側鎖をもつN-ブロック化アミノ酸を含み、通常使用されるN-保護基または誘導体形成基(derivatizating group)を使用する8つの小さいが代表的なセットを集めた。分析物質の構造並びにクロマトグラフィー的結果の両方を表１に列記する。
明らかに酸性分析物質エナンチオマーを分離可能にするエナンチオ選択的特性は、５種全ての両性イオン性CSPに存在している。ほんの幾つかの例外に関しては、全ての分析物質は全てCSP上でベースラインで分離された。典型的なキラルWAX CSPと比較すると(図１参照)、全α-値は、少々の分散はあるが確認されている(データは示されていない)。キラル認識における保護基のタイプ及びシンコナ型CSPにおけるエナンチオ選択性の効果は既に詳細が記載されており[35，38]、CSP1〜5に関しても確認することができる。3,5-ジニトロベンゾイルアミドは優れたエナンチオ分離(α-値は15以下、解像度＞20)を示し、Fmoc-、DNP-及びアセチル基は良好に分離され、Z-基に続く。DNP-基は他のN-保護化基と比較して溶離順が逆になる。
CSP1及びCSP2のSOは、その酸官能基(acid function)の種類だけが異なる構造的同族体である。さらに、どちらのCSPも殆ど同一のSO充填である。従ってCSP1とCSP２との間の保持時間の顕著な違いは、酸の長さで説明することができる。CSP2のより強いスルホン酸は−分子内というこの特別なケースにおいて−CSP1のより弱いカルボン酸と比較してより支配的な対イオンであり、従って移動相において同様の酸濃度ではより短い保持時間となる。従って、カルボン酸ベースのCSP1の保持因子は、たとえば二酸DNB-Gluに関して、スルホン酸ベースのCSP2の最大4倍高い。この点において、イオン交換体-ベースのエナンチオ選択的クロマトグラフィーにおける内因性(intrinsic)または分子内対イオンの作用は、現在準備中の別の詳細な研究で取り上げられるだろう。同様のSO充填におけるスルホン酸型CSP3と4の間のエナンチオ選択性及び保持時間における(in parts)顕著な差は、それらのジアステレオマーSOによる分析物質の様々な分子識別プロセスに反映する。
分析物質のエナンチオマーの溶出順序及び溶出順序を切り替える能力は、たとえば不純物プロファイリング及び分取エナンチオ分離となるときは重要であり得る[42]。この点において、合成低分子量SO及び対応するCSPは、逆の配置のCSPに切り替えることによって溶出順序のスイッチとなるという好都合な点を提案できる。本明細書に示す両性イオン性CSPの両方の親CSP(図１参照)に関しては、例えばキニンベースの弱アニオン交換体CSP及びその擬似エナンチオマー的キニジンベースのCSPに関しては、この種の溶出順序の逆転は既に示されている[13，35，38]。CSP1〜5は似たような挙動を示す(表１参照)。エナンチオ分離の際にキラル酸性分析物質の溶出順序は常に両性イオン性CSP1〜4では同一であり、これは全てキニンベースであり、標準的な純粋なアニオン交換型キニンベースCSPの文献で報告された溶出順序と合致する。対照的に、SOの一部として擬似エナンチオマー的キニジンを使用するCSP5は、CSP1〜4と比較して溶出順序が逆になる。これらの知見は、新規両性イオン性CSPが、慣用のキニン-及びキニジン-型CSPと非常に似ている酸性分析物質に対してシンコナベース優勢のキラル認識機構を示すということを強く示唆する。従って、アルカロイド部分のO9-位置に導入された酸性基は基本的にこの分子識別シナリオを変更しない。
キラルアミンのエナンチオ分離
シンコナベースモチーフによるキラル酸性分析物質に対するエナンチオ選択性を確認後、そのカチオン交換部位をベースとしてキラルアミンエナンチオマーに対するその分離能力に関して両性イオン性CSPを研究した。エナンチオ選択性がSCX CSPから新規両性SOへトランス-2-アミノシクロヘキサンスルホン酸部分を含むことによって転移するか、またはアルカロイド構造と組み合わせたアキラルな酸性側鎖がキラルアミン溶質に対してエナンチオ選択性を提供し得るかを評価することは特に興味深かった。この目的に関して、β-ブロッカー、β-交感神経様作用薬及び他の薬剤などの大部分は薬品を含んでいた一連の12種の塩基を研究した(表２参照)。SCX CSPに関して最近報告された研究[13]から直接採用された非最適化移動相条件を使用して実施した。結果を表２にまとめる。
シンコナベースモチーフによるキラル酸性分析物質に対するエナンチオ選択性を確認後、そのカチオン交換部位をベースとしてキラルアミンエナンチオマーに対するその分離能力に関して両性イオン性CSPを研究した。エナンチオ選択性がSCX CSPから新規両性SOへトランス-2-アミノシクロヘキサンスルホン酸部分を含むことによって転移するか、またはアルカロイド構造と組み合わせたアキラルな酸性側鎖がキラルアミン溶質に対してエナンチオ選択性を提供し得るかを評価することは特に興味深かった。この目的に関して、β-ブロッカー、β-交感神経様作用薬及び他の薬剤などの大部分は薬品を含んでいた一連の12種の塩基を研究した(表２参照)。SCX CSPに関して最近報告された研究[13]から直接採用された非最適化移動相条件を使用して実施した。結果を表２にまとめる。
全体として、酸性セレクターサブユニットのキラリティと相関性を示す二つの顕著な所見がある。キラル酸性部分をもつ−両性イオン性CSP3及び4は両方とも、α=1.05-2.00の範囲で親SCX CSPと同様の選択した分析物質に対するエナンチオ選択性を示す。これによって、CSP3は明らかに12種の分析物質全てをベースライン分離することによって広範な用途を提供する。しかしながらCSP4は、全部でCSP3(表２のエントリー8)及び5種の溶質よりもたった一種の分析物質を分離することによってそれほど顕著ではないエナンチオ選択性を示す。対照的に、それぞれ酸性ではあるがアキラルな側鎖をもつCSP1、2及び5は、選択した分析物質のセットに対してごく僅かなエナンチオ選択性を示すが、抗マラリア薬メフロキン(Mefloquine)(エントリー4)は例外であった。これは5種の両性イオン性CSPのどれに関してもベースライン分離し得る。これにより、CSP3及び4のキラルトランス-2-アミノシクロヘキサンスルホン酸部分は、キラルアミンに対して考察した両性イオンCSPの観察されたエナンチオ選択的特性に対してまったく有益であるが、本質的ではないという結論が導かれる。測定された溶出順序は一般的な傾向を示さない。
その酸サブユニットにおいて反対の配置であるが、ジアステレオマーキラルセレクターに依存するCSP3及び4を操作する際、溶出順序の逆転が5種の溶質(エントリー1、3、7、8及び9)について観察されたが、他の4種の分析物質(エントリー4、10、11及び12)の溶出順序は変化のないままであり、これは融合した両性イオン性構成要素(entity)のキラルサブユニットが互いに完全に独立して挙動しないことをはっきりと示している。さらに擬似エナンチオマーCPS2及び5(エントリー3及び4)における溶出順序を比較すると、アルカロイドモチーフの誘導的な影響(guiding influence)が示される。明らかに、キラルβ-アミノシクロヘキサンスルホン酸部分の重要な役割に加えて、アルカロイド構造の「キラル環境」もある程度、本明細書で選択されたアミン分析物質に対する全てのキラル認識プロセスに含まれるようである。たとえば、メフロキン(α＞15、CSP3)の非常に高いエナンチオ選択性は、この特別な場合においてキニンモチーフが重要であり、キラル酸サブユニットと組み合わせると、よく結合したメフロキンエナンチオマーと殆ど「理想的に一致」することができ、その保持時間も大きく増加させることを示唆する。
キラル酸及びキラルアミンのエナンチオ選択における上記結果は、一つのSOモチーフにおいてアニオン交換体とカチオン交換体とを組み合わせるという概念が、特にCSP3及び4に関しては成功し、選択されたキラル酸性及び塩基性サブユニットは単一セレクター中で一緒に融合された際に証明されたように相変わらず機能することを提示している。その結果、CSP3及び４のような新規両性イオン性材料は、単一であるが両性イオン性イオン交換体型CSPを使用してキラル酸及びキラル塩基のエナンチオマー分離を可能にする。
キラル両性イオン性分析物質のエナンチオ分離
両性イオン性SOをベースとするCSPによって保護されていないアミノ酸などの両性イオン性分析物質を直接クロマトグラフィー上でエナンチオマー分離することにより、エナンチオ選択的イオン交換体の新規用途を開拓することができた。従って、最初にこの現象が広範囲に及ぶものであるかということ、及び我々がキラル両性イオン性イオン交換体のこの幅広い相互作用機構に関する見識を得られるかどうかを究明することが重要であった。この目的に関して、両性イオン性の分析物質のかなり広い多様な集合体を集めた(表３)。これは一つ及び二つのキラル中心、1級及び2級アミノ基、カルボン酸及びスルホン酸並びに、脂肪族、芳香族及び側鎖並びに幾つかのジペプチドを含む官能基をもつ、環式及び非環式の天然及び非天然α-及びβ-アミノ酸を含んでいた。
両性イオン性SOをベースとするCSPによって保護されていないアミノ酸などの両性イオン性分析物質を直接クロマトグラフィー上でエナンチオマー分離することにより、エナンチオ選択的イオン交換体の新規用途を開拓することができた。従って、最初にこの現象が広範囲に及ぶものであるかということ、及び我々がキラル両性イオン性イオン交換体のこの幅広い相互作用機構に関する見識を得られるかどうかを究明することが重要であった。この目的に関して、両性イオン性の分析物質のかなり広い多様な集合体を集めた(表３)。これは一つ及び二つのキラル中心、1級及び2級アミノ基、カルボン酸及びスルホン酸並びに、脂肪族、芳香族及び側鎖並びに幾つかのジペプチドを含む官能基をもつ、環式及び非環式の天然及び非天然α-及びβ-アミノ酸を含んでいた。
キラル酸及びキラルアミン(上記参照)のエナンチオ分離用に適用したクロマトグラフィー条件は、両性イオン性分析物質のエナンチオ分離にも直接適用可能であることが判明した。従って、本概念の明確さのために、本明細書中に示した両性イオン性の溶質における研究に関しては、移動相の最適化は実施しなかった。しかしながら、移動相を変化させると、特に非水性溶離液系での水性またはプロトン活性におけるpHに関して、溶出の分析物質-特異的最適化及び両性イオン性溶質の分離が可能になると予想される。
クロマトグラフィーの結果及び溶質の構造はいずれも表３に示されているが、これらの結果を詳細に考察する前に、幾つかの追加の情報を提供すべきである。対照実験では、CSPの両方の親タイプ(図１参照)を、塩基性及び両性イオン性溶質に関してそのエナンチオマー分離能-キニン-ベースのWAX、並びに表1〜3の酸性及び両性イオン性分析物質に対して2-アミノシクロヘキサンスルホン酸-ベースのSCXに関して試験した。WAX型CSP上に注入された塩基性分析物質はカラムの空隙容量の直前に溶出され、このことは誘引力にもかかわらず、僅かに反発があることを示しており、エナンチオ分離しなかった。SCX型CSPに注入された酸性溶質は同様の挙動を示した。これらの知見は、SO及び溶質の両方が同一記号の電荷を保持する場合、顕著に静電気反発が起き、溶質はCSPにより保持されるのではなく排除される。所定の弱酸性移動相条件下における両性イオン性分析物質に関しては、新規両性イオン性CSPを使用するときとは異なり、いずれのCSPにおいても非常に弱い保持力のみで、エナンチオ選択は観察されなかった(対応するデータは示されていない)。これらの知見は溶質の両方の帯電部位、プロトン化アミン及び解離した酸が、CSP1〜5の同様に二重にイオン化した両性イオン性SOによって同時に類似と識別されること、及びこの二重イオン相互作用は、両性イオン性CSP1〜5において両性イオン性分析物質の知見されたエナンチオ分離の基本であるという結論を導く。表３に示されている全ての化合物に関しては、ベースライン分離または少なくとも部分的な分離が、5種の両性イオン性CSPの一つに対して達成できた。一連の分析物質は非常に雑多であるため、キラル両性イオン性分析物質のエナンチオマー分離に関する広範な適用性が新規両性イオン性CSPに関して選定できた。もちろんカラム性能は、様々なCSPの間及び分析物質それぞれに対して同じように割り当てられていない。たとえば分析物質の構造の中での傾向に関しては、トリプトファン及びその誘導体の群は非常によく分離できたが、フェニルアラニン及びチロシンのような芳香族基を含む他のアミノ酸に関しては、エナンチオ選択性は低く、必ずしも分離できるとは限らなかった。さらに、2級アミン基をもつ環式アミノ酸は、そのより剛直な構造によるためか、ロイシン-及びグリシン-型の非環式脂肪族アミノ酸よりも幾らかよく分離された。それでもトランス-2-アミノシクロヘキサンスルホン酸(エントリー33)、CSP3及び4のSOの本質的な部分である部分に関してはまったく分離は起きなかったが、1,2-ジメチルタウリン(エントリー37)、酸性対応物に関しては、かなり優れたエナンチオ選択性が観察されたことは意外であった。より一般的な観察は、α-アルキル置換α-アミノ酸に関しては、フェニルアミン(エントリー13及び14)またはチロシン(エントリー18及び28)に関して見られるように、非置換化合物と比較してエナンチオ選択性は明らかに増加したということであった。
全体として、分離は時折ピークテーリングがあり、エナンチオ選択性がかなりよいにもかかわらず、追加の官能基を保持するエフロルニチン(eflornithine)及び他のアミノ酸の場合などでは、ベースライン分離は観察できなかった。H-結合ドナーまたはアクセプターとして機能を果たし得る追加の帯電または部分的に帯電した基及び官能基は両性イオン性分析物質及びSOの正確に方向付けられた結合を邪魔するかもしれないので、脱着速度論の低下につながる。移動相及びそのpHまたはプロトン活性を最適調整すると、そのような現象を減少させると予想されるが、本研究において詳細に研究しなかった。
本研究において示されたCSPは、弱カチオン/弱アニオン交換体(CSP1)に対してか、または強カチオン/弱アニオン交換体(CSP2〜5)のいずれかに関する。これに関連して、強カチオン交換体と強アニオン交換体部分、即ちCSP2〜4のようなスルホン酸と、四級化キヌクリジン窒素の両方からなる両性イオン性SOは、非常に優れているかもしれず、現在、本出願人グループにより研究中である。
分析物質の構造の観点から表３に示されているデータを詳しく調査することに加えて、CSPのセレクターの構造的な差異並びに、エナンチオ分離及びクロマトグラフィーの因果関係についても考慮しなければならない。
CSP1及びCSP2は、両性イオン性SO内のカルボン酸とスルホン酸官能基を比較する目的に関して合成して試験した。そのSOは構造的に類似であるが、その酸性官能基の型においてのみ異なっており(図１)、いずれのCSPも同様のSO充填であるので、直接比較が可能である。表３の結果は、CSP1及び2の分離性能において顕著な差を示している。保持因子(retention factor)は、スルホン酸ベースのCSP2よりもカルボン酸ベースのCSP1において常に小さい。明らかに、SOの強酸部分は、所定の移動相条件下では両性イオン性分析物質の塩基性置換基との強いイオン相互作用をもたらす。さらにエントリー28(表３)から例示されるように、CSP2はエナンチオ選択性が同様であってもよいピーク効果を提供し、著しく改良された分割を例外なく保持する。CSP1は移動相最適化の影響を最も受けやすいが、スルホン酸官能基は簡便な両性イオン性CSPにより適している。CSP3及び4はいずれもキニン-及びトランス-2-アミノシクロヘキサンスルホン酸-ベースのセレクターに依存しているが、酸の部分の中の反対の構造のため、ジアステレオマーである。その構造的類似性にもかかわらず、これらは両性イオン性分析物質と結合するとエナンチオ選択性に差異を示すと予想される。直接比較を支持するものは、両方の対応するCSP3及び4に対して殆ど同一のSO充填である。CSP3が表３由来のたった一つの分析物質(エントリー31)を除き全てに関してより大きな保持因子を示すことは意外であった。おそらく、CSP3の両性イオン性結合部位の立体幾何学により、CSP4と比較してアミノ酸及びペプチドが全体としてより強く結合できたのだろう。原理上は、より強い結合は必ずしもより高いエナンチオ選択性を意味しない。しかしながら、全ての分析物質のおよそ75%はCSP4よりもCSP3上でよく分離される。
全体としてみれば、本研究において示した全てのCSPの中でも、CSP3は分離の多くと最高の分離のいずれをも提供する。従って、合成的に最適化されたキラルSO構造体の可能性を実証し、さらなるセレクター設計及び合成を誘導できた。表３からの上記考察データの補足説明として、CSP3を使用するβ-アミノ酸(β-ネオペンチルグリシン、エントリー12)、環式アミノ酸(プロリン、エントリー29)及びトリプトファン(エントリー35)のエナンチオマー分離の選択クロマトグラムを図４に示す。
溶出順序は、キラル識別のメカニズムを解明するために、そして本件においてはエナンチオ選択的相互作用がCSP1〜5のシリーズにおけるSOの様々な酸性及び塩基性サブユニットに起因すると考える必要な情報である。従って、表３由来の数種の分析物質の溶出順序を測定した。最初に酸サブユニットの影響を考慮すべきである、というのもCSP3及び4の酸性部分は反対の配置であり、潜在的に溶出順序に影響を与え得たからである。上記考察のように、CSP3と4は保持及び両性イオン性溶質の分析において選択性も異なる。さらに二つのシクロヘキサンスルホン酸ベースの材料の間では、両性アミノ酸分析物質に対して溶出順序の変化は観察されなかった。このことは、キラル酸性部分は重要であるが、両性イオン性エナンチオ識別プロセスでは優勢ではないことを示している。さらにアキラル酸性部分を含むCSP1及び2もCSP3及び4のような同一溶出順序を示す。言い換えれば、キニンモチーフを用いる四つ全てのCSPは同一溶出順序を提供する。キニジンをベースとし、且つCSP2に対して擬似エナンチオマーであるCSP5だけに関しては、両性イオン性溶質の溶出順序は逆転する。これらの知見は、アルカロイド配置(geometry)が、キラル酸性分析物質だけでなく、キラル両性イオン性及び両性化合物に対してもキラル識別及びエナンチオマー識別(differentiation)の核心であることを強く示唆している。
本研究で示された新規種類のキラル両性イオン性固定相は、キラル酸またはキラルアミンだけでなく、その両方と、相乗的に支持された(synergistically supported)イオン対(イオン交換体)-媒介プロセスによって、さらに両性イオン性化合物を分離する卓越したエナンチオ選択特性を示す。図５は、CSP3で得られたキラル塩基性薬剤メフロキン、N-保護化フェニルアラニン、及び遊離アミノ酸のエナンチオマー分離のクロマトグラフのこれらの特徴を示す。
図６は、新規両性イオン性分離材料、CSP4とその親の、純粋なカチオン及びアニオン交換体CSP SCX及びQN-AXの比較を示す(図１参照)。明らかに、溶出挙動は、CSP4のキラルセレクター構造内に存在する分子内対イオンにより、大きく変化した。エナンチオ選択性は、キラルカチオン及びアニオン交換体基礎構造(substructure)を単一のキラルセレクターに融合する際に十分に保持できた。
結論
両性イオン性SOをベースとする新規イオン交換体型CSPを製造し、HPLCにおいてキラル酸、キラルアミン及びキラルアミノ酸のエナンチオマー分離に関して評価した。
両性イオン性SOをベースとする新規イオン交換体型CSPを製造し、HPLCにおいてキラル酸、キラルアミン及びキラルアミノ酸のエナンチオマー分離に関して評価した。
本発明のSOは、単一キラル化合物内でのカチオン-及びアニオン交換体SOモチーフの組み合わせに似ている。これらの合成は、慣用で市販の出発物質を使用して容易である。同種の弱イオン交換体CSPの典型的な酸性分析物質であるN-ブロック化アミノ酸の分離のためのエナンチオ選択性は大部分保持できたが、N-誘導体形成基(derivatizing group)の影響及び溶出順序における結果は、シンコナカルバメート型CSPに関して記載されたように、基本的に変化のない結合メカニズムを示す。キラルアミンに対するエナンチオ選択性は、先に報告された親SCX CSPと匹敵しえる様式で、新規両性イオン性CSPによっても達成できた。
さらに本発明によって、二重イオン対プロセスによって両性イオン性分析物質のエナンチオ選択が可能である。様々なタイプ及び構造の40アミノ酸並びにジペプチドのベースライン分離または少なくとも部分的分離が新規両性イオン性CSP1〜5で達成できた。根本的な分子認識メカニズムはSOのアルカロイド基礎構造により影響を受けるが、分離は、酸性側鎖のそれぞれの担体の組み合わせでのみ起き得るという一般的な分離概念を誘導できた。本明細書中で研究された両性イオン性CSPの中でも、CSP3は、酸、塩基及びアミノ酸の最高のエナンチオ分離を提供した。
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Claims (9)
- 少なくとも一つのカチオン交換基と少なくとも一つのアニオン交換基とを含むキラルセレクター成分(SO)と、前記セレクター成分を保持するキャリヤとを含むエナンチオ選択的両性イオン的イオン交換材料であって、
前記キラルセレクター成分は非-大環状形状で前記イオン交換基を接続するための少なくとも一つのキラルリンカー部分を含み、及び
前記キラルリンカー部分は少なくとも一つのπ-π相互作用部位を含有する、前記エナンチオ選択的両性イオン性イオン交換材料。 - 前記少なくとも一つのカチオン交換基がpka＜5.5をもち、且つ前記少なくとも一つのアニオン交換基がpka＞8.0をもつ、請求項１に記載のエナンチオ選択的両性イオン性イオン交換材料。
- 前記カチオン交換基がpka＜3.0をもち、且つ前記アニオン交換基がpka＞8.0をもつ、請求項２に記載のエナンチオ選択的両性イオン性イオン交換材料。
- 前記セレクター化合物SOがpka値＜5.5の少なくとも二つの酸性基と、pka＞8.0の少なくとも一つの塩基性基とを含む、請求項１〜３に記載のエナンチオ選択的両性イオン性イオン交換材料。
- 前記セレクター化合物SOがpka値＞8.0の少なくとも二つの塩基性基と、pka＜5.5の少なくとも一つの酸性基とを含む、請求項１〜４に記載のエナンチオ選択的両性イオン性イオン交換材料。
- 前記カチオン交換基がカルボン酸、スルホン酸、スルフィン酸、燐酸、ホスホン酸またはホスフィン酸基であることを特徴とする、請求項１〜５に記載のエナンチオ選択的両性イオン性イオン交換材料。
- 前記アニオン交換基が一級、二級、三級または四級アミノ基であることを特徴とする、請求項１〜５に記載のエナンチオ選択的両性イオン性イオン交換材料。
- 前記少なくとも一つのアニオン交換基がキニンまたはキニジン残基である、請求項１〜７に記載のエナンチオ選択的両性イオン性イオン交換材料。
- 前記少なくとも一つのカチオン交換基がスルホン酸基である、請求項１〜８に記載のエナンチオ選択的両性イオン性イオン交換材料。
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