JP2011522524A - 化合物又は製剤における造血プロスタグランジンｄシンターゼの有力リガンドを置換する能力をアッセイする方法 - Google Patents

化合物又は製剤における造血プロスタグランジンｄシンターゼの有力リガンドを置換する能力をアッセイする方法 Download PDF

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Abstract

【解決手段】例示的な実施形態は、蛍光偏光アッセイに関するもので、化合物又は製剤について、それらの造血プロスタグランディンＤシンターゼ（Ｈ−ＰＧＤＳ）に対する親和性を、Ｈ−ＰＧＤＳの一次アミノ酸配列を含む酵素と結合されたフルオロフォア含有検出検体の置換能力に基づいてスクリーニングするものである。他の例示的な実施形態は、Ｎ末端に融合されたマルトース結合タンパクアミノ酸配列を有する酵素を利用するものである。
【選択図】図７

Description

本発明は、造血プロスタグランジンＤシンターゼ（Ｈ−ＰＧＤＳ）に親和性の化合物のスクリーニングに対する蛍光偏光アッセイに関するものである。
プロスタグランジンＤ2（ＰＧＤ2）は、自然発生のプロスタグランジンであり、アレルギーや炎症性疾患内で媒体であることが示されている［Spik,I.,Brenuchon,C.,Angeli,V.,et al.J.Immunol.,2005,174,3703-3708;Urade,Y.,Hayaishi,O.Vitamin and Hormones,2000,58,89-120］。ＰＧＤ2は、プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ（シクロオキシゲナーゼ、ＣＯＸ）とＰＧＤシンターゼ（ＰＧＤＳ）による触媒反応により、アラキドン酸から生成される。ＣＯＸは、アラキドン酸のＰＧＧ2脱酸素化とＰＧＨ2のＰＧＧ2への過酸化の二つの逐次反応を触媒し、その共通の前駆体はプロスタノイドである［Aritaka,K.,Kado,Y.,Inoue,T.,Miyano,M.Urade,Y.J.Biol.Chem.,2006 ,281,15277-15286］。ＰＧＨ2代謝により、ＰＧＥ2、ＰＧＤ2、ＰＧＦ2、ＰＧｌ2及びトロンボキサンＡ2（ＴＸＡ2）となる。
明確に区別される二種類のプロスタグランジンＤシンターゼとして、リポカリンタイプＰＧＤＳ（Ｌ−ＰＧＤＳ）と造血性のＰＧＤＳ（Ｈ−ＰＧＤＳ）があり、これらは、ＰＧＤ2の生成に関与する。Ｌ−ＰＧＤＳとＨ−ＰＧＤＳは、一次アミノ酸配列、細胞局在及び三次構造の点で異なる。Ｌ−ＰＧＤＳはβ−トレースとしても知られ、中枢神経系、男性器、および心臓に局在し、睡眠及び苦痛の調節に関与する［Aritaka et al］。Ｈ−ＰＧＤＳは、肥満細胞、Ｔｈ２細胞、小膠細胞、壊死した筋肉繊維及びアポトーシス平滑筋細胞内に局在するために、アレルギーや炎症反応と関連がある［Aritaka et al., 2006］。Ｈ−ＰＧＤＳは、活性のためにグルタチオンを必要とし、グルタチオンＳトランスフェラーゼのシグマクラスに属する［Kanaoka Y.,Fujimora，K.,Kikuno，R.,et al., Eur.J.Biochem.,2000,267,3315-3322;Kanaoka, Y.,Ago, H.,Inagaki, E., et al., Cell,1997,90,1085-1095;Urade, Y.,Fujimoto, N.,Ujihara, M.,et al.,J.Biol.Chem.,1987,262(8),3820-3825］。ＨＱＬ-７９とトラニラストは両方とも、Ｈ−ＰＧＤＳ阻害剤として広く知られており、該阻害剤で慢性処理されたモルモット肺組織内のＰＧＤ2レベルを低下させることが示されている［Matsushita, N.,Hizue, M.,Aritaka, K.,Hayashi,K.,Takada,A.,Mitui,K.,Hayashi, M.,Hirotsu, I.,Kimura, Y.,Tani, T.,Nakajima, H.Jpn.J.Pharmacol.,1998,78,1-10)］。両阻害剤は、既知のインビトロアッセイにおいて、シンターゼに対するＩＣ50値はミクロモルである。最近の特許出願公開公報に記載されたピリミジンアミド化合物［U.S.Appn.No.2008/0207651 Blake et al.,発明の名称“Heterocyclic Compounds Useful in Treating Disease and Conditions”及びU.S.Appn.No.2008/0227782 Aldous et al.,発明の名称“Pyrimidine Amide Compounds as PGDS Inhibitors”）及びピリジンアミド化合物[U.S.Appn.No.2008/0146569 Blake et al 発明の名称“Nicotinamide Derivatives”）では、Ｈ−ＰＧＤＳ阻害剤のＩＣ50ｓはナノモルである。
現在知られているインビトロＨ−ＰＧＤＳ阻害アッセイは、典型的には、ＰＧＤ2酵素免疫学的検定（ＥＩＡｓ）、蛍光偏光免疫測定法（FPIAS）、又は対応する放射性免疫学測定法（RIAs）を用いて定量することにより、ＰＧＤ2生成を調整する化合物又は製剤の能力を決定するものである。これらの機能アッセイは、Ｈ−ＰＧＤＳを基質として、不安定なＰＧＨ2プロスタノイド先駆物質を利用する。ＰＧＨ2は、ＰＧＤ2及びＰＧＥ2に非酵素的に転換されるので、ＰＧＤ2の非酵素的生成を最小とするために、ＰＧＨ2からＰＧＤ2生成を測定するアッセイでは、煩雑で高精度時間反応と急冷処理を行わなければならない。これらのアッセイは、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）には、適していない。
他のインビトロＨ−ＰＧＤＳアッセイでは、例えばクロロジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）またはモノクロロビマネ（ＭＣＢ）のようなグルタチオンＳトランスフェラーゼを使用し、グルタチオンと、ＣＤＮＢ又はＭＣＢとの結合は、それぞれ比色定量法又は蛍光定量法によって測定される［Greig,G.M,Masse,F.,Nantel,F.,et al.,J.Allergy Clin.Immunol.,2006,117(Suppl.2),S66］。この検査方法の制限は、内因生ＧＳＴｓも阻害する阻害剤を選択せざるを得ないことである。ＧＳＴｓは、重要な解毒酵素であり、異物代謝において重要な役割を果たすことが知られており、これらの酵素を阻害することは、毒性学的意義を低下させることになる。ＧＳＴアッセイに固有の他の制限は、これらアッセイの一般的な傾向として、ＧＳＨとは直接結合する(conjugate)が、真核細胞内のＨ−ＰＧＤＳとは結合しない化合物を対象にしていることである。最後に、ＣＤＮＢ及びＭＣＢがＧＳＨと非酵素的に結合する能力は、これらアッセイにおいて、シグナルノイズ比を低下させ、ダイナミックレンジを狭めることである。
既知の細胞ベースのアッセイは、有効性、特異性、及びＨ−ＰＧＤＳモジュレータの細胞毒性を、同時に測定するものであり、ヒトＰＧＤ2が発現されるあらゆるほ乳類細胞株内のアラキドン酸カスケードの刺激を含んでいる［WO2006／15195 Yang et al、発明の名称“Method for Determining the Potency, Specificity, and Toxicity of Hematopoietic D2 synthase”］。
蛍光偏光（ＦＰ）アッセイは、例えば前述した従来の方法と比べて、タンパク質リガンド結合の研究で利点をもたらす。ＦＰアッセイは、リアルタイム測定を可能にし、放射性物質を使用せずにすみ、均質で、例示的には、工程数を少なくすることができ（洗浄工程を必要としない）、検出限界はサブナノモルである。ＦＰアッセイは、現在、新薬発見に用いられており、日常的に、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）フォーマットに変換される［Burke,T.J.,Loniello,K.R.,Beebe,J.A.,Ervin,K.M.Comb.Chem.High Throughput Screen.,2003,6(3),183-194］。
蛍光は、一般的に、発光に関連する多くの現象の内の一つである。蛍光は、発光であり、特定波長（励起波長）の光子の分子吸収が、長波長（低エネルギー）の光子の発光をトリガするのに対し、吸収されたエネルギーの残部は、通常、増加した分子運動又は熱エネルギーに変換される。蛍光を生じさせる蛍光物質の分子成分は、フルオロフォアと呼ばれる。特定周波数の光子（νex）は、フルオロフォアを、その基底状態（Ｓ0）から励起状態（Ｓ1）へと、促進させる。
Ｓ0＋ｈνex → Ｓ1（ｈ＝Planck定数）
蛍光は、フルオロフォアの励起状態の電子から基底状態の遷移時に生じ、長波長、低周波光子（νem）の発光を伴う。
Ｓ1 → ｈνem＋Ｓ0
蛍光偏光の原理は、蛍光分子が偏光により励起されると、その励起寿命が、分子が偏光平面から飛び出す時間よりも短いとき、同じ偏光平面内で光を発することである。高エネルギー状態が、分子が励起平面から飛び出す時間よりも長く存在するとき、光は励起平面とは異なる平面内で発せられ、かなりの偏光解消された信号が検出される。非常に大きくて高質量の分子の場合、発光前に、励起平面の外で回転することは少ないため、高度に偏光された偏光を発し易く、強い偏光信号が生成され易い。小さい分子の場合、緩和(relaxation)と発光前に、励起平面から外へ飛び出すことが多いため、発光の偏光はかなり解消され（励起平面と比較して）、ＦＰ信号は弱くなる。偏光を評価する二つの測定方法が必要とされ、第１の方法は、励起フィルターと平行な偏光発光フィルターを用いること（Ｓ平面）であり、第２の方法は、励起フィルターと直交する偏光発光フィルター（Ｐ平面）を用いることである。蛍光偏光反応は、ｍＰ（ミリ−偏光）レベルとして与えられ、次式から得られる。
偏光（ｍＰ）＝1000×［Ｓ−（Ｇ×Ｐ）］／［Ｓ＋（Ｇ×Ｐ）］
前記式において、Ｓ及びＰは、バックグラウンドが差し引かれた蛍光計数率であり、Ｇ（グレーティング）は、機器とアッセイに依存するファクターである。分子の回転速度は、分子のサイズ、溶液の温度及び粘度に依存する。フルオレセイン、ローダミン、及びＤｙＬｉｇｈｔ(商標名)６３３は、バイオアフィニティアッセイ(例えば受容体リガンド結合アッセイ)において、分子の回転速度に適した蛍光寿命を有する。その基本原理は、検出検体が小さいこと及び回転が速いことである（低偏光）。検出検体が大分子（酵素）に結合すると、回転はかなりスローダウンする（偏光が低偏光から高偏光へ変化する）。
＜発明の要旨＞
一つの例示的な実施形態は、蛍光偏光アッセイ及び該アッセイに関連する使用方法に関するもので、化合物又は製剤について、それらの造血プロスタグランディンＤシンターゼ（Ｈ−ＰＧＤＳ）に対する親和性(affinity)を、Ｈ−ＰＧＤＳの一次アミノ酸配列(primary amino acid sequence)を含むタンパク質に非共有結合されたフルオロフォア含有検出検体の置換能力(ability to displace)に基づいてスクリーニングするものである。
他の例示的実施形態は、Ｈ−ＰＧＤＳに結合するリガンド成分を有するフルオロフォア含有検出検体に関するものである。
他の例示的実施形態は、Ｈ−ＰＧＤＳの一次アミノ酸配列と、分子回転を遅らせる目的で添加し、Ｈ−ＰＧＤＳ活性部位で結合するリガンドに実質的に干渉することなく酵素質量を増大させるアミノ酸配列と、を含む融合酵素に関する。
本発明の他の例示的実施形態は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。詳細な説明及び具体的実施例は、発明の例示的実施形態を開示するもので、例示のみを目的としており、発明の範囲を限定することを企図するものでないことは理解されるべきである。
図１は、例示的な検出検体を調製するために用いられる例示的なフルオロフォア結合剤を示す図である。
図２は、検出検体２−（６−ヒドロキシ-3−オキソ-３Ｈ−キサンテン−９−イル）−5-（２−（３−（（２−フェニルピリミジン−５−カルボキシアミド)メチル)フェニルスルホンアミド)エチルカルバモイル)-安息香酸の一般的合成径路の概要を示す図である。
図３は、例示的な実施形態で用いられるヒトＨ−ＰＧＤＳ酵素（２３ｋＤａ）の一次アミノ酸配列を示す図であり、１文字と３文字は両文字とも略記である。
図４は、検出検体（化合物２０）が一定濃度のとき、増大する偏光（ｍＰ）信号と増大するＨ−ＰＧＤＳ酵素（２３ｋＤａ）濃度の関係をプロットした図である。
図５は、偏光（ｍＰ）信号とＨ−ＰＧＤＳ酵素（２３ｋＤａ）濃度の関係図上に５％ＤＭＳＯの効果をプロットした図である。
図６は、例示的な実施形態で使用されるマルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）−Ｈ−ＰＧＤＳ融合酵素の一次アミノ酸配列を示す図であり、１文字と３文字は両文字とも略記である。
図７は、増大する偏光（ｍＰ）信号と増大するＭＢＰ−Ｈ−ＰＧＤＳ融合酵素（６６ｋＤＡ）濃度との関係を、増大するｍＰ信号と増大するＨ−ＰＧＤＳ酵素（２３ｋＤＡ）濃度との関係と比較してプロットした図である。
図８は、偏光（ｍｐ）信号とＭＢＰ−Ｈ−ＰＧＤＳ融合酵素（６６ｋＤａ）濃度の関係図上に５％ＤＭＳＯの効果をプロットした図である。
図９は、精製されたＨ−ＰＧＤＳ酵素（２３ｋＤａ）及びＭＢＰ−Ｈ−ＰＧＤＳ融合酵素（６６ｋＤａ）についてクマシー染色された１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥであって、二つの酵素のサイズの違いを示す図である。
図１０は、Ｈ−ＰＧＤＳＦＰアッセイにおいて９種の既知のＨ−ＰＧＤＳ阻害剤の試験によって作成された滴下曲線をプロットした図であって、該アッセイについて、様々な効力を有する結合剤を同定する能力を示す図である。
図１１は、新規なＨ−ＰＧＤＳ阻害剤の滴下曲線をプロットした図である。
図１２は、ＦＰ結合アッセイの性能特性を示す図である。
＜発明の詳細な説明＞
例示的な実施の形態は、Ｈ−ＰＧＤＳに対する結合親和性(binding affinity)を有する化合物又は製剤を特定するための蛍光偏光アッセイに関するもので、前記化合物又は製剤は、アレルギー性鼻炎、通年性鼻炎、鼻漏、鼻づまり、鼻炎、すべての種類の鼻炎、ＣＯＰＤ、アレルギー性結膜炎、関節炎、アトピー性皮膚炎及び他のタイプの皮膚炎症、眼の炎症、創傷治癒、皮膚傷、多発性硬化、アルツハイマー病、及び虚血再かん流傷害からの疾患に対する処理において新規な治療を提供する。
この明細書での例示的な実施形態では、化合物又は製剤について、Ｈ−ＰＧＤＳと結合能力を有する検出検体に関して、Ｈ−ＰＧＤＳ親和性のハイスループットスクリーニングを行なうために、均一で、迅速で、一貫性のあるアッセイを提供する。
Ｈ−ＰＧＤＳに対して結合親和性を有する化合物又は製剤を同定する一つの例示的なアッセイ混合物は、Ｈ−ＰＤＧＳに結合する検出検体(フルオロフォア（フルオロフォア部分）に結合され、結合可能性のあるＨ−ＰＧＤＳリガンド成分（酵素結合化合物）を含む）、グルタチオン等の共同因子、ヒト組み換えＨ−ＰＧＤＳの一次アミノ酸配列を含む酵素、及びＨ−ＰＧＤＳに対して結合親和性が知られていない試験化合物又は製剤を含んでいる。例示的なアッセイ混合物は、分子回転を遅くする目的のために、Ｈ−ＰＧＤＳ活性部位(active site)で結合するリガンドと実質的に干渉することなく酵素の質量を増大させる追加のアミノ酸配列を含むこともできる。
他の例示的な実施形態は、例示的なアッセイ混合物で使用可能なヒト組み換えＨ−ＰＧＤＳの一次アミノ酸配列を含む酵素に関する。
さらに他の実施形態は、ヒト組み換えＨ−ＰＧＤＳの一次アミノ酸配列と、例示的なアッセイ混合物で使用可能な上記酵素の質量を増大させるための追加のアミノ酸配列とを含む酵素に関する。
他の例示的な実施形態は、検出検体に関するものである。
現在のアッセイでは、Ｈ−ＰＧＤＳ活性を測定するのにプロスタグランジンＨ2（ＰＧＨ2）等の不安定な基質が用いられているが、本発明では不要である。
これらの化合物又は製剤を同定する１つの例示的方法は、最初に、Ｈ−ＰＤＧＳに結合する検出検体(フルオロフォア（フルオロフォア部分）に結合され、結合可能性のあるＨ−ＰＧＤＳリガンド成分（酵素結合化合物）を含む）、グルタチオン等の共同因子、ヒト組み換えＨ−ＰＧＤＳの一次アミノ酸配列を含む酵素、及び試験化合物又は製剤を含むアッセイ混合物を培養することを含んでいる。次に、アッセイ混合物は、励起波長を有する偏光電磁放射で励起される。次に、アッセイ混合物によって発光された蛍光偏光信号が測定され、該蛍光偏光（ｍＰ）が決定される。最後に、試験化合物又は製剤の濃度に対してｍＰをプロットすることにより、試験化合物又は製剤の結合親和性（ＩＣ50）が決定され、用量反応曲線が作成される（即ち、試験化合物又は製剤の結合親和性が、試験化合物又は製剤を含まないアッセイ混合物と全く同じように作成され測定された基準信号(baseline signal)と対比される）。
検出検体(detection analyte)は、蛍光プローブとも呼ばれ、酵素結合成分とフルオロフォア部分(fluorophore moiety)を含んでいる。検出献体は、両方とも、試験化合物又は製剤と競合的な方法で酵素と結合し、その励起波長を有する光で励起されて蛍光を発する。酵素結合化合物は、関連性ある試験濃度で十分なＦＰ信号を発生させることができる親和性をもつ酵素と結合するあらゆる分子である。
一つの例示的な検出検体酵素を結合する成分は、Ｎ−置換−２−フェニルピリミジン−５−カルボキシアミドを含んでいる。一方、アミド官能基のＮ−置換は、検出検体の酵素との結合親和性能力を維持又は増大させることができ、関連性ある試験濃度で十分なＦＰ信号を発生させることができるあらゆる分子配列であってよい。好ましい置換基として、ベンジル、フェニル、フェネチル、２−ピリジル、３−ピリジル、及び４−ピリジルを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。フルオロフォア又は化合物をフルオロフォアに結合するリンカー部分(linker moiety)との好ましい結合部位(sites of linkage)は、Ｎ置換部分におけるあらゆる開放芳香族位置を含む。より好ましい結合部位は、Ｎ置換部分が化合物のメタ乃至２−フェニルピリミジン−５−カルボキシアミド部分の芳香族炭素原子である。
他の例示的な検出検体酵素を結合する成分は、Ｎ−置換−６−フェニルニコチンアミド分子を含んでいる。一方、アミド官能基のＮ−置換は、検出検体の酵素との結合親和性能力を維持又は増大させることができ、関連性ある試験濃度で十分なＦＰ信号を発生させることができるあらゆる分子配列であってよい。好ましい置換基として、ベンジル、フェニル、フェネチル、２−ピリジル、３−ピリジル、及び４−ピリジルを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。フルオロフォア又は化合物をフルオロフォアに結合するリンカー部分との好ましい結合部位は、Ｎ置換部分におけるあらゆる開放芳香族位置を含む。より好ましい結合部位は、Ｎ置換部分が化合物のメタ乃至６−フェニルニコチンアミド部分の芳香族炭素原子である。
さらに、他の例示的な検出検体酵素を結合する成分は、Ｎ−置換−２−フェノキシピリミジン−５−カルボキシアミドを含んでいる。一方、アミド官能基のＮ−置換は、検出検体の酵素との結合親和性能力を維持又は増大させることができ、関連性ある試験濃度で十分なＦＰ信号を発生させることができるあらゆる分子配列であってよい。好ましい置換基として、ベンジル、フェニル、フェネチル、２−ピリジル、３−ピリジル、及び４−ピリジルを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。フルオロフォア又は化合物をフルオロフォアに結合するリンカー部分との好ましい結合部位は、Ｎ置換部分におけるあらゆる開放芳香族位置を含む。より好ましい結合部位は、Ｎ置換部分が化合物のメタ乃至２−フェノキシピリミジン−５−カルボキシアミド部分の芳香族炭素原子である。
さらに、他の例示的な検出検体酵素を結合する成分は、Ｎ−置換−６−フェノキシニコチンアミド分子を含んでいる。一方、アミド官能基のＮ−置換は、検出検体の酵素との結合親和性能力を維持又は増大させることができ、関連性ある試験濃度で十分なＦＰ信号を発生させることができるあらゆる分子配列であってよい。好ましい置換基として、ベンジル、フェニル、フェネチル、２−ピリジル、３−ピリジル、及び４−ピリジルを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。フルオロフォア又は化合物をフルオロフォアに結合するリンカー部分との好ましい結合部位は、Ｎ置換部分におけるあらゆる開放芳香族位置を含む。より好ましい結合部位は、Ｎ置換部分が化合物のメタ乃至６−フェノキシニコチンアミド部分の芳香族炭素原子である。
他の例示的な検出検体酵素を結合する成分は、Ｎ−置換−４−（３−フルオロベンゾイル）ピペラジン−１−カルボキシアミドを含んでいる。一方、一次尿素官能基のＮ−置換は、検出検体の酵素との結合親和性能力を維持又は増大させることができ、関連性ある試験濃度で十分なＦＰ信号を発生させることができるあらゆる分子配列であってよい。好ましい置換基として、ベンジル、フェニル、フェネチル、２−ピリジル、３−ピリジル、及び４−ピリジルを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。フルオロフォア又は化合物をフルオロフォアに結合するリンカー部分との好ましい結合部位は、Ｎ置換部分におけるあらゆる開放芳香族位置を含む。より好ましい結合部位は、Ｎ置換部分が化合物のメタ乃至４−（３−フルオロベンゾイル）ピペラジン−１−カルボキシアミド部分の芳香族炭素原子である。
他の例示的な検出検体酵素を結合する化合物は、４−（５−ベンゾイル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾル−２−イル）−Ｎ−置換−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボキシアミドを含んでいる。一方、アミド官能基のＮ−置換は、検出検体の酵素との結合親和性能力を維持又は増大させることができ、関連性ある試験濃度で十分なＦＰ信号を発生させることができるあらゆる分子配列であってよい。好ましい置換基として、ベンジル、フェニル、フェネチル、２−ピリジル、３−ピリジル、及び４−ピリジルを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。フルオロフォア又は化合物をフルオロフォアに結合するリンカー部分との好ましい結合部位は、Ｎ置換部分におけるあらゆる開放芳香族位置を含む。より好ましい結合部位は、Ｎ置換部分が化合物のメタ乃至４−（５−ベンゾイル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾル−２−イル）−Ｎ−置換−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボキシアミド部分の芳香族炭素原子である。
他の例示的な検出検体酵素を結合する化合物は、５−（１−置換−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−２−フェニルチアゾール分子を含んでいる。一方、ピラゾール環の１位置でのＮ−置換は、検出検体の酵素との結合親和性能力を維持又は増大させることができ、関連性ある試験濃度で十分なＦＰ信号を発生させることができるあらゆる分子配列であってよい。好ましい置換基として、ベンジル、フェニル、フェネチル、２−ピリジル、３−ピリジル、及び４−ピリジルを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。フルオロフォア又は化合物をフルオロフォアに結合するリンカー部分との好ましい結合部位は、Ｎ置換部分におけるあらゆる開放芳香族位置を含む。より好ましい結合部位は、Ｎ置換部分が化合物のメタ乃至５−（１−置換基−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−２−フェニルチアゾール部分の芳香族炭素原子である。
他の例示的な検出検体酵素を結合する化合物は、５−（２−置換−イミダゾール−４−イル）−２−フェニルピリミジンを含んでいる。一方、イミダゾール環の２位置での置換は、検出検体の酵素との結合親和性能力を維持又は増大させることができ、関連性ある試験濃度で十分なＦＰ信号を発生させることができるあらゆる分子配列であってよい。好ましい置換基として、ベンジル、フェニル、フェネチル、２−ピリジル、３−ピリジル、及び４−ピリジルを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。フルオロフォア又は化合物をフルオロフォアに結合するリンカー部分との好ましい結合部位は、Ｎ置換部分におけるあらゆる開放芳香族位置を含む。より好ましい結合部位は、Ｎ置換部分が化合物のメタ乃至５−（１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−２−フェニルチアゾール部分の芳香族炭素原子である。
フルオロフォア部分は、例えば、励起波長と呼ばれる特定波長の光エネルギーを吸収する分子の成分又は官能基である。励起波長における光の吸収により、フルオロフォアは、基底状態（Ｓ0）よりも高エネルギー電子状態（Ｓ1）で短時間存在することができる。検出検体に対する励起波長の好ましい範囲は、約４７０−６４０ｎｍである。フルオロフォア部分は、脱励起ステップにおいて、異なるが同じ特定波長で光エネルギーを放出し、分子を蛍光発光させることができる。検出検体に対する発光波長(emission wavelength)の好ましい範囲は、約５００−７００ｎｍ（緑−赤の可視光範囲）である。検出検体に対する発光波長のさらに好ましい範囲は、約６００−７００ｎｍ（オレンジ−赤の可視光範囲）である。蛍光寿命は、短時間であり（ナノ秒、すなわち１０-9〜１０-7秒）、フルオロフォアは、基底状態に脱励起する前の励起状態で存在する。フルオロフォアは、例えば、フルオレセイン、テトラメチル、ローダミン、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、テキサスレッド、及びＤｙＬｉｇｈｔ（商標名）６３３を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。表１は、これらフルオロフォアの例を、励起波長、発光波長及び発光色と共に記載している。
Figure 2011522524
好ましい例示的な実施形態で用いる検出検体では、フルオロフォアは、アッセイ混合物励起ステップで放出されるバックグランド偏光の波長とは十分に異なる放出波長を有し、フルオロフォア成分酵素が結合された検出検体により生成されるＦＰ信号の測定値が最大化される。
検出検体の化合物又は製剤成分は、直接的な化学結合を通じて、フルオロフォア成分とリンクされることができる。検出検体は、化合物又は製剤をフルオロフォアと化学的に橋架けするリンカー部分をさらに含むことができる。例示的なリンカー部分として、以下のものを含むが、それらに限定されるものではない。
Figure 2011522524
一つの例示的な実施形態において、検出検体は、２−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−５−（２−（３−（（２−フェニルピリミジン−５−カルボキシアミド）メチル）フェニルスルホンアミド）エチルカルバモイル）安息香酸（実験例６、化合物２０）である。
他の例示的な実施形態において、検出検体は、Ｎ−（３−（Ｎ−（２−（５−カルボニル−Ｘ−ローダミン）アミノ）エチル）スルファモイル）ベンジル）−２−フェニルピリミジン−５−カルボキシアミド（実験例７、化合物２１）である。
さらに他の例示的な実施形態において、検出検体は、Ｎ−（３−（Ｎ−（２−（Dylight(商標)６３３）アミノ）エチル）スルファモイル）ベンジル）−２−フェニルピリミジン−５−カルボキシアミド（実験例８、化合物２２）である。
さらに他の例示的な実施形態において、酵素は、例えば、造血プロスタグランジンＤシンターゼ（Ｈ−ＰＧＤＳ）の一次アミノ酸配列である。例示的な実施形態は、野生型Ｈ−ＰＧＤＳを含むことができるが、そうでない場合は、以後、融合酵素と称するものとする。例示的な融合酵素には、より具体的には、ヒト野生型Ｈ−ＰＧＤＳを含むことができる。融合酵素は、図３に示されるように、酵素のＮ末端又はその近傍にポリヒスチジンタグを含むことができる。例示的な融合酵素は、ヒト野生型Ｈ−ＰＧＤＳの第１残基（メチオニン）及び第２残基（プロリン）との間に挿入されたヘキサヒスチジンタグを含むことができる。
融合酵素の他の例示的な実施形態は、造血プロスタグランジンＤシンターゼ（Ｈ−ＰＧＤＳ）の一次アミノ酸配列と、分子回転(タンブリング)を遅らせる目的で、Ｈ−ＰＧＤＳ活性部位で結合するリガンドに実質的に干渉することなく酵素に質量を追加するアミノ酸配列と、を含んでいる。例示的な融合酵素は、図６に示されるように、Ｈ−ＰＧＤＳのＮ末端と融合されたマルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）アミノ酸配列を含んでいる。
他の例示的な実施形態において、アッセイで用いる酵素濃度は、有用なＦＰ信号を生成するために、図４で示されるように、１ｎＭ〜１０００ｎＭである。
さらに他の実施形態において、アッセイは、共溶媒として、水または水性緩衝溶液に０〜１０体積％のＤＭＳＯをさらに用いることもできるし、また、ＦＰ信号に悪影響を及ぼさない水又は水性緩衝溶液と共にエタノール又はメタノールのような他の共溶媒を用いることできる。それゆえ、化合物のスクリーニング可能範囲は、図５及び図８に示されるように、ピコモルからマイクロモルの範囲となる。
他の例示的な実施形態において、アッセイは、酵素による検出検体の培養をさらに行なうことができ、培養時間は、約５分〜１２０分である。
他の例示的な実施形態において、アッセイは、約０．１ｍＭ〜１０ｍＭ濃度のグルタチオン（ＧＳＨ）を共同因子として用いることもできる。
他の例示的な実施形態において、アッセイは、ｐＨ範囲が約６.６〜８.５で、Ｔｒｉｓ，ＨＥＰＥＳ，リン酸塩、ＭＯＰＳ，Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ及びＴｒｉｓ−ＨＣｌを含む群の緩衝溶液を用いることもできる。
他の例示的な実施形態において、アッセイは、塩化ナトリウム又は塩化カリウム等の一種又は複数種の塩添加剤を１０ｍＭ〜５００ｍＭの濃度範囲内で用いることができる。
他の例示的な実施形態において、アッセイは、ＣＨＡＰＳ等の洗浄添加剤を約０．１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度で用いることもできる。
他の例示的な実施形態において、アッセイは、ＤＴＴ、β−ＭＥ又はＴＣＥＰ等の還元剤を０．１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度で用いることもできる。
他の例示的な実施形態において、アッセイは、黒色の非結合プレート表面を用いることができる。
本願で用いられる略記の意味は次のとおりである。
Ａｃは、アセチルである。
β−ＭＥは、ベータ−メルカプトエタノールである。
Ｂｏｃは、ブチルオキシカルボニルである。
ＢＳＡは、ウシ血清アルブミンである。
ＣＨＡＰＳは、３［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−プロパンスルフォン酸である。
ＣＨ2Ｃｌ2は、ジクロロメタンである。
ＣＨ3ＣＮは、アセトニトリルである。
ＣＤＣｌ3は、重クロロフォルムである。
ＤＣＣは、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドである。
ＤＭＥは、１，２−ジメトキシエタンである。
ＤＭＦは、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドである。
ＤＭＳＯは、ジメチル・スルホキシドである。
ＤＴＴは、ジチオスレイトールである。
ＥＤＡＣは、Ｎ−（３-ジメチルアミノプロピル)−Ｎ’−エチルカルボジイミドクロイドである。
ＥＤＴＡは、エチレンジアミン４酢酸である。
ＥＩＡは、酵素免疫測定法である。
Ｅｔは、エチルである。
Ｅｔ3Ｎは、トリエチルアミンである。
ＨＣｌは、塩化水素である。
ＨＥＰＥＳは、４−（２−ヒドロキシエチル）−１ピペラジンエタンスルホン酸である。
ＨＯＢｔは、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールである。
Ｍｅは、メチルである。
ＭｅＯＨは、メタノールである。
ＭＯＰＳは、３−（Ｎ−モルホリノ)プロパンスルホン酸である。
ＮａＮ3は、アジ化ナトリウムである。
ＮＨＳは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである。
ＮＭＭは、Ｎ−メチルモルホリンである。
Ｐｄ／Ｃは、炭素上のパラジウムである。
Ｐｈは、フェニルである。
Ｒｔもしくはｒｔは、室温である。
ＴＣＥＰは、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸である。
ＴＦＡは、トリフルオロ酢酸である。
トリス−ＨＣｌは、２−アミノ−２（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール塩酸である。
なお、別途定義しない限り、例示的な実施形態に関連して用いられる科学的及び技術的用語は、当該分野の専門家によって共通に理解される意味を有するものとする。
さらに、別途文脈によって必要とされない限り、単数の用語は、複数を含み、複数の用語は、単数を含むものとする。一般的に、ここでの記載と関係のある科学技術および分子生物学的な学術用語は、当該分野で広く知られ用いられている用語である。
本発明の実施形態における上記の記載は、単なる例示であるから、その変形例は、本発明の精神及び範囲から逸脱するものとみなされるべきでない。
質量スペクトル（ＭＳ）は、Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ ＬＣＱ質量分析計を用いて得られた（ｃｌａｓｓｉｃ シリアル番号は、ＬＣ０００９３０である）。
核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ（３００ＭＨｚ）又はＶａｒｉａｎＩＮＯＶＡ（４００ＭＨＺ）核磁気共鳴スペクトルメータのいずれかを用いて得られた。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析分離は、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣで行ない、次にＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＧ１３１５Ｂ Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ ＤｅｔｅｃｔｏｒをＵＶmax＠６３３ｎｍで実施した。
＜実験例１： 蛍光偏光アッセイ＞
検出検体及びＨ−ＰＧＤＳ−ＭＢＰ融合酵素を、還元グルタチオン（５ｍＭ）の存在下で、３０−６０分間、室温で培養し、ＦＰを、吸光度、蛍光、蛍光偏光及びＦＲＥＴ機能装備されたＴＥＣＡＮ ＳＡＦＩＲＥ２プレートリーダを用いて測定した。アッセイは、９６ウェルのマイクロタイタープレートの中で行ない、全試料体積は１００μｌである。使用した検出検体に適した励起と発光波長を用いた。
｛ステップ１：製剤の準備｝
（ａ）検出検体：Ｈ−ＰＧＤＳ ＦＰ 蛍光プローブ−緑
ＦＰ緩衝剤濃縮物（４×（２００ｍＭＴｒｉｓ ｐＨ8.0，２００ｍＭ塩化カリウム，２０ｍＭＣＨＡＰＳ，４０ｍＭＤＴＴ）,Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．６０００２８， ６ｍｌ)を、脱イオン水（１８ｍｌ）で希釈し、１×ＦＰ緩衝剤(２４ｍＬ)を得た。
無水エタノール（２０μＬ，１００μｇ／ｍｌ）内に２−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−５−（２−（３−（（２−フェニルピリミジン−５−カルボキシアミド）メチル）フェニルスルホンアミド）エチルカルバモイル）安息香酸（化合物２０，実験例６参照，２μｇ）からなる溶液を、１×ＦＰ緩衝剤（１８０μＬ）で希釈し、Ｈ−ＰＧＤＳＦＰ蛍光プローブ−緑試薬を調製した。
（ｂ）酵素；ＭＢＰ−Ｈ−ＰＧＤＳ融合
Ｈ−ＰＧＤＳ−マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ；１００μｌ，０．５ｍｇ／ｍｌ）融合（ＭＢＰ−Ｈ−ＰＧＤＳ融合）（図６）を、１×ＦＰ緩衝剤（９００μｌ）で希釈した。
（ｃ）ＨＱＬ−７９ＦＰ陽性対照
１２本の清浄なマイクロフュージチューブに、Ａ１〜Ａ１２のラベルを付した。５ｍＭ４-（ジフェニルメトキシ）−１−［３−（１Ｈ−テトラゾル−５−イル）プロピル−ピペリジン］（ＨＱＬ−７９）を含むジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ６０００２７，１００μＬ）を、チューブＡ１２に加えた。ジメチルスルフォキシド（５０μｌ）を、チューブＡ１〜Ａ１１の各々に加えた。ＨＱＬ−７９対照溶液の連続的希釈は、まず、チューブＡ１２から５０μＬ取り除き、取り除いたものをＡ１１の中に入れ、次にチューブＡ１１の内容物と十分に混合することにより行なった。次に、チューブＡ１１から５０μｌを取り除いて、チューブＡ１０の中に入れ、チューブＡ１０の内容物と十分に混合した。このプロセスを、チューブＡ９からＡ２についても繰り返し行なった。
（ｄ）グルタチオン（ＧＳＨ）溶液
１００ｍＭの水性（脱イオン水）グルタチオン溶液（バイアル内に１５００μｌ）を、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．６０００２９）から入手した。
｛ステップ２：アッセイ混合物の調製｝
５０ｍＬ円錐チューブ内に、Ｈ−ＰＧＤＳ１×ＦＰ緩衝剤（１８．６５ｍＬ）、Ｈ−ＰＧＤＳ ＦＰ蛍光プローブ−緑（１３８μｌ）、ＭＢＰ−Ｈ−ＰＧＤＳ融合希釈物（８８０μＬ）、及びグルタチオン溶液（１２５０μｌ）を加えた。調製された混合物は、標準の９６ウェル、３８４ウェル又は高密度プレートのどれに対しても十分な量であった。
｛ステップ３：試験化合物溶液の調製｝
滴定終点が不明な試験化合物については、数種類の濃度のＤＭＳＯ、エタノール、又はメタノールに溶解させることもできる。各阻害剤のウェルの中に最後の２．５μｌを加えた。
｛ステップ４：アッセイプロトコル（３８４−ウェルプレート形式）｝
（ａ）アッセイ混合物の分配
アッセイ混合物（４７．５μｌ）を、プレートウェルに加えた。
（ｂ）最大結合（１００％活性）ウェルの調製
マイクロフュージチューブＡ１のＤＭＳＯ（２．５μｌ）を、プレートウェルＡ１及びＢ１に加えた。
（ｃ）ＨＱＬ陽性対照溶液の分配
マイクロフュージチューブＡ２の陽性対照溶液（２．５μｌ）を、プレートウェルＡ２とＢ２の各々に加えた。マイクロフュージチューブＡ３の陽性対照溶液（２．５μｌ）を、プレートウェルＡ３及びＢ３の各々に加えた。この手順は、陽性対照の標準希釈物が全て部分標本化(aliquoted)等分されるまで続けて行なった。
（ｄ）試験化合物溶液の分配
試験化合物溶液（２．５μｌ）を、ウェルに加えた。各試験化合物濃度のアッセイは、典型的には、２倍又は３倍で行なった。特定の試験化合物のＩＣ50は、全濃度滴下と陽性対照溶液の全濃度滴下を実施することによって得られる。試験化合物の一濃度と最大結合ウェルの比較により、ＭＢＰ−Ｈ−ＰＧＤＳに対する試験化合物の相対的な親和性を評価した。
（ｅ）培養
プレートを、６０分−９０分間、カバーを付けて、室温で培養した。ＦＰ信号は、少なくとも２時間安定している。
（ｆ）プレートの読出し
プレートは、４７０ｎｍの励起波長と５３０ｎｍの発光波長での値を示す（フルオレセイン蛍光を含む検出検体に対して）。測定は、蛍光偏光モードで行ない、ｚ高さをウェルの中央にセットし、Ｇ−ファクターをＴｅｃａｎＳａｆｉｒｅ２リーダの１．１３にセットした。
｛ステップ５：分析（上記ステップ４参照）｝
（ａ）計算
分子の蛍光偏光を、以下のように定義する。
偏光（mＰ）＝１０００×（I平衡−I直交）／（I平衡＋I直交）
前記式において、I平衡 は、平行発光強度測定結果で、I直交は、直交発光強度測定結果である。
半対数軸上においてｍＰと試験化合物濃度の関係をプロットすると、競合結合アッセイの典型的なＳ字状用量反応曲線が得られる。このデータは、４パラメータロジスティック式と一致する。
全滴定曲線を実行すると、ｍＰ信号が５０％減少した試験化合物濃度が、試験をした各試験化合物のグラフから推定される。
１種類のみ又は２種類の濃度で、試験化合物を試験をすると、相対的効率は、以下の式を用いて、推定することができる。
信号減少％＝１００×（ｍＰ１００％活性−ｍＰサンプル）／（ｍＰ１００％活性）
＜Ｂ．性能特性：Ｚ'−ファクター＞
Ｚ'−ファクターは、アッセイの品質を記載するのに用いられる用語［Hohwy,M.,Spadola,L.,Lundquist,B.er al.,J Medicinal Chem., 2008,51(7),2178-2186］であり、以下の式を用いて計算される。
Ｚ'＝１−［（３σC+＋３σC-）／｜μC+−μC-｜］
Ｚ'−ファクターは、陽性（Ｃ＋）対照と陰性（Ｃ−）対照の両方について平均と標準偏差の４つのパラメータ（μC+，σC+，とμC-，σC-）から計算される。Ｚ'−ファクターの理論的上限は、１．０である。ロバストアッセイは、Ｚ'ファクター＞０．５である［Zhang,J.H.,Chung,T.D.Y.,and Oldenburg,K.R.J.Biomolecular Screening, 1999,4(2),67-73］。このアッセイのＺ'−ファクターは、実験例に記載された蛍光プローブ−緑を使用し、０．７９であった（図１２）。また、発光波長と背景光を有するカラーとの間の干渉を回避するために、所望により、他の検出検体（蛍光プローブ）を用いることもできる。次の表２は、実験例１に開示された方法を用いてスクリーニングされた様々な化合物の化合物の試験データを記録したものである。
Figure 2011522524
Figure 2011522524
 a) WO 2007/041634 to Aldous et al., entitled "Pyrimidine Amide Compounds as PGDS Inhibitors", Example 1 ; Inhibition of PGH2 -> PGD2, EIA assay (Cayman Chemical,Catalog No. 500151 (Publication Date: May 14, 2003) to measure PGD2 levels (Aventis)
b) Aritake, K., Kado, Y., Inoue, T., Miyano, M., Urade, Y., J. Biol. Chem., 2006, 287(22), 15277-15286; Inhibition of [1-14C]PGH2 -> [1-14C]PGD2, RIA assay (Osaka Bioscience Institute)
c) WO 2008/104869 to Blake et al., entitled "Nicotinamide Derivatives as Inhibitors of H- PGDS and Their Use for Treating Prostaglandin D2 Mediated Diseases", Example 12; Inhibition of PGH2 -> PGD2, fluorescence intensity assay (U.S.Pat. Appn. No. 2004/1 52148 to Lambalot, entitled ") to measure remaining PGH2 levels by Fe(II) reduction of PGH2 to malondialdehyde (MDA) and formation of fluorescent complex 2-thiobarbituric acid (TBA)-MDA (Pfizer)
d) WO 2008/075172 to Blake et al., entitled "Nicotinamide Derivatives", Example 8; Inhibition of PGH2 -> PGD2, fluorescence intensity assay (USPat. Appn. No. 2004/1 52148 by Lambalot) (Pfizer)
e) WO 2008/075172 to Blake et al., entitled "Nicotinamide Derivatives", Example 29; Inhibition of PGH2 -> PGD2, fluorescence intensity assay (U.S.Pat. Appn. No. 2004/1 52148 by Lambalot) (Pfizer)
f) Abstract MEDI 26 (poster) Division of Medicinal Chemistry, American Chemical Society National Meeting, New Orleans, LA, April 6-10, 2008; Example 36 (Taiho)
g) WO 2008/122787 to Babette et al., entitled "Piperazine Compounds for Inhibition of Haematopoietic D Synthetase", Example 80; GSH-MCB conjugation measured by fluorometry (Evotec)
h) AU Pat. App. No. 2006/267454 to Keiko et al., entitled "Benzoimidazole Compound Capable of Inhibiting Prostaglandin D Synthetase, Example 34 (Taiho)
i) Hohwy, M., Spadola, L., Lundquist, B. et al., J. Medicinal Chem., 2008, 57(7), 2178-2186;Compound 13; GSH-MCB conjugation measured by fluorometry (AstraZeneca)
＜実験例２：２−フェニル−Ｎ−（２−（フェニルアミノ）エチル）ピリミジン−５−カルボキシアミド（化合物１０）の調製＞
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１５ｍＬ）の中に２−フエニルピリミジン−５−カルボン酸からなる撹拌混合物２００ｍｇ［化合物１７；WO 2007/041634 aldous et al.,発明の名称“Pyrimidine Amide Compounds as PGDS Inhibitors”の実験例１、ステップ１−３に記載されたとおり合成］に対し、Ｎ−メチルモルフォリン（Ａｌｄｒｉｃｈ，０．３３ｍＬ）、Ｎ−フェネチレンジアミン（Ａｃｒｏｓ，１７３ｍｇ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾル（２０９ｍｇ）、及び１−（３−ジメチルアミノ−プロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）を順次加えた。反応混合物を、アルゴン雰囲気下で、一晩撹拌し、次に、減圧下で、少しだけ濃縮した。濃縮物は、酢酸エチル（２００ｍＬ）と飽和重炭酸ナトリウム（２００ｍＬ）に分別した。層を分離し、有機相を、水（２×２００ｍＬ）で２回洗浄し、ブライン溶液（２００ｍＬ）で１回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮して、オフホワイト固体を得る。室温で、少量の無水エタノールと共に粉末化し、真空ろ過により回収し、真空乾燥することにより、表題化合物を白色粉末として得た（０．２３０ｇ、収率７２．３％）；１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ3）δ９．１３（ｓ，２Ｈ），８．５１（ｄｄ，２Ｈ）、７．６１−７．５１（ｍ，３Ｈ）、７．２１（ｔ，２Ｈ），６．７９（ｔ，１Ｈ）、６．７０（ｄ，２Ｈ）６．５７（ｂｒｏａｄ ｍ，１Ｈ），３．９９（ｂｒｏａｄ ｍ，１Ｈ），３．７５（ｍ，２Ｈ）３．４８（ｔ， ２Ｈ）；ＭＳ（ＡＰＣＩ+）ｍ／ｚ３１９。
＜実験例３：Ｎ−ベンジル−２−（３−フルオロフェニル）−４−メチルチアゾール−５−カルボキシアミド（化合物１１）の調製＞
｛ステップ１：Ｎ−ベンジル−２−ブロモ−４−メチルチアゾール−５−カルボキシアミドの調製｝
Figure 2011522524
 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの中に２−ブロモ−４−メチルチアゾール−５−カルボン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，１．０ｇ）、１−（３−ジメチルアミノ−プロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ、１．３ｇ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾル（０．６１３ｇ）、Ｎ-メチル−２−ピロリジノン（０．４８ｍＬ）からなる混合物に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）内にベンジルアミン（０．５４ｍＬ）からなる混合物を加えた。反応混合物を、室温で、一晩撹拌し、次に、酢酸エチル（２００ｍＬ）と水（２００ｍＬ）に分別した。層を分離し、有機相を、さらに水（２×２００ｍＬ）で２回洗浄し、ブライン溶液（１５０mＬ）で１回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮する事により、表題中間体を粗黄色油として得た（１．８４７ｇ；メジャースポットＲf０.４５、３：１ ｖ/ｖ ヘキサン−酢酸エチル溶媒系）。これを、室温で静置して、凝固させた；ＭＳ（ＥＳＩ-）ｍ／ｚ３１１。
＜ステップ２：Ｎ−ベンジル−２−（３−フルオロフェニル）−４−メチルチアゾール−５−カルボキシアミド（化合物１１）の調製＞
Figure 2011522524
 Ｎ−ベンジル−２−ブロモ−４−メチルチアゾール−５−カルボキシアミド（０．４５ｇ）、３−フルオロフェニルボロン酸（０．４０ｇ）、テトラキシ（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．１６ｇ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１５ｍＬ）及び２Ｍ炭酸セシウム水溶液（２．５ｍＬ）からなる混合物を、９０℃の窒素雰囲気下で、２．５時間撹拌した。室温に冷却した後、混合物を、酢酸エチル（２００ｍＬ）と水（２００ｍＬ）に分別した。この相を分離し、次に、有機相を、エーテル（２００ｍＬ）とブライン溶液（１５０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥して、減圧下で濃縮することにより、濃褐色の固体（０．８９ｇ）を得た。生成物を、フラッシュシリカカラムクロマトグラフィによって、精製した。へキサン中に勾配５％〜１０％の酢酸エチルを有するフラッシュシリカカートリッジSilicycle(登録商標)１２ｇを通して溶出することにより、表題化合物を白色固体として得た（０．３３ｇ，収率７０％）；Ｒｆ０．６８で７：３ｖ／ｖヘキサン−酢酸エチル；1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ3）δ７．７７−７．６０（ｍ,２Ｈ）、７．４７−７．３０（ｍ，６Ｈ），７．１６（ddd，１Ｈ）、６．１０（broad ｔ，１Ｈ），４．６４（ｄ，２Ｈ），２．７８（ｓ、３Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ-）ｍ／ｚ３２５（Ｍ−１）。
＜実験例４：Ｎ−（３．４−ジメソオキシベンジル）−６−フェニルニコチンアミド（化合物１２）の調製＞
｛ステップ１：６−ブロモ−Ｎ−（３，４−ジメソオキシベンジル）ニコチンアミドの調製｝
Figure 2011522524
 ６−ブロモニコチン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，１．５ｇ），Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシカルボジイミド（１．６０ｇ）及びジクロロメタン（１０ｍＬ）からなる混合物に対し、ジクロロメタン（１０ｍＬ）の中にベラトリルアミン（１．２４ｇ）からなる溶液を加え、その後、１−ヒドロキシベンゾトリアゾルを加えた（１００ｍｇ）。反応混合物を、室温で、一晩撹拌した。粗反応混合物を、追加したジクロロメタン（２００ｍＬ）で希釈し、希釈した混合物を、水（２×１００ｍＬ）で２回洗浄し、ブライン溶液（１００ｍＬ）で一回洗浄した。有機相は、次に、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、さらに、減圧下で濃縮して、白色固体を得た。生成物は、酢酸エチルの中で粉末化し、ろ過により収集し、表題中間体を白色固体として得た（２．２２ｇ，収率８５％）。；Ｒｆ０．３５で３：２ｖ／ｖヘキサン−酢酸エチル；ＭＳ（ＥＳＩ-）ｍ／ｚ３４９，３５１。
＜ステップ２：Ｎ-(３，４−ジメソオキシベンジル)−６−フェニルニコチンアミド（化合物１２）の調製＞
Figure 2011522524
 窒素雰囲気下で、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）の中に６−ブロモ−Ｎ−（３，４−ジメソオキシベンジル）ニコチンアミド（１．１１ｇ）、フェニルボロン酸（０．７７ｇ）及びテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．３６５ｇ）からなる混合物に対し、２Ｍ含水炭酸セシウム（６ｍＬ）を加えた。撹拌混合物を、９０℃で２時間加熱し、次に、酢酸エチル（２００ｍＬ）と水（２００ｍＬ）に分別した。この相を分離し、有機相を、水（２×２００ｍＬ）の新鮮部分及びブライン溶液（１５０ｍＬ）で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮して、オレンジ色の固体を得た。固体を、１：１ｖ／ｖヘキサン−酢酸エチルと共に粉末化し、ろ過により収集し、表題化合物を固体として得た（０．４４７ｇ，収率４０．６％）。Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ3）δ９．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１Ｈｚ），８．２０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４，２．４Ｈｚ），８．０５−８．０１（ｍ，２Ｈ），７．８１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４，０．６Ｈｚ），７．５１−７．４７（ｍ，３Ｈ），６．５１（broad ｔ，１Ｈ），４．６２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），３．８９１（ｓ，３Ｈ），３．８８８（ｓ，３Ｈ）；Ｒｆ０．１７、７：３ｖ／ｖヘキサン−酢酸エチル；ＭＳ（ＡＰＣＩ+）ｍ／ｚ３４９（Ｍ＋１）。
＜実験例５：（２−フェニルピリミジン−５−イル）（ピペラジン−１−イル）メタノン（化合物１３）の調製＞
｛ステップ１：［tert］−ブチル４−（２−フェニルピリミジン−５−カルボニル）ピペラジン−１−カルボン酸塩の調製｝
Figure 2011522524
 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３２ｍＬ）の中に［tert］−ブチル−ピペラジン−１−カルボン酸塩（４６５ｍｇ）、２−フェニルピリミジン−５−カルボン酸４５０ｍｇ（化合物１７；ＷＯ２００７／０４１６３４の実験例１、ステップ１−３に記載されたとおり合成）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾル（３０４ｍｇ）及びＮ−メチル−モルホリン（０．２７５ｍＬ）からなる混合物に対し、１−（ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ，６４６ｍｇ）を加え、得られた混合物を３０分間撹拌した。混合物を、酢酸エチル（２５０ｍＬ）で希釈し、水（４×３００ｍＬ）で４回洗浄し、ブライン溶液で１回洗浄した。有機相を乾燥し、ろ過し、減圧下で、濃縮して、表題中間体を白色固体として得た（５８７ｍｇ，収率７１％）。ＭＳ（ＥＳＩ+）ｍ／ｚ３６９（Ｍ＋１）；ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ：２．１×１５０ｍｍ，３μＧｅｍｉｎｉＣ１８；検出波長：２１０ｎｍ；移動相Ａ：９０／１０ Ｈ2Ｏ／ＣＨ3ＣＮ １０ｍＭ ＮＨ4ＯＡｃ：移動相Ｂ：１０／９０ Ｈ2Ｏ／ＣＨ3ＣＮ １０ｍＭ ＮＨ4ＯＡｃ；勾配：０−６分０−１００％Ｂ，６−１０分 １００％Ｂ，１０．１−１５分０％Ｂ；流速：０．２５ｍＬ／ｍｉｎ）純度：９７．２％，反応時間：１１．９分。
＜ステップ２：（２−フェニルピリミジン−５−イル）（ピペラジン−１−イル）メタノン（化合物１３）の調製＞
Figure 2011522524
 ０℃のジクロメタン（８ｍＬ）の中にtert−ブチル４−（２−フェニルピリミジン−５−カルボニル）ピペラジン−１−カルボン酢酸（５８７ｍｇ）からなる混合物に対し、トリフルオロ酢酸（７ｍＬ）を加えた。混合物を、１時間撹拌冷却し、次に減圧下で濃縮して、残留物を得て、得られた残留物を、フラッシュカラムクロマトグラフィで、精製した。０．５％濃縮水酸化アンモニウムを含む９５：５ジクロメタンメタノールで溶出し、表題化合物を得た（４００ｍｇ，収率９４％）；ＭＳ（ＥＳＩ+）ｍ／ｚ３６９（Ｍ＋１）；ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ：２．１×１５０ｍｍ，３μＧｅｍｉｎｉＣ１８；検出波長：２１０ｎｍ；移動相Ａ：９０／１０ Ｈ2Ｏ／ＣＨ3ＣＮ １０ｍＭ ＮＨ4ＯＡｃ；移動相Ｂ：１０／９０ Ｈ2Ｏ／ＣＨ3ＣＮ １０ｍＭ ＮＨ4ＯＡｃ；勾配：０−６分０−１００％Ｂ，６−１０分 １００％Ｂ，１０．１−１５分０％Ｂ；流速：０．２５ｍＬ／min）純度：９８．５％，反応時間：９．７分。
＜実験例６：検出検体２−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−５−（２−（３−（（２フェニルピリミジン−５−カルボキシアミド）メチル）フェニルスルホンアミド）エチルカルバモイル）安息香酸（化合物２０）の調製＞
｛ステップ１：［tert］−ブチル２−（３−シアノフェニルスルホンアミド）−エチルカルバミン酸（化合物１５）の調製｝
Figure 2011522524
 tert−ブチル２-アミノエチルカルバミン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，８３２ｍｇ）、トリエチルアミン（１．４４ｍＬ）及び１，４−ジオキサン（２５ｍＬ）からなる撹拌混合物に、３−シアノベンゼン−１−スルホニルクロリド（化合物１４，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，９４２ｍｇ）を加え、混合物を、一晩撹拌した。溶媒は、減圧下で取り除き、残留物を、酢酸エチルと５％含水水酸化カリウム硫酸塩とに分別した。有機相を、塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、さらなる精製を実施することなく、減圧下で濃縮し、表題中間体（１．５２ｇ）を得た。
＜ステップ２：［tert］−ブチル２−（３−アミノメチル）フェニルスルホンアミド）−エチルカルボン酸（化合物１６）の調製＞
Figure 2011522524
 窒素雰囲気下で、メタノール中に粗tert−ブチル２−３（−シアノフェニルスルホンアミド）−エチルカルボン酸塩（化合物１５，１．５２ｇ）からなる混合物に対し、５％パラジウム炭素（１ｇ）を加えた。水素ガスを、大気圧下で、バルーンを介して供給した。反応混合物を、２時間、激しく撹拌し、次にセライト(Celite)でろ過し、追加のエタノールでリンスした。混合物を、減圧下で濃縮し、シリカクロマトグラフィー（５：９５メタノール−ジクロロメタン）で精製することにより、表題中間体を得た（６５０ｍｇ，２ステップで４２％）。
＜ステップ３：［tert］−ブチル２−（３−（（２−フェニルピリミジン−５−カルボキシアミド）メチル）フェニルスルホンアミド）エチルカルボン酸塩（化合物１８）の調製＞
Figure 2011522524
 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１１ｍＬ）の中に、tert−ブチル２−３−（アミノメチル）フェニルスルホンアミド）エチルカルボン酸（化合物１６，２７８ｍｇ）、２−フェニルピリミジン−５−カルボン酸１８２ｍｇ（化合物１７；ＷＯ２００７／０４１６３４ Aldous et al.，“Pyrimidine Amide Compounds as PGDS Inhibitors”の実験例１、ステップ１−３に記載されたとおり合成）、ＨＯＢｔ(１２３ｍｇ)及びＮ−メチル−モルホリン（０．１１ｍＬ）からなる混合物に対し、１−（ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸水（２８７ｍｇ）を加え、混合物を２．５時間撹拌した。粗反応混合物を、酢酸エチルで希釈し、塩水で洗浄した。有機相を、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、ろ過し、減圧下で、濃縮した。残留物を、シリカクロマトグラフィ（５：９５）で精製して、表題中間体を得た（３６３ｍｇ，８７％）；ＭＳ（ＥＳＩ-）ｍ／ｚ５１０（Ｍ−１）。
＜ステップ４：Ｎ−（３−（Ｎ−（２−アミノエチル）スルファモイル）ベンジル）−２−フェニルピリミジン−５−カルボキシアミド（化合物１９）の調製＞
Figure 2011522524
 ０℃のジクロロメタン（４ｍＬ）の中に、tert−ブチル２−（３−（（２−フェニルピリミジン−５−カルボキシアミド）メチル）フェニルスルホンアミド）エチルカルボン塩酸（化合物１８，３３６ｍｇ）からなる撹拌混合物に対し、トリフルオロ酢酸（４ｍＬ）を加え、混合物を、１．５時間、撹拌した。反応混合物を、飽和重炭酸ナトリウムで急冷し、酢酸エチル内に３回抽出し、塩水で洗浄した。有機相を乾燥し（ＭｇＳＯ4）、ろ過し、減圧下で濃縮した。残留物を、シリカクロマトグラフィ（５：９５メタノール−ジクロモメタン）で精製し、表題中間体を得た（２７０ｍｇ，９０％）；融点１３５−１３７℃；ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ２．５１（ｔ，２Ｈ），２．７２（ｔ、２Ｈ），３．０−４．０（ｂｓ，３Ｈ），４．６１（ｄ，２Ｈ）７．５４−７．６４（ｍ，５Ｈ），７．６８（ｄ，１Ｈ），７．７５（ｓ，１Ｈ），８．４４（ｄｄ，２Ｈ），９．２９（ｓ，２Ｈ），９．５２（ｔ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳI+）ｍ／ｚ４１３（Ｍ＋１）；Ｈ−ＰＧＤＳ−ＭＢＰ ＦＰアッセイIＣ50（検出検体として化合物２０）：２００−３００ｎＭ。
＜ステップ５：２−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−５−（２−（３−（（２−フェニルピリミジン−５−カルボキシアミド）メチル）フェニルスルフォンアミド）エチルカルボアモイル）安息香酸（化合物２０）の調製＞
Figure 2011522524
 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）の中にＮ−（３−（Ｎ−（２−アミノエチル）スルファモイル）ベンジル）−２−フェニルピリミジン−５−カルボキシアミド（化合物１９，８．７ｍｇ）からなる混合物に対し、２５０ｍＭリン酸カリウムバッファ，ｐＨ８（２ｍＬ）と５−カルボキシフルオレセイン、スクシンイミジルエステル（５−ＦＡＭ，ＳＥ；Ｂｉｏｔｉｕｍ ＣａｔａｌｏｇＮｏ．９００２９；１０ｍｇ）を加えた。混合物は、反応が完了するまで、暗室の中で撹拌した。粗生成物を、調製薄層クロマトグラフィーによって精製し（７５：１５：２クロロフォルム−メタノール−水）、表題化合物を得た（約４ｍｇ）；ＭＳ（ＥＳＩ-）ｍ／ｚ７６８（Ｍ−１）。
＜実験例７：検出検体Ｎ−（３−（Ｎ−（２−（５−カルボニル−Ｘ−ローダミン）アミノ）エチル）スルファモイル）ベンジル）−２−フェニルピリミジン−５−カルボキシアミド（化合物２１）の調製＞
Figure 2011522524
 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）の中にＮ−（３−（Ｎ−（２−アミノエチル）スルファモイル）ベンジル）−２−フェニルピリミジン−５−カルボキシアミド（実験例６，上記ステップ４からの化合物１９，５ｍｇ）からなる化合物に対し、２５０ｍＭリン酸カリウムバッファ，ｐＨ８（２ｍＬ）及び、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）内に５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、スクシミジルエステル（１ｍＬ）を加え、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ）でリンスした。混合物を、暗室の中で一晩撹拌した。粗生成物を、調製薄層クロマトグラフィで精製し（７５：１５：２ クロロホルム−メタノール−水）、表題化合物を得た（約２ｍｇ）；ＭＳ（ＥＳＩ-）ｍ／ｚ９２７（Ｍ−１）。
＜実験例８：検出検体Ｎ−（３−（Ｎ−（２−（DyLight（商標） ６３３）アミノ）エチル）スルファモイル）ベンジル）−２−フェニルピリミジン−５−カルボキシアミド（化合物２２）の調製＞
Figure 2011522524
 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１００μＬ）の中にＮ−（３−（Ｎ−（２−アミノエチル）スルファモイル）ベンジル）−２−フェニルピリミジン−５−カルボキシアミド（実験例６，上記ステップ４からの化合物１９，１ｍｇ）からなる混合物に対し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２００μＬ）の中に０．０５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ８．５（４００μＬ）とＤｙＬｉｇｈｔ６３３（商標）ＮＨＳエステル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ４６４１４；１ｍｇ）を加え、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２００μＬ）でリンスした。混合物を、暗室の中で、一晩撹拌した。粗生成物を、逆相調製薄層クロマトグラフィ（溶媒系１：１ｖ／ｖエタノール−水）で精製し、表題化合物を得た；ＭＳ（ＥＳＩ+）ｍ／ｚ１３４１，１３６３（ｍ＋１），１３８５（Ｍ＋Ｎａ+）；ＵＶ−ＶＩＳ（λmax、ｎｍ）２０５，２７５，６２０；ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ２．１×５０ｍｍ，３．５μｍＺｏｒｂａｘＳＢ−Ｃ１８，品番８７１７００−９０２ ，シリアル♯ＵＳＦＣ００２００７７；移動相Ａ：９０：１０：０．１Ｈ2Ｏ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ；移動相Ｂ：９０：１０：０１ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ／ＡｃＯＨ；勾配：０−６分０−１００％Ｂ，６−９分１００％Ｂ，９．１−１５分０％Ｂ：流速０．４ｍＬ／ｍｉｎ；温度：３５℃）純度：１００％，保持時間：５．５１分。
＜実験例９：クローニング，発現，精製，及びＨ−ＰＧＤＳ−ＭＢＳ融合タンパクの特性解析＞
｛ＭＢＰ−Ｈ−ＰＧＤＳプロトコル｝
（a）．クローニング
以下の配列のアミノ酸２−１９９を、ｐＭＡＬ−ｃ２ＸベクターのＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII部位に挿入した：（太字で示されたアクセッション番号ＮＭ014485）。
これは、図６に示されているように、Ｎ末端マルトース結合タンパク質がタグされたヒト造血ＰＧＤＳを生じた。クローンは、次に、発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）星形細胞に形質転換され、グリセロールストックが生成された。推定サイズは、６６．２９ｋＤＡである。
（ｂ）．発現
この蛋白質は、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンが入ったＬＢの中で、上記グリセロールストックを３７℃で培養して得られ、０．４−０．６のＯＤが得られた。培養物には、次に、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）が最終濃度１ｍＭになるまで注入した。注入から約１８時間後、培養物を収穫し、細胞ペレットを−８０℃で保存した。
（ｃ）．精製
細胞ペレットを、２００ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，０．１ｍｇ／ｍｌリゾザイム、及びプロテアーゼ阻害剤混合物を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．４の中で再懸濁し、超音波処理して細胞溶解した。溶解された細胞懸濁液を、次に約３００００×ｇで、３０分間、遠心分離した。懸濁液は、４℃で一晩中振動させて、アミロース樹脂に結合させた。樹脂結合バッファは、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．４であり、２００ｍＭＮａＣｌと１ｍＭＥＤＴＡを含んでいる。樹脂は、次に、結合バッファで３回洗浄し、精製されたＭＢＰ−Ｈ−ＰＧＤＳを、２００ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ及び１０ｍＭマルトースが入れられた２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．４を用いて、溶出した。
（ｄ）．特徴づけ(characterization)
精製されたサンプルの蛋白質濃度を、ＢＣＡ，Ｂｒａｄｆｏｒｄ、及びＡ２８０法を用いて求めた。蛋白質の純度を調べるために、クマシー電気泳動を実施した。ＰＧＨ2 からＰＧＤ2の動的生成(kinetic formation)を用いて比活性度を求め、Ｃａｙｍａｎ製ＰＧＤ2ＥＩＡＫｉｔを用いて定量した。
（ｅ）アッセイ条件（全量１２５μｌを室温下で実施した）
１．緩衝剤：１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０
２．１ｍＭ 還元グルタチオン
３．４０μＭＰＧＨ2
４．１ｍＭ ＭｇＣｌ2
５．９４０ｎｇＭＢＰ−Ｈ−ＰＧＤＳ
ＰＧＨ2で反応を開始し、時間点(time point)は、０秒，１５秒，３０秒及び４５秒である。各時間点では、２０ｍＭＦｅＣｌ2 の中で急冷した。未反応のＰＧＨ2が１２−ＨＨＴへ駆動することによって生じるさ追加の反応を防ぐためである。急冷されたサンプルは、ＰＧＤ2ＥＩＡＫｉｔに使用できるようにするため、ＥＩＡバッファ（０.０１％ＮａＮ3，０．４ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＴＡ及び０．１％ＢＳＡを含む１００ｍＭリン酸塩，ｐＨ７．４）の中で１：５０００に希釈した。

Claims (47)

  1. 試験化合物又は製剤の造血プロスタグランディンＤシンターゼに対する親和性について、試験化合物又は製剤をスクリーニングする方法であって、
    検出検体と、共同因子と、Ｈ−ＰＧＤＳの一次アミノ酸配列を含む酵素と、試験化合物又は製剤と、を含むアッセイ混合物を生成し、
    アッセイ混合物を特定の励起波長で照射して、蛍光偏光信号を生成し、
    アッセイ混合物の照射によって生成された蛍光偏光信号を測定して、測定強度を決定し、
    測定強度から、試験化合物又は製剤の造血プロスタグランディンＤシンターゼに対する結合親和性を決定することを含んでおり、結合親和性は、アッセイ混合物中の酵素に結合されている検出検体を移動させることができる試験化合物又は製剤の能力の関数である、方法。
  2. 結合親和性の決定は、
    検出検体と、共同因子と、Ｈ−ＰＧＤＳの一次アミノ酸配列を含む酵素と、を含む基準アッセイ混合物を生成し、
    基準アッセイ混合物を特定の励起波長で照射して、基準蛍光偏光信号を生成し、
    アッセイ混合物の照射によって生成された基準蛍光偏光信号を測定して、基準測定強度を決定し、
    基準測定強度と測定強度を比較し、測定強度の変化を決定し、
    測定強度の変化から、試験化合物又は製剤の造血プロスタグランディンＤシンターゼに対する結合親和性を決定する、ことを含んでいる請求項１の方法。
  3. 照射されたアッセイ混合物を、測定強度を決定する前に、約５分〜１２０分間培養することをさらに含んでいる請求項１の方法。
  4. アッセイ混合物を、黒色の非結合プレート表面に適用することをさらに含んでいる請求項１の方法。
  5. アッセイ混合物を照射する前に、マルトース結合タンパク質アミノ酸配列を、前記酵素のＮ末端へ融合することを含んでいる請求項１の方法。
  6. Ｈ−ＰＧＤＳは、ヒト組換えＨ−ＰＧＳを含んでいる請求項１の方法。
  7. 試験化合物又は製剤の造血プロスタグランディンＤシンターゼに対する結合親和性を決定するためのアッセイ溶液であって、
    検出検体と、
    共同因子と、
    Ｈ−ＰＧＤＳの一次アミノ酸配列を含む酵素と、
    試験化合物又は製剤とを含んでいる、アッセイ溶液。
  8. Ｈ−ＰＧＤＳは、ヒト組換えＨ−ＰＧＤＳを含んでいる請求項７のアッセイ溶液。
  9. 検出検体は、２−（６−ヒドロキシ-３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−５−（２−（３−（（２−フェニルピリミジン−５−カルボキシアミド）メチル）フェニルスルホンアミド)エチルカルバモイル)-安息香酸を含んでいる請求項７のアッセイ溶液。
  10. 検出検体は、Ｎ−（３−（Ｎ−（２−（５−カルボニル−Ｘ−ローダミン）アミノ）エチル）スルファモイル）ベンジル）−２−フェニルピリミジン−５−カルボキシアミド、を含んでいる請求項７のアッセイ溶液。
  11. 検出検体は、Ｎ（３−（Ｎ−（２−（DyLight(商標名)６３３）アミノ）エチル）スルファモイル）ベンジル）−２−フェニルピリミジン−５−カルボキシアミドを含んでいる請求項７のアッセイ溶液。
  12. 検出検体は、Ｎ−置換−２−フェニルピリミジン−５−カルボキシアミドを含んでいる請求項７のアッセイ溶液。
  13. ＤＭＳＯをさらに含んでいる請求項７のアッセイ溶液。
  14. 共同因子は、グルタチオンを含んでいる請求項７のアッセイ溶液。
  15. アッセイ溶液は、ｐＨ範囲が約６.６〜８.５の緩衝溶液を含み、該緩衝溶液は、Ｔｒｉｓ，ＨＥＰＥＳ，リン酸塩、ＭＯＰＳ，Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ及びＴｒｉｓ−ＨＣｌからなる群から選択される一種又は複数種をさらに含んでいる請求項７のアッセイ溶液。
  16. アッセイ溶液は、一種又は複数種の塩添加剤を約１０ｍＭ〜５００ｍＭの濃度範囲でさらに含んでいる請求項７のアッセイ溶液。
  17. アッセイ溶液は、洗浄剤添加剤を約０．１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度範囲でさらに含んでいる請求項７のアッセイ溶液。
  18. アッセイ溶液は、還元剤を約０．１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度範囲でさらに含んでいる請求項７のアッセイ溶液。
  19. 検出検体は、酵素結合成分及びフルオロフォア部分を含み、酵素結合成分は、アッセイ混合物が照射されると、前記酵素又は試験化合物若しくは試験製剤と結合する請求項７のアッセイ溶液。
  20. 酵素結合成分は、Ｎ−置換−２−フェニルピリミジン−５−カルボキシアミドを含んでいる請求項１９のアッセイ溶液。
  21. 酵素結合成分は、Ｎ−置換−６−フェニルニコチンアミドを含んでいる請求項１９のアッセイ溶液。
  22. 酵素結合成分は、Ｎ−置換−２−フェノキシピリミジン−５−カルボキシアミドを含んでいる請求項１９のアッセイ溶液。
  23. 酵素結合成分は、Ｎ−置換−６−フェノキシニコチンアミドを含んでいる請求項１９のアッセイ溶液。
  24. 酵素結合成分は、Ｎ−置換−４−（３−フルオロベンゾイル）ピペラジン−１−カルボキシアミドを含んでいる請求項１９のアッセイ溶液。
  25. 酵素結合成分は、４−（５−ベンゾイル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾル−２−イル）−Ｎ−置換−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボキシアミドを含んでいる請求項１９のアッセイ溶液。
  26. 酵素結合成分は、５−（１−置換−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−２−フェニルチアゾールを含んでいる請求項１９のアッセイ溶液。
  27. 酵素結合成分は、５−（２−置換−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−２−フェニルピリミジンを含んでいる請求項１９のアッセイ溶液。
  28. Ｈ−ＰＧＤＳ親和性に対する化合物のスクリーニングに用いられ、造血プロスタグランディンＤシンターゼのアミノ酸配列を含む酵素。
  29. 前記酵素は、野生型Ｈ−ＰＧＤＳを含んでいる請求項２８の酵素。
  30. 前記酵素のＮ末端又はその近傍にヒスチジンタグを含んでいる請求項２８の酵素。
  31. 前記酵素は、ヒト野生型Ｈ−ＰＧＤＳを含んでいる請求項２８の酵素。
  32. 野生型Ｈ−ＰＧＤＳのメチオニン群とプロリン群との間に挿入されたヘキサヒスチジンタグを含んでいる請求項２９の酵素。
  33. 前記酵素のＮ末端と融合されたマルトース結合タンパクアミノ酸配列を含んでいる請求項２８の酵素。
  34. アミノ酸配列は、Met Lys lie GIu GIu GIy Lys Leu VaI lie Trp He Asn GIy Asp Lys GIy Tyr Asn GIy Leu Ala GIu VaI GIy Lys Lys Phe GIu Lys Asp Thr GIy lie Lys VaI Thr VaI GIu His Pro Asp Lys Leu GIu GIu Lys Phe Pro GIn VaI Ala Ala Thr GIy Asp GIy Pro Asp He He Phe Trp Ala His Asp Arg Phe GIy GIy Tyr Ala GIn Ser GIy Leu Leu Ala GIu lie Thr Pro Asp Lys Ala Phe GIn Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala VaI Arg Tyr Asn GIy Lys Leu He Ala Tyr Pro He Ala VaI GIu Ala Leu Ser Leu He Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp GIu GIu He Pro Ala Leu Asp Lys GIu Leu Lys Ala Lys GIy Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu GIn GIu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu lie Ala Ala Asp GIy GIy Tyr Ala Phe Lys Tyr GIu Asn GIy Lys Tyr Asp lie Lys Asp VaI GIy VaI Asp Asn Ala GIy Ala Lys Ala GIy Leu Thr Phe Leu VaI Asp Leu lie Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser He Ala GIu Ala Ala Phe Asn Lys GIy GIu Thr Ala Met Thr lie Asn GIy Pro Trp Ala Trp Ser Asn He Asp Thr Ser Lys VaI Asn Tyr GIy VaI Thr VaI Leu Pro Thr Phe Lys GIy GIn Pro Ser Lys Pro Phe VaI GIy VaI Leu Ser Ala GIy lie Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys GIu Leu Ala Lys GIu Phe Leu GIu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp GIu GIy Leu GIu Ala VaI Asn Lys Asp Lys Pro Leu GIy Ala VaI Ala Leu Lys Ser Tyr GIu GIu GIu Leu Ala Lys Asp Pro Arg lie Ala Ala Thr Met GIu Asn Ala GIn Lys GIy GIu He Met Pro Asn He Pro GIn Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala VaI Arg Thr Ala VaI He Asn Ala Ala Ser GIy Arg GIn Thr VaI Asp GIu Ala Leu Lys Asp Ala GIn Thr Asn Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu GIy He GIu GIy Arg lie Ser GIu Phe GIy Ser Pro Asn Tyr Lys Leu Thr Tyr Phe Asn Met Arg GIy Arg Ala GIu lie He Arg Tyr lie Phe Ala Tyr Leu Asp He GIn Tyr GIu Asp His Arg lie GIu GIn Ala Asp Trp Pro GIu He Lys Ser Thr Leu Pro Phe GIy Lys lie Pro lie Leu GIu VaI Asp GIy Leu Thr Leu His GIn Ser Leu Ala He Ala Arg Tyr Leu Thr Lys Asn Thr Asp Leu Ala GIy Asn Thr GIu Met GIu GIn Cys His VaI Asp Ala lie VaI Asp Thr Leu Asp Asp Phe Met Ser Cys Phe Pro Trp Ala GIu Lys Lys GIn Asp VaI Lys GIu GIn Met Phe Asn GIu Leu Leu Thr Tyr Asn Ala Pro His Leu Met GIn Asp Leu Asp Thr Tyr Leu GIy GIy Arg GIu Trp Leu lie GIy Asn Ser VaI Thr Trp Ala Asp Phe Tyr Trp GIu lie Cys Ser Thr Thr Leu Leu VaI Phe Lys Pro Asp Leu Leu Asp Asn His Pro Arg Leu VaI Thr Leu Arg Lys Lys VaI GIn Ala lie Pro Ala VaI Ala Asn Trp lie Lys Arg Arg Pro GIn Thr Lys Leuを含んでいる請求項２８の酵素。
  35. Ｈ−ＰＧＤＳの一次アミノ酸配列を含む酵素と可逆的に結合する酵素結合成分と、
    フルオロフォア部分とを含んでいる、検出検体。
  36. 検出検体は、２−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−５−（２−（３−（（２−フェニルピリミジン−５−カルボキシアミド）メチル）フェニルスルホンアミド）エチルカルバモイル）−安息香酸を含んでいる請求項３５の検出検体。
  37. 検出検体は、Ｎ−（３−（Ｎ−（２−（５−カルボニル−Ｘ−ローダミン）アミノ）エチル）スルファモイル）ベンジル）−２−フェニルピリミジン−５−カルボキシアミドを含んでいる請求項３５の検出検体。
  38. 検出検体は、Ｎ−（３−（Ｎ−（２−（DyLight(商標名)６３３）アミノ）エチル）スルファモイル）ベンジル）−２−フェニルピリミジン−５−カルボキシアミドを含んでいる請求項３５の検出検体。
  39. 検出検体は、Ｎ−置換−２−フェニルピリミジン−５−カルボキシアミドを含んでいる請求項３５の検出検体。
  40. 酵素結合成分は、Ｎ−置換−２−フェニルピリミジン−５−カルボキシアミドを含んでいる請求項３５の検出検体。
  41. 酵素結合成分は、Ｎ−置換−６−フェニルニコチンアミドを含んでいる請求項３５の検出検体。
  42. 酵素結合成分は、Ｎ−置換−２−フェノキシピリミジン−５−カルボキシアミドを含んでいる請求項３５の検出検体。
  43. 酵素結合成分は、Ｎ−置換−６−フェノキシニコチンアミドを含んでいる請求項３５の検出検体。
  44. 酵素結合成分は、Ｎ−置換−４−（３−フルオロベンゾイル）ピペラジン−１−カルボキシアミドを含んでいる請求項３５の検出検体。
  45. 酵素結合成分は、４−（５−ベンゾイル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾル−２−イル）−Ｎ−置換−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボキシアミドを含んでいる請求項３５の検出検体。
  46. 酵素結合成分は、５−（１−置換−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−２−フェニルチアゾールを含んでいる請求項３５の検出検体。
  47. 酵素結合成分は、５−（２−置換−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−２−フェニルピリミジンを含んでいる請求項３５の検出検体。
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