JP2011513338A - 細胞障害のための併用療法 - Google Patents

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Abstract

被検者においてＮＡＤ＋の合成を誘起する方法。該方法は、治療有効量のリスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を、被検者に対して投与することを包含する。ＮＡＤ＋の合成によって、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）酵素およびサーチュイン酵素の活性が増加する。該ＰＡＲＰ酵素は、ＰＡＲＰ−１またはＰＡＲＰ−２である。該サーチュイン酵素は、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、およびＳＩＲＴ７からなる群より選択される。

Description

発明の詳細な説明
〔技術分野〕
本発明は、被検者内で、ＤＮＡ修復およびＮＡＤ＋合成を誘起するための方法および組成物に関する。本発明は、さらに、酸化ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷に関連する状態および疾病を予防および治療するための方法および医薬組成物に関する。
〔背景技術〕
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）は、アルコール代謝、乳酸代謝、およびアミノ酸代謝ならびにエネルギー（ＡＴＰ）生成などの複数の代謝過程において、必須の補助因子および電子トランスポーターとして作用する補酵素（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＰＨ）のピリジンヌクレオチドファミリーの親化合物である。ＮＡＤ＋は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）、Ｓｉｒ２相同体（ＳＩＲＴ１）、およびＮＡＤグリコヒドラーゼ（ＣＤ３８＋）などの重要な複数のＮＡＤ依存性酵素にとって、必須の基質である。ＰＡＲＰは、ＤＮＡにおける二本鎖または一本鎖の切断の修復を媒介する核内酵素であり、また、ＮＡＤ依存性脱アセチル化酵素ＳＩＲＴ１は、遺伝子サイレンシングおよび細胞の寿命延長に影響する。ＮＡＤグリコヒドラーゼは、ＮＡＤ＋から環状ＡＤＰ−リボース（ｃＡＤＰＲ： ｃｙｃｌｉｃ ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）の生成を触媒し、細胞内のカルシウムシグナリングに影響する。これらの細胞機能およびその他の細胞機能におけるＮＡＤ＋の役割は、ＮＡＤ＋が代謝活性の制御因子であることに加えて、ＮＡＤ＋が細胞の素過程のコントロールにおいて中心的な役割を果たすことを示唆している。
したがって、細胞質内および核内の両方でＮＡＤ＋レベルを維持することは、核の完全性、細胞の生存、および細胞成長を持続させる上で非常に重要なことである。細胞のＮＡＤ＋レベルの低下は、複数のタイプの細胞において死と一貫した相関関係があり、酸化ストレスに関連する変性障害において頻繁に見られる。酸化ストレスは、酸化ストレスおよび／または損傷を誘起する酸化性化合物、例えば、活性酸素種（ＲＯＳ）、スーパーオキシドラジカル、ヒドロキシラジカル、一酸化窒素、オゾン、チイルラジカル、炭素を中心としたラジカル（例えば、トリクロロメチルラジカル）などが、過剰に存在することを特徴とする。ＲＯＳ、例えば、Ｈ２Ｏ２、Ｏ２・−、・ＯＨ、ＮＯなどには有害な効果があり、この有害な効果の例としては、補助因子の酸化を介した特定の酵素の不活性化、脂質の多価不飽和脂肪酸（polydesaturated fatty acids）の酸化、タンパク質内におけるアミノ酸酸化、ＤＮＡ損傷などがあげられる。酸素フリーラジカル活性は、神経変性、虚血再灌流障害、粥状動脈硬化、炎症、皮膚細胞（例えばケラチノサイトおよび線維芽細胞）におけるＤＮＡ損傷、ＤＮＡ損傷に続いて起こる調節解除された細胞シグナル伝達を介した潜在的な腫瘍生成などといった、複数の病理過程の根底にある、複数の重要な分子カスケードの原因となる。
ＲＯＳ生成の増加は、紫外線または電離放射線（ｘ線、γ線）に対する曝露、化学薬品、感染、炎症、またはミトコンドリアの効率低下が原因になって起こるということが知られている。これらの因子の任意の１つまたはその組み合わせが、ＵＶによって誘起される皮膚細胞の慢性または急性の損傷とともに、慢性の変性状態、例えば、正常な細胞の老化、皮膚の加速的な老化、アルツハイマー病、パーキンソン病などににおいて頻繁に見られる。アルツハイマー病およびパーキンソン病は、神経細胞の進行性の喪失を特徴とする、神経変性疾患の例である。脳細胞死の主要因は不明であるが、酸化ストレスおよび加速的なＤＮＡ損傷に関連する炎症性の変化によって媒介されているようである。
酸化損傷によって引き起こされるＤＮＡ鎖の切断には、細胞の重要なＮＡＤ＋源を使い切る素早い修復応答性が必要である。ＮＡＤ＋が複数の酵素に対して基質として作用する一方で、ＮＡＤ＋の急速な代謝回転および枯渇に対し最も重要な寄与体は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）酵素のファミリーメンバー、特にＰＡＲＰ−１の活性化である。前述のように、ＰＡＲＰ−１は、ＤＮＡに発生する二本鎖または一本鎖の切断によって活性化されるＤＮＡ結合性酵素であって、塩基除去修復（ＢＥＲ）過程において無くてはならないものである。ＤＮＡ損傷の修復には多数のタンパク質が関与しているが、ＤＮＡ病変の大部分はＢＥＲによって修復される。これに応じて、ＮＡＤ＋は、ＤＮＡ修復において中心的な役割を果たし、酸化ストレスの間に、細胞内のレベルが急速に低下する。したがって、抗酸化能およびＤＮＡ修復の改善が、細胞の生存が促進および保持される一つのメカニズムである。
細胞質内および核内の両方でＮＡＤ＋レベルを維持することが、核の完全性、細胞の生存、および細胞成長を持続させる上で非常に重要であることは明らかである。そこで、ＮＡＤ＋が欠乏する環境で細胞内のＮＡＤ＋レベルを増加させることができる処理が、一般に必要である。酸化ストレスの治療法においては、大部分が、フリーラジカルの生成の予防（キレート療法）または分子損傷の低減（抗酸化療法）に重点をおいてきた。このような治療は、ＲＯＳによって引き起こされたＤＮＡ損傷を軽減する手段を提供しないので、細胞死および調節解除された細胞増殖（つまり腫瘍の増殖）を減少させる可能性が限られている。よって、慢性の酸化ストレスまたは急性の酸化ストレスに関連する疾病および状態において、ＤＮＡ修復を亢進できる治療法が必要である。
〔発明の開示〕
１つの態様において、本発明は、被検者においてＮＡＤ＋の合成を誘起する方法であって、治療有効量のリスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を、被検者に対して投与することを包含する方法を提供する。第１の態様の一実施形態では、ＮＡＤ＋の合成の上記誘起は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）酵素の活性を増加させる。第１の態様の一実施形態では、上記ＰＡＲＰ酵素は、ＰＡＲＰ−１またはＰＡＲＰ−２である。
第１の態様の一実施形態では、ＮＡＤ＋の合成の上記誘起は、サーチュイン酵素の活性を増加させる。第１の態様の一実施形態では、上記サーチュイン酵素は、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、およびＳＩＲＴ７からなる群より選択される。
第２の態様において、本発明は、酸化ストレスに関連する疾病または状態を防止または治療する方法であって、治療有効量のリスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を、被検者に対して投与することを包含し、上記投与は、被検者においてＮＡＤ＋の合成を誘起する方法を提供する。
第３の態様において、本発明は、ＤＮＡ損傷に関連する疾病または状態を防止または治療する方法であって、治療有効量のリスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を、被検者に対して投与することを包含する方法を提供する。
第２の態様および第３の態様の一実施形態では、上記疾病または状態が神経変性疾患である。第２の態様および第３の態様の一実施形態では、上記神経変性疾患がアルツハイマー病またはパーキンソン病である。
第２の態様および第３の態様の一実施形態では、上記疾病または状態が、皮膚の加速的な老化に関連する。
第２の態様および第３の態様の一実施形態では、上記疾病または状態が、ＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷であり、上記皮膚細胞が、ケラチノサイトおよび線維芽細胞を包含してもよい。
第２の態様および第３の態様の一実施形態では、上記リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体が、三剤併用療法として、治療有効量で投与される。
第２の態様および第３の態様の一実施形態では、ＤＮＡ損傷に関連する上記疾病または状態が癌である。
第２の態様および第３の態様の一実施形態では、上記疾病または状態が、紫外光に対する曝露、電離放射線、化学薬品に対する曝露、感染、炎症、ミトコンドリアの効率の低下、またはこれらの組み合わせによってもたらされる。
第１態様、第２の態様、および第３の態様の一実施形態では、上記リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体が、トランス異性体である。
第１態様、第２の態様、および第３の態様の一実施形態では、リスベラトロールに機能的に同等な上記類似体の任意の１つによる方法が、リスベラトロールのヒドロキシル化類似体、リスベラトロールのメトキシル化類似体、シス−リスベラトロールグルコシド（シス−ｐｉｃｅｉｄ）、およびトランス−リスベラトロール−３−Ｏ−β−グルコシド（トランス−ｐｉｃｅｉｄ）からなる群より選択される。
第４の態様において、本発明は、ＮＡＤ＋の合成を増加させるために使用される医薬組成物であって、治療有効量のリスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を包含する医薬組成物を提供する。
第５の態様において、本発明は、酸化ストレスに関連する疾病または状態を予防または治療するために使用される医薬組成物であって、治療有効量のリスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を包含し、被検者においてＮＡＤ＋の合成を誘起する医薬組成物を提供する。
第６の態様において、本発明は、ＤＮＡ損傷に関連する疾病または状態を予防または治療するために使用される医薬組成物であって、治療有効量のリスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を包含し、被検者においてＮＡＤ＋の合成を誘起する医薬組成物を提供する。
第６の態様の一実施形態では、上記疾病または状態が、ＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷であり、上記皮膚細胞が、ケラチノサイトおよび線維芽細胞を包含してもよい。
第６の態様の一実施形態では、上記リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体が、三剤併用療法として、治療有効量で投与される。
第７の態様において、本発明は、酸化ストレスに関連する疾病または状態を予防または治療するために使用される医薬組成物であって、ＮＡＤ＋の合成を誘起することができる少なくとも１つの薬剤と、有効量の、下記の（ａ）および（ｂ）のうち１つまたは両方との相乗的な組み合わせを包含し、（ａ）は、少なくとも１つの抗酸化剤であり、（ｂ）は、少なくとも１つのキレート薬である医薬組成物を提供する。
第７の態様の一実施形態では、ＮＡＤ＋の合成を誘起することができる少なくとも１つの薬剤が、リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体である。
第７の態様の一実施形態では、上記抗酸化剤が、メラトニン、ビタミンＥ、ビタミンＣ、メチオニン、タウリン、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、およびグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＸ）、Ｌ−エルゴチオネインＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、ビタミンＡ、βカロチン、レチノール、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン−３−没食子酸、フラベノイド（ｆｌａｖｅｎｏｉｄ）、Ｌ−エルゴチオネイン、イデベノン、およびセレンからなる群より選択される。
第７の態様の一実施形態では、上記キレート薬が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ベルサンテ二ナトリウムカルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｖｅｒｓａｎｔｅ））（ＣａＮａ２−ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、αリポ酸（ＡＬＡ）、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）、ジメルカプロール（ＢＡＬ）、デフェロキサミン、Ｄ−ペニシラミン、ジメルカプロール、アミノフェノキシエタン−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）デファラシロックス（Ｄｅｆａｒａｓｉｒｏｘ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、２−ピリジンカルボン酸（ピコリン酸）、２，３−ピリジンジカルボン酸（キノリン酸）、２−アミノ安息香酸（アントラニル酸）、キヌレン酸、キサンツレン酸、および８−ヒドロキシキノリン（およびこれらの機能性誘導体）からなる群より選択される。
第８の態様において、本発明は、酸化ストレスに関連する疾病または状態を治療するための方法であって、ＮＡＤ＋の合成を誘起することができる少なくとも１つの薬剤と、効果的な量の、下記の（ａ）および（ｂ）のうち１つまたは両方との相乗的な組み合わせを含有する、治療有効量の医薬組成物を、被検者に対して投与することを包含し、（ａ）は、少なくとも１つの抗酸化剤であり、（ｂ）は、少なくとも１つのキレート薬である方法を提供する。
第９の態様において、本発明は、ＤＮＡ損傷に関連する疾病または状態を治療するための方法であって、ＮＡＤ＋の合成を誘起することができる少なくとも１つの薬剤と、有効量の、下記の（ａ）および（ｂ）のうち１つまたは両方との相乗的な組み合わせを含有する、治療有効量の医薬組成物を、被検者に対して投与することを包含し、（ａ）は、少なくとも１つの抗酸化剤であり、（ｂ）は、少なくとも１つのキレート薬である方法を提供する。
第８の態様の一実施形態では、上記疾病または状態が、ＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷であり、上記皮膚細胞が、ケラチノサイトおよび線維芽細胞を包含してもよい。
第８の態様の一実施形態では、上記リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体が、三剤併用療法として、治療有効量で投与される。
第８の態様および第９の態様の一実施形態では、ＮＡＤ＋の合成を誘起することができる少なくとも１つの上記薬剤が、リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体である。
第８の態様および第９の態様の一実施形態では、上記抗酸化剤が、メラトニン、ビタミンＥ、ビタミンＣ、メチオニン、タウリン、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、およびグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＸ）、Ｌ−エルゴチオネインＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、ビタミンＡ、βカロチン、レチノール、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン−３−没食子酸、フラベノイド、Ｌ−エルゴチオネイン、イデベノン、およびセレンからなる群より選択される。
第８の態様および第９の態様の一実施形態では、上記キレート薬が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ベルサンテ二ナトリウムカルシウム）（ＣａＮａ２−ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、αリポ酸（ＡＬＡ）、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）、ジメルカプロール（ＢＡＬ）、デフェロキサミン、Ｄ−ペニシラミン、ジメルカプロール、アミノフェノキシエタン−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）デファラシロックス、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）２−ピリジンカルボン酸（ピコリン酸）、２，３−ピリジンジカルボン酸（キノリン酸）、２−アミノ安息香酸（アントラニル酸）、キヌレン酸、キサンツレン酸、および８−ヒドロキシキノリン（およびこれらの機能性誘導体）からなる群より選択される。
第１０の態様において、本発明は、被検者においてＮＡＤ＋の合成を増加させるためのキットであって、リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を包含するキットを提供する。
第１１の態様において、本発明は、被検者において酸化ストレスに関連する疾病または状態を治療するためのキットであって、リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を包含するキットを提供する。
第１２の態様において、本発明は、被検者においてＤＮＡ損傷に関連する疾病または状態を治療するためのキットであって、リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を包含するキットを提供する。
第１２の態様の一実施形態では、上記疾病または状態が、ＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷であり、上記皮膚細胞が、ケラチノサイトおよび線維芽細胞を包含してもよい。
第１２の態様の一実施形態では、上記リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体が、三剤併用療法として、治療有効量で投与される。
第１０の態様、第１１の態様、および第１２の態様の一実施形態では、上記リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体が、トランス異性体である。
第１０の態様、第１１の態様、および第１２の態様の一実施形態では、機能的に同等な上記類似体が、リスベラトロールのヒドロキシル化類似体、リスベラトロールのメトキシル化類似体、シス−リスベラトロールグルコシド（シス−ｐｉｃｅｉｄ）、およびトランス−リスベラトロール−３−Ｏ−β−グルコシド（トランス−ｐｉｃｅｉｄ）からなる群より選択される。
〔定義〕
本願において、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数形には、文脈と明らかに矛盾しないかぎり、複数の部材に言及している場合が含まれる。例えば、「幹細胞（ａ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」という表現には、複数個の幹細胞が含まれる。
本願において、「．．．を包含する(comprising)」という表現は、「．．．を含む(including)」という意味である。この「．．．を包含する(comprising)」という表現の、例えば、「．．．を包含する(comprise)」および「．．．を包含する(comprises)」などという活用形は、対応する異なった意味である。したがって、例えば、タンパク質をコード化する配列「を包含する(comprising)」ポリヌクレオチドは、その配列だけからなっていてもよく、あるいは、該配列以外の１つ以上の配列を備えていてもよい。
本願において、「リスベラトロール」という言葉には、リスベラトロールのシス異性体、リスベラトロールのトランス異性体、またはこの２つの異性体の混合物のいずれをも包含される。この言葉には、自然に発生する活性剤および化学的に合成される活性剤の両方、ならびに実験室にあるような化合物が包含される。さらに、「リスベラトロール」という言葉がここで使用される場合、薬理学的に許容可能な、リスベラトロールの塩、エステル、アミド、プロドラッグ、ならびに誘導体および類似体を包含することが意図されている。
本願において、「相乗的」という言葉は、複数の薬剤の組み合わせによって生み出される相加的な効果より大きいことを指し、同じ薬剤を使用して「相乗的」効果がない場合に得られる効果を超えるものである。
本願において、「治療有効量」は、言及している特定の治療用化合物の、所望の治療効果を提供するために非有毒であって十分な量を、その意味合いに含む。必要とされる厳密な量は、例えば、患者の身全体の健康状態、患者の年齢、ならびに疾病の段階および重症度などの要因によって、被検者ごとにばらつきがある。
本画において、「神経変性疾患」という言葉は、脳、中枢神経系、および末梢を含めた身体の任意の幹部において、神経細胞の変性または不活性化が起こる、動物の疾病または状態を指す。
本願において、「酸化ストレス」という言葉は、一般的な文脈で使用されており、フリーラジカルまたは活性酸素種（ＲＯＳ）（例えばα−ヒドロキシエチルラジカル、過酸化水素、ペルオキシラジカル、ヒドロキシラジカル、およびスーパーオキシドラジカル）の生成が亢進されている状態、および／または酸化促進物と抗酸化物との間で不均衡を引き起こす、抗酸化物に対する防御系の枯渇を指す。一般に、酸化ストレスには、酸化損傷の原因となる細胞内部または細胞環境におけるフリーラジカルの蓄積が伴う。酸化ストレスは、例えば紫外線または電離放射線に対する曝露、または化学薬品、異なる感染病原体による感染、炎症、またはミトコンドリアの効率の低下などの、生物的な（生きている）ソースおよび非生物的な（生きていない）ソースから発生することもある。
〔図面の簡単な説明〕
つぎに、本発明の好適な実施形態を、添付の図面を参照して記載するが、これは単なる例にすぎない。
図１は、ニコチンアミド（ＮＡＭ）またはニコチン酸（ＮＡ）から始まる、サルベージ経路を介したＮＡＤ＋の合成を示す図である。
図２は、トリプトファンから始まる、新生経路を介したＮＡＤ＋の合成を示す図である。
図３は、培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおける、細胞内のＮＡＤ＋レベルに対する、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤１−ＭＴの効果を示すグラフである。ヒトの胎児のアストロサイトを、１−ＭＴだけ、または１−ＭＴ／Ｌ−トリプトファン（ｌ−Ｔｒｙｐ）と１−ＭＴ／ニコチン酸（Ｎｉｃ ａ）との組み合わせを用いて処理した。コントロールに比較すると＊ｐ＜０．０５、１−ＭＴだけを用いた処理に比較すると＊＊ｐ＜０．０５、Ｌ−ｔｒｙｐおよび１−ＭＴを用いて処理した細胞に比較すると＊＊＊＊ｐ＜０．０５であった。
図４は、培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおける、ＰＡＲＰ活性に対する、異なる濃度の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の効果を示すグラフである。Ｈ２Ｏ２を使用しなかった場合に比較するとαｐ＜０．０５、１０μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較するとβｐ＜０．０５、２０μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較するとχｐ＜０．０５、５０μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較するとδｐ＜０．０５であった。
図５は、培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおける、細胞内のＮＡＤ＋に対する、異なる濃度の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の効果を示すグラフである。０μＭのＨ２Ｏ２コントロールに比較すると＊ｐ＜０．０５、５０μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較すると＊＊ｐ＜０．０５、１００μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５であった。
図６は、異なる濃度の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）に曝露された後の、培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおける、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を示すグラフである。０μＭのＨ２Ｏ２コントロールに比較すると＊ｐ＜０．０５、１０μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較すると＊＊ｐ＜０．０５、５０μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５、１００μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較するとΨ＜０．０５であった。
図７は、培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおける、Ｈ２Ｏ２によって媒介されるＮＡＤ＋の枯渇に対する、ケルセチンの効果を示すグラフである。＊ｐ＜０．０５、また、Ｈ２Ｏ２だけを使用した場合に比較すると＊＊ｐ＜０．００５であった。
図８は、メラトニンを用いた処理をした後の、ヒトの培養神経芽細胞腫細胞における、細胞内のＮＡＤ＋レベルに対する、Ｈ２Ｏ２の効果を示すグラフである。Ｃｔｒｌに比較すると＊ｐ＜０．０５、１００μＭのＨ２０２の場合と２０μＭのＭｅｌ ＋ Ｈ２０２の場合とを比較すると＊＊ｐ＜０．０５、２μＭのＭｅｌ ＋ Ｈ２０２ の場合と２００μＭのＭｅｌ ＋ Ｈ２０２の場合とを比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５であった。
図９は、ビタミンＥを用いて処理した後の、ヒトの培養神経芽細胞腫細胞における、細胞内のＮＡＤ＋レベルに対する、Ｈ２Ｏ２の効果を示すグラフである。Ｃｔｒｌに比較すると＊ｐ＜０．０５であった。
図１０は、アスコルビン酸および第一鉄の存在下でＨ２Ｏ２を用いて処理した後の、ヒトの神経芽細胞腫細胞における、細胞内のＮＡＤ濃度に対する、親油性キレート剤であるクリオキノール（ＣＱ）の用量反応の効果を示すグラフである。Ｃｔｒｌに比較すると＊ｐ＜０．０５、Ｈ２０２ ＋ Ｆｅの場合に比較すると＊＊ｐ＜０．０５、１０μＭのＣＱ ＋ Ｈ２０２ ＋ Ｆｅの場合に比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５であった。
図１１は、Ｈ２Ｏ２によって媒介されるＮＡＤ＋の枯渇に対する、リスベラトロールの効果を示すグラフである。リスベラトロールは、細胞内のＮＡＤ＋を、コントロール（＊ｐ＜０．０５）を超えて大幅に増加させた。ヒトの初代アストロサイトにおいてＨ２Ｏ２だけを使用した場合に比較すると＊＊ｐ＜０．０５であった。
図１２は、新生経路を介した、リスベラトロールによって誘起されるＮＡＤ＋の合成に対する、キヌレニン経路阻害剤１−ＭＴの効果を示すグラフである。
図１３は、ＮＡＤ＋の合成に対する、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）阻害剤であるタンニン酸の効果を示す、用量反応曲線のグラフである。ＩＣは抑制濃度を示す。
図１４は、リスベラトロールによって媒介されるＮＡＤ＋の合成に対する、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）阻害剤であるタンニン酸の効果を示すグラフである。リスベラトロールを用いて処理しただけの場合に比較すると＊ｐ＜０．０５、コントロールに比較すると＊＊ｐ＜０．０５であった。
図１５は、ヒトの脳のアストロサイトにおける、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）活性に対する、リスベラトロールの効果を示すグラフである。
図１６は、ヒトの脳のアストロサイトにおける、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）活性に対する、各種濃度のリスベラトロールの効果を示す表である。
図１７は、酸化ストレスがＤＮＡ損傷を誘起する、共通のメカニズムを示す図である。
図１８は、酸化促進剤（Ｈ２Ｏ２）および鉄（Ｆｅ）に曝露した後、キレート剤（クリオキノール−ＣＱ）および抗酸化剤（ビタミンＥ）を用いて処理した神経芽細胞腫細胞における、ＮＡＤ＋生成を示すグラフである。
図１９ａ〜図１９ｄは、細胞内のＮＡＤ濃度、＋／−ＵＶ曝露、＋／−補充をグラフに表したものである。図１９ｅ〜図１９ｈは、上清のＬＤＨの活性、＋／−ＵＶ曝露、＋／−補充をグラフに表したものである。
図２０ａは、ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから２４時間後のＮＡＤの回復時にＲＥＳ、＋／−ＰＡＭ、＋／−ＣＬＱ、＋／−ＭＥＬを用いて処理した後の、ＮＡＤ濃度に対する、二剤併用の補充物の効果を示すグラフである。
図２０ｂは、ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬまたはＲＥＳ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＰＡＭを用いて２４時間処理した後の、ＬＤＨの放出（細胞死）に対する、二剤併用の補充物の効果を示すグラフである。
図２１は、ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから２４時間後のＮＡＤの回復時に、ＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＰＡＭを用いて処理した後の、ＮＡＤ濃度に対する、三剤併用の補充物（選択された組み合わせ）の効果を示すグラフである。
図２２ａは、ケラチノサイトの免疫細胞化学を可視化したものであり、補充をせずにＵＶ処理された細胞のＤＮＡ損傷（中央カラム）が、強く染色していることを示している。
図２２ｂは、ケラチノサイトの、ＩＣＣで染色された各部分について、蛍光強度の半定量を示すグラフである。
図２３ａは、線維芽細胞の免疫細胞化学を可視化したものであり、補充をせずにＵＶ処理された細胞のＤＮＡ損傷（中央カラム）が、強く染色していることを示している。
図２３ｂは、線維芽細胞の、ＩＣＣで染色された各部分について、蛍光強度の半定量を示すグラフである。
図２４は、ヒトの初代線維芽細胞において、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ（１００μＭ）またはＭＥＬ（１００μＭ）またはＣＬＱ（０．１μＭ）またはＰＡＭ（１００μＭ）を用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対するモノセラピー補充の効果を示すグラフである。
図２５は、ヒトの初代線維芽細胞において、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬ、ＲＥＳ＋ＣＬＱ、ＲＥＳ＋ＰＡＭを用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対する二剤併用療法の補充物の効果を示すグラフである。使用した濃度は、ＥＣ５０／ＥＣ５０、ＥＣ１０／ＥＣ９０、ＥＣ９０／ＥＣ１０にそれぞれ等価であった。
図２６は、ヒトの初代線維芽細胞において、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＰＡＭを用いて処理２４時間した後の、ＤＮＡ修復に対する三剤併用療法の補充物の効果を示すグラフである。
図２７は、ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ（１００μＭ）またはＭＥＬ（１００μＭ）またはＣＬＱ（０．１μＭ）またはＰＡＭ（１００μＭ）を用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対するモノセラピー補充の効果を示すグラフである。
図２８は、ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬ、ＲＥＳ＋ＣＬＱ、ＲＥＳ＋ＰＡＭを用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対する二剤併用療法の補充物の効果を示すグラフである。使用した濃度は、ＥＣ５０／ＥＣ５０、ＥＣ１０／ＥＣ９０、ＥＣ９０／ＥＣ１０にそれぞれ等価であった。
図２９は、ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＰＡＭを用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対する三剤併用療法の補充物の効果を示すグラフである。
図３０は、Ｈ２Ｏ２によって誘起される酸化ストレスを１５分間与えた後、抗酸化剤（メラトニン）および／またはクリオキノール）、キレート剤および／またはリスベラトロールを用いて２４時間かけて行った事前処理の、ヒトの胎児のアストロサイトにおける細胞内のＮＡＤレベルに対する効果を示すグラフである。＊ｐ＜０．０５、Ｈ２Ｏ２だけを使用した場合に比較すると＊＊ｐ＜０．０５、二剤併用療法によるそれぞれの処理に比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５であった。
〔発明を実施するための形態〕
本発明は、細胞内でのＮＡＤ＋合成がリスベラトロール（３，５，４’−トリヒドロキシスチルベン）によって増加する、という知見に関連している。特定のメカニズムに制限または限定されるものではないが、発明者は、リスベラトロールが、サルベージ経路（図１に示す）を介して、具体的には、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）活性をアップレギュレートすることによって、ＮＡＤ＋の合成を誘起することを実証した。そこで本発明は、被検者において細胞内のＮＡＤ＋の合成の誘起を可能にする手段を提供する。
発明者は、リスベラトロールの投与によるＮＡＤ＋合成の誘起が、ＤＮＡ修復を誘起し、細胞の生存および長寿を促進する手段を提供することも実証した。やはり特定のメカニズムに制限または限定されるものではないが、リスベラトロールによるＮＭＮＡＴ活性のアップレギュレーションは、ＮＡＤ＋の前駆体であり、かつ、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）酵素のファミリーメンバーの副産物であるニコチンアミド（ＮＡＭ）の代謝を増加させる効果があると考えられる。ＮＡＭは、ＰＡＲＰ酵素（例えばＰＡＲＰ−１）および哺乳類のサーチュイン酵素のファミリーメンバー（ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、およびＳＩＲＴ７）の阻害物質である。したがって、リスベラトロールの投与によって誘起されるＮＡＭの代謝が、利用可能なＮＡＤ＋レベルを増加させるように作用し、その一方で、ＰＡＲＰ活性およびサーチュイン酵素の活性の両方の抑制を低減する。なお、ＰＡＲＰ活性の抑制を低減することによって、ＤＮＡ修復が促進され、サーチュイン酵素の活性の抑制を低減することによって、細胞の生存および長寿が促進される。
さらに、本発明は、ＮＡＤ＋の合成の促進剤（例えばリスベラトロール）を、キレート薬および／または抗酸化剤と組み合わせて使用して、酸化ストレスに関連する状態の治療に対し相乗効果を生み出すことに関する。発明者は、酸化還元活性を有する金属をキレート化する薬剤と、残留性の酸素フリーラジカルによって引き起こされる損傷を減少させる抗酸化剤とからなる薬物併用療法に由来する利点が、ＮＡＤ＋の合成促進剤を包含することによって、相乗的に亢進される可能性のあることを実証した。この相乗効果は、必須の基質ＮＡＤ＋の生成が増加することによって、（少なくともＰＡＲＰ酵素活性の増加を介して）ＤＮＡ修復が向上すること、および（少なくともサーチュイン活性の増加を介して）細胞の生存および長寿が向上するによって生まれると考えられる。
リスベラトロールとＮＡＤ＋合成
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）は、いくつかの異なる出発化合物から合成され得る。（図２に示す）「新生」経路では、ＮＡＤ＋が、必須アミノ酸トリプトファンから生成される。この経路には、トリプトファンからのキノリン酸の生成が伴う。なお、このキノリン酸は、ホスホリボース基の転移を通じて変換されて、ニコチン酸モノヌクレオチド（ＮａＭＮ）になる。つぎに、アデニル酸基が転移されて、ニコチン酸アデニンジヌクレオチド（ＮａＡＤ）を形成する。つぎに、ＮａＡＤのニコチン酸基がアミド化されてニコチンアミド基になり、ＮＡＤ＋を形成する。あるいは、ニコチンアミド、または予め形成された、ニコチンアミドを含有する化合物（例えばニコチンアミドリボシド）が、「サルベージ」経路（図１を参照）を介したＮＡＤ＋の生成に用いられれる。新生経路またはサルベージ経路のいずれかにおける酵素の阻害により、ＮＡＤ＋が顕著に枯渇する。このことは、細胞のＮＡＤ＋レベルを維持するためには、これらの経路がどちらも重要であることを明確に示している。
本発明は、被検者において、細胞内のＮＡＤ＋の合成／レベルを増加させる方法を提供する。この方法は、治療有効量のリスベラトロール、またはそれと機能的に同等な類似体、もしくはリスベラトロール誘導体を、被検者に対して投与することを包含する。
本発明の方法によれば、リスベラトロール（３，５，４’−トリヒドロキシスチルベン、トランス−３，５，４’−トリヒドロキシスチルベン；３，４’，５−スチルベントリオール；トランス−リスベラトロール；（Ｅ）−５−（ｐ型ヒドロキシスチリル）レゾルシノール、およびレゾルシノールとしても知られている）が、天然型で、例えばブドウの皮、ワイン、またはその他の植物由来の組成から単離された状態で、当該技術分野において公知の方法で、投与されてもよい（例えば、Lamuela-Raventos, J. Agric. Food Chem. (1995) (43): 281-283, and Wang et al. J Agric Food Chem. (2002) 50:431-435に記載の方法を参照。該文献の内容は参照によってここに引用されるものとする）。例えば、適切な溶媒（例えばメタノール）を使って粉末状の植物性物質を抽出し、つづけて濃縮し、水で希釈してもよい。適切な非極性有機溶剤（例えばヘキサン）を用いて洗浄した後、例えば酢酸エチルを使って、水層を分画してもよい。この酢酸エチルによる抽出物は、つぎに、溶出剤として例えばクロロホルム−メタノールを使って、シリカゲルクロマトグラフィーのカラムで分離してもよい。濃縮されたリスベラトロールを含有する画分を一つにまとめ、さらに、カラムクロマトグラフィーを実施してもよい。
上記の構成に加えて、あるいは、上記の構成の替わりに、Moreno-Manas et al. Anal. Quim (1985) 81:157-61, Jeand et al. Am. J. Enol. Vitic. (1991) 42:41-46, Goldberg et al. Anal. Chem. (1994) 66: 3959-63, and Farina et al. Nat. Prod. Res. (2006). 20: 247-52に記載されているように（該文献の内容は参照によってここに引用されるものとする）、リスベラトロールを、例えば、２つの置換フェノールがスチレン二重結合を介して結合されるウィティッヒ反応を使って、化学的に合成してもよい。上記の構成に加えて、あるいは、上記の構成の替わりに、本発明で使用するリスベラトロールを、業者（例えばＳｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）から入手してもよい。
本発明にしたがって使用するリスベラトロールは、シス異性体、トランス異性体、またはこれらの混合物の形態であってもよい。シス−リスベラトロールを、当該技術分野において公知の方法で（例えば、トランス−リスベラトロールを加熱または紫外線に曝露し、その後、ＨＰＬＣによって分離し、さらに質量分析（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ； ＭＳ）によって特定することによって）、トランス−リスベラトロールから調製してもよい。本発明では、機能的に同等なリスベラトロールの誘導体および類似体についても考察する。リスベラトロールの類似体とは、リスベラトロールに基づく化合物であって、化学修飾されたリスベラトロール化合物を形成するために、この親化合物に結合した置換基を有しているものである。置換基の例としては、Ｃ１−Ｃ３アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル）、ＣＨ２ＯＨ、ハロゲン（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。上記ヒドロキシル基のうちの任意の１つ以上に、例えば保護基で、官能性を持たせてもよい。適切な保護基は当業者に知られている（“Protective Groups in Organic Synthesis" by Theodora Greene and Peter Wuts (third edition, 1999, John Wiley and Sons)を参照）。上記の構成の替わりに、上記ヒドロキシル基のうちの任意の１つ以上に、例えば、Ｃ１−Ｃ３アルキル（この場合にはエーテルが形成される）、またはカルボン酸基（この場合にはエステルが形成される）で、官能性を持たせてもよい。
上記化合物の例としては、リスベラトロールのヒドロキシル化類似体またはメトキシル化類似体などが挙げられる。上記機能的に同等なリスベラトロールの類似体は、シス−リスベラトロールグルコシド（シス−ｐｉｃｅｉｄ）またはトランス−リスベラトロール−３−Ｏ−β−グルコシド（トランス−ｐｉｃｅｉｄ）であってもよい。リスベラトロールの誘導体の一例としては、１つ以上のヒドロキシル基（通常は３−ヒドロキシル基）が単糖または二糖に共役結合している誘導体があげられる。一般に、３−ヒドロキシル基は、単糖の１位に共役結合していてもよい。リスベラトロールに共役結合してもよい糖類の例としては、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、およびガラクトースなどが挙げられるが、これらの例に限定されるものではない。本発明の方法において使用に適した、その他のリスベラトロールの誘導体および類似体については、例えば、米国特許第７０２６５１８号明細書、米国特許第６７９０８６９号明細書、国際特許出願公開第ＷＯ／２００３／０５５４４４号明細書、国際特許出願公開第ＷＯ／２００４／０００３０２号明細書、および国際特許出願公開第ＷＯ／１９９９／００３８１６号明細書に記載されている。なお、これらの特許文献の内容は参照によってここに引用されるものとする。当業者がこれらの文献を参照すれば、ここに記載されているリスベラトロールの誘導体および類似体が非限定的な例であること、また、本発明が、機能的に同等な効果を誘起することができる、その他のリスベラトロール誘導体および類似体の使用を包含することが理解できよう。
本発明では、リスベラトロールの薬学的に許容可能な塩およびその類似体についても考察する。S. M. Berge et al.は、J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66:1-19で薬学的に許容可能な塩について詳細に記載している。この塩は、本発明の化合物の最終的な単離および精製の間にインサイツで調製可能であり、または遊離塩基機能を適切な有機酸と反応させることによって、別々に調製可能である。酸付加塩の代表的な例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、ジグルコン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、半硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロヨウ化物塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、ニトロ化塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチニン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸化塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などがあげられる。アルカリ塩またはアルカリ土類金属塩の代表的な例としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、さらに、非有毒なアンモニウム、四級アンモニウム、およびアミンの陽イオンなどがあげられ、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン、トリエタノールアミンなどを含むが、これらの例に限定されるものではない。
本発明の方法によると、細胞内のＮＡＤ＋の合成を誘起するために、治療有効量のリスベラトロールを被検者に投与してもよい。細胞内のＮＡＤ＋は、当該技術分野において公知の方法で測定可能であり、例えばGrant and Kapoor, J. Neurochem. (1998) 70(4): 1759-1763に記載されている。細胞内のＮＡＤ＋レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の技術を使って、測定可能である。このような測定方法は、例えばKlaidman et al., Anal Biochem (1995) 228:312-317に記載されている。なお、この文献の内容は参照によってここに引用されるものとする。上記の構成に加えて、あるいは、上記の構成の替わりに、分光光度マイクロサイクリングアッセイを使用して、細胞内のＮＡＤ＋レベルを測定してもよい。このような測定方法は、例えばNisselbaum and Green, Anal Biochem (1969) 27: 212-217 or Berofsky and Swan, Anal Biochem (1973) 53: 452-458に記載されている。なお、この文献の内容は参照によってここに引用されるものとする。例えば、組織／細胞のホモジネートを、ＮＡＤ＋と測定可能な化合物との反応を促進するために必須の成分を含有する、ｐＨ値を制御した（バッファ）溶液（反応混合物）中でインキュベーションしてもよい。この反応混合物は、例えばエタノール、アルコール脱水素酵素、フェナジンメトサルフェート、３−［４，５−ジメチルチアゾ−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド、（ＭＴＴ）（ビシンバッファ溶液中）などを含有していてもよい。インキュベーションを適切な時間実行した後、適切な停止用試薬、例えばヨード酢酸で、反応を停止させ、試料中のＮＡＤ＋レベルをミクロプレート読み取り装置で試薬のブランク値に対して測定して決定する。
ＮＡＤ＋依存性酵素は、ＤＮＡ修復において、特に酸化ストレス条件下で、重要な役割を果たす。そこで、本発明は、治療有効量のリスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を、被検者に対して投与することを包含する、被検者においてＤＮＡ修復を誘起する方法を提供する。被検者におけるＤＮＡ修復の誘起は、１つ以上のポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）酵素のファミリーメンバーの活性亢進によって起こってもよい。ＰＡＲＰ酵素の活性は、当該技術分野において公知の方法で測定可能である。例えば、Cheung and Zhang Anal Biochem (2000) 282: 24-28（この文献の内容は参照によってここに引用されるものとする）に記載されているように、ＰＡＲＰ酵素活性を、ビオチン化されたＮＡＤを使って、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）によってアッセイしてもよい。上記の構成に加えて、あるいは、上記の構成の替わりに、Karson et al., Anal Biochem (2004) 326 : 78-86またはPutt et al., Chem. Bio. Chem (2005) 6:53-55（この文献の内容は参照によってここに引用されるものとする）記載されているように、ＰＡＲＰ酵素の活性を、ＮＡＤの化学的な定量化を介して、酵素試験を用いて測定してもよい。例えば、プレートに蒔いた細胞または組織を洗浄し、つぎに過剰なＮＡＤ＋を含有する適切な緩衝液を使って溶解させる。適切な緩衝液は、例えばＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）、トリトンＸ−１００（１％）、およびＮＡＤ＋（２０μＭ）を、トリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ値８．１）中に含有していてもよい。ＮＡＤ＋はＰＡＲＰ酵素の唯一の基質であり、しかもこの反応の間に劣化するので、全体の酵素活性は、緩衝液中のＮＡＤ＋の濃度の経時的な減少によって決定される。適切な期間のインキュベーションに続いて、消費されたＮＡＤ＋の量を、上述のように、ＮＡＤ（Ｈ）マイクロサイクリングアッセイによって測定する。
ＰＡＲＰ酵素は、ＮＡＤ＋をアデノシン二リン酸リボース（ＡＤＰＲ）のドナーとして消費し、核タンパク質上で、例えばヒストンおよびＰＡＲＰ自身において、ポリ（ＡＤＰ−リボース）を合成する。ＰＡＲＰの過度な活性化、特に酸化ストレスの間のＰＡＲＰの過度な活性化は、細胞のＮＡＤ＋の大幅な枯渇の原因になる可能性があり、このことが細胞の壊死につながる。本発明の方法にしたがってリスベラトロールを投与すれば、まずＮＡＤ＋の合成を増加させて、そうすることによってＰＡＲＰによって媒介されるＤＮＡ修復のための基質が利用できる可能性を増加させることによって、上記問題は解消され、二つ目に、ニコチンアミド（ＮＡＭ）の代謝が増加することを介して、ＰＡＲＰ活性のアクティブな阻害剤を除去するという効果を奏する。ＰＡＲＰ−１は、ＤＮＡ鎖の切断によって活性化され、塩基除去修復（ＢＥＲ）経路、単一鎖切断（ＳＳＢ）経路、および二本鎖切断（ＤＳＢ）経路などを含めた、複数のＤＮＡ修復経路に結び付けられている。二重ＺｎフィンガーのＤＮＡ結合領域を介して、損傷ＤＮＡにＰＡＲＰ−１が結合すると、ＰＡＲＰ−１の活動を強力に活性化し、それゆえ、ＰＡＲＰ−１がＤＮＡ損傷センサーとしても機能することを可能にする。ＰＡＲＰ−２も損傷ＤＮＡによって刺激され、ＰＡＲＰ−１およびＸ線修復相互補体グループ１（ＸＲＣＣ−１）との相互作用を介して塩基除去修復（ＢＥＲ）経路に結び付けられている。
ニコチンアミド（ＮＡＭ）も、例えばＳＩＲＴ１などの、哺乳類のサーチュインファミリー酵素の活性を阻害する（http://en.wikipedia.org/wiki/Sir2-note-1）。本発明の方法にしたがってリスベラトロールを投与すれば、一方で、ＮＡＭの代謝の増加を誘起することによってサーチュイン活性の抑制を低減させながら、ＮＡＤ＋の合成を増加させ、それゆえ、サーチュイン活性に必要な基質が利用できる可能性を増加させる。そこで、本発明は、リスベラトロールの投与によってサーチュイン活性を誘起する方法を提供する。
医薬組成物および投与経路
本発明は、治療有効量のリスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を包含する医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、ＮＡＤ＋を必要とする被検者においてＮＡＤ＋の合成を増加させるために使用されてもよい。上記の構成に加えて、あるいは、上記の構成の替わりに、本発明の医薬組成物は、酸化ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷に関連する疾病または状態を、予防する、あるいは治療するために使用されてもよい。
本発明の医薬組成物中のリスベラトロールは、シス異性体、トランス異性体、またはこれらの混合物の形態であってもよい。本発明の医薬組成物に適したリスベラトロールの類似体の例としては、リスベラトロールのヒドロキシル化類似体またはリスベラトロールのメトキシル化類似体などが挙げられるが、これらの例に限定されるものではない。機能的に同等なリスベラトロールの類似体は、シス−リスベラトロールグルコシド（シス−ｐｉｃｅｉｄ）またはトランス−リスベラトロール−３−Ｏ−β−グルコシド（トランス−ｐｉｃｅｉｄ）であってもよい。本発明の医薬組成物に適したリスベラトロールの誘導体の一例としては、１つ以上のヒドロキシル基（典型的には３−ヒドロキシル基）が単糖または二糖に共役結合している誘導体が挙げられる。一般に、３−ヒドロキシル基は、単糖の１位にに共役結合していてもよい。リスベラトロールに共役結合してもよい糖類の例としては、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、およびガラクトースなどがあげられるが、これらの例に限定されるものではない。その他の適切なリスベラトロールの誘導体および類似体は、例えば米国特許第７０２６５１８号明細書、米国特許第６７９０８６９号明細書、国際特許出願公開第ＷＯ／２００３／０５５４４４、国際特許出願公開第ＷＯ／２００４／０００３０２、国際特許出願公開第ＷＯ／１９９９／００３８１６などに記載されている。なお、これらの特許文献の内容は参照によってここに引用されるものとする。当業者がこれらの文献を参照すれば、本発明の医薬組成物に適した、上述のリスベラトロールの誘導体および類似体は、非限定的な例であって、本発明は、機能的に同等な効果を誘起することができる、類似のその他のリスベラトロールの誘導体および類似体の使用を包含することが理解できよう。
残留性の酸素フリーラジカルによって引き起これる損傷を低減するために、酸化還元活性を有する金属および／または抗酸化剤をキレート化する薬剤からなる薬物併用療法は、ＮＡＤ＋の合成促進剤を包含することによって相乗的に亢進され得る。そこで、本発明は、ＮＡＤ＋の合成を促進するための少なくとも１つの薬剤と、少なくとも１つの抗酸化剤および／または少なくとも１つのキレート薬との相乗的な組み合わせを包含する、酸化ストレスに関連する状態および疾病を治療法するための医薬組成物を提供する。
ＮＡＤ＋の合成を促進するための薬剤を、抗酸化剤および／またはキレート薬を含有する組成物中に包含することによって、酸化ストレスを予防、治療、または軽減するための相乗効果が提供できる。好適な実施形態において、ＮＡＤ＋の合成を促進するための上記薬剤は、リスベラトロール、リスベラトロールの機能的類似体、またはこれらに相当するものである。特定のメカニズムに制限されるものではないが、酸化ストレス条件にある間ＮＡＤ＋が増加することは、ＮＡＤ＋依存性の他の酵素、例えばＮＡＤグリコヒドラーゼの機能にとって有益であるかもしれない。このことが、酸化ストレス下にある細胞に対してさらに薬効を提供する。上記の構成に加えて、あるいは、上記の構成の替わりに、ＮＡＤ＋の合成を促進する薬剤は、ＮＡＤ＋に対する依存性を有する脱アセチル化酵素、例えばサーチュインファミリー酵素（例えばＳＩＲＴ１）の活性を増加させる能力を有していて、該脱アセチル化酵素の必須な基質であるＮＡＤ＋の生成の増加を介してＰＡＲＰ酵素活性を亢進させることによって、ＤＮＡ修復の改善を促進してもよい。上記の構成に加えて、あるいは、上記の構成の替わりに、ＮＡＤ＋の合成を促進する薬剤は、ＮＭＮＡＴ活性の誘起を介して、ＮＡＭの代謝を増加させることもでき、こうすることによってＰＡＲＰ／サーチュインの阻害剤を除去し、上記酵素の活性をさらに誘起してもよい。
本発明の相乗的な組成物に適したキレート薬の例としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ベルサンテ二ナトリウムカルシウム）（ＣａＮａ２−ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、αリポ酸（ＡＬＡ）、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）、ジメルカプロール（ＢＡＬ）、デフェロキサミン、Ｄ−ペニシラミン、ジメルカプロール、アミノフェノキシエタン−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）デファラシロックス、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）２−ピリジンカルボン酸（ピコリン酸）、２，３−ピリジンジカルボン酸（キノリン酸）、２−アミノ安息香酸（アントラニル酸）、キヌレン酸、キサンツレン酸、および８−ヒドロキシキノリン（およびこれらの機能性誘導体）などがあげられるが、これらの例に限定されるものではない。一般に、キレート薬とは、酸化還元活性を有する金属と、錯体を形成することができるものであって、この錯体中では、一般に金属イオンが該キレート薬の２つ以上の原子に結合していて、こうすることによってヒドロキシラジカルの生成を低減させる。この結合は、配位結合またはイオン結合の任意の組み合わせであってもよい。キレート薬と結合して錯体を形成するかもしれない酸化還元活性を有する金属の例としては、Ｆｅ＋＋、Ｃｕ＋、Ｃｒ＋＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｃｏ＋＋、Ｎｉ＋＋、Ａｇ＋などが挙げられるが、これらの例に限定されるものではない。
本発明の相乗的な組成物に適した抗酸化剤の例としては、メラトニン、ビタミンＥ、ビタミンＣ、メチオニン、タウリン、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、およびグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＸ）、ならびにＬ−エルゴチオネインＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、ビタミンＡ、βカロチン、レチノール、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン−３−没食子酸、フラベノイド、Ｌ−エルゴチオネイン、イデベノン、およびセレンなどがあげられるが、これらの例に限定されるものではない。その他の適切な抗酸化剤は、米国特許第２００８０１５２１８号明細書に記載されており、該特許文献の内容は参照によってここに引用されるものとする。
本発明の医薬組成物は、治療上投与されてもよい。治療上の適用において、組成物は、酸化ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷を増加させると考えられる状態で、または既に酸化ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷に関連する疾病に罹患している、もしくはそのような状態にある患者に対して、または酸化ストレスおよびその合併症に関連する疾病または状態を少なくとも部分的に停止させるために、予防的に投与されてもよい。治療を行っている医師が投与量のレベルおよびパターンを選択して、上記医薬組成物を一回または複数回投与してもよい。
任意の患者に対する上述の治療上有効な投与量のレベルは、次に列挙するような種々の因子によって左右される。すなわち、酸化ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷に関連する疾病または状態の重症度（ＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷を含む）、採用した組成（物）、患者の年齢、体重、身全体の健康状態、および食事、投与時刻、投与経路、治療の継続時間、相乗的な組成物と組み合わせて使用または同時に使用する薬剤、さらに他の医学においてよく知られた関連する因子などである。
当業者であれば、通例的な実験によって、ＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷を含む、酸化ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷に関連する疾病または状態を、本発明の医薬組成物により治療するために必要な、上記の治療薬の有効な非有毒量を決定できるであろう。
本発明の方法では、投与される医薬組成物は、体重１ｋｇ当たり約０．０００１ｍｇから約１０００ｍｇまで、例えば体重１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇから約７５０ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇから約５００ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇから約５００ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇから約２５０ｍｇまで、または体重１ｋｇ当たり約１．０ｍｇから約２５０ｍｇまでの範囲にあればよい、さらに好適には、２４時間当たりの効果的な服用量は、体重１ｋｇ当たり約１．０ｍｇから約２００ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約１．０ｍｇから約１００ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約１．０ｍｇから約５０ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約１．０ｍｇから約２５ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約５．０ｍｇから約５０ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約５．０ｍｇから約２０ｍｇまで、または体重１ｋｇ当たり約５．０ｍｇから約１５ｍｇまでの範囲にあればよい。
さらに、本発明の組成物の個々の服用量の最適量および投与間隔が、状態の性質および程度、投与の形式、経路、および部位、および治療中の特定の患者の性質によつて決定されればよいことは、当業者には明らかである。また、このような最適条件を、従来の方法によって決定してもかまわない。
最適な治療手順を（例えば、規定された日数の間投与される、本発明の組成物の一日あたりの投与回数）従来の治療手順決定試験を使って当業者が確認できることも、当業者には明らかである。
一般に、本発明の医薬組成物は、当業者にとって公知である方法によって調製されればよく、したがって、薬学的に許容可能なキャリア、希釈液、および／または補助剤を包含していてもよい。
本発明の方法によれば、医薬組成物は、任意の適した経路によって、全身に投与されてもよく、部分的に投与されてもよく、または局所的に投与されてもよい。任意の環境において使用する特定の投与経路は、治療対象である疾病または状態の性質、疾病または状態の重症度および程度、誘導される特定の化合物の必要な服用量、および化合物の潜在的な副作用を含めた、複数の因子によって左右される。
例えば、適切な濃度の所望の化合物が、治療するべき身体の部位に直接誘導されることが要求される環境中では、投薬は全身的に行うのではなく、部分的に行われる。部分的に投薬することによって、局所的に非常に高い濃度を作り出す所望の化合物を、要求されている部位へデリバリーできるようになり、それゆえ、身体の他の器官が上記化合物に曝露されることを避けて、避けることによって副作用を潜在的に低減しながら、所望する治療効果または防止効果実現するために適している。
一例として、本発明の実施形態に係わる投与は、腔内経路、膀胱内経路、筋肉内経路、動脈内経路、静脈内経路、皮下経路、局所的経路、または経口経路などを含めた、任意の標準的な経路によって実現されればよい。腔内の投与は、腹腔内経路であっても、胸膜内経路であってもよい。特定の実施形態では、投与は点滴静注または腹腔内投与を介して行われる。
所望であれば、持続的な放出または間欠的な放出に適した医薬組成物を包含するデバイスまたは組成物を、実質的には、身体に埋め込んでも、局所的に適用しても、上述のような物質を比較的ゆっくりと身体へ放出することができる。
上記のキャリア、希釈液、および補助剤は、上記組成物の他の成分と適合できるという観点で、必ず”許容可能”でなければならない。また、レシピエントにとって有害であってはならない。薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈液の例としては、脱塩水または蒸留水；生理食塩水；ピーナッツ油、ベニバナ油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油（例えば、ピーナッツ油、ベニバナ油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、ラッカセイ油、またはヤシ油）などの野菜を基にした油；メチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサン、およびメチルフェニルポリソルポクサンなどの、ポリシロキサンを含めたシリコーンオイル；揮発性シリコーン；流動パラフィン、軟パラフィン、スクアランなどのミネラルオイル；メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体；エタノールまたはイソプロパノールなどの低級アルカノール；低級アラルカノール(aralkanol)；ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、またはグリセリンなどの低級ポリアルキレングリコールまたは低級アルキレングリコール；イソプロピルパルミチン酸、ミリスチン酸イソプロピル、またはエチルオレイン酸などの脂肪酸エステル；ポリビニルピリドン；寒天；カラゲナン；トラガカントゴムまたはアラビアゴム；およびワセリンなどがあげられる。上記一つのまたは複数のキャリアは、上記組成物の１０％から９９．９重量％を形成すればよい。
本発明の医薬組成物は、組成物の形態、経口摂取（例えばカプセル、錠剤、カプレット、およびエリキシル剤）による投与に適した形態、局所投与に適した軟膏、クリーム、またはローションの形態（この形態はＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷の治療および修復には特に好ましい）、点眼としてのデリバリーに適した形態、例えば鼻腔内の吸入または経口の吸入などの吸入による投与に適したエアロゾルの形態、皮下注射、筋肉内注射、または静脈内注射である非経口投与に適した形態であればよい。
注射用の溶液または注射用の懸濁液として投与する場合、非有毒な、非経口的に許容可能な希釈液またはキャリアの例としては、リンゲル溶液、等張生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、エタノール、および１，２−プロピレングリコールなどが挙げられる。
経口使用の場合の、適切なキャリア、希釈液、賦形剤、および補助剤の例としては、ピーナッツ油、流動パラフィン、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム、トラガカントゴム、ブドウ糖、スクロース、ソルビトール、マンニトール、ゼラチンの、およびレシチンなどがあげられる。さらに、これらの経口製剤は、適切な人工香味料および着色料を含有していてもよい。カプセルの形態で使用される場合、カプセルは、壊変を遅延させる、モノステアリン酸グリセリンまたはグリセリルジステアレートなどの化合物で被覆されていてもよい。
補助剤は通常、皮膚軟化薬剤、乳化剤、増粘剤、保存料、殺菌剤、および緩衝剤を包含している。
経口投与用の固形物は、ヒトおよび獣の薬務において許容可能な結合剤、甘味料、崩壊剤、希釈液、人工香味料、コーティング剤、保存料、潤滑剤、および／または遅延剤を包含していてもよい。適切な結合剤の例としては、アラビアゴム、ゼラチン、トウモロコシ澱粉、トラガカントゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、またはポリエチレングリコールなどがあげられる。適切な甘味料の例としては、スクロース、ラクトース、グルコース、アスパルテーム、またはサッカリンなどがあげられる。適切な崩壊剤の例としては、トウモロコシ澱粉、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、グアーガム、キサンタンガム、ベントナイト、アルギン酸、または寒天などがあげられる。適切な希釈液の例としては、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、ブドウ糖、カオリン、セルロース、炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、またはリン酸ジカルシウムなどがあげられる。適切な調味料の例としては、ペパーミント油、冬緑樹油、サクランボ、オレンジ、またはキイチゴの人工香味料などがあげられる。適切なコーティング剤の例としては、アクリル酸および／またはメタクリル酸および／またはこれらのエステル、ワックス、脂肪アルコール、ゼイン、セラック、またはグルテンの重合体または共重合体などがあげられる。適切な保存料の例としては、安息香酸ナトリウム、ビタミンＥ、αトコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベン、またはナトリウム重亜硫酸などがあげられる。適切な潤滑剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ナトリウムオレイン酸、塩化ナトリウム、または滑石などがあげられる。適切な遅延剤の例としては、モノステアリン酸グリセリンまたはグリセリルジステアレートなどが挙げられる。
経口投与用の液体形態物は、上記の薬剤に加えて、液体キャリアを包含していてもよい。適切な液体キャリアの例としては、水、および例えばオリーブ油、ピーナッツ油、ゴマ油、サンフラワーオイル、ベニバナ油、ラッカセイ属油、ヤシ油、流動パラフィン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセリン、脂肪アルコール、トリグリセリドなどの油、またはこれらの混合物などが挙げられる。
経口投与用の懸濁液の例としては、さらに、分散剤および／または懸濁剤などがあげられる。適切な懸濁剤の例としては、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、ポリ−ビニル−ピロリドン、アルギン酸ナトリウム、またはアセチルアルコールなどがあげられる。適切な分散剤としては、レシチン、例えばステアリン酸などの脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレイン酸またはポリオキシエチレンソルビトールジオレイン酸、ポリオキシエチレンソルビトールモノステアリン酸またはポリオキシエチレンソルビトールジステアリン酸、またはポリオキシエチレンソルビトールモノラウリン酸またはポリオキシエチレンソルビトールジラウリン酸、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸またはポリオキシエチレンソルビタンジオレイン酸、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸またはポリオキシエチレンソルビタンジステアリン酸、またはポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸またはポリオキシエチレンソルビタンジラウリン酸などが挙げられる。
本発明の医薬組成物は、選択された治療用化合物を、選択された賦形剤、キャリア、補助剤、および／または希釈液を用いてブレンド、粉砕、均質化、懸濁、溶解、乳化、分散、および／または混合することによって、調製されてもよい。
錠剤またはカプセルの形態の、本発明の１つのタイプの医薬組成物は、（ａ）第１の治療用化合物を、任意の所望の賦形剤、キャリア、補助剤、および／または希釈液とともに包含する第１の錠剤またはカプセルを調製し、（ｂ）第２の治療用化合物と該第１の錠剤またはカプセルとを包含する第２の錠剤またはカプセルを調製することによって調製されてもよい。
カプセルの形態の、本発明の別のタイプの医薬組成物は、（ａ）第１の治療用化合物を、任意の所望の賦形剤、キャリア、補助剤、および／または希釈液とともに包含する第１のカプセルを調製し、（ｂ）第２の治療用化合物と該第１のカプセルとを包含する第２のカプセルを調製することによって調製されてもよい。
錠剤の形態の、本発明のさらに別のタイプの医薬組成物は、（ａ）治療用化合物を、任意の所望の賦形剤、キャリア、補助剤、および／または希釈液とともに包含するカプセルを調製し、（ｂ）該第２の治療用化合物と該カプセルを包含する錠剤を調製することによって調製されてもよい。
経口投与用の乳濁液は、１つ以上の乳化剤をさらに包含していてもよい。適切な乳化剤の例としては、例を上述した分散剤、またはグアーガム、アラビアゴム、またはトラガカントゴムなどの天然ゴムなどがあげられる。
非経口的に投与可能な組成物を調製するための方法は、当業者にとって自明であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa.,に詳細に記載されている。この文献の内容は参照によってここに引用されるものとする。
本発明の局所的な組成物は、治療用化合物を、１つ以上の許容可能なキャリア、および必要に応じて任意のその他の治療用成分とともに包含している。局所投与に適した組成物は、皮膚を通って、治療画必要な部位に浸透するために適した液体または半液体の調製物、例えばリニメント剤、ローション、クリーム、軟膏、またはペースト、および眼、耳、または鼻部への投与に適した液滴を包含している。
本発明に係わる液滴は、無菌の、水性溶液、油性溶液、または懸濁液を包含していてもよい。これらの液滴は、殺菌性および／または殺真菌性の薬剤および／または任意のその他の適切な保存料、および必要に応じて表面活性剤を含有する水溶液に、治療用化合物を溶解させることによって、調製されてもよい。その結果得られる溶液は、次に、濾過することによって透明にされ、適切な容器に移されて、無菌化されてもよい。滅菌は、高圧蒸気殺菌法または９０℃−１００℃で半時間維持することによって、または濾過の後に無菌的な方法で容器に移すことによって、実現されてもよい。上記液滴に包含するために適した、殺菌性のおよび殺真菌性の薬剤の例としては、硝酸フェニル水銀または酢酸（０．００２％）、塩化ベンザルコニウム（０．０１％）、およびクロルヘキシジン酢酸（０．０１％）などがあげられる。油性溶液の調製に適した溶媒の例としては、グリセリン、希釈アルコール、およびプロピレングリコールなどが挙げられる。
本発明に係わるローションの例としては、皮膚または眼に対して適用するために適したものが挙げられる。点眼薬剤は、殺菌剤を必要に応じて含有する無菌性水溶液を包含していてもよく、液滴の調製に関連して上述した方法と同様の方法によって調製されてもよい。皮膚に適用するローションまたはリニメント剤は、乾燥を加速し、皮膚を冷却する薬剤、例えばアルコールまたはアセトン、および／またはグリセリンなどの保湿剤、またはヒマシ油もしくはラッカセイ油などの油をも包含していてもよい。
本発明に係わるクリーム、軟膏、またはペーストは、外用化合物の半流動性製剤であって、細かく分割または粉末化した形態の有効成分を、単独で混合、または水性の液体または非水性の液体中で溶解または懸濁させた状態で、グリース状または非グリース状の基剤と混合することによって、調製されてもよい。この基剤は、硬パラフィン、軟パラフィン、または流動パラフィン、グリセリン、蜜蝋、金属石鹸などの炭化水素；粘液；アーモンド、トウモロコシ、ラッカセイ属、ヒマシ油、またはオリーブ油などの天然由来の油；羊毛脂肪またはその誘導体、またはステアリン酸もしくはオレイン酸などの脂肪酸を、プロピレングリコールまたはマクロゴールなどのアルコールとともに包含していてもよい。
上記組成物は、任意の適切な界面活性物質、例えば、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤（例えばソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体）などを包含していてもよい。天然ゴム、セルロースの誘導体、または無機物質（例えば、ケイ質シリカ）などの懸濁剤、およびラノリンなどのその他の成分を包含していてもよい。
上記組成物は、リポソームの形態で標的細胞に投与または誘導されてもよい。リポソームは一般に、リン脂質などの脂質物質に由来し、水性培地に分散している単層状または多層状の水和液晶によって形成されている。組成物を標的細胞に投与または誘導する際に使用されるリポソームの具体的な例としては、合成コレステロール（シグマ）、リン脂質１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社）、ＰＥＧ脂質３−Ｎ−［（−メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミレスチロキシ−プロピルアミン（ＰＥＧ−ｃＤＭＡ）、および陽イオン性の脂質１，２−ｄｉ−ｏ−オクタデセニル−３−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）または１，２−ジリノレイロキシ−３−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を５５：２０：１０：１５または４８：２０：２：３０のモル比で混合したもの、さらにＰＥＧ−ｃＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、およびＤＬｉｎＤＭＡなどがあげられる。非有毒、生理的に許容可能、かつ代謝可能であって、リポソームを形成できる任意の脂質が使用可能である。リポソームの形態の上記組成物は、安定剤、保存料、賦形剤などを包含していてもよい。好ましい脂質としては、リン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン）があげられ、いずれも天然のものでも合成されたものでもよい。リポソームを形成する方法は、当該技術分野において公知であり、この点について具体的に、Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p. 33 et seq.,を参照するが、この文献の内容は参照によってここに引用されるものとする。
上記組成物は、微小粒子の形態で投与されてもよい。ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコライド（ＰＬＧＡ）、およびε−カプロラクトン（ε−カプロラクトン）から形成される、生分解性の微小粒子は、血漿の半減期を延長し、こうすることによって有効性を延長する薬物担体として広範に使用されている（R. Kumar, M., 2000, J Pharm Pharmaceut Sci. 3(2) 234-258）。微小粒子は、ワクチン、抗生物質、およびＤＮＡを含めた、薬剤となり得るある範囲のものを誘導することを目的として、製剤されている。また、これらの製剤は、非経口的な皮下注射、静脈内注射、および吸入を含めた、各種誘導経路にあわせて開発されている。
上記組成物は、糖酢酸イソ酪酸エステル（ＳＡＩＢ）および有機溶剤または有機溶剤の混合物からなる、コントロールド・リリース・マトリックスを包含していてもよい。粘性をさらに増加させ、放出速度を低下させるために、重合体の添加物が、放出調製成分とてし上記媒体に添加されてもよい。ＳＡＩＢは、周知の食品添加物である。ＳＡＩＢは、２つの酢酸基に対して６つのイソ酪酸という名目上の比において、高い疎水性を有し、完全にエステル化されたスクロースの誘導体である。混合エステルとしては、ＳＡＩＢは結晶化せずに、透明な粘稠性を有する液体として存在する。ＳＡＩＢを、エタノールまたはベンジルアルコールなどの薬剤的に受容される有機溶剤に混合すると、混合物の粘性が大幅に減少し、注射が可能になる。ＳＡＩＢ溶液製剤またはＳＡＩＢ懸濁液製剤を形成するために、治療用化合物が、ＳＡＩＢをデリバリーする媒体に添加されてもよい。該製剤が皮下に注入されると、溶媒はマトリックスから拡散し、ＳＡＩＢ／薬剤の混合物またはＳＡＩＢ／薬剤／重合体の混合物がインサイツを形成するデポとして構成することが可能になる。
当業者であれば、本発明の方法よれば、上記医薬組成物が、単独でまたは併用療法として１つ以上の付加的な薬剤とともに投与されてもよいことが理解できるであろう。例えば、本発明の医薬組成物は、ＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷を含めた、酸化ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷に関連する状態を治療または防止することができる、１つ以上の付加的な薬剤とともに投与されてもよい。
上記の併用療法の場合、所望の効果を得るために、併用療法の各成分が同時に投与されてもよく、任意の順番で順に投与されてもよく、または異なるタイミングで投与されてもよい。上記の構成の替わりに、上記成分をまとめて、一回の服用量の単位の組み合わせ生成物として製剤されてもよい。別々に投与される場合、上記成分が同じ投与経路で投与されることが好ましいこともある。ただし、必ずしもこうする必要はない。
治療上の利点は、組み合わせ療法を介しても実現され得る。併用療法では、組成物はおよびその他の任意の薬剤は、同時に投与されても、または任意の順番で順に投与されてもよい。そこで、本発明に係わる治療方法は、放射線療法、化学療法、手術、またはその他の形態の医療行為などの、通常の療法とともに適用されてもよい。化学療法薬剤の例としては、ドキソルビシン、タキソール、フルオロウリシル(fluorouricil)、メルファラン、シスプラチン、オキサリプラチン、αインターフェロン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、アンジオインヒビン、ＴＮＰ−４７０、ペントサンポリサルフェート、血小板第４因子、アンジオスタチン、ＬＭ−６０９、ＳＵ−１０１、ＣＭ−１０１、テクガラン(Techgalan)、サリドマイド、ＳＰ−ＰＧなどが挙げられる。その他の化学療法薬剤としては、メクロエタミン(mechloethamine)、メルファン(melphan)、クロラムブシル、シクロホスファミド、およびイホスファミドを含めたメクロレタミン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、およびストレプトゾシンを含めたニトロソウレアなどのアルキル化剤；ブスルファンを含めたスルホン酸アルキル；ジカルバジン(dicarbazine)を含めたトリアジン；チオテパおよびヘキサメチルメラミンを含めたエチエンイミン(ethyenimine)；メトトレキサートを含めた葉酸類似体；５−フルオロウラシルおよびシトシンアラビノシドを含めたピリミジン類似体；６−メルカプトプリンおよび６−チオグアニンを含めたプリン類似体；アクチノマイシンＤを含めた抗腫瘍性の抗生物質；ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、およびメトラマイシン(methramycin)を含めたアントラサイクリン；タモキシフェンおよびコルチオステロイド(cortiosteroid)を含めたホルモンおよびホルモン拮抗薬剤、ならびにシスプラチンおよびブレキナルを含めた種々の薬剤、ならびにＣＯＭＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、メトトレキサート、およびプレドニゾン）、エトポシド、ｍＢＡＣＯＤ（メトトレキサート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびデキサメタゾン）、ならびにＰＲＯＭＡＣＥ／ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキサート（ロイコボリン(leucovin)レスキューを併用）、ドキソルビシン、シクロホスファミド、タキソール、エトポシド／メクロレタミン、ビンクリスチン、プレドニゾン、およびプロカルバジン）などの療法などが挙げられる。
当業者であれば、ここに記載されている本発明に対して、具体的に記載されたもの以外の変更や変形が可能であることが理解できるであろう。本発明にはこういった変更や変形がすべて含まれることが理解されるはずである。
治療方法
本発明では、ＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷を含めた、酸化ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷に関連する疾病および状態を治療するための方法について考察する。一実施形態において、該方法は、治療有効量のリスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を、被検者に対して投与することを包含する。別の一実施形態において、該方法は、ＮＡＤ＋の合成を誘起する少なくとも１つの薬剤と、効果的な量の、少なくとも１つの抗酸化剤および少なくとも１つのキレート薬のいずれかまたは両方との、相乗的な組み合わせを含有する治療有効量の医薬組成物を、被検者に対して投与することを包含する。
当業者であれば、本発明の上記組成物の投与を使用して、ＮＡＤ＋の合成を刺激することを直接の標的とし、そうすることによって、ＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷を含めた酸化ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷を治療するための薬効を提供し得ることができ、Ｈ２Ｏ２、Ｏ２・−、・ＯＨ、およびＮＯなどの活性酸素種のレベルの上昇を伴うことが理解できよう。ＮＡＤ＋の合成量が増加すると、ＤＮＡの修復においておよびサーチュイン酵素に関与するＰＡＲＰ酵素に対して余分な基質が提供され、また、ニコチンアミド代謝が増加し、それゆえ、ＰＡＲＰおよびサーチュインの酵素活性の強力な阻害剤が除去される。そこで、本発明の該方法は、ＮＡＤ＋レベルの決定的な減少を軽減する手段を提供し、細胞死の酸化ストレスによって誘起されるＰＡＲＰの活性化の増加レベルをつりあわせる。
ＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷を含めた、酸化ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷に関連する、本発明の方法による治療に適した疾病および状態としては、紫外線または電離放射線（例えばｘ線、γ線）に対する曝露、化学薬品、感染、炎症、またはミトコンドリアの効率低下が原因になって、ＲＯＳレベルの上昇が起こる疾病および状態などがあげられるが、これらの例に限定されるものではない。本発明の方法は、皮膚の通常の細胞老化または加速的な老化の治療、ＵＶによって誘起される皮膚細胞（つまりケラチノサイトおよび線維芽細胞）のＤＮＡ損傷の治療および修復、ならびにアルツハイマー病およびパーキンソン病を含めた神経変性疾患および障害の治療および修復に適している。上記の構成に加えて、あるいは、上記の構成の替わりに、本発明の方法は、癌を含めた、ＤＮＡ損傷に関連する疾病および状態の治療に適している。上記の疾病は非限定的な例であって、本発明の組成物は、酸化ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷に関連するその他の状態および疾病の治療に使用可能であることが、当業者であれば理解できよう。
キット
本発明は、リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を包含する、ＮＡＤ＋の合成を増加させるためのキットを提供する。
さらに、本発明は、リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を包含する、被検者において、酸化ストレスに関連する疾病または状態を治療するためのキットを提供する。
さらに、本発明は、リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を包含する、被検者において、ＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷を含めた、ＤＮＡ損傷に関連する疾病または状態を治療するためのキットを提供する。
上記リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体は、シス異性体、トランス異性体、またはこれらの混合物であってもよい。キットに包含されていてもよいリスベラトロールの類似体としては、リスベラトロールのメトキシル化類似体、シス−リスベラトロールグルコシド（シス−ｐｉｃｅｉｄ）、およびトランス−リスベラトロール−３−Ｏ−β−グルコシド（トランス−ｐｉｃｅｉｄ）などがあげられるが、これらの例に限定されるものではない。
上記キットは、任意の数の付加的な構成要素を包含していてもよい。非限定的な例として、この付加的な構成要素には、参照試料、緩衝液、標識、およびアッセイを実施するための説明書なとが含まれていてもよい。
次に、特定の例を参照して本発明を説明するが、これは、本発明の範囲を限定すると解釈すべきものではない。
〔実施例〕
実施例１：ヒトの胎児のアストロサイトにおける、ＩＤＯ阻害剤１−ＭＴによる、ＮＡＤ＋合成の新生経路の抑制。
ヒトの胎児の初代アストロサイトを、２４ウェルの培養プレート（〜１０５個の細胞／ウェル）に播種した。各ウェルは、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および０．５％のグルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）を補充した、１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０の細胞培養培地を含んでいた。培養物を２４時間放置して平衡化させ、つづいて、ＩＤＯ阻害剤１−メチルトリプトファン（１−ＭＴ）（１００μＭ）を、単独でまたはＬ−トリプトファン（１００μＭ）もしくはニコチン酸（１００μＭ）のいずれかと組み合わせて用いて、処理した。この薬剤の添加につづいて、培養を、５％のＣＯ２中で３７℃で２４時間インキュベーションし、つづいて細胞のＮＡＤ＋の濃度を分析した。細胞物をＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ値７．４）で洗浄し、ニコチンアミド（１０ｍＭ）をＰＡＲＰ阻害剤として含有するホモジネート溶液中で超音波処理した。それから、細胞のホモジネートの試料を、ビシン緩衝液（１２０ｍＭ）、エタノール（０．６Ｍ）、フェニジンメチルサルフェート(phenyzine methyl sulfate ; PMS)（２ｍＭ）、ＭＴＴ（０．５ｍＭ）、およびアルコール脱水素酵素（１ｍｇ／ｍｌ）を含有する反応混合物に添加した。ＮＡＤ＋およびＮＡＤＨのレベルを、バイオラド×６８０型ミクロプレート読み取り装置（バイオラド社、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）において５７０ｎｍのフィルターを使って、試薬のブランク値に対して分光測定で数量化した。
細胞一個当たりのＮＡＤ＋（Ｈ）の濃度を、タンパク質のさまざまなレベルについて、細胞のホモジネート中のタンパク質の総量を参照することによって調節した。
総タンパク質量を、ブラッドフォードのタンパク質アッセイ法を使って決定した。１０μｌの細胞のホモジネート試料（ＮＡＤ＋アッセイにおいて使用したもの）を、２３０μｌのミリＱ水および６０μｌのブラッドフォード試薬とともに各ウェルに手早く添加し、１０分〜１５分間放置して平衡化させた。それから、プレートを、バイオラド×６８０型ミクロプレート読み取り装置（バイオラド社、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）において５９５ｎｍのフィルターを使って読み取った。
トリプトファンからＮＡＤ＋の新生合成の完全な阻害は、競合的なＩＤＯ阻害剤１−ＭＴ（１ｍＭ、２４ｈ）によって誘起される。その結果、細胞内のＮＡＤ＋レベルが大きく減少した（図３）。過剰な量のＬ−トリプトファンまたはサルベージ経路の基質であるニコチン酸のいずれかを補充すると、１−ＭＴのみによる処理に比較して、ＮＡＤ＋の枯渇が部分的に逆転した（図３）。
実施例２：Ｈ２Ｏ２は、ヒトの胎児のアストロサイトにおいて、ＰＡＲＰ活性を増加させる。
ヒトの胎児の初代アストロサイトを、２４ウェルの培養プレート（〜１０５個の細胞／ウェル）に播種した。各ウェルは、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および０．５％のグルタミックス(Glutamix)を補充した、１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０の細胞培養培地を含んでいた。培養物を２４時間放置して平衡化させ、つづいて、酸化促進剤Ｈ２Ｏ２を０μＭから１０００μＭまで濃度を増加させて用いて、処理した。このＨ２Ｏ２の添加につづいて、培養物を、５％のＣＯ２中で３７℃で１５分間インキュベーションし、つづいて２回洗浄し、トリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ値８．１）にＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）、トリトンＸ−１００（１％）、およびＮＡＤ＋（２０μＭ）を含有する２００μＬのＰＡＲＰアッセイ緩衝液中で、均質化／溶解ざせ、さらに３７℃で６０分間放置してインキュベーションした。ＮＡＤ＋は、ＰＡＲＰ酵素にとっての唯一の基質であって、この反応中に劣化するので、酵素活性全体が、アッセイ緩衝液におけるＮＡＤ＋の濃度の減少を定量化することによって、決定される。ＮＡＤ＋の消費量は、上述のように、ＮＡＤ＋（Ｈ）マイクロサイクリングアッセイによって測定される。
ＰＡＲＰ−１の活性は、１０μＭ〜１００μＭのＨ２Ｏ２に２０分間曝露した後、培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおいて大幅に増加した（図４）（Ｈ２Ｏ２に暴露しなかった場合に比較するとαｐ＜０．０５、１０μＭのＨ２Ｏ２の場合に比較するとβｐ＜０．０５、２０μＭのＨ２Ｏ２の場合に比較するとχｐ＜０．０５、５０μＭのＨ２Ｏ２の場合に比較するとδｐ＜０．０５）。
実施例３：Ｈ２Ｏ２は、ヒトの胎児のアストロサイトにおいて、細胞内ＮＡＤ＋を減少させる。
ヒトの胎児の初代アストロサイトを、２４ウェルの培養プレート（〜１０５個の細胞／ウェル）に播種した。各ウェルは、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および０．５％グルタミックスを補充した、１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０の細胞培養培地を含んでいた。培養物を２４時間放置して平衡化させ、つづいて、酸化促進剤Ｈ２Ｏ２を０μＭから１０００μＭまで濃度を増加させて用いて、処理した。このＨ２Ｏ２の添加につづいて、培養物を、５％のＣＯ２中で３７℃で１５分間インキュベーションし、つづいて２回洗浄し、３００μＬのＰＢＳに再懸濁し、氷上に載置した。つづいて、上記の実施例１に記載のように、超音波処理を行い、細胞のＮＡＤレベルを即時分析した。
細胞内のＮＡＤ＋は、１０μＭ〜１００μＭのＨ２Ｏ２に２０分間曝露した後、培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおいて大幅に減少した（図５）（０μＭのＨ２Ｏ２のコントロールの場合に比較すると＊ｐ＜０．０５、５０μＭのＨ２Ｏ２の場合に比較すると＊＊ｐ＜０．０５、１００μＭのＨ２Ｏ２の場合に比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５）。ＮＡＤ＋レベルの減少は、測定したＰＡＲＰ−１活性と負の相関関係を有していた（図４に示す）。
実施例４：Ｈ２Ｏ２は、ヒトの胎児のアストロサイトにおいて、ＬＤＨ放出の誘起する。
ヒトの胎児の初代アストロサイトを、２４ウェルの培養プレート（〜１０５個の細胞／ウェル）に播種した。各ウェルは、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および０．５％グルタミックスを補充した、１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０の細胞培養培地を含んでいた。培養物を２４時間放置して平衡化させ、つづいて、酸化促進剤Ｈ２Ｏ２を０μＭから１０００μＭまで濃度を増加させて用いて、処理した。このＨ２Ｏ２の添加につづいて、培養物を、５％のＣＯ２中で３７℃で２０分間インキュベーションし、つぎに、上清を採取して分析し、ＬＤＨの活性を求めた。ＬＤＨは細胞質の酵素であるので、細胞培養で得られた上清へのＬＤＨの漏出量は、全体的な細胞生存率の尺度として広く使用される。５０μｌのピルビン酸（１１．５ｍＭ）を、５０μｌの細胞培養で得られた上清に手早く添加する。さらに、１００μｌのＮＡＤＨ溶液（７００μＭ）をウェルに添加する。バイオラド×６８０型ミクロプレート読み取り装置（バイオラド社、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使って３４０ｎｍの吸光度の変化を５分間監視し、得られた曲線の直線部分における吸光度の最大変化率を算出することによって、ＬＤＨの活性を分光測定で測定する。
ＬＤＨの活性（細胞死の尺度）は、１０μＭ〜１００μＭのＨ２Ｏ２に２０分間曝露した後、培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおいて大幅に増加した（図６）（０μＭのＨ２Ｏ２のコントロールの場合に比較すると＊ｐ＜０．０５、１０μＭのＨ２Ｏ２の場合に比較すると＊＊ｐ＜０．０５、５０μＭのＨ２Ｏ２の場合に比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５、１００μＭのＨ２Ｏ２の場合に比較するとΨ＜０．０５）。ＬＤＨの放出の増加が、測定した細胞内のＮＡＤレベルの減少量と直接的な相関関係を有していた（図５に示す）。
実施例５：抗酸化剤は、ヒトの胎児のアストロサイトおよびヒトの神経芽細胞腫細胞において、Ｈ２Ｏ２によって誘起される細胞内のＮＡＤ＋の枯渇を阻害する。
酸素ラジカルによって誘起されるストレスは、効果的な抗酸化療法によって寛解され得る。ケルセチンは、よく実証された抗酸化活性を有する、植物に由来するポリフェノール化合物である。ヒトの胎児のアストロサイトにおいてＨ２Ｏ２によって誘起されるＮＡＤの枯渇を調節するケルセチンの能力を、テストした。
ヒトの胎児の初代アストロサイトを、２４ウェルの培養プレート（〜１０５個の細胞／ウェル）に播種した。各ウェルは、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および０．５％グルタミックスを補充した、１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０の細胞培養培地を含んでいた。培養物を２４時間放置して平衡化させ、つづいて、ＤＭＳＯ（０．２％）だけを用いるか、または０．２％ＤＭＳＯおよびケルセチン（５０μＭ）を併用して用いるかのいずれかによって、処理した。さらに２４時間インキュベーションした後、Ｈ２Ｏ２を選択した培養物に添加し（図７を参照）、５％のＣＯ２中で３７℃で２０分間インキュベーションした。つづいてＰＢＳで２回洗浄し、〜３００μＬのＰＢＳで超音波処理を行った。その結果得られたホモジネート(homegenate)を氷上に載置した。つづいて、上記の実施例１に記載のように、細胞のＮＡＤ＋レベルを即時分析した。
ＮＡＤ＋レベルは、１０μＭ〜１００μＭのＨ２Ｏ２に２０分間曝露した後、ケルセチンの存在下で一晩培養した場合、培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおいてほぼ保存された（図７）（＊ｐ＜０．０５、Ｈ２Ｏ２だけを用いる場合に比較すると＊＊ｐ＜０．００５）。
ヒトの神経芽細胞腫細胞における、ＮＡＤ＋レベルに対するメラトニンの効果も調べた。ヒトの神経芽細胞腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）を、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのｌ−グルタミン、および１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充した、ＲＰＭＩ１６４０の細胞培養培地で、９５％の空気／５％のＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で３７℃で保持した。実験を実施する前に、細胞を、約５×１０５個の密度になるまで、２４ウェルの培養プレートに播種し、一晩インキュベーションした。実験当日に、上記培地を吸引し、廃棄した。細胞を５００μＬのＰＢＳで２回洗浄し、つづいて、１０μＭの鉄、１０μＭのアスコルビン酸（鉄をＦｅ２＋の酸化状態で維持するため）、および１００μＭのＨ２Ｏ２を含有するＰＢＳを、１ウェル当たり１ｍｌ添加した。この鉄を、抗酸化性を有するメラトニン（２μＭ〜２００μＭ）とともに５分間インキュベーションし、つづいてＨ２Ｏ２を添加した。すべての処理物を、５％のＣＯ２中で３７℃でさらに３０分間インキュベーションした。それから培養物をＰＢＳで２回洗浄し、〜３００μＬのＰＢＳで超音波処理を行った。その結果得られたホミジネートを氷上に載置した。つづいて、上記の実施例１に記載のように、細胞のＮＡＤ＋レベルを即時分析した。
図８は、１００μＭのＨ２Ｏ２で処理した、ヒトの培養神経芽細胞腫細胞において、細胞内のＮＡＤ＋レベルの枯渇が、２μＭ、２０μＭ、および２００μＭのメラトニンを用いた事前処理によって阻害されていることを示している（Ｃｔｒｌに比較すると＊ｐ＜０．０５、１００μＭのＨ２０２の場合と２０μＭのＭｅｌ ＋ Ｈ２０２の場合とを画すると＊＊ｐ＜０．０５、２μＭのＭｅｌ ＋ Ｈ２０２の場合と２００μＭのＭｅｌ ＋ Ｈ２０２の場合とを比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５）。
ヒトの神経芽細胞腫細胞における、ＮＡＤ＋レベルに対するビタミンＥの効果も調べた。ヒトの神経芽細胞腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）を、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのｌ−グルタミン、および１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充した、ＲＰＭＩ１６４０の細胞培養培地で、９５％の空気／５％のＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で３７℃で保持した。実験を実施する前に、細胞を、約５×１０５個の密度になるまで、２４ウェルの培養プレートに播種し、一晩インキュベーションした。実験当日に、上記培地を吸引し、廃棄した。細胞を５００μＬのＰＢＳで２回洗浄し、つづいて、１０μＭの鉄、１０μＭのアスコルビン酸（鉄をＦｅ２＋の酸化状態で維持するため）、および１００μＭのＨ２Ｏ２を含有するＰＢＳを、１ウェル当たり１ｍｌ添加した。この鉄を、抗酸化性を有するビタミンＥ（２μＭ〜２００μＭ）とともに５分間インキュベーションし、つづいてＨ２Ｏ２を添加した。すべての処理物を、５％のＣＯ２中で３７℃でさらに３０分間インキュベーションした。それから培養物をＰＢＳで２回洗浄し、〜３００μＬのＰＢＳで超音波処理を行った。その結果得られたホミジネートを氷上に載置した。つづいて、上記の実施例１に記載のように、細胞のＮＡＤ＋レベルを即時分析した。
図９は、１００μＭのＨ２Ｏ２で処理した、ヒトの培養神経芽細胞腫細胞において、細胞内のＮＡＤ＋レベルｋ枯渇が、２μＭ、２０μＭ、および２００μＭのビタミンＥを用いた事前処理によって阻害されていることを示している（Ｃｔｒｌに比較すると＊ｐ＜０．０５）。
これらの結果は、酸化ストレスによって誘起されるＮＡＤ＋の枯渇が、抗酸化剤だけを有効な投与量で用いた処理によって、寛解され得ることを実証している。
実施例６：クリオキノールは、ヒトの初代アストロサイトににおいて、・ＯＨによって誘起されるＮＡＤ＋の枯渇を低減する。
Ｈ２Ｏ２の、利用可能な酸化還元活性を有する金属イオンとのフェントン反応は、ヒドロキシラジカル（ＯＨ・）の生成の原因となる。
アルツハイマー病などの神経変性疾患において巨大分子が酸化的に修飾されることが増加するのは、その相当な程度が、膜透過性の酸化物質である過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の細胞内での生成の、非効率的なミトコンドリア活性に起因する増加、神経外でのＨ２Ｏ２の生成の増加、ミクログリアの活性化、およびＡβ沈着物に由来するようである。この反応性の高いフリーラジカルには、ＰＡＲＰの活性化およびＮＡＤ＋の枯渇を引き起こす、深刻なＤＮＡ損傷を誘起する潜在的な力がある。
Ｆｅ２＋やＣｕ＋などの酸化還元活性を有する金属を効果的なキレート化すれば、・ＯＨによって媒介されるＰＡＲＰの活性化が低下し、つづいてＮＡＤの枯渇が寛解されるという仮説について、試験を実施した。ヒトの神経芽細胞腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）を、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのｌ−グルタミン、および１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充した、ＲＰＭＩ１６４０の細胞培養培地で、９５％の空気／５％のＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で３７℃で保持した。実験を実施する前に、細胞を、約５×１０５個の密度になるまで、２４ウェルの培養プレートに播種し、一晩インキュベーションした。実験当日に、上記培地を吸引し、廃棄した。細胞を５００μＬのＰＢＳで２回洗浄し、つづいて、１０μＭの鉄、１０μＭのアスコルビン酸（鉄をＦｅ２＋の酸化状態で維持するため）、および１００μＭのＨ２Ｏ２を含有するＰＢＳを、１ウェル当たり１ｍｌ添加した。この鉄を、キレート剤クリオキノール（１μＭ〜１００μＭ）とともに５分間インキュベーションし、つづいてＨ２Ｏ２を添加した。すべての処理物を、５％のＣＯ２中で３７℃でさらに３０分間インキュベーションした。それから培養物をＰＢＳで２回洗浄し、〜３００μＬのＰＢＳで超音波処理を行った。その結果得られたホミジネートを氷上に載置した。つづいて、上記の実施例１に記載のように、細胞のＮＡＤ＋レベルを即時分析した。
Ｈ２Ｏ２で処理したヒトの神経芽細胞腫細胞における、細胞内のＮＡＤ＋の濃度に対する、親油性キレート剤であるクリオキノール（ＣＱ）の用量反応の効果を、図１０に示す（Ｃｔｒｌに比較すると＊ｐ＜０．０５、Ｈ２０２ ＋ Ｆｅの場合と比較すると＊＊ｐ＜０．０５、１０μＭ ＣＱ ＋ Ｈ２０２ ＋ Ｆｅの場合と比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５）。これらの結果は、・ＯＨによって誘起されるＮＡＤ＋の枯渇が、細胞透過性のキレート薬だけを用いた処理によって、投与量に依存はするものの効果的に低減されることを実証している。
実施例７：リスベラトロールは、細胞内のＮＡＤ＋を増加させる。
ヒトの胎児の初代アストロサイトを、２４ウェルの培養プレート（〜１０５個の細胞／ウェル）に播種した。各ウェルは、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および０．５％グルタミックスを補充した、１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０の細胞培養培地を含んでいた。培養物を２４時間放置して平衡化させ、つづいて、リスベラトロール（１００μＭ）を用いて、処理した。さらに２４時間インキュベーションした後、Ｈ２Ｏ２を選択した培養物に添加し、５％のＣＯ２中で３７℃で２０分間インキュベーションした。つづいてＰＢＳで２回洗浄し、〜３００μＬのＰＢＳで超音波処理を行った。その結果得られたホモジネートを氷上に載置した。つづいて、上記の実施例１に記載のように、細胞のＮＡＤ＋レベルを即時分析した。
リスベラトロールは、コントロールレベルを超える範囲において、細胞内のＮＡＤ＋を大幅に増加させた（＊ｐ＜０．０５）。ヒトの初代アストロサイトにおいてＨ２Ｏ２だけを使用する場合と比較すると、＊＊ｐ＜０．０５であった（図１１）。リスベラトロールは中程度の見かけ上の抗酸化活性しか示さなかった（ＮＡＤ＋の枯渇はわずかに減少）が、酸化ストレスにを受けていない細胞内における、細胞内のＮＡＤ＋に対するリスベラトロールの効果は際立っており、細胞内のＮＡＤ＋の濃度が約７５％の増加を示した。また、恒常的な酸化活性が低減したために、その他の抗酸化剤の場合、無処置のコントロールを超える範囲において、ＮＡＤ＋レベルの中程度の増加が観察されたが、リスベラトロールの効果は、これらの他の抗酸化剤のうちで最良のものより１００％大きかった。実施例８：リスベラトロールは、初代細胞において、ＩＤＯ阻害剤１−ＭＴまたはＱＰＲＴ阻害剤ＰＡの存在下で、細胞内のＮＡＤ＋を増加させる。
ヒトの胎児の初代アストロサイトを、２４ウェルの培養プレート（〜１０５個の細胞／ウェル）に播種した。各ウェルは、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および０．５％グルタミックスを補充した、１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０の細胞培養培地を含んでいた。培養物を２４時間放置して平衡化させ、つづいて、リスベラトロール（１００μＭ）、１−ＭＴ（１ｍＭ）、ＰＡ（１ｍＭ）、リスベラトロール（１００μＭ） ＋ １−ＭＴ（１ｍＭ）、およびリスベラトロール（１００μＭ） ＋ ＰＡ（１ｍＭ）を用いて、処理した。さらに２４時間インキュベーションした後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、〜３００μＬのＰＢＳで超音波処理を行った。その結果得られたホモジネートを氷上に載置した。つづいて、上記の実施例１に記載のように、細胞のＮＡＤ＋レベルを即時分析した。
細胞内のＮＡＤ＋に対するリスベラトロールの効果は、リスベラトロールだけを使用するか、または１−ＭＴ、１ｍＭ（ＩＤＯの阻害剤、デノボＮＡＤ合成における第１の酵素）、およびＰＡ１ｍＭ（ＱＰＲＴの阻害剤、デノボＮＡＤ合成における下流の酵素）の存在下で併用するかのいずれかにおいて、水平になる（図１２）（１−ＭＴだけで処理する場合と比較すると＊ｐ＜０．０５、ＰＡだけで処理する場合と比較すると＊＊ｐ＜０．０５）。どちらの阻害剤も、各酵素の活性を完全に遮断すると考えられる濃度で使用した。どちらの阻害剤も、リスベラトロールの効果を抑止できなかった。このことは、リスベラトロールには、サルベージ経路によってＮＡＤ＋の合成を誘起できる可能性があることを暗示している。
実施例９：ＮＭＮＡＴの阻害剤であるタンニン酸は、リスベラトロールによって媒介される、細胞内のＮＡＤ＋の増加を抑止する。
ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）を含めた各種ソースからＮＡＤ＋を生成するためには、サルベージ経路によって、約５つの酵素が使用される（図１参照）。ＮＭＮＡＴを阻害して、その効果を、リスベラトロールによって引き起こされる、先に観察した細胞内のＮＡＤ＋レベルの上昇に対して評価した。ヒトの胎児の初代アストロサイトを、２４ウェルの培養プレート（〜１０５個の細胞／ウェル）に播種した。各ウェルは、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および０．５％グルタミックスを補充した、１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０の細胞培養培地を含んでいた。培養物を２４時間放置して平衡化させ、つづいて、タンニン酸（１００μＭ）またはリスベラトロール（１００μＭ）またはリスベラトロール（１００μＭ）およびタンニン酸（１００μＭ）を用いて、処理した。培養物を、５％のＣＯ２中で３７℃でさらに２４時間インキュベーションした。つづいてＰＢＳで２回洗浄し、〜３００μＬのＰＢＳで超音波処理を行った。その結果得られたホモジネートを氷上に載置した。つづいて、上記の実施例１に記載のように、細胞のＮＡＤ＋レベルを即時分析した。
タンニン酸（２４時間、１００μＭ）を用いて処理したことによって、細胞内のＮＡＤ＋レベルに対するリスベラトロールの効果が完全に抑止された（図１４）。タンニン酸（１００μＭ）だけを用いた処理では、ＮＡＤ＋レベルを２４時間の潜伏期間中に大幅に低下させるにはいたらなかった（図１４）（リスベラトロールだけによる処理に比較した場合＊ｐ＜０．０５、コントロールに比較した場合＊＊ｐ＜０．０５）。これらの結果は、タンニン酸によるＮＭＮＡＴの完全抑制によって、リスベラトロールによって媒介される、先に観察された細胞内のＮＡＤ＋の増加が防止できたことを示唆している。したがって、リスベラトロールの存在下における細胞内のＮＡＤ＋レベルの上昇は、ＮＭＮＡＴ活性のアップレギュレートによって、最もよく説明できると考えられる。
実施例１０：リスベラトロールは、ヒトの脳のアストロサイトにおいて、ＮＭＮＡＴ活性を増加させる。
細胞のホモジネート全体における、ヒトのアストロサイトのＮＭＮＡＴ活性に対するリスベラトロールの効果を、図１５に示す。ヒトの脳のアストロサイトを、トリプソン処理し(trypsonised)、２回洗浄し、つぎにＨＥＰＥＳ緩衝液中で再懸濁した。つづいて、超音波の短いバーストによって均質化した。そして細胞の微粒子を遠心分離によって除去し、上清を使用してＮＭＮＡＴ活性の分析を行った。２００μＭのリスベラトロールを、わずかな体積の上清に添加した。つぎにこの試料およびリスベラトロールを含まない（コントロール）試料におけるＮＭＮＡＴ活性を、Balducci et al. Anal. Biochem. (1995). 228: 64-68を修正したプロトコールを使って決定した。標準アッセイを、１ｃｍのパスを有する１ｍｌのキュベット内で、最終的な体積を８５０μｌとして３７℃で実施した。反応混合物には、３９０μｌのエタノール試薬、ＭｇＣｌ２（４０ｍＭ）、１００μｌのＡＴＰ（１２．５ｍＭ）、５０μｌのＡＤＨ（０．５ｍｇ／ｍｌ）、および適切な量のｈｒ−ＮＭＮＡＴ１を含有する、２４０μｌのＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ、ｐＨ値７．４）が含まれていた。反応は、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）を０．６２５ｍＭの最終濃度まで添加することによって、開始させた。１０分間の吸光度の増加を、Ｃａｒｙ ５０ＢＩＯ ＵＶ分光光度計（Ｖａｒｉａｎ社、Ｓｙｄｎｅｙ）を用いて、３４０ｎｍで連続的に記録した。１分間当たりの吸光度の変化を、線形プログレス曲線の勾配から算出し、１分間当たりのＮＡＤＨの生成量（ｎＭ／分）を、ＮＡＤＨ検量線を使って決定した。
２００μＭのリスベラトロールを用いた処理によって、ヒトの脳のアストロサイトの細胞のホモジネート全体において、ＮＭＮＡＴ活性が、コントロール（リスベラトロール処理していないもの）に比較すると６７％増加した。ＮＭＮＡＴの活性に対するリスベラトロールの効果を、ヒトの組換え型ＮＭＮＡＴ（ｈｒＮＭＮＡＴ：Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）（図１６）を使って、直接確認した。リスベラトロールの存在によって、細胞抽出液全体においてＮＭＮＡＴ活性が、大幅に（約７０％）増加した（図１６）。リスベラトロールの投与によって、依存的に、最大反応速度が＞５００％に増加し、Ｋｍが約３分の１に減少した。標準アッセイを、１ｃｍのパスを有する１ｍｌのキュベット内で、最終的な体積を８５０μｌとして３７℃で実施した。反応混合物には、３９０μｌのエタノール試薬、ＭｇＣｌ２（４０ｍＭ）、１００μｌのＡＴＰ（１２．５ｍＭ）、５０μｌのＡＤＨ（０．５ｍｇ／ｍｌ）、および適切な量のｈｒ−ＮＭＮＡＴ１を含有する、２４０μｌのＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ、ｐＨ値７．４）が含まれていた。反応は、ＮＭＮを０．６２ｍＭの最終濃度まで添加することによって、開始させた。ＮＭＮＡＴ活性を、リスベラトロール（５０μＭ、１００μＭ、および２００μＭ）について測定した。１０分間の吸光度の増加を、Ｃａｒｙ ５０ＢＩＯ ＵＶ分光光度計（Ｖａｒｉａｎ社、Ｓｙｄｎｅｙ）を用いて、３４０ｎｍで連続的に記録した。１分間当たりの吸光度の変化を、線形プログレス曲線の勾配から算出し、１分間当たりのＮＡＤＨの生成量（ｎＭ／分）を、ＮＡＤＨ検量線を使って決定した。
これらの結果は、リスベラトロールがＮＡＤのサルベージ経路の酵素ＮＭＮＡＴに対して直接作用しており、この作用は酵素活性の未知のアロステリックなアップレギュレートを介して行われている可能性がもっとも高いことを、強く示唆するものである。
実施例１１：クリオキノールおよびビタミンＥは、Ｈ２Ｏ２およびＦｅに曝露された神経芽細胞腫細胞において、ＮＡＤ＋枯渇を低減させる。
ヒトの神経芽細胞腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）を、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのｌ−グルタミン、および１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充した、ＲＰＭＩ１６４０の細胞培養培地で、９５％の空気／５％のＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で３７℃で保持した。実験を実施する前に、細胞を、約５×１０５個の密度になるまで２４ウェルの培養プレートに播種し、一晩インキュベーションした。実験当日に、上記培地を吸引し、廃棄した。それから細胞を５００μＬＤＰＢＳで２回洗浄し、つづいて、１０μＭの鉄または銅、１０μＭのアスコルビン酸（鉄をＦｅ２＋の酸化状態で維持するため）、および１００μＭのＨ２Ｏ２を含有するＤＰＢＳを、１ウェル当たり１ｍｌ添加した。この鉄を、キレート剤であるクリオキノール（ＣＱ）および／または２０μＭの上記抗酸化ビタミンＥ（ＶｉｔＥ）とともに５分間インキュベーションし、つづいてＨ２Ｏ２を添加した。すべての組み合わせを、３０分間インキュベーションした。つづいて、上記の実施例１に記載のように、ＮＡＤ＋のアッセイを実施した。
キレート剤、クリオキノール、および抗酸化剤であるビタミンＥで処理することによって、神経芽細胞腫細胞において、フリーラジカルによって誘起されるＮＡＤ＋の枯渇に対する相乗的な保護がなされた（図１８）。
実施例１２：ヒト皮膚細胞（ケラチノサイト、線維芽細胞）の培養物における、細胞内のＮＡＤおよび細胞外のＬＤＨの活性に対する、Ｕ．Ｖ．照射、＋／−補充の効果。
ヒト皮膚細胞（ケラチノサイト）を、５×１０６個の密度で、Ｐｅｒｍａｎｏｘのチャンバースライド（ＮＵＮＣ）で２週間成長させた。この方法は、本分野において一般的に使用され、当業者にとって周知であるので、本明細書において使用した方法を詳細に説明する必要はない。
細胞に対して、曝露しないまま放置するか、またはＵＶＢ（〜２００ｍＪｃｍ−２）に１５分間曝露するか、いずれかの処理を行った。つぎに、０．１μＭ〜１００μＭのクリオキノール（ＣＬＱ）（図１９ａ）、ピコリンアミド（ＰＡＭ）（図１９ｂ）、メラトニン（ＭＥＬ）（図１９ｃ）、またはリスベラトロール（ＲＥＳ）（図１９ｄ）のうちのいずれかを、２４時間の単剤療法として、培地に補充した。
細胞を２４時間放置してインキュベーションし、つづいて、細胞内のＮＡＤ（図１９ａ〜図１９ｄから図２１）および細胞外のＬＤＨ（図２１）を分析した。図１９ａ〜図１９ｄは、細胞内のＮＡＤ濃度、＋／−ＵＶ曝露、＋／−補充を示している。図１９ｅ〜図１９ｈは、上清のＬＤＨの活性、＋／−ＵＶＥ曝露、＋／−補充を示している。
図１９ａ〜図１９ｄは、ＮＡＤレベルが大幅に低下し、これに対応して、ＵＶＢ照射を受けたヒト線維芽細胞において、上清（細胞死を示唆するもの、図１９ｅ〜図１９ｈ）のＬＤＨの活性が増加することを示している。各治療法の最小有効濃度（ＭＥＣ）は、０．１μＭ ＭＥＬ、０．１μＭ ＣＬＱ、１０μＭ ＭＥＬ、および５０μＭ ＲＥＳ（それぞれの投与群についてＮ＝３）であった。
図２０ａおよび図２０ｂは、一般に、ＲＥＳを包含する二剤併用療法は、他のどの二剤の組み合わせと比べても、ずっとうまく細胞内のＮＡＤを再生成でき、細胞死（ＬＤＨの活性）を全体的に最小化できることを示している。重要なことは、選択された二剤併用療法の組み合わせによって、ＮＡＤレベルを元へ戻し、細胞死（ＬＤＨの活性）を非ＵＶ処理のコントロールレベルにまで低減することができたことである。図２０ａは、ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから２４時間後のＮＡＤの回復時にＲＥＳ、＋／−ＰＡＭ、＋／−ＣＬＱ、＋／−ＭＥＬを用いて処理した後の、ＮＡＤ濃度に対する、二剤併用の補充物の効果を示している。（グレースケールにおいて）影の薄い方のバーは、ＲＥＳを包含する処理を示している。図２０ｂは、ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬまたはＲＥＳ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＰＡＭを用いて２４時間処理した後の、ＬＤＨの放出（細胞死）に対する、二剤併用の補充物の効果を示している。
図２１ａも、ＲＥＳ／ＭＥＬ／ＰＩＣを用いた三剤併用療法が、ＮＡＤレベルを元へ戻し、細胞死（ＬＤＨの活性）を非ＵＶ処理のコントロールレベルにまで低減することができることを示している。図２１は、ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから２４時間後のＮＡＤの回復時に、ＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＰＡＭを用いて処理した後の、ＮＡＤ濃度に対する、三剤併用の補充物（選択された組み合わせ）の効果を示している。処理用補充物それぞれについて、ＥＣ３３に等しい濃度を使用して三剤の組み合わせを行った。
実施例１３：ヒト皮膚細胞（ケラチノサイト、線維芽細胞）における、ＤＮＡ損傷および修復に対する、Ｕ．Ｖ．照射の効果。
ヒト皮膚細胞（ケラチノサイトおよび線維芽細胞）を、５×１０６個の密度で、Ｐｅｒｍａｎｏｘのチャンバースライド（ＮＵＮＣ）で２週間成長させた。この方法は、本分野において一般的に使用され、当業者にとって周知であるので、本明細書において使用した方法を詳細に説明する必要はない。
細胞を、ＵＶＢ（〜２００ｍＪｃｍ−２）に１５分間曝露した。つぎに、以下に列挙するもののうちいずれかを、培地に補充した。すなわち、
・単剤療法としての、１００μＭのクリオキノール（Ｃ）、１００μＭピコリンアミド（Ｐ）、１００μＭメラトニン（Ｍ）、または１００μＭのリスベラトロール（Ｒ）と、
・二剤併用療法としての、１０μＭ（Ｒ） ＋ ５０μＭ（Ｍ）、１０μＭ（Ｒ） ＋ ０．１μＭ（Ｃ）、または９０μＭ（Ｒ） ＋ ０．０８μＭ（Ｐ）と、
・三剤併用療法としての、０．６５μＭ（Ｐ） ＋ ３３μＭ（Ｃ） ＋ ５μＭ（Ｒ）または０．３μＭ（Ｐ） ＋ ３３μＭ（Ｃ） ＋ ５μＭ（Ｒ）とのうちのいずれかである。
単剤療法に使用した投与量は、どの治療法についても、すべてＩＣ１００に等価であった。また、二剤併用療法に使用した適量の組み合わせは、｛ＩＣ５０（Ｒ） ＋ ＩＣ５０（Ｍ）｝、｛ＩＣ１０（Ｒ） ＋ ＩＣ９０（Ｃ）｝、｛ＩＣ９０（Ｒ） ＋ ＩＣ１０（Ｐ）｝であった。さらに、三剤併用療法に使用した適量の組み合わせは、｛ＩＣ３３（Ｒ） ＋ ＩＣ３３（Ｍ） ＋ ＩＣ３３（Ｃ）｝｛ＩＣ３３（Ｒ） ＋ ＩＣ３３（Ｍ） ＋ ＩＣ３３（Ｐ）｝であった。
細胞を２４時間放置してインキュベーションし、つづいて、ＤＮＡ損傷を分析した（ケラチノサイトについては図２２ａおよび２２ｂ、線維芽細胞については図２３ａおよび２３ｂを参照）。
免疫細胞化学の可視化および半定量化のために、細胞をアセトン／メタノール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で、−２０℃で２０分間固定した。つぎに、細胞をＰＢＳで３回すすぎ、ＰＢＳにおいて０．０２５％のトリトン×１００とともに室温で１０分間インキュベーションすることによって、膜を用いた穏やかな透過処理を実施した。洗浄後、細胞を、５％の正常なヤギの血清（ＮＧＳ）とともに、ＰＢＳにおいて室温で４５分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回すすぎ、５％のＮＧＳで希釈した一次抗体６〜４ＰＰ ｍＡｂ（コスモバイオ株式会社、日本）とともに、３７℃で１時間インキュベーションした。つぎに、細胞を５％のＮＧＳ溶液で洗浄し、適切な標識二次抗体（Ａｌｅｘａ５９４と結合した、ヤギの抗ネズミＩｇＧ）とともに３７℃で１時間インキュベーションした。核を、ＤＡＰＩを使って、室温で１μｇ／ｍｌで５分間染色した。３７℃でＰＢＳで数回洗浄した後、カバーガラスを、フルオロモウント−Ｇを担持するガラススライドの上に手早く載せ、デジタルＳｅｎｓｉＣａｍに関連するオリンパスＢ×６０型蛍光顕微鏡を使って、詳細に観測した。それぞれの標識化実験について、以下の３つのコントロールを実施した。すなわち、１）ｍＡｂｓのアイソタイプの抗体コントロールおよびｐＡｂｓの血清コントロールと、２）二次的な標識抗体だけを用いたインキュベーションと、３）非標識細胞の自己蛍光の推定とである。強度を、ＩｍａｇｅＪ１０．２を使って数量化（半数量化）した。３つの別々の顕微鏡レベルのフィールドを、各処理について分析した。データのＳＥＭは＜５％であった。
図２２ａおよび図２３ａは、補充をせずにＵＶ処理された細胞のＤＮＡ損傷（中央のカラム）について、強い染色を示している。ＤＮＡ損傷シグナルの強度が単剤療法の場合にはほかに比べてわずかに弱く、二剤併用療法の場合にはさらに弱く、三剤併用療法（Ｎ＝３、ケラチノサイト、それぞれの投与群についてＮ＝１の線維芽細胞）で処理した細胞では−ｖｅコントロール（つまりＵＶ損傷がない試料）と比べて差がなかった。なお、もっとも効果的な単剤療法（ＩＣ１００）でも、ＩＣ１００当量の二剤併用療法ほどには効果的でなく、その二剤併用療法でも、ＩＣ１００当量の三剤併用療法ほどには効果的でなかった。
図２２ｂおよび図２３ｂは、ＩＣＣで染色された各部分の蛍光強度の半定量を示しており、三剤併用療法がもっとも効果的なＤＮＡ修復を達成していることの、明確でグラフィカルな証拠を示唆している。
実施例１４：ヒト皮膚細胞（線維芽細胞）の培養物における、ＤＮＡ修復に対する、Ｕ．Ｖ．照射、＋／−補充の効果。
ヒト皮膚細胞（線維芽細胞）を、５×１０６個の密度で、Ｐｅｒｍａｎｏｘのチャンバースライド（ＮＵＮＣ）で２週間成長させた。この方法は、本分野において一般的に使用され、当業者にとって周知であるので、本明細書において使用した方法を詳細に説明する必要はない。
細胞に対して、曝露しないまま放置するか、またはＵＶＢ（〜２００ｍＪｃｍ−２）に１５分間曝露するか、いずれかの処理を行った。つぎに、１００μＭのクリオキノール（ＣＬＱ）、ピコリンアミド（ＰＡＭ）、メラトニン（ＭＥＬ）、またはリスベラトロール（ＲＥＳ）のうちのいずれかを、２４時間の単剤療法として、培地に補充した。
細胞を２４時間放置してインキュベーションし、つづいて、細胞内の残留性ＤＮＡ損傷（ｄｓＤＮＡの切断）を分析した（図２４）。残留性のｄｓＤＮＡの切断がＵＶ処理したコントロールの場合より少なければ、このことが、ＤＮＡ修復の効率を示唆している。図２４は、ヒトの初代線維芽細胞において、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ（１００μＭ）、ＭＥＬ（１００μＭ）、ＣＬＱ（０．１μＭ）、またはＰＡＭ（１００μＭ）を用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対するモノセラピー補充の効果を示している。使用した濃度は、どの治療法についても、ＥＣ１００に等価であった。
図２４は、ＲＥＳ、ＰＡＭ、ＣＬＱ、またはＭＥＬを用いた単剤療法によって、ｄｓＤＮＡの切断量が大幅に低減されることを示している。見かけ上の最大の改善はＭＥＬで処置した群の場合に観察され、損傷ＤＮＡが〜４０％減少した。
図２５は、ＲＥＳ＋ＭＥＬ、ＲＥＳ＋ＣＬＱ、またはＲＥＳ＋ＰＡＭを用いた二剤併用療法によっても、ｄｓＤＮＡの切断量が大幅に低減されることを示している。最大の改善はＭＥＬで処置した群の場合に観察され、損傷ＤＮＡが＞６０％減少した。図２５は、ヒトの初代線維芽細胞において、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬ、ＲＥＳ＋ＣＬＱ、またはＲＥＳ＋ＰＡＭを用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対する二剤併用の補充物の効果を示す。使用した濃度は、ＥＣ５０／ＥＣ５０、ＥＣ１０／ＥＣ９０、およびＥＣ９０／ＥＣ１０にそれぞれ等価であった。
ただし、図２６は、ＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＰＡＭを用いた三剤併用療法によって、ｄｓＤＮＡの切断量がさらに大幅に低減されることを示している。ＤＮＡの修復の最大の改善は、ＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＰＡＭで処置した群の場合に観察され、損傷ＤＮＡが＞８０％減少した。図２６は、ヒトの初代線維芽細胞において、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＰＡＭを用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対する三剤併用の補充物の効果を示している。
まとめると、このデータは、ＲＥＳを包含する二剤併用療法が、どの単剤療法と比較しても、（細胞内のＮＡＤの再生成について先に観察したように）ＤＮＡの修復を（ＥＣ１００の濃度であっても）はるかによく亢進することを明瞭に示している。該データは、三剤併用療法が、二剤併用療法より、ＤＮＡ修復の亢進において（ＥＣ１００当量の組み合わせを使っても）はるかに効果的であったことをも示している。
実施例１５：ヒト皮膚細胞（ケラチノサイト）の培養物における、ＤＮＡ修復に対する、ＵＶ照射、＋／−補充の効果。
ヒト皮膚細胞（ケラチノサイト）を、５×１０６個の密度で、Ｐｅｒｍａｎｏｘのチャンバースライド（ＮＵＮＣ）で２週間成長させた。この方法は、本分野において一般的に使用され、当業者にとって周知であるので、本明細書において使用した方法を詳細に説明する必要はない。
細胞に対して、曝露しないまま放置するか、またはＵＶＢ（〜２００ｍＪｃｍ−２）に１５分間曝露するか、いずれかの処理を行った。つぎに、１００μＭのクリオキノール（ＣＬＱ）、ピコリンアミド（ＰＡＭ）、メラトニン（ＭＥＬ）、またはリスベラトロール（ＲＥＳ）のうちのいずれかを、２４時間の単剤療法として、培地に補充した。
細胞を２４時間放置してインキュベーションし、つづいて、細胞内の残留性ＤＮＡ損傷（ｄｓＤＮＡの切断）を分析した（図２７）。残留性のｄｓＤＮＡの切断がＵＶ処理したコントロールの場合より少なければ、このことが、ＤＮＡ修復の効率を示唆している。
図２７は、ＲＥＳ、ＰＡＭ、ＣＬＱ、またはＭＥＬを用いた単剤療法によって、ｄｓＤＮＡの切断量が大幅に低減されることを示している。見かけ上の最大の改善はＭＥＬで処置した群の場合に観察され、損傷ＤＮＡが〜３０％減少した。図２７は、ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ（１００μＭ）、ＭＥＬ（１００μＭ）、ＣＬＱ（０．１μＭ）、またはＰＡＭ（１００μＭ）を用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対するモノセラピー補充の効果を示す。使用した濃度は、どの治療法についても、ＥＣ１００に等価であった。
図２８は、ＲＥＳ＋ＭＥＬ、ＲＥＳ＋ＣＬＱ、またはＲＥＳ＋ＰＡＭを用いた二剤併用療法によっても、ｄｓＤＮＡの切断量が大幅に低減されることを示している。最大の改善はＭＥＬで処置した群の場合に観察され、損傷ＤＮＡが〜４０％減少した。図２８は、ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬ、ＲＥＳ＋ＣＬＱ、またはＲＥＳ＋ＰＡＭを用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対する二剤併用の補充物の効果を示す。使用した濃度は、ＥＣ５０／ＥＣ５０、ＥＣ１０／ＥＣ９０、およびＥＣ９０／ＥＣ１０にそれぞれ等価であった。
ただし、図２９は、ＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＰＡＭを用いた三剤併用療法によって、ｄｓＤＮＡの切断量がさらに大幅に低減されることを示している。ＤＮＡの修復の最大の改善は、ＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＰＡＭで処置した群の場合に観察され、損傷ＤＮＡが〜６０％減少した。図２９は、ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＰＡＭを用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対する三剤併用の補充物の効果を示す。
まとめると、このデータは、二剤併用療法が、どの単剤療法と比較しても、（細胞内のＮＡＤの再生成について先に観察したように）ＤＮＡの修復を（ＥＣ１００の濃度であっても）はるかによく亢進することを明瞭に示している。該データは、三剤併用療法が、二剤併用療法より、ＤＮＡ修復の亢進において（ＥＣ１００当量の組み合わせをを使っても）はるかに効果的であることをも示している。
実施例１６：相乗的な組成物。
ヒトのヒトの胎児の初代アストロサイトを、Guillemin et al. J. Neurochem. (2001) 78(4): 842-853に記載されているように、培養した。細胞内のＮＡＤ＋レベルを、Grant and Kapoor J. Neurochem. (1998) 70(4): 1759-1763に記載された方法を使って測定した。Bradford Anal. Biochem. (1976) 53: 452-458に記載されたブラッドフォードのタンパク質アッセイ法を使って、細胞のホモジネート中のタンパク質の量を測定することによって、細胞内のＮＡＤ＋の濃度を、培養物間の細胞数のバラツキについて調節した。
約１×１０５個の細胞を２４ウェルの培養プレートに播種し、Guillemin et al. J. Neurochem. (2001) 78(4): pp.842-853に先に記載されたように、２４時間培養状態で保持した。選択した濃度の個々薬剤または合剤（クリオキノール１０μＭ、メラトニン５μＭ、リスベラトロール１００μＭ）を、１０μＬの部分標本において、１ｍｌの培地に添加した。２４時間後に、培地を除去して２回洗浄し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と置き替えた。つぎに、１００μＭのＨ２Ｏ２を含有する、３００μＬのＰＢＳを、それぞれの培養ウェルに添加し、５％のＣＯ２中で３７℃で１５分間放置してインキュベーションした。つぎに、ＰＢＳを、それぞれの培養物から吸引し、新鮮なホモジネート混合物と置き替えた。そして、細胞を、超音波処理し、ＮＡＤ＋（Ｈ）および総タンパク質量について、ホモジネートを分析した。
図３０は、Ｈ２Ｏ２（１００μＭ）によって誘起される酸化ストレスを１５分間加えた後、メラトニンを５μＭ（抗酸化剤）および／またはクリオキノールを１０μＭ（Ｆｅ２＋／Ｃｕ＋、キレート剤）および／またはリスベラトロールを１００μＭ（ＮＭＮＡＴ、酵素活性化薬剤）を用いた２４時間の事前処理の、細胞内のＮＡＤ＋レベルに対する効果を示す。ＮＡＤ＋レベルは、三剤併用療法によって処理された細胞において、どの１つの薬剤またはどの２つの薬剤の組み合わせを用いた処理法と比較しても、大幅に高かった。
Ｈ２Ｏ２処理
図３０は、細胞がＨ２Ｏ２で処理されると、その結果、細胞内のＮＡＤレベルが大きく減少することを示している。この結果は、ヒドロキシラジカル（フェントン反応）によって誘起されるＤＮＡ損傷、およびその結果生じる、ＮＡＤを基質として使用するＤＮＡ修復酵素ＰＡＲＰの、過度な活性化に起因する。
単剤療法
強力な抗酸化性を有するメラトニンまたはＦｅ＋＋／Ｃｕ＋のキレート剤であるクリオキノールを用いて事前処理することによって、ＮＡＤ＋の枯渇が大幅に低減される（図３０）。ただし、リスベラトロールだけを用いた事前処理では、酸化性を有する（Ｈ２Ｏ２）傷害だけの場合と比較して、細胞内のＮＡＤ＋の大きな変化を示さなかった。
二剤併用療法
クリオキノール、メラトニン、またはリスベラトロールのうちの任意の２つの薬剤を用いた事前処理では、どの単剤療法と比較しても、酸化性を有する（Ｈ２Ｏ２）傷害の後、ＮＡＤ＋レベルがかなり高い程度に保存された（図１９）。リスベラトロール(resveratol)を包含する二剤併用療法では、リスベラトロールを包含しない処理法と比較してＮＡＤ＋レベルがかなり高い程度に保存され（図１９）、相乗効果があることを示唆している。
三剤併用療法
クリオキノール＋メラトニン＋リスベラトロールの３つの薬剤すべてを用いて事前処理することによって、どの単剤療法または二剤併用療法と比較しても、酸化性を有する（Ｈ２Ｏ２）傷害の後、ＮＡＤ＋レベルがかなり高い程度に保存された（図１９）（＊ｐ＜０．０５、Ｈ２Ｏ２だけの場合に比較すると＊＊ｐ＜０．０５、二剤併用療法による処理それぞれに比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５）。
〔産業上の利用可能性〕
本発明は、被検者においてＤＮＡ修復およびＮＡＤ＋の合成を誘起するための方法および組成物に関して使用され得る。特に、本発明は、酸化ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷に関連する状態および疾病を予防および治療するための方法および医薬組成物に関して使用され得る。
ニコチンアミド（ＮＡＭ）またはニコチン酸（ＮＡ）から始まる、サルベージ経路を介したＮＡＤ＋の合成を示す図である。 トリプトファンから始まる、新生経路を介したＮＡＤ＋の合成を示す図である。 培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおける、細胞内のＮＡＤ＋レベルに対する、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤１−ＭＴの効果を示すグラフである。ヒトの胎児のアストロサイトを、１−ＭＴだけ、または１−ＭＴ／Ｌ−トリプトファン（ｌ−Ｔｒｙｐ）と１−ＭＴ／ニコチン酸（Ｎｉｃ ａ）との組み合わせを用いて処理した。コントロールに比較すると＊ｐ＜０．０５、１−ＭＴだけを用いた処理に比較すると＊＊ｐ＜０．０５、Ｌ−ｔｒｙｐおよび１−ＭＴを用いて処理した細胞に比較すると＊＊＊＊ｐ＜０．０５であった。 培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおける、ＰＡＲＰ活性に対する、異なる濃度の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の効果を示すグラフである。Ｈ２Ｏ２を使用しなかった場合に比較するとαｐ＜０．０５、１０μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較するとβｐ＜０．０５、２０μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較するとχｐ＜０．０５、５０μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較するとδｐ＜０．０５であった。 培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおける、細胞内のＮＡＤ＋に対する、異なる濃度の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の効果を示すグラフである。０μＭのＨ２Ｏ２コントロールに比較すると＊ｐ＜０．０５、５０μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較すると＊＊ｐ＜０．０５、１００μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５であった。 異なる濃度の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）に曝露された後の、培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおける、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を示すグラフである。０μＭのＨ２Ｏ２コントロールに比較すると＊ｐ＜０．０５、１０μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較すると＊＊ｐ＜０．０５、５０μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５、１００μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較するとΨ＜０．０５であった。 培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおける、Ｈ２Ｏ２によって媒介されるＮＡＤ＋の枯渇に対する、ケルセチンの効果を示すグラフである。＊ｐ＜０．０５、また、Ｈ２Ｏ２だけを使用した場合に比較すると＊＊ｐ＜０．００５であった。 メラトニンを用いた処理をした後の、ヒトの培養神経芽細胞腫細胞における、細胞内のＮＡＤ＋レベルに対する、Ｈ２Ｏ２の効果を示すグラフである。Ｃｔｒｌに比較すると＊ｐ＜０．０５、１００μＭのＨ２０２の場合と２０μＭのＭｅｌ ＋ Ｈ２０２の場合とを比較すると＊＊ｐ＜０．０５、２μＭのＭｅｌ ＋ Ｈ２０２ の場合と２００μＭのＭｅｌ ＋ Ｈ２０２の場合とを比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５であった。 ビタミンＥを用いて処理した後の、ヒトの培養神経芽細胞腫細胞における、細胞内のＮＡＤ＋レベルに対する、Ｈ２Ｏ２の効果を示すグラフである。Ｃｔｒｌに比較すると＊ｐ＜０．０５であった。 アスコルビン酸および第一鉄の存在下でＨ２Ｏ２を用いて処理した後の、ヒトの神経芽細胞腫細胞における、細胞内のＮＡＤ濃度に対する、親油性キレート剤であるクリオキノール（ＣＱ）の用量反応の効果を示すグラフである。Ｃｔｒｌに比較すると＊ｐ＜０．０５、Ｈ２０２ ＋ Ｆｅの場合に比較すると＊＊ｐ＜０．０５、１０μＭのＣＱ ＋ Ｈ２０２ ＋ Ｆｅの場合に比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５であった。 Ｈ２Ｏ２によって媒介されるＮＡＤ＋の枯渇に対する、リスベラトロールの効果を示すグラフである。リスベラトロールは、細胞内のＮＡＤ＋を、コントロール（＊ｐ＜０．０５）を超えて大幅に増加させた。ヒトの初代アストロサイトにおいてＨ２Ｏ２だけを使用した場合に比較すると＊＊ｐ＜０．０５であった。 新生経路を介した、リスベラトロールによって誘起されるＮＡＤ＋の合成に対する、キヌレニン経路阻害剤１−ＭＴの効果を示すグラフである。 ＮＡＤ＋の合成に対する、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）阻害剤であるタンニン酸の効果を示す、用量反応曲線のグラフである。ＩＣは抑制濃度を示す。 リスベラトロールによって媒介されるＮＡＤ＋の合成に対する、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）阻害剤であるタンニン酸の効果を示すグラフである。リスベラトロールを用いて処理しただけの場合に比較すると＊ｐ＜０．０５、コントロールに比較すると＊＊ｐ＜０．０５であった。 ヒトの脳のアストロサイトにおける、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）活性に対する、リスベラトロールの効果を示すグラフである。 ヒトの脳のアストロサイトにおける、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）活性に対する、各種濃度のリスベラトロールの効果を示す表である。 酸化ストレスがＤＮＡ損傷を誘起する、共通のメカニズムを示す図である。 酸化促進剤（Ｈ２Ｏ２）および鉄（Ｆｅ）に曝露した後、キレート剤（クリオキノール−ＣＱ）および抗酸化剤（ビタミンＥ）を用いて処理した神経芽細胞腫細胞における、ＮＡＤ＋生成を示すグラフである。 図１９ａ〜図１９ｄは、細胞内のＮＡＤ濃度、＋／−ＵＶ曝露、＋／−補充をグラフに表したものである。図１９ｅ〜図１９ｈは、上清のＬＤＨの活性、＋／−ＵＶ曝露、＋／−補充をグラフに表したものである。 ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから２４時間後のＮＡＤの回復時にＲＥＳ、＋／−ＰＡＭ、＋／−ＣＬＱ、＋／−ＭＥＬを用いて処理した後の、ＮＡＤ濃度に対する、二剤併用の補充物の効果を示すグラフである。 ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬまたはＲＥＳ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＰＡＭを用いて２４時間処理した後の、ＬＤＨの放出（細胞死）に対する、二剤併用の補充物の効果を示すグラフである。 ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから２４時間後のＮＡＤの回復時に、ＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＰＡＭを用いて処理した後の、ＮＡＤ濃度に対する、三剤併用の補充物（選択された組み合わせ）の効果を示すグラフである。 ケラチノサイトの免疫細胞化学を可視化したものであり、補充をせずにＵＶ処理された細胞のＤＮＡ損傷（中央カラム）が、強く染色していることを示している。 ケラチノサイトの、ＩＣＣで染色された各部分について、蛍光強度の半定量を示すグラフである。 線維芽細胞の免疫細胞化学を可視化したものであり、補充をせずにＵＶ処理された細胞のＤＮＡ損傷（中央カラム）が、強く染色していることを示している。 線維芽細胞の、ＩＣＣで染色された各部分について、蛍光強度の半定量を示すグラフである。 ヒトの初代線維芽細胞において、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ（１００μＭ）またはＭＥＬ（１００μＭ）またはＣＬＱ（０．１μＭ）またはＰＡＭ（１００μＭ）を用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対するモノセラピー補充の効果を示すグラフである。 ヒトの初代線維芽細胞において、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬ、ＲＥＳ＋ＣＬＱ、ＲＥＳ＋ＰＡＭを用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対する二剤併用療法の補充物の効果を示すグラフである。使用した濃度は、ＥＣ５０／ＥＣ５０、ＥＣ１０／ＥＣ９０、ＥＣ９０／ＥＣ１０にそれぞれ等価であった。 ヒトの初代線維芽細胞において、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＰＡＭを用いて処理２４時間した後の、ＤＮＡ修復に対する三剤併用療法の補充物の効果を示すグラフである。 ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ（１００μＭ）またはＭＥＬ（１００μＭ）またはＣＬＱ（０．１μＭ）またはＰＡＭ（１００μＭ）を用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対するモノセラピー補充の効果を示すグラフである。 ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬ、ＲＥＳ＋ＣＬＱ、ＲＥＳ＋ＰＡＭを用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対する二剤併用療法の補充物の効果を示すグラフである。使用した濃度は、ＥＣ５０／ＥＣ５０、ＥＣ１０／ＥＣ９０、ＥＣ９０／ＥＣ１０にそれぞれ等価であった。 ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＰＡＭを用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対する三剤併用療法の補充物の効果を示すグラフである。 Ｈ２Ｏ２によって誘起される酸化ストレスを１５分間与えた後、抗酸化剤（メラトニン）および／またはクリオキノール）、キレート剤および／またはリスベラトロールを用いて２４時間かけて行った事前処理の、ヒトの胎児のアストロサイトにおける細胞内のＮＡＤレベルに対する効果を示すグラフである。＊ｐ＜０．０５、Ｈ２Ｏ２だけを使用した場合に比較すると＊＊ｐ＜０．０５、二剤併用療法によるそれぞれの処理に比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５であった。
発明の詳細な説明
〔技術分野〕
本発明は、被検者内で、ＤＮＡ修復およびＮＡＤ＋合成を誘起するための方法および組成物に関する。特に、本発明は、リスベラトロール（３，５，４’−トリヒドロキシスチルベン）が、サルベージ経路を介して、具体的には、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）活性のアップレギュレーションによって、ＮＡＤ ＋ 合成を誘起するという知見に関する。そこで、本発明は、被検者において細胞内でのＮＡＤ ＋ 合成の誘起を可能にする手段を提供する。本発明は、さらに、酸化ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷に関連する状態および疾病を予防および治療するための方法および医薬組成物に関する。
〔背景技術〕
リスベラトロールは、周知の化合物であり、その使用法はこれまでに複数の異なる研究分野において調べられてきた。例えば、「Howitz KT, Bitterman KJ, Cohen HY, Lamming DW, Lavu S, Wood JG, Zipkin RE, Chung P, Kisielewski A, Zhang LL, Scherer B, Sinclair DA (2003). “Small molecule activators of sirtuins extend Saccharomyces cerevisiae lifespan" Nature 425 (6954): 191-196」では、リスベラトロールが出芽酵母の寿命を大幅に延長することが報告されている。
「Wood JG, Rogina B, Lavu1 S, Howitz K, Helfand SL, Tatar M, Sinclair D (2004). “Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay aging in metazoans" Nature 430 (7000): 686-9」に報告されている後の研究では、リスベラトロールが線虫（Caenorhabditis elegans）およびキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）の寿命を延長することも示された。
さらに、「Jang M, Cai L, Udeani GO, Slowing KV, Thomas CF, Beecher CW, Fong HH, Farnsworth NR, Kinghorn AD, Mehta RG, Moon RC, Pezzuto JM (1997). “Cancer chemopreventive activity of resveratrol, a natural product derived from grapes" Science 275 (5297): 218-20」では、局所的なリスベラトロールの塗布により、発癌物質で処理したマウスにおける皮膚癌の発生が防止できることが報告された。動物モデルにおけるリスベラトロールの抗癌効果については、最近の研究が他にも多数存在する。この研究は、リスベラトロールの抗癌作用の最も強力な証拠が、リスベラトロールが直接接触する腫瘍、例えば皮膚腫瘍および消化管腫瘍の場合について、存在することを示唆している。
また、リスベラトロールは、寿命延長、ならびに再灌流傷害および放射線照射による損傷に対する耐性付与に関係している。例えば、「Sun J, Folk D, Bradley TJ, Tower J (01 June 2002). “Induced overexpression of mitochondrial Mn-superoxide dismutase extends the life span of adult Drosophila melanogaster". Genetics 161 (2): 661-72.」、「Hu D, Cao P, Thiels E, et al. (March 2007). “Hippocampal long-term potentiation, memory, and longevity in mice that overexpress mitochondrial superoxide dismutase". Neurobiol Learn Mem 87 (3): 372-84.」、「Wong GH (May 1995). “Protective roles of cytokines against radiation: induction of mitochondrial MnSOD". Biochim. Biophys. Acta 1271 (1): 205-9.」などを参照されたい。
リスベラトロールの使用について実施されたこれまでの研究に加えて、ＮＭＮＡＴの活性を調整すれば、ＮＡＤのレベルが調整できることが知られている。
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）は、アルコール代謝、乳酸代謝、およびアミノ酸代謝ならびにエネルギー（ＡＴＰ）生成などの複数の代謝過程において、必須の補助因子および電子トランスポーターとして作用する補酵素（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＰＨ）のピリジンヌクレオチドファミリーの親化合物である。ＮＡＤ＋は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）、Ｓｉｒ２相同体（ＳＩＲＴ１）、およびＮＡＤグリコヒドラーゼ（ＣＤ３８＋）などの重要な複数のＮＡＤ依存性酵素にとって、必須の基質である。ＰＡＲＰは、ＤＮＡにおける二本鎖または一本鎖の切断の修復を媒介する核内酵素であり、また、ＮＡＤ依存性脱アセチル化酵素ＳＩＲＴ１は、遺伝子サイレンシングおよび細胞の寿命延長に影響する。ＮＡＤグリコヒドラーゼは、ＮＡＤ＋から環状ＡＤＰ−リボース（ｃＡＤＰＲ： ｃｙｃｌｉｃ ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）の生成を触媒し、細胞内のカルシウムシグナリングに影響する。これらの細胞機能およびその他の細胞機能におけるＮＡＤ＋の役割は、ＮＡＤ＋が代謝活性の制御因子であることに加えて、ＮＡＤ＋が細胞の素過程のコントロールにおいて中心的な役割を果たすことを示唆している。
したがって、細胞質内および核内の両方でＮＡＤ＋レベルを維持することは、核の完全性、細胞の生存、および細胞成長を持続させる上で非常に重要なことである。細胞のＮＡＤ＋レベルの低下は、複数のタイプの細胞において死と一貫した相関関係があり、酸化ストレスに関連する変性障害において頻繁に見られる。酸化ストレスは、酸化ストレスおよび／または損傷を誘起する酸化性化合物、例えば、活性酸素種（ＲＯＳ）、スーパーオキシドラジカル、ヒドロキシラジカル、一酸化窒素、オゾン、チイルラジカル、炭素を中心としたラジカル（例えば、トリクロロメチルラジカル）などが、過剰に存在することを特徴とする。ＲＯＳ、例えば、Ｈ２Ｏ２、Ｏ２・−、・ＯＨ、ＮＯなどには有害な効果があり、この有害な効果の例としては、補助因子の酸化を介した特定の酵素の不活性化、脂質の多価不飽和脂肪酸（polydesaturated fatty acids）の酸化、タンパク質内におけるアミノ酸酸化、ＤＮＡ損傷などがあげられる。酸素フリーラジカル活性は、神経変性、虚血再灌流障害、粥状動脈硬化、炎症、皮膚細胞（例えばケラチノサイトおよび線維芽細胞）におけるＤＮＡ損傷、ＤＮＡ損傷に続いて起こる調節解除された細胞シグナル伝達を介した潜在的な腫瘍生成などといった、複数の病理過程の根底にある、複数の重要な分子カスケードの原因となる。
ＲＯＳ生成の増加は、紫外線または電離放射線（ｘ線、γ線）に対する曝露、化学薬品、感染、炎症、またはミトコンドリアの効率低下が原因になって起こるということが知られている。これらの因子の任意の１つまたはその組み合わせが、ＵＶによって誘起される皮膚細胞の慢性または急性の損傷とともに、慢性の変性状態、例えば、正常な細胞の老化、皮膚の加速的な老化、アルツハイマー病、パーキンソン病などににおいて頻繁に見られる。アルツハイマー病およびパーキンソン病は、神経細胞の進行性の喪失を特徴とする、神経変性疾患の例である。脳細胞死の主要因は不明であるが、酸化ストレスおよび加速的なＤＮＡ損傷に関連する炎症性の変化によって媒介されているようである。
酸化損傷によって引き起こされるＤＮＡ鎖の切断には、細胞の重要なＮＡＤ＋源を使い切る素早い修復応答性が必要である。ＮＡＤ＋が複数の酵素に対して基質として作用する一方で、ＮＡＤ＋の急速な代謝回転および枯渇に対し最も重要な寄与体は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）酵素のファミリーメンバー、特にＰＡＲＰ−１の活性化である。前述のように、ＰＡＲＰ−１は、ＤＮＡに発生する二本鎖または一本鎖の切断によって活性化されるＤＮＡ結合性酵素であって、塩基除去修復（ＢＥＲ）過程において無くてはならないものである。ＤＮＡ損傷の修復には多数のタンパク質が関与しているが、ＤＮＡ病変の大部分はＢＥＲによって修復される。これに応じて、ＮＡＤ＋は、ＤＮＡ修復において中心的な役割を果たし、酸化ストレスの間に、細胞内のレベルが急速に低下する。したがって、抗酸化能およびＤＮＡ修復の改善が、細胞の生存が促進および保持される一つのメカニズムである。
細胞質内および核内の両方でＮＡＤ＋レベルを維持することが、核の完全性、細胞の生存、および細胞成長を持続させる上で非常に重要であることは明らかである。そこで、ＮＡＤ＋が欠乏する環境で細胞内のＮＡＤ＋レベルを増加させることができる処理が、一般に必要である。酸化ストレスの治療法においては、大部分が、フリーラジカルの生成の予防（キレート療法）または分子損傷の低減（抗酸化療法）に重点をおいてきた。このような治療は、ＲＯＳによって引き起こされたＤＮＡ損傷を軽減する手段を提供しないので、細胞死および調節解除された細胞増殖（つまり腫瘍の増殖）を減少させる可能性が限られている。よって、慢性の酸化ストレスまたは急性の酸化ストレスに関連する疾病および状態において、ＤＮＡ修復を亢進できる治療法が必要である。
リスベラトロールは、細胞の健康に有益なＳＩＲＴ１酵素の活性化に直接作用することが知られている。さらに、ＳＩＲＴ１は、ＮＡＤレベルの増加によって活性化されることもよく知られている。
例えば、米国特許出願公開第２００６／０００２９１４号明細書は、軸索変性を治療する、あるいは防止するに際し、直接的に、もしくは後続のサーチェインの活性増加を介して、ＮＡＤ活性を増加させて、細胞に薬効を提供するように作用する薬剤の使用に関する。
ＮＡＤレベルを増加させるために開示された薬剤の作用は、直接的な経路を介しても、間接的な経路を介してもよい。例えば第５段落には以下の記載がある。
「…ＳＩＲＴ１の活性化は、ＳＩＲＴ１分子に対する直接的な作用によってなされても、またはＳＩＲＴ１のヒストン／タンパク質脱アセチル化酵素活性のための基質として作用するニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の供給を増加させることによってなされ得る。…ＮＡＤ活性の増加が、サーチュインが関与しないその他のメカニズムを介して作用し得ると考えられる。」
第７段落および第８段落では、ＮＡＤの増加が、ＮＡＤ自体、または任意の前駆体、中間体、もしくはＮＡＤを生成する物質（例えばＮＭＮＡＴ）、またはＳＩＲＴ１を直接活性化する任意の化合物の供給によってなされてもよいことが明瞭に記載されている。第７段落および第８段落には以下の記載がある。
「さまざまな実施形態において、上記薬剤は、ＮＡＤ活性の増加を介してＳＩＲＴ１活性を増加させる。ＮＡＤ活性を増加させれば、ＮＡＤがＳＩＲＴ１の基質として作用するので、サーチュイン活性を増加させることができると考えられる。このような薬剤の例としては、ＮＡＤもしくはＮＡＤＨ、ＮＡＤの前駆体、ＮＡＤサルベージ経路における中間体、またはＮＡＤを生成する物質（例えば、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）もしくはニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼをコード化する核酸）などがあげられる。ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼは、ＮＭＮＡＴ１タンパク質であってもよい。」
「さまざまな実施形態において、上記薬剤は、ＳＩＲＴ１活性を直接増加させるようにも作用し、したがって、該薬剤は（中略）でき、このような化合物は、リスベラトロール…からなる群より選択されるスチルベンを含んでもよい。」
第１０段落では、第７段落の内容がさらに議論され、ＮＡＤを直接増加させる特定された薬剤に、ＮＡＤを生成する経路において酵素の活性および／または安定性を増加させる薬剤が含まれている。
ただし、この文献は、リスベラトロールが、ＮＭＮＡＴの活性化を介してＮＡＤのレベルを増加させる効果を有することを開示しているわけでもなければ、そのような効果を有するかもしれないことを開示しているわけでもない。
この文献は、ニューロンにおいてサーチュイン活性およびＮＡＤ生理活性を増加させる薬剤を、スクリーニングする方法の使用をも開示している。このことは、第１５段落において、さらに、以下のように明瞭に記載されている。
「このような方法は、いくつかの実施形態では、一次スクリーニング法であってもよく、この場合、二次アッセイによって、活性を、サーチュイン活性に関連するもの、またはＮＡＤおよび補酵素もしくはＮＡＤ生合成の経路もしくはＮＡＤサルベージ経路の成分に関連するものとしてさらに描写する。」
（例えば、ＮＭＮＡＴの活性を増加させることによって）ＮＡＤレベルに対して直接影響を与える際に、リスベラトロールについて言及され、また、リスベラトロールがＳＩＲＴ１活性に関連して使用されてはいるが、スクリーニング法もしくはリスベラトロールの有効性、または任意の関連する薬剤については言及がない。
米国２００６／０００２９１４と同様に、国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０９１７１０号は、間接的に、ＮＡＤの形成に必要な前駆体、中間体、もしくは物質を付加することによってＮＡＤ活性の増加を介してか、または直接的に、ＳＩＲＴ１活性を直接的に増加させる薬剤、例えばリスベラトロールを使用するかのいずれかによって、ＳＩＲＴ１活性が増加させられることを開示する。
ただし、これらの直接的経路と間接的経路とを組み合わて使用することについては、開示も教唆も一切されていない。
国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０９１７１０号には、リスベラトロールが、３つのその他の酵素（具体的には、ＡＭＰＫ活性、ＬＫＢ１活性、および／またはカルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼβ（ｃａＭＫＫβ））の活性を増加させることによって、軸索崩壊の防止にも役立つという発見も開示され、該国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０９１７１０号は主にこの発見に関することを根拠としている。
国際特許出願公開第ＷＯ２００６／０７２８０９号には、ＮＡＤのレベルを増加させるために、それぞれ前駆体酵素および基質であるＰＢＥＦおよびＰＲＰＰを使用することが開示されている。これは、無関係な種を付加するのではなく、これらの成分自身を付加することによって実施されるようである。
同様に、米国特許出願公開第２００６２６９６１６号には、カロテノイド化合物、ニコチンアミド化合物、亜鉛化合物、Ｄリボース、およびカギカズラ属の種からの水可溶性抽出物を含有する、ＤＮＡ修復過程を亢進するための補充的な組成物が提供されていることが開示されている。この組成物は、リスベラトロールおよびグルコシノレート化合物をさらに含有してもよい。さらに、個々人のＤＮＡ修復過程を亢進するためにこの補充的な組成物を使用する方法も提供されている。ただし、米国特許出願公開第２００６２６９６１６号に開示されたＮＡＤは、その他の手段を介してＮＡＤの生成をトリガーすることに対比する意味で直接、補充物として生成される。
ＮＭＮＡＴ活性をアップレギュレートすることによってＮＡＤレベルを増加させると、ＳＩＲＴ酵素を活性化することによってニューロンが保護できることも知られている。国際特許出願公開第ＷＯ２００３／０８２１８７号には、ＮＭＮＡＴのアップレギュレートまたは下方制御のいずれかのメカニズムを使用すると、その結果、続いてＮＡＤ生成が増加または減少することが開示されている。例えば、１２ページの３１行目から１３ページの７行目までには、以下の記載がある。
「上記の本発明の組成物は、癌を治療するために使用可能である。この形態で使用する場合、該組成物は、ＮＭＮＡＴを下方制御し、こうすることによってＮＡＤの生成量を減少させ化合物を含有する。この治療法は、細胞死を誘起し、したがって、癌性細胞を取り除く際に補助になる。
本発明の組成物を糖尿病または老化の治療に使用する場合、癌治療の反対のことが起きる。換言すれば、投与された組成物はＮＭＮＡＴをアップレギュレートし、そうすることによってＮＡＤの生成量を増加させる。この治療法は、Ｂ細胞死の発生を減少させ、それゆえ、糖尿病に関連する大きな問題のうちの一つをこうして取り除く。」
この文献のページ６には、「ＮＭＮＡＴ修正化合物」を以下のように規定する。
「ここで使用されるＮＭＮＡＴ修正化合物という表現は、ＮＭＮＡＴの生成を修正することができる、任意の化合物を含むことを意図したものであるが、これらに限定されるものではない。例えば、該化合物は、治療法に依存してＮＭＮＡＴの生成を増加または減少させる遺伝子治療法用組成物、例えばｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＣＲＮＡ、およびｔＲＮＡなどであってもよい。また、該化合物は、ＮＭＮＡＴであってもよく、こうすることによって…ＮＭＮＡＴ生成量を増加させる化合物を含む必要がなくなる。」
ただし、国際特許出願公開第ＷＯ２００３／０８２１８７号で与えられている例は、わずかに、生成物（例えばＮＭＮＡＴ酵素）をコード化する遺伝子治療法用組成物だけである（遺伝子材料、例えばＤＮＡまたはＲＮＡなどの応用）、またはＮＭＮＡＴ自体の使用だけである。この文献には、リスベラトロールの用について、いかなる開示も議論もなく、特に、ＮＭＮＡＴ酵素の活性を増加させるリスベラトロールの使用についての開示がない。
同様に、米国特許出願公開第２００１００３３８４８号は、皮膚細胞および上皮膚細胞のＮＡＤ含有量を増進させるすることができるＮＡＤ促進剤を使用する方法を開示する。これらのＮＡＤ促進剤は、ＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷に対するその他の保護性の応答を亢進させるために、局所的、経口的、または非経口的に投与されてもよい。本発明は、さらに、細胞内のＮＡＤ含有量を効果的に上昇させるＮＡＤ促進剤を包含する医薬組成物に関する。最後に、本発明は、障害、例えば、日焼けおよび皮膚細胞のＤＮＡ損傷の結果発生するその他の皮膚の劣化を治療するために、ＮＡＤ促進剤を使用する方法に関する。
ただし、この米国特許出願公開には、細胞内のＮＡＤ含有量を効果的に上昇させることを通じて、ＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷に対するその他の保護性の応答を亢進させるために、リスベラトロールを使用することが開示されていない。
また、国際特許出願公開第ＷＯ２００４０１６７２６号は、真核細胞および原核細胞の寿命を調節するため、ならびに細胞をあるストレス、例えば熱ショックに対して保護するための方法および組成を提供する。１つの方法では、例えば、ＮＰＴ１、ＰＮＣ１、ＮＭＡ１、およびＮＭＡ２からなる群より選択される１つ以上のタンパク質のレベルまたは活性を調節することによって、細胞中のＮＡＤ＋サルベージ経路の流動を調節することを包含する。別のもう一つの方法では、細胞内のニコチンアミドのレベルを調節することを包含する。
ただし、この国際特許出願公開は、真核細胞および原核細胞の寿命を調節するため、および細胞をあるストレスに対して保護するために、特に細胞内のニコチンアミド（ＮＡＤ）のレベルを調節することによって、リスベラトロールを使用することを開示していない。
〔発明の開示〕
１つの態様において、本発明は、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）活性をアップレギュレートすることによって被検者においてＮＡＤ＋の合成を誘起する方法であって、治療有効量のリスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を、被検者に対して投与することを包含する方法を提供する。第１の態様の一実施形態では、リスベラトロールの投与を介したＮＭＮＡＴ活性の上記アップレギュレートは、ＮＡＤ ＋ の前駆体であり、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）酵素の副産物であり、かつ、ＰＡＲＰ酵素および哺乳類のサーチュイン酵素のファミリーメンバーの阻害剤であるニコチンアミド（ＮＡＭ）の代謝を増加させる。ＮＡＭの代謝の上記増加は、ＰＡＲＰ活性を相対的に増加させることでＤＮＡ修復を促進させるとともに、哺乳類のサーチュイン酵素活性を相対的に増加させることで。細胞の生存および長寿を促進させる。
第１の態様の一実施形態では、上記ＰＡＲＰ酵素が、ＰＡＲＰ−１またはＰＡＲＰ−２であり、上記哺乳類のサーチュイン酵素のファミリーメンバーが、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、およびＳＩＲＴ７からなる群より選択される。
第２の態様において、本発明は、酸化ストレスに関連する疾病または状態を防止または治療する方法であって、治療有効量のリスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を、被検者に対して投与することを包含し、上記投与は、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）活性をアップレギュレートすることによって、被検者においてＮＡＤ＋の合成を誘起する方法を提供する。
第３の態様において、本発明は、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）活性をアップレギュレートすることによって、ＤＮＡ損傷に関連する疾病または状態を防止または治療する方法であって、治療有効量のリスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を、被検者に対して投与することを包含する方法を提供する。
第２の態様および第３の態様の一実施形態では、上記疾病または状態が神経変性疾患である。第２の態様および第３の態様の一実施形態では、上記神経変性疾患がアルツハイマー病またはパーキンソン病である。
第２の態様および第３の態様の一実施形態では、上記疾病または状態が、皮膚の加速的な老化に関連する。
第２の態様および第３の態様の一実施形態では、上記疾病または状態が、ＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷であり、上記皮膚細胞が、ケラチノサイトおよび線維芽細胞を包含してもよい。
第２の態様および第３の態様の一実施形態では、上記リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体が、三剤併用療法として、治療有効量で投与される。
第２の態様および第３の態様の一実施形態では、ＤＮＡ損傷に関連する上記疾病または状態が癌である。
第２の態様および第３の態様の一実施形態では、上記疾病または状態が、紫外光に対する曝露、電離放射線、化学薬品に対する曝露、感染、炎症、ミトコンドリアの効率の低下、またはこれらの組み合わせによってもたらされる。
第１態様、第２の態様、および第３の態様の一実施形態では、上記リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体が、トランス異性体である。
第１態様、第２の態様、および第３の態様の一実施形態では、リスベラトロールに機能的に同等な上記類似体の任意の１つによる方法が、リスベラトロールのヒドロキシル化類似体、リスベラトロールのメトキシル化類似体、シス−リスベラトロールグルコシド（シス−ｐｉｃｅｉｄ）、およびトランス−リスベラトロール−３−Ｏ−β−グルコシド（トランス−ｐｉｃｅｉｄ）からなる群より選択される。
第４の態様において、本発明は、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）活性をアップレギュレートすることによってＮＡＤ＋の合成を増加させるために使用される医薬組成物であって、治療有効量のリスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を包含する医薬組成物を提供する。
第５の態様において、本発明は、酸化ストレスに関連する疾病または状態を予防または治療するために使用される医薬組成物であって、治療有効量のリスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を包含し、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）活性をアップレギュレートすることによって、被検者においてＮＡＤ＋の合成を誘起する医薬組成物を提供する。
第６の態様において、本発明は、ＤＮＡ損傷に関連する疾病または状態を予防または治療するために使用される医薬組成物であって、治療有効量のリスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を包含し、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）活性をアップレギュレートすることによって、被検者においてＮＡＤ＋の合成を誘起する医薬組成物を提供する。
第６の態様の一実施形態では、上記疾病または状態が、ＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷であり、上記皮膚細胞が、ケラチノサイトおよび線維芽細胞を包含してもよい。
第６の態様の一実施形態では、上記リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体が、三剤併用療法として、治療有効量で投与される。
第７の態様において、本発明は、酸化ストレスに関連する疾病または状態を予防または治療するために使用される医薬組成物であって、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）活性をアップレギュレートすることによってＮＡＤ＋の合成を誘起する、リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体と、有効量の、下記の（ａ）および（ｂ）のうち１つまたは両方との相乗的な組み合わせを包含し、（ａ）は、少なくとも１つの抗酸化剤であり、（ｂ）は、少なくとも１つのキレート薬である医薬組成物を提供する。
第７の態様の一実施形態では、ＮＡＤ＋の合成を誘起することができる少なくとも１つの薬剤が、リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体である。
第７の態様の一実施形態では、上記抗酸化剤が、メラトニン、ビタミンＥ、ビタミンＣ、メチオニン、タウリン、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、およびグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＸ）、Ｌ−エルゴチオネインＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、ビタミンＡ、βカロチン、レチノール、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン−３−没食子酸、フラベノイド（ｆｌａｖｅｎｏｉｄ）、Ｌ−エルゴチオネイン、イデベノン、およびセレンからなる群より選択される。
第７の態様の一実施形態では、上記キレート薬が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ベルサンテ二ナトリウムカルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｖｅｒｓａｎｔｅ））（ＣａＮａ２−ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、αリポ酸（ＡＬＡ）、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）、ジメルカプロール（ＢＡＬ）、デフェロキサミン、Ｄ−ペニシラミン、ジメルカプロール、アミノフェノキシエタン−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）デファラシロックス（Ｄｅｆａｒａｓｉｒｏｘ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、２−ピリジンカルボン酸（ピコリン酸）、２，３−ピリジンジカルボン酸（キノリン酸）、２−アミノ安息香酸（アントラニル酸）、キヌレン酸、キサンツレン酸、および８−ヒドロキシキノリン（およびこれらの機能性誘導体）からなる群より選択される。
第８の態様において、本発明は、酸化ストレスに関連する疾病または状態を治療するための方法であって、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）活性をアップレギュレートすることによってＮＡＤ＋の合成を誘起する、リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体と、有効量の、下記の（ａ）および（ｂ）のうち１つまたは両方との相乗的な組み合わせを含有する、治療有効量の医薬組成物を、被検者に対して投与することを包含し、（ａ）は、少なくとも１つの抗酸化剤であり、（ｂ）は、少なくとも１つのキレート薬である方法を提供する。
第９の態様において、本発明は、ＤＮＡ損傷に関連する疾病または状態を治療するための方法であって、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）活性をアップレギュレートすることによってＮＡＤ＋の合成を誘起する、リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体と、有効量の、下記の（ａ）および（ｂ）のうち１つまたは両方との相乗的な組み合わせを含有する、治療有効量の医薬組成物を、被検者に対して投与することを包含し、（ａ）は、少なくとも１つの抗酸化剤であり、（ｂ）は、少なくとも１つのキレート薬である方法を提供する。
第８の態様の一実施形態では、上記疾病または状態が、ＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷であり、上記皮膚細胞が、ケラチノサイトおよび線維芽細胞を包含してもよい。
第８の態様の一実施形態では、上記リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体が、三剤併用療法として、治療有効量で投与される。
第８の態様および第９の態様の一実施形態では、ＮＡＤ＋の合成を誘起することができる少なくとも１つの上記薬剤が、リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体である。
第８の態様および第９の態様の一実施形態では、上記抗酸化剤が、メラトニン、ビタミンＥ、ビタミンＣ、メチオニン、タウリン、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、およびグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＸ）、Ｌ−エルゴチオネインＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、ビタミンＡ、βカロチン、レチノール、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン−３−没食子酸、フラベノイド、Ｌ−エルゴチオネイン、イデベノン、およびセレンからなる群より選択される。
第８の態様および第９の態様の一実施形態では、上記キレート薬が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ベルサンテ二ナトリウムカルシウム）（ＣａＮａ２−ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、αリポ酸（ＡＬＡ）、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）、ジメルカプロール（ＢＡＬ）、デフェロキサミン、Ｄ−ペニシラミン、ジメルカプロール、アミノフェノキシエタン−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）デファラシロックス、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）２−ピリジンカルボン酸（ピコリン酸）、２，３−ピリジンジカルボン酸（キノリン酸）、２−アミノ安息香酸（アントラニル酸）、キヌレン酸、キサンツレン酸、および８−ヒドロキシキノリン（およびこれらの機能性誘導体）からなる群より選択される。
第１０の態様において、本発明は、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）活性をアップレギュレートすることによって、被検者においてＮＡＤ＋の合成を増加させるためのキットであって、リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を包含するキットを提供する。
第１１の態様において、本発明は、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）活性をアップレギュレートすることによって、被検者において酸化ストレスに関連する疾病または状態を治療するためのキットであって、リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を包含するキットを提供する。
第１２の態様において、本発明は、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）活性をアップレギュレートすることによって、被検者においてＤＮＡ損傷に関連する疾病または状態を治療するためのキットであって、リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を包含するキットを提供する。
第１２の態様の一実施形態では、上記疾病または状態が、ＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷であり、上記皮膚細胞が、ケラチノサイトおよび線維芽細胞を包含してもよい。
第１２の態様の一実施形態では、上記リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体が、三剤併用療法として、治療有効量で投与される。
第１０の態様、第１１の態様、および第１２の態様の一実施形態では、上記リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体が、トランス異性体である。
第１０の態様、第１１の態様、および第１２の態様の一実施形態では、機能的に同等な上記類似体が、リスベラトロールのヒドロキシル化類似体、リスベラトロールのメトキシル化類似体、シス−リスベラトロールグルコシド（シス−ｐｉｃｅｉｄ）、およびトランス−リスベラトロール−３−Ｏ−β−グルコシド（トランス−ｐｉｃｅｉｄ）からなる群より選択される。
〔定義〕
本願において、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数形には、文脈と明らかに矛盾しないかぎり、複数の部材に言及している場合が含まれる。例えば、「幹細胞（ａ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」という表現には、複数個の幹細胞が含まれる。
本願において、「．．．を包含する(comprising)」という表現は、「．．．を含む(including)」という意味である。この「．．．を包含する(comprising)」という表現の、例えば、「．．．を包含する(comprise)」および「．．．を包含する(comprises)」などという活用形は、対応する異なった意味である。したがって、例えば、タンパク質をコード化する配列「を包含する(comprising)」ポリヌクレオチドは、その配列だけからなっていてもよく、あるいは、該配列以外の１つ以上の配列を備えていてもよい。
本願において、「リスベラトロール」という言葉には、リスベラトロールのシス異性体、リスベラトロールのトランス異性体、またはこの２つの異性体の混合物のいずれをも包含される。この言葉には、自然に発生する活性剤および化学的に合成される活性剤の両方、ならびに実験室にあるような化合物が包含される。さらに、「リスベラトロール」という言葉がここで使用される場合、薬理学的に許容可能な、リスベラトロールの塩、エステル、アミド、プロドラッグ、ならびに誘導体および類似体を包含することが意図されている。
本願において、「相乗的」という言葉は、複数の薬剤の組み合わせによって生み出される相加的な効果より大きいことを指し、同じ薬剤を使用して「相乗的」効果がない場合に得られる効果を超えるものである。
本願において、「治療有効量」は、言及している特定の治療用化合物の、所望の治療効果を提供するために非有毒であって十分な量を、その意味合いに含む。必要とされる厳密な量は、例えば、患者の身全体の健康状態、患者の年齢、ならびに疾病の段階および重症度などの要因によって、被検者ごとにばらつきがある。
本画において、「神経変性疾患」という言葉は、脳、中枢神経系、および末梢を含めた身体の任意の幹部において、神経細胞の変性または不活性化が起こる、動物の疾病または状態を指す。
本願において、「酸化ストレス」という言葉は、一般的な文脈で使用されており、フリーラジカルまたは活性酸素種（ＲＯＳ）（例えばα−ヒドロキシエチルラジカル、過酸化水素、ペルオキシラジカル、ヒドロキシラジカル、およびスーパーオキシドラジカル）の生成が亢進されている状態、および／または酸化促進物と抗酸化物との間で不均衡を引き起こす、抗酸化物に対する防御系の枯渇を指す。一般に、酸化ストレスには、酸化損傷の原因となる細胞内部または細胞環境におけるフリーラジカルの蓄積が伴う。酸化ストレスは、例えば紫外線または電離放射線に対する曝露、または化学薬品、異なる感染病原体による感染、炎症、またはミトコンドリアの効率の低下などの、生物的な（生きている）ソースおよび非生物的な（生きていない）ソースから発生することもある。
〔図面の簡単な説明〕
つぎに、本発明の好適な実施形態を、添付の図面を参照して記載するが、これは単なる例にすぎない。
図１は、ニコチンアミド（ＮＡＭ）またはニコチン酸（ＮＡ）から始まる、サルベージ経路を介したＮＡＤ＋の合成を示す図である。
図２は、トリプトファンから始まる、新生経路を介したＮＡＤ＋の合成を示す図である。
図３は、培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおける、細胞内のＮＡＤ＋レベルに対する、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤１−ＭＴの効果を示すグラフである。ヒトの胎児のアストロサイトを、１−ＭＴだけ、または１−ＭＴ／Ｌ−トリプトファン（ｌ−Ｔｒｙｐ）と１−ＭＴ／ニコチン酸（Ｎｉｃ ａ）との組み合わせを用いて処理した。コントロールに比較すると＊ｐ＜０．０５、１−ＭＴだけを用いた処理に比較すると＊＊ｐ＜０．０５、Ｌ−ｔｒｙｐおよび１−ＭＴを用いて処理した細胞に比較すると＊＊＊＊ｐ＜０．０５であった。
図４は、培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおける、ＰＡＲＰ活性に対する、異なる濃度の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の効果を示すグラフである。Ｈ２Ｏ２を使用しなかった場合に比較するとαｐ＜０．０５、１０μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較するとβｐ＜０．０５、２０μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較するとχｐ＜０．０５、５０μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較するとδｐ＜０．０５であった。
図５は、培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおける、細胞内のＮＡＤ＋に対する、異なる濃度の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の効果を示すグラフである。０μＭのＨ２Ｏ２コントロールに比較すると＊ｐ＜０．０５、５０μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較すると＊＊ｐ＜０．０５、１００μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５であった。
図６は、異なる濃度の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）に曝露された後の、培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおける、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を示すグラフである。０μＭのＨ２Ｏ２コントロールに比較すると＊ｐ＜０．０５、１０μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較すると＊＊ｐ＜０．０５、５０μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５、１００μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較するとΨ＜０．０５であった。
図７は、培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおける、Ｈ２Ｏ２によって媒介されるＮＡＤ＋の枯渇に対する、ケルセチンの効果を示すグラフである。＊ｐ＜０．０５、また、Ｈ２Ｏ２だけを使用した場合に比較すると＊＊ｐ＜０．００５であった。
図８は、メラトニンを用いた処理をした後の、ヒトの培養神経芽細胞腫細胞における、細胞内のＮＡＤ＋レベルに対する、Ｈ２Ｏ２の効果を示すグラフである。Ｃｔｒｌに比較すると＊ｐ＜０．０５、１００μＭのＨ２０２の場合と２０μＭのＭｅｌ ＋ Ｈ２０２の場合とを比較すると＊＊ｐ＜０．０５、２μＭのＭｅｌ ＋ Ｈ２０２ の場合と２００μＭのＭｅｌ ＋ Ｈ２０２の場合とを比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５であった。
図９は、ビタミンＥを用いて処理した後の、ヒトの培養神経芽細胞腫細胞における、細胞内のＮＡＤ＋レベルに対する、Ｈ２Ｏ２の効果を示すグラフである。Ｃｔｒｌに比較すると＊ｐ＜０．０５であった。
図１０は、アスコルビン酸および第一鉄の存在下でＨ２Ｏ２を用いて処理した後の、ヒトの神経芽細胞腫細胞における、細胞内のＮＡＤ濃度に対する、親油性キレート剤であるクリオキノール（ＣＱ）の用量反応の効果を示すグラフである。Ｃｔｒｌに比較すると＊ｐ＜０．０５、Ｈ２０２ ＋ Ｆｅの場合に比較すると＊＊ｐ＜０．０５、１０μＭのＣＱ ＋ Ｈ２０２ ＋ Ｆｅの場合に比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５であった。
図１１は、Ｈ２Ｏ２によって媒介されるＮＡＤ＋の枯渇に対する、リスベラトロールの効果を示すグラフである。リスベラトロールは、細胞内のＮＡＤ＋を、コントロール（＊ｐ＜０．０５）を超えて大幅に増加させた。ヒトの初代アストロサイトにおいてＨ２Ｏ２だけを使用した場合に比較すると＊＊ｐ＜０．０５であった。
図１２は、新生経路を介した、リスベラトロールによって誘起されるＮＡＤ＋の合成に対する、キヌレニン経路阻害剤１−ＭＴの効果を示すグラフである。
図１３は、ＮＡＤ＋の合成に対する、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）阻害剤であるタンニン酸の効果を示す、用量反応曲線のグラフである。ＩＣは抑制濃度を示す。
図１４は、リスベラトロールによって媒介されるＮＡＤ＋の合成に対する、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）阻害剤であるタンニン酸の効果を示すグラフである。リスベラトロールを用いて処理しただけの場合に比較すると＊ｐ＜０．０５、コントロールに比較すると＊＊ｐ＜０．０５であった。
図１５は、ヒトの脳のアストロサイトにおける、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）活性に対する、リスベラトロールの効果を示すグラフである。
図１６は、ヒトの脳のアストロサイトにおける、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）活性に対する、各種濃度のリスベラトロールの効果を示す表である。
図１７は、酸化ストレスがＤＮＡ損傷を誘起する、共通のメカニズムを示す図である。
図１８は、酸化促進剤（Ｈ２Ｏ２）および鉄（Ｆｅ）に曝露した後、キレート剤（クリオキノール−ＣＱ）および抗酸化剤（ビタミンＥ）を用いて処理した神経芽細胞腫細胞における、ＮＡＤ＋生成を示すグラフである。
図１９ａ〜図１９ｄは、細胞内のＮＡＤ濃度、＋／−ＵＶ曝露、＋／−補充をグラフに表したものである。図１９ｅ〜図１９ｈは、上清のＬＤＨの活性、＋／−ＵＶ曝露、＋／−補充をグラフに表したものである。
図２０ａは、ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから２４時間後のＮＡＤの回復時にＲＥＳ、＋／−ＰＡＭ、＋／−ＣＬＱ、＋／−ＭＥＬを用いて処理した後の、ＮＡＤ濃度に対する、二剤併用の補充物の効果を示すグラフである。
図２０ｂは、ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬまたはＲＥＳ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＰＡＭを用いて２４時間処理した後の、ＬＤＨの放出（細胞死）に対する、二剤併用の補充物の効果を示すグラフである。
図２１は、ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから２４時間後のＮＡＤの回復時に、ＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＰＡＭを用いて処理した後の、ＮＡＤ濃度に対する、三剤併用の補充物（選択された組み合わせ）の効果を示すグラフである。
図２２ａは、ケラチノサイトの免疫細胞化学を可視化したものであり、補充をせずにＵＶ処理された細胞のＤＮＡ損傷（中央カラム）が、強く染色していることを示している。
図２２ｂは、ケラチノサイトの、ＩＣＣで染色された各部分について、蛍光強度の半定量を示すグラフである。
図２３ａは、線維芽細胞の免疫細胞化学を可視化したものであり、補充をせずにＵＶ処理された細胞のＤＮＡ損傷（中央カラム）が、強く染色していることを示している。
図２３ｂは、線維芽細胞の、ＩＣＣで染色された各部分について、蛍光強度の半定量を示すグラフである。
図２４は、ヒトの初代線維芽細胞において、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ（１００μＭ）またはＭＥＬ（１００μＭ）またはＣＬＱ（０．１μＭ）またはＰＡＭ（１００μＭ）を用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対するモノセラピー補充の効果を示すグラフである。
図２５は、ヒトの初代線維芽細胞において、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬ、ＲＥＳ＋ＣＬＱ、ＲＥＳ＋ＰＡＭを用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対する二剤併用療法の補充物の効果を示すグラフである。使用した濃度は、ＥＣ５０／ＥＣ５０、ＥＣ１０／ＥＣ９０、ＥＣ９０／ＥＣ１０にそれぞれ等価であった。
図２６は、ヒトの初代線維芽細胞において、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＰＡＭを用いて処理２４時間した後の、ＤＮＡ修復に対する三剤併用療法の補充物の効果を示すグラフである。
図２７は、ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ（１００μＭ）またはＭＥＬ（１００μＭ）またはＣＬＱ（０．１μＭ）またはＰＡＭ（１００μＭ）を用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対するモノセラピー補充の効果を示すグラフである。
図２８は、ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬ、ＲＥＳ＋ＣＬＱ、ＲＥＳ＋ＰＡＭを用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対する二剤併用療法の補充物の効果を示すグラフである。使用した濃度は、ＥＣ５０／ＥＣ５０、ＥＣ１０／ＥＣ９０、ＥＣ９０／ＥＣ１０にそれぞれ等価であった。
図２９は、ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＰＡＭを用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対する三剤併用療法の補充物の効果を示すグラフである。
図３０は、Ｈ２Ｏ２によって誘起される酸化ストレスを１５分間与えた後、抗酸化剤（メラトニン）および／またはクリオキノール）、キレート剤および／またはリスベラトロールを用いて２４時間かけて行った事前処理の、ヒトの胎児のアストロサイトにおける細胞内のＮＡＤレベルに対する効果を示すグラフである。＊ｐ＜０．０５、Ｈ２Ｏ２だけを使用した場合に比較すると＊＊ｐ＜０．０５、二剤併用療法によるそれぞれの処理に比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５であった。
〔発明を実施するための形態〕
本発明は、細胞内でのＮＡＤ＋合成がリスベラトロール（３，５，４’−トリヒドロキシスチルベン）によって増加する、という知見に関連している。特定のメカニズムに制限または限定されるものではないが、発明者は、リスベラトロールが、サルベージ経路（図１に示す）を介して、具体的には、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）活性をアップレギュレートすることによって、ＮＡＤ＋の合成を誘起することを実証した。そこで本発明は、被検者において細胞内のＮＡＤ＋の合成の誘起を可能にする手段を提供する。
発明者は、リスベラトロールの投与によるＮＡＤ＋合成の誘起が、ＤＮＡ修復を誘起し、細胞の生存および長寿を促進する手段を提供することも実証した。やはり特定のメカニズムに制限または限定されるものではないが、リスベラトロールによるＮＭＮＡＴ活性のアップレギュレーションは、ＮＡＤ＋の前駆体であり、かつ、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）酵素のファミリーメンバーの副産物であるニコチンアミド（ＮＡＭ）の代謝を増加させる効果があると考えられる。ＮＡＭは、ＰＡＲＰ酵素（例えばＰＡＲＰ−１）および哺乳類のサーチュイン酵素のファミリーメンバー（ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、およびＳＩＲＴ７）の阻害物質である。したがって、リスベラトロールの投与によって誘起されるＮＡＭの代謝が、利用可能なＮＡＤ＋レベルを増加させるように作用し、その一方で、ＰＡＲＰ活性およびサーチュイン酵素の活性の両方の抑制を低減する。なお、ＰＡＲＰ活性の抑制を低減することによって、ＤＮＡ修復が促進され、サーチュイン酵素の活性の抑制を低減することによって、細胞の生存および長寿が促進される。
さらに、本発明は、ＮＡＤ＋の合成の促進剤（例えばリスベラトロール）を、キレート薬および／または抗酸化剤と組み合わせて使用して、酸化ストレスに関連する状態の治療に対し相乗効果を生み出すことに関する。発明者は、酸化還元活性を有する金属をキレート化する薬剤と、残留性の酸素フリーラジカルによって引き起こされる損傷を減少させる抗酸化剤とからなる薬物併用療法に由来する利点が、ＮＡＤ＋の合成促進剤を包含することによって、相乗的に亢進される可能性のあることを実証した。この相乗効果は、必須の基質ＮＡＤ＋の生成が増加することによって、（少なくともＰＡＲＰ酵素活性の増加を介して）ＤＮＡ修復が向上すること、および（少なくともサーチュイン活性の増加を介して）細胞の生存および長寿が向上するによって生まれると考えられる。
リスベラトロールとＮＡＤ＋合成
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）は、いくつかの異なる出発化合物から合成され得る。（図２に示す）「新生」経路では、ＮＡＤ＋が、必須アミノ酸トリプトファンから生成される。この経路には、トリプトファンからのキノリン酸の生成が伴う。なお、このキノリン酸は、ホスホリボース基の転移を通じて変換されて、ニコチン酸モノヌクレオチド（ＮａＭＮ）になる。つぎに、アデニル酸基が転移されて、ニコチン酸アデニンジヌクレオチド（ＮａＡＤ）を形成する。つぎに、ＮａＡＤのニコチン酸基がアミド化されてニコチンアミド基になり、ＮＡＤ＋を形成する。あるいは、ニコチンアミド、または予め形成された、ニコチンアミドを含有する化合物（例えばニコチンアミドリボシド）が、「サルベージ」経路（図１を参照）を介したＮＡＤ＋の生成に用いられれる。新生経路またはサルベージ経路のいずれかにおける酵素の阻害により、ＮＡＤ＋が顕著に枯渇する。このことは、細胞のＮＡＤ＋レベルを維持するためには、これらの経路がどちらも重要であることを明確に示している。
本発明は、被検者において、細胞内のＮＡＤ＋の合成／レベルを増加させる方法を提供する。この方法は、治療有効量のリスベラトロール、またはそれと機能的に同等な類似体、もしくはリスベラトロール誘導体を、被検者に対して投与することを包含する。
本発明の方法によれば、リスベラトロール（３，５，４’−トリヒドロキシスチルベン、トランス−３，５，４’−トリヒドロキシスチルベン；３，４’，５−スチルベントリオール；トランス−リスベラトロール；（Ｅ）−５−（ｐ型ヒドロキシスチリル）レゾルシノール、およびレゾルシノールとしても知られている）が、天然型で、例えばブドウの皮、ワイン、またはその他の植物由来の組成から単離された状態で、当該技術分野において公知の方法で、投与されてもよい（例えば、Lamuela-Raventos, J. Agric. Food Chem. (1995) (43): 281-283, and Wang et al. J Agric Food Chem. (2002) 50:431-435に記載の方法を参照。該文献の内容は参照によってここに引用されるものとする）。例えば、適切な溶媒（例えばメタノール）を使って粉末状の植物性物質を抽出し、つづけて濃縮し、水で希釈してもよい。適切な非極性有機溶剤（例えばヘキサン）を用いて洗浄した後、例えば酢酸エチルを使って、水層を分画してもよい。この酢酸エチルによる抽出物は、つぎに、溶出剤として例えばクロロホルム−メタノールを使って、シリカゲルクロマトグラフィーのカラムで分離してもよい。濃縮されたリスベラトロールを含有する画分を一つにまとめ、さらに、カラムクロマトグラフィーを実施してもよい。
上記の構成に加えて、あるいは、上記の構成の替わりに、Moreno-Manas et al. Anal. Quim (1985) 81:157-61, Jeand et al. Am. J. Enol. Vitic. (1991) 42:41-46, Goldberg et al. Anal. Chem. (1994) 66: 3959-63, and Farina et al. Nat. Prod. Res. (2006). 20: 247-52に記載されているように（該文献の内容は参照によってここに引用されるものとする）、リスベラトロールを、例えば、２つの置換フェノールがスチレン二重結合を介して結合されるウィティッヒ反応を使って、化学的に合成してもよい。上記の構成に加えて、あるいは、上記の構成の替わりに、本発明で使用するリスベラトロールを、業者（例えばＳｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）から入手してもよい。
本発明にしたがって使用するリスベラトロールは、シス異性体、トランス異性体、またはこれらの混合物の形態であってもよい。シス−リスベラトロールを、当該技術分野において公知の方法で（例えば、トランス−リスベラトロールを加熱または紫外線に曝露し、その後、ＨＰＬＣによって分離し、さらに質量分析（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ； ＭＳ）によって特定することによって）、トランス−リスベラトロールから調製してもよい。本発明では、機能的に同等なリスベラトロールの誘導体および類似体についても考察する。リスベラトロールの類似体とは、リスベラトロールに基づく化合物であって、化学修飾されたリスベラトロール化合物を形成するために、この親化合物に結合した置換基を有しているものである。置換基の例としては、Ｃ１−Ｃ３アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル）、ＣＨ２ＯＨ、ハロゲン（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。上記ヒドロキシル基のうちの任意の１つ以上に、例えば保護基で、官能性を持たせてもよい。適切な保護基は当業者に知られている（“Protective Groups in Organic Synthesis" by Theodora Greene and Peter Wuts (third edition, 1999, John Wiley and Sons)を参照）。上記の構成の替わりに、上記ヒドロキシル基のうちの任意の１つ以上に、例えば、Ｃ１−Ｃ３アルキル（この場合にはエーテルが形成される）、またはカルボン酸基（この場合にはエステルが形成される）で、官能性を持たせてもよい。
上記化合物の例としては、リスベラトロールのヒドロキシル化類似体またはメトキシル化類似体などが挙げられる。上記機能的に同等なリスベラトロールの類似体は、シス−リスベラトロールグルコシド（シス−ｐｉｃｅｉｄ）またはトランス−リスベラトロール−３−Ｏ−β−グルコシド（トランス−ｐｉｃｅｉｄ）であってもよい。リスベラトロールの誘導体の一例としては、１つ以上のヒドロキシル基（通常は３−ヒドロキシル基）が単糖または二糖に共役結合している誘導体があげられる。一般に、３−ヒドロキシル基は、単糖の１位に共役結合していてもよい。リスベラトロールに共役結合してもよい糖類の例としては、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、およびガラクトースなどが挙げられるが、これらの例に限定されるものではない。本発明の方法において使用に適した、その他のリスベラトロールの誘導体および類似体については、例えば、米国特許第７０２６５１８号明細書、米国特許第６７９０８６９号明細書、国際特許出願公開第ＷＯ／２００３／０５５４４４号明細書、国際特許出願公開第ＷＯ／２００４／０００３０２号明細書、および国際特許出願公開第ＷＯ／１９９９／００３８１６号明細書に記載されている。なお、これらの特許文献の内容は参照によってここに引用されるものとする。当業者がこれらの文献を参照すれば、ここに記載されているリスベラトロールの誘導体および類似体が非限定的な例であること、また、本発明が、機能的に同等な効果を誘起することができる、その他のリスベラトロール誘導体および類似体の使用を包含することが理解できよう。
本発明では、リスベラトロールの薬学的に許容可能な塩およびその類似体についても考察する。S. M. Berge et al.は、J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66:1-19で薬学的に許容可能な塩について詳細に記載している。この塩は、本発明の化合物の最終的な単離および精製の間にインサイツで調製可能であり、または遊離塩基機能を適切な有機酸と反応させることによって、別々に調製可能である。酸付加塩の代表的な例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、ジグルコン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、半硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロヨウ化物塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、ニトロ化塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチニン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸化塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などがあげられる。アルカリ塩またはアルカリ土類金属塩の代表的な例としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、さらに、非有毒なアンモニウム、四級アンモニウム、およびアミンの陽イオンなどがあげられ、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン、トリエタノールアミンなどを含むが、これらの例に限定されるものではない。
本発明の方法によると、細胞内のＮＡＤ＋の合成を誘起するために、治療有効量のリスベラトロールを被検者に投与してもよい。細胞内のＮＡＤ＋は、当該技術分野において公知の方法で測定可能であり、例えばGrant and Kapoor, J. Neurochem. (1998) 70(4): 1759-1763に記載されている。細胞内のＮＡＤ＋レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の技術を使って、測定可能である。このような測定方法は、例えばKlaidman et al., Anal Biochem (1995) 228:312-317に記載されている。なお、この文献の内容は参照によってここに引用されるものとする。上記の構成に加えて、あるいは、上記の構成の替わりに、分光光度マイクロサイクリングアッセイを使用して、細胞内のＮＡＤ＋レベルを測定してもよい。このような測定方法は、例えばNisselbaum and Green, Anal Biochem (1969) 27: 212-217 or Berofsky and Swan, Anal Biochem (1973) 53: 452-458に記載されている。なお、この文献の内容は参照によってここに引用されるものとする。例えば、組織／細胞のホモジネートを、ＮＡＤ＋と測定可能な化合物との反応を促進するために必須の成分を含有する、ｐＨ値を制御した（バッファ）溶液（反応混合物）中でインキュベーションしてもよい。この反応混合物は、例えばエタノール、アルコール脱水素酵素、フェナジンメトサルフェート、３−［４，５−ジメチルチアゾ−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド、（ＭＴＴ）（ビシンバッファ溶液中）などを含有していてもよい。インキュベーションを適切な時間実行した後、適切な停止用試薬、例えばヨード酢酸で、反応を停止させ、試料中のＮＡＤ＋レベルをミクロプレート読み取り装置で試薬のブランク値に対して測定して決定する。
ＮＡＤ＋依存性酵素は、ＤＮＡ修復において、特に酸化ストレス条件下で、重要な役割を果たす。そこで、本発明は、治療有効量のリスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を、被検者に対して投与することを包含する、被検者においてＤＮＡ修復を誘起する方法を提供する。被検者におけるＤＮＡ修復の誘起は、１つ以上のポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）酵素のファミリーメンバーの活性亢進によって起こってもよい。ＰＡＲＰ酵素の活性は、当該技術分野において公知の方法で測定可能である。例えば、Cheung and Zhang Anal Biochem (2000) 282: 24-28（この文献の内容は参照によってここに引用されるものとする）に記載されているように、ＰＡＲＰ酵素活性を、ビオチン化されたＮＡＤを使って、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）によってアッセイしてもよい。上記の構成に加えて、あるいは、上記の構成の替わりに、Karson et al., Anal Biochem (2004) 326 : 78-86またはPutt et al., Chem. Bio. Chem (2005) 6:53-55（この文献の内容は参照によってここに引用されるものとする）記載されているように、ＰＡＲＰ酵素の活性を、ＮＡＤの化学的な定量化を介して、酵素試験を用いて測定してもよい。例えば、プレートに蒔いた細胞または組織を洗浄し、つぎに過剰なＮＡＤ＋を含有する適切な緩衝液を使って溶解させる。適切な緩衝液は、例えばＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）、トリトンＸ−１００（１％）、およびＮＡＤ＋（２０μＭ）を、トリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ値８．１）中に含有していてもよい。ＮＡＤ＋はＰＡＲＰ酵素の唯一の基質であり、しかもこの反応の間に劣化するので、全体の酵素活性は、緩衝液中のＮＡＤ＋の濃度の経時的な減少によって決定される。適切な期間のインキュベーションに続いて、消費されたＮＡＤ＋の量を、上述のように、ＮＡＤ（Ｈ）マイクロサイクリングアッセイによって測定する。
ＰＡＲＰ酵素は、ＮＡＤ＋をアデノシン二リン酸リボース（ＡＤＰＲ）のドナーとして消費し、核タンパク質上で、例えばヒストンおよびＰＡＲＰ自身において、ポリ（ＡＤＰ−リボース）を合成する。ＰＡＲＰの過度な活性化、特に酸化ストレスの間のＰＡＲＰの過度な活性化は、細胞のＮＡＤ＋の大幅な枯渇の原因になる可能性があり、このことが細胞の壊死につながる。本発明の方法にしたがってリスベラトロールを投与すれば、まずＮＡＤ＋の合成を増加させて、そうすることによってＰＡＲＰによって媒介されるＤＮＡ修復のための基質が利用できる可能性を増加させることによって、上記問題は解消され、二つ目に、ニコチンアミド（ＮＡＭ）の代謝が増加することを介して、ＰＡＲＰ活性のアクティブな阻害剤を除去するという効果を奏する。ＰＡＲＰ−１は、ＤＮＡ鎖の切断によって活性化され、塩基除去修復（ＢＥＲ）経路、単一鎖切断（ＳＳＢ）経路、および二本鎖切断（ＤＳＢ）経路などを含めた、複数のＤＮＡ修復経路に結び付けられている。二重ＺｎフィンガーのＤＮＡ結合領域を介して、損傷ＤＮＡにＰＡＲＰ−１が結合すると、ＰＡＲＰ−１の活動を強力に活性化し、それゆえ、ＰＡＲＰ−１がＤＮＡ損傷センサーとしても機能することを可能にする。ＰＡＲＰ−２も損傷ＤＮＡによって刺激され、ＰＡＲＰ−１およびＸ線修復相互補体グループ１（ＸＲＣＣ−１）との相互作用を介して塩基除去修復（ＢＥＲ）経路に結び付けられている。
ニコチンアミド（ＮＡＭ）も、例えばＳＩＲＴ１などの、哺乳類のサーチュインファミリー酵素の活性を阻害する（http://en.wikipedia.org/wiki/Sir2-note-1）。本発明の方法にしたがってリスベラトロールを投与すれば、一方で、ＮＡＭの代謝の増加を誘起することによってサーチュイン活性の抑制を低減させながら、ＮＡＤ＋の合成を増加させ、それゆえ、サーチュイン活性に必要な基質が利用できる可能性を増加させる。そこで、本発明は、リスベラトロールの投与によってサーチュイン活性を誘起する方法を提供する。
医薬組成物および投与経路
本発明は、治療有効量のリスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を包含する医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、ＮＡＤ＋を必要とする被検者においてＮＡＤ＋の合成を増加させるために使用されてもよい。上記の構成に加えて、あるいは、上記の構成の替わりに、本発明の医薬組成物は、酸化ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷に関連する疾病または状態を、予防する、あるいは治療するために使用されてもよい。
本発明の医薬組成物中のリスベラトロールは、シス異性体、トランス異性体、またはこれらの混合物の形態であってもよい。本発明の医薬組成物に適したリスベラトロールの類似体の例としては、リスベラトロールのヒドロキシル化類似体またはリスベラトロールのメトキシル化類似体などが挙げられるが、これらの例に限定されるものではない。機能的に同等なリスベラトロールの類似体は、シス−リスベラトロールグルコシド（シス−ｐｉｃｅｉｄ）またはトランス−リスベラトロール−３−Ｏ−β−グルコシド（トランス−ｐｉｃｅｉｄ）であってもよい。本発明の医薬組成物に適したリスベラトロールの誘導体の一例としては、１つ以上のヒドロキシル基（典型的には３−ヒドロキシル基）が単糖または二糖に共役結合している誘導体が挙げられる。一般に、３−ヒドロキシル基は、単糖の１位にに共役結合していてもよい。リスベラトロールに共役結合してもよい糖類の例としては、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、およびガラクトースなどがあげられるが、これらの例に限定されるものではない。その他の適切なリスベラトロールの誘導体および類似体は、例えば米国特許第７０２６５１８号明細書、米国特許第６７９０８６９号明細書、国際特許出願公開第ＷＯ／２００３／０５５４４４、国際特許出願公開第ＷＯ／２００４／０００３０２、国際特許出願公開第ＷＯ／１９９９／００３８１６などに記載されている。なお、これらの特許文献の内容は参照によってここに引用されるものとする。当業者がこれらの文献を参照すれば、本発明の医薬組成物に適した、上述のリスベラトロールの誘導体および類似体は、非限定的な例であって、本発明は、機能的に同等な効果を誘起することができる、類似のその他のリスベラトロールの誘導体および類似体の使用を包含することが理解できよう。
残留性の酸素フリーラジカルによって引き起これる損傷を低減するために、酸化還元活性を有する金属および／または抗酸化剤をキレート化する薬剤からなる薬物併用療法は、ＮＡＤ＋の合成促進剤を包含することによって相乗的に亢進され得る。そこで、本発明は、ＮＡＤ＋の合成を促進するための少なくとも１つの薬剤と、少なくとも１つの抗酸化剤および／または少なくとも１つのキレート薬との相乗的な組み合わせを包含する、酸化ストレスに関連する状態および疾病を治療法するための医薬組成物を提供する。
ＮＡＤ＋の合成を促進するための薬剤を、抗酸化剤および／またはキレート薬を含有する組成物中に包含することによって、酸化ストレスを予防、治療、または軽減するための相乗効果が提供できる。好適な実施形態において、ＮＡＤ＋の合成を促進するための上記薬剤は、リスベラトロール、リスベラトロールの機能的類似体、またはこれらに相当するものである。特定のメカニズムに制限されるものではないが、酸化ストレス条件にある間ＮＡＤ＋が増加することは、ＮＡＤ＋依存性の他の酵素、例えばＮＡＤグリコヒドラーゼの機能にとって有益であるかもしれない。このことが、酸化ストレス下にある細胞に対してさらに薬効を提供する。上記の構成に加えて、あるいは、上記の構成の替わりに、ＮＡＤ＋の合成を促進する薬剤は、ＮＡＤ＋に対する依存性を有する脱アセチル化酵素、例えばサーチュインファミリー酵素（例えばＳＩＲＴ１）の活性を増加させる能力を有していて、該脱アセチル化酵素の必須な基質であるＮＡＤ＋の生成の増加を介してＰＡＲＰ酵素活性を亢進させることによって、ＤＮＡ修復の改善を促進してもよい。上記の構成に加えて、あるいは、上記の構成の替わりに、ＮＡＤ＋の合成を促進する薬剤は、ＮＭＮＡＴ活性の誘起を介して、ＮＡＭの代謝を増加させることもでき、こうすることによってＰＡＲＰ／サーチュインの阻害剤を除去し、上記酵素の活性をさらに誘起してもよい。
本発明の相乗的な組成物に適したキレート薬の例としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ベルサンテ二ナトリウムカルシウム）（ＣａＮａ２−ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、αリポ酸（ＡＬＡ）、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）、ジメルカプロール（ＢＡＬ）、デフェロキサミン、Ｄ−ペニシラミン、ジメルカプロール、アミノフェノキシエタン−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）デファラシロックス、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）２−ピリジンカルボン酸（ピコリン酸）、２，３−ピリジンジカルボン酸（キノリン酸）、２−アミノ安息香酸（アントラニル酸）、キヌレン酸、キサンツレン酸、および８−ヒドロキシキノリン（およびこれらの機能性誘導体）などがあげられるが、これらの例に限定されるものではない。一般に、キレート薬とは、酸化還元活性を有する金属と、錯体を形成することができるものであって、この錯体中では、一般に金属イオンが該キレート薬の２つ以上の原子に結合していて、こうすることによってヒドロキシラジカルの生成を低減させる。この結合は、配位結合またはイオン結合の任意の組み合わせであってもよい。キレート薬と結合して錯体を形成するかもしれない酸化還元活性を有する金属の例としては、Ｆｅ＋＋、Ｃｕ＋、Ｃｒ＋＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｃｏ＋＋、Ｎｉ＋＋、Ａｇ＋などが挙げられるが、これらの例に限定されるものではない。
本発明の相乗的な組成物に適した抗酸化剤の例としては、メラトニン、ビタミンＥ、ビタミンＣ、メチオニン、タウリン、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、およびグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＸ）、ならびにＬ−エルゴチオネインＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、ビタミンＡ、βカロチン、レチノール、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン−３−没食子酸、フラベノイド、Ｌ−エルゴチオネイン、イデベノン、およびセレンなどがあげられるが、これらの例に限定されるものではない。その他の適切な抗酸化剤は、米国特許第２００８０１５２１８号明細書に記載されており、該特許文献の内容は参照によってここに引用されるものとする。
本発明の医薬組成物は、治療上投与されてもよい。治療上の適用において、組成物は、酸化ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷を増加させると考えられる状態で、または既に酸化ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷に関連する疾病に罹患している、もしくはそのような状態にある患者に対して、または酸化ストレスおよびその合併症に関連する疾病または状態を少なくとも部分的に停止させるために、予防的に投与されてもよい。治療を行っている医師が投与量のレベルおよびパターンを選択して、上記医薬組成物を一回または複数回投与してもよい。
任意の患者に対する上述の治療上有効な投与量のレベルは、次に列挙するような種々の因子によって左右される。すなわち、酸化ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷に関連する疾病または状態の重症度（ＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷を含む）、採用した組成（物）、患者の年齢、体重、身全体の健康状態、および食事、投与時刻、投与経路、治療の継続時間、相乗的な組成物と組み合わせて使用または同時に使用する薬剤、さらに他の医学においてよく知られた関連する因子などである。
当業者であれば、通例的な実験によって、ＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷を含む、酸化ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷に関連する疾病または状態を、本発明の医薬組成物により治療するために必要な、上記の治療薬の有効な非有毒量を決定できるであろう。
本発明の方法では、投与される医薬組成物は、体重１ｋｇ当たり約０．０００１ｍｇから約１０００ｍｇまで、例えば体重１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇから約７５０ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇから約５００ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇから約５００ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇから約２５０ｍｇまで、または体重１ｋｇ当たり約１．０ｍｇから約２５０ｍｇまでの範囲にあればよい、さらに好適には、２４時間当たりの効果的な服用量は、体重１ｋｇ当たり約１．０ｍｇから約２００ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約１．０ｍｇから約１００ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約１．０ｍｇから約５０ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約１．０ｍｇから約２５ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約５．０ｍｇから約５０ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約５．０ｍｇから約２０ｍｇまで、または体重１ｋｇ当たり約５．０ｍｇから約１５ｍｇまでの範囲にあればよい。
さらに、本発明の組成物の個々の服用量の最適量および投与間隔が、状態の性質および程度、投与の形式、経路、および部位、および治療中の特定の患者の性質によつて決定されればよいことは、当業者には明らかである。また、このような最適条件を、従来の方法によって決定してもかまわない。
最適な治療手順を（例えば、規定された日数の間投与される、本発明の組成物の一日あたりの投与回数）従来の治療手順決定試験を使って当業者が確認できることも、当業者には明らかである。
一般に、本発明の医薬組成物は、当業者にとって公知である方法によって調製されればよく、したがって、薬学的に許容可能なキャリア、希釈液、および／または補助剤を包含していてもよい。
本発明の方法によれば、医薬組成物は、任意の適した経路によって、全身に投与されてもよく、部分的に投与されてもよく、または局所的に投与されてもよい。任意の環境において使用する特定の投与経路は、治療対象である疾病または状態の性質、疾病または状態の重症度および程度、誘導される特定の化合物の必要な服用量、および化合物の潜在的な副作用を含めた、複数の因子によって左右される。
例えば、適切な濃度の所望の化合物が、治療するべき身体の部位に直接誘導されることが要求される環境中では、投薬は全身的に行うのではなく、部分的に行われる。部分的に投薬することによって、局所的に非常に高い濃度を作り出す所望の化合物を、要求されている部位へデリバリーできるようになり、それゆえ、身体の他の器官が上記化合物に曝露されることを避けて、避けることによって副作用を潜在的に低減しながら、所望する治療効果または防止効果実現するために適している。
一例として、本発明の実施形態に係わる投与は、腔内経路、膀胱内経路、筋肉内経路、動脈内経路、静脈内経路、皮下経路、局所的経路、または経口経路などを含めた、任意の標準的な経路によって実現されればよい。腔内の投与は、腹腔内経路であっても、胸膜内経路であってもよい。特定の実施形態では、投与は点滴静注または腹腔内投与を介して行われる。
所望であれば、持続的な放出または間欠的な放出に適した医薬組成物を包含するデバイスまたは組成物を、実質的には、身体に埋め込んでも、局所的に適用しても、上述のような物質を比較的ゆっくりと身体へ放出することができる。
上記のキャリア、希釈液、および補助剤は、上記組成物の他の成分と適合できるという観点で、必ず”許容可能”でなければならない。また、レシピエントにとって有害であってはならない。薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈液の例としては、脱塩水または蒸留水；生理食塩水；ピーナッツ油、ベニバナ油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油（例えば、ピーナッツ油、ベニバナ油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、ラッカセイ油、またはヤシ油）などの野菜を基にした油；メチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサン、およびメチルフェニルポリソルポクサンなどの、ポリシロキサンを含めたシリコーンオイル；揮発性シリコーン；流動パラフィン、軟パラフィン、スクアランなどのミネラルオイル；メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体；エタノールまたはイソプロパノールなどの低級アルカノール；低級アラルカノール(aralkanol)；ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、またはグリセリンなどの低級ポリアルキレングリコールまたは低級アルキレングリコール；イソプロピルパルミチン酸、ミリスチン酸イソプロピル、またはエチルオレイン酸などの脂肪酸エステル；ポリビニルピリドン；寒天；カラゲナン；トラガカントゴムまたはアラビアゴム；およびワセリンなどがあげられる。上記一つのまたは複数のキャリアは、上記組成物の１０％から９９．９重量％を形成すればよい。
本発明の医薬組成物は、組成物の形態、経口摂取（例えばカプセル、錠剤、カプレット、およびエリキシル剤）による投与に適した形態、局所投与に適した軟膏、クリーム、またはローションの形態（この形態はＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷の治療および修復には特に好ましい）、点眼としてのデリバリーに適した形態、例えば鼻腔内の吸入または経口の吸入などの吸入による投与に適したエアロゾルの形態、皮下注射、筋肉内注射、または静脈内注射である非経口投与に適した形態であればよい。
注射用の溶液または注射用の懸濁液として投与する場合、非有毒な、非経口的に許容可能な希釈液またはキャリアの例としては、リンゲル溶液、等張生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、エタノール、および１，２−プロピレングリコールなどが挙げられる。
経口使用の場合の、適切なキャリア、希釈液、賦形剤、および補助剤の例としては、ピーナッツ油、流動パラフィン、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム、トラガカントゴム、ブドウ糖、スクロース、ソルビトール、マンニトール、ゼラチンの、およびレシチンなどがあげられる。さらに、これらの経口製剤は、適切な人工香味料および着色料を含有していてもよい。カプセルの形態で使用される場合、カプセルは、壊変を遅延させる、モノステアリン酸グリセリンまたはグリセリルジステアレートなどの化合物で被覆されていてもよい。
補助剤は通常、皮膚軟化薬剤、乳化剤、増粘剤、保存料、殺菌剤、および緩衝剤を包含している。
経口投与用の固形物は、ヒトおよび獣の薬務において許容可能な結合剤、甘味料、崩壊剤、希釈液、人工香味料、コーティング剤、保存料、潤滑剤、および／または遅延剤を包含していてもよい。適切な結合剤の例としては、アラビアゴム、ゼラチン、トウモロコシ澱粉、トラガカントゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、またはポリエチレングリコールなどがあげられる。適切な甘味料の例としては、スクロース、ラクトース、グルコース、アスパルテーム、またはサッカリンなどがあげられる。適切な崩壊剤の例としては、トウモロコシ澱粉、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、グアーガム、キサンタンガム、ベントナイト、アルギン酸、または寒天などがあげられる。適切な希釈液の例としては、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、ブドウ糖、カオリン、セルロース、炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、またはリン酸ジカルシウムなどがあげられる。適切な調味料の例としては、ペパーミント油、冬緑樹油、サクランボ、オレンジ、またはキイチゴの人工香味料などがあげられる。適切なコーティング剤の例としては、アクリル酸および／またはメタクリル酸および／またはこれらのエステル、ワックス、脂肪アルコール、ゼイン、セラック、またはグルテンの重合体または共重合体などがあげられる。適切な保存料の例としては、安息香酸ナトリウム、ビタミンＥ、αトコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベン、またはナトリウム重亜硫酸などがあげられる。適切な潤滑剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ナトリウムオレイン酸、塩化ナトリウム、または滑石などがあげられる。適切な遅延剤の例としては、モノステアリン酸グリセリンまたはグリセリルジステアレートなどが挙げられる。
経口投与用の液体形態物は、上記の薬剤に加えて、液体キャリアを包含していてもよい。適切な液体キャリアの例としては、水、および例えばオリーブ油、ピーナッツ油、ゴマ油、サンフラワーオイル、ベニバナ油、ラッカセイ属油、ヤシ油、流動パラフィン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセリン、脂肪アルコール、トリグリセリドなどの油、またはこれらの混合物などが挙げられる。
経口投与用の懸濁液の例としては、さらに、分散剤および／または懸濁剤などがあげられる。適切な懸濁剤の例としては、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、ポリ−ビニル−ピロリドン、アルギン酸ナトリウム、またはアセチルアルコールなどがあげられる。適切な分散剤としては、レシチン、例えばステアリン酸などの脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレイン酸またはポリオキシエチレンソルビトールジオレイン酸、ポリオキシエチレンソルビトールモノステアリン酸またはポリオキシエチレンソルビトールジステアリン酸、またはポリオキシエチレンソルビトールモノラウリン酸またはポリオキシエチレンソルビトールジラウリン酸、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸またはポリオキシエチレンソルビタンジオレイン酸、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸またはポリオキシエチレンソルビタンジステアリン酸、またはポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸またはポリオキシエチレンソルビタンジラウリン酸などが挙げられる。
本発明の医薬組成物は、選択された治療用化合物を、選択された賦形剤、キャリア、補助剤、および／または希釈液を用いてブレンド、粉砕、均質化、懸濁、溶解、乳化、分散、および／または混合することによって、調製されてもよい。
錠剤またはカプセルの形態の、本発明の１つのタイプの医薬組成物は、（ａ）第１の治療用化合物を、任意の所望の賦形剤、キャリア、補助剤、および／または希釈液とともに包含する第１の錠剤またはカプセルを調製し、（ｂ）第２の治療用化合物と該第１の錠剤またはカプセルとを包含する第２の錠剤またはカプセルを調製することによって調製されてもよい。
カプセルの形態の、本発明の別のタイプの医薬組成物は、（ａ）第１の治療用化合物を、任意の所望の賦形剤、キャリア、補助剤、および／または希釈液とともに包含する第１のカプセルを調製し、（ｂ）第２の治療用化合物と該第１のカプセルとを包含する第２のカプセルを調製することによって調製されてもよい。
錠剤の形態の、本発明のさらに別のタイプの医薬組成物は、（ａ）治療用化合物を、任意の所望の賦形剤、キャリア、補助剤、および／または希釈液とともに包含するカプセルを調製し、（ｂ）該第２の治療用化合物と該カプセルを包含する錠剤を調製することによって調製されてもよい。
経口投与用の乳濁液は、１つ以上の乳化剤をさらに包含していてもよい。適切な乳化剤の例としては、例を上述した分散剤、またはグアーガム、アラビアゴム、またはトラガカントゴムなどの天然ゴムなどがあげられる。
非経口的に投与可能な組成物を調製するための方法は、当業者にとって自明であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa.,に詳細に記載されている。この文献の内容は参照によってここに引用されるものとする。
本発明の局所的な組成物は、治療用化合物を、１つ以上の許容可能なキャリア、および必要に応じて任意のその他の治療用成分とともに包含している。局所投与に適した組成物は、皮膚を通って、治療画必要な部位に浸透するために適した液体または半液体の調製物、例えばリニメント剤、ローション、クリーム、軟膏、またはペースト、および眼、耳、または鼻部への投与に適した液滴を包含している。
本発明に係わる液滴は、無菌の、水性溶液、油性溶液、または懸濁液を包含していてもよい。これらの液滴は、殺菌性および／または殺真菌性の薬剤および／または任意のその他の適切な保存料、および必要に応じて表面活性剤を含有する水溶液に、治療用化合物を溶解させることによって、調製されてもよい。その結果得られる溶液は、次に、濾過することによって透明にされ、適切な容器に移されて、無菌化されてもよい。滅菌は、高圧蒸気殺菌法または９０℃−１００℃で半時間維持することによって、または濾過の後に無菌的な方法で容器に移すことによって、実現されてもよい。上記液滴に包含するために適した、殺菌性のおよび殺真菌性の薬剤の例としては、硝酸フェニル水銀または酢酸（０．００２％）、塩化ベンザルコニウム（０．０１％）、およびクロルヘキシジン酢酸（０．０１％）などがあげられる。油性溶液の調製に適した溶媒の例としては、グリセリン、希釈アルコール、およびプロピレングリコールなどが挙げられる。
本発明に係わるローションの例としては、皮膚または眼に対して適用するために適したものが挙げられる。点眼薬剤は、殺菌剤を必要に応じて含有する無菌性水溶液を包含していてもよく、液滴の調製に関連して上述した方法と同様の方法によって調製されてもよい。皮膚に適用するローションまたはリニメント剤は、乾燥を加速し、皮膚を冷却する薬剤、例えばアルコールまたはアセトン、および／またはグリセリンなどの保湿剤、またはヒマシ油もしくはラッカセイ油などの油をも包含していてもよい。
本発明に係わるクリーム、軟膏、またはペーストは、外用化合物の半流動性製剤であって、細かく分割または粉末化した形態の有効成分を、単独で混合、または水性の液体または非水性の液体中で溶解または懸濁させた状態で、グリース状または非グリース状の基剤と混合することによって、調製されてもよい。この基剤は、硬パラフィン、軟パラフィン、または流動パラフィン、グリセリン、蜜蝋、金属石鹸などの炭化水素；粘液；アーモンド、トウモロコシ、ラッカセイ属、ヒマシ油、またはオリーブ油などの天然由来の油；羊毛脂肪またはその誘導体、またはステアリン酸もしくはオレイン酸などの脂肪酸を、プロピレングリコールまたはマクロゴールなどのアルコールとともに包含していてもよい。
上記組成物は、任意の適切な界面活性物質、例えば、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤（例えばソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体）などを包含していてもよい。天然ゴム、セルロースの誘導体、または無機物質（例えば、ケイ質シリカ）などの懸濁剤、およびラノリンなどのその他の成分を包含していてもよい。
上記組成物は、リポソームの形態で標的細胞に投与または誘導されてもよい。リポソームは一般に、リン脂質などの脂質物質に由来し、水性培地に分散している単層状または多層状の水和液晶によって形成されている。組成物を標的細胞に投与または誘導する際に使用されるリポソームの具体的な例としては、合成コレステロール（シグマ）、リン脂質１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社）、ＰＥＧ脂質３−Ｎ−［（−メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミレスチロキシ−プロピルアミン（ＰＥＧ−ｃＤＭＡ）、および陽イオン性の脂質１，２−ｄｉ−ｏ−オクタデセニル−３−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）または１，２−ジリノレイロキシ−３−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を５５：２０：１０：１５または４８：２０：２：３０のモル比で混合したもの、さらにＰＥＧ−ｃＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、およびＤＬｉｎＤＭＡなどがあげられる。非有毒、生理的に許容可能、かつ代謝可能であって、リポソームを形成できる任意の脂質が使用可能である。リポソームの形態の上記組成物は、安定剤、保存料、賦形剤などを包含していてもよい。好ましい脂質としては、リン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン）があげられ、いずれも天然のものでも合成されたものでもよい。リポソームを形成する方法は、当該技術分野において公知であり、この点について具体的に、Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p. 33 et seq.,を参照するが、この文献の内容は参照によってここに引用されるものとする。
上記組成物は、微小粒子の形態で投与されてもよい。ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコライド（ＰＬＧＡ）、およびε−カプロラクトン（ε−カプロラクトン）から形成される、生分解性の微小粒子は、血漿の半減期を延長し、こうすることによって有効性を延長する薬物担体として広範に使用されている（R. Kumar, M., 2000, J Pharm Pharmaceut Sci. 3(2) 234-258）。微小粒子は、ワクチン、抗生物質、およびＤＮＡを含めた、薬剤となり得るある範囲のものを誘導することを目的として、製剤されている。また、これらの製剤は、非経口的な皮下注射、静脈内注射、および吸入を含めた、各種誘導経路にあわせて開発されている。
上記組成物は、糖酢酸イソ酪酸エステル（ＳＡＩＢ）および有機溶剤または有機溶剤の混合物からなる、コントロールド・リリース・マトリックスを包含していてもよい。粘性をさらに増加させ、放出速度を低下させるために、重合体の添加物が、放出調製成分とてし上記媒体に添加されてもよい。ＳＡＩＢは、周知の食品添加物である。ＳＡＩＢは、２つの酢酸基に対して６つのイソ酪酸という名目上の比において、高い疎水性を有し、完全にエステル化されたスクロースの誘導体である。混合エステルとしては、ＳＡＩＢは結晶化せずに、透明な粘稠性を有する液体として存在する。ＳＡＩＢを、エタノールまたはベンジルアルコールなどの薬剤的に受容される有機溶剤に混合すると、混合物の粘性が大幅に減少し、注射が可能になる。ＳＡＩＢ溶液製剤またはＳＡＩＢ懸濁液製剤を形成するために、治療用化合物が、ＳＡＩＢをデリバリーする媒体に添加されてもよい。該製剤が皮下に注入されると、溶媒はマトリックスから拡散し、ＳＡＩＢ／薬剤の混合物またはＳＡＩＢ／薬剤／重合体の混合物がインサイツを形成するデポとして構成することが可能になる。
当業者であれば、本発明の方法よれば、上記医薬組成物が、単独でまたは併用療法として１つ以上の付加的な薬剤とともに投与されてもよいことが理解できるであろう。例えば、本発明の医薬組成物は、ＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷を含めた、酸化ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷に関連する状態を治療または防止することができる、１つ以上の付加的な薬剤とともに投与されてもよい。
上記の併用療法の場合、所望の効果を得るために、併用療法の各成分が同時に投与されてもよく、任意の順番で順に投与されてもよく、または異なるタイミングで投与されてもよい。上記の構成の替わりに、上記成分をまとめて、一回の服用量の単位の組み合わせ生成物として製剤されてもよい。別々に投与される場合、上記成分が同じ投与経路で投与されることが好ましいこともある。ただし、必ずしもこうする必要はない。
治療上の利点は、組み合わせ療法を介しても実現され得る。併用療法では、組成物はおよびその他の任意の薬剤は、同時に投与されても、または任意の順番で順に投与されてもよい。そこで、本発明に係わる治療方法は、放射線療法、化学療法、手術、またはその他の形態の医療行為などの、通常の療法とともに適用されてもよい。化学療法薬剤の例としては、ドキソルビシン、タキソール、フルオロウリシル(fluorouricil)、メルファラン、シスプラチン、オキサリプラチン、αインターフェロン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、アンジオインヒビン、ＴＮＰ−４７０、ペントサンポリサルフェート、血小板第４因子、アンジオスタチン、ＬＭ−６０９、ＳＵ−１０１、ＣＭ−１０１、テクガラン(Techgalan)、サリドマイド、ＳＰ−ＰＧなどが挙げられる。その他の化学療法薬剤としては、メクロエタミン(mechloethamine)、メルファン(melphan)、クロラムブシル、シクロホスファミド、およびイホスファミドを含めたメクロレタミン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、およびストレプトゾシンを含めたニトロソウレアなどのアルキル化剤；ブスルファンを含めたスルホン酸アルキル；ジカルバジン(dicarbazine)を含めたトリアジン；チオテパおよびヘキサメチルメラミンを含めたエチエンイミン(ethyenimine)；メトトレキサートを含めた葉酸類似体；５−フルオロウラシルおよびシトシンアラビノシドを含めたピリミジン類似体；６−メルカプトプリンおよび６−チオグアニンを含めたプリン類似体；アクチノマイシンＤを含めた抗腫瘍性の抗生物質；ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、およびメトラマイシン(methramycin)を含めたアントラサイクリン；タモキシフェンおよびコルチオステロイド(cortiosteroid)を含めたホルモンおよびホルモン拮抗薬剤、ならびにシスプラチンおよびブレキナルを含めた種々の薬剤、ならびにＣＯＭＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、メトトレキサート、およびプレドニゾン）、エトポシド、ｍＢＡＣＯＤ（メトトレキサート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびデキサメタゾン）、ならびにＰＲＯＭＡＣＥ／ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキサート（ロイコボリン(leucovin)レスキューを併用）、ドキソルビシン、シクロホスファミド、タキソール、エトポシド／メクロレタミン、ビンクリスチン、プレドニゾン、およびプロカルバジン）などの療法などが挙げられる。
当業者であれば、ここに記載されている本発明に対して、具体的に記載されたもの以外の変更や変形が可能であることが理解できるであろう。本発明にはこういった変更や変形がすべて含まれることが理解されるはずである。
治療方法
本発明では、ＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷を含めた、酸化ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷に関連する疾病および状態を治療するための方法について考察する。一実施形態において、該方法は、治療有効量のリスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を、被検者に対して投与することを包含する。別の一実施形態において、該方法は、ＮＡＤ＋の合成を誘起する少なくとも１つの薬剤と、効果的な量の、少なくとも１つの抗酸化剤および少なくとも１つのキレート薬のいずれかまたは両方との、相乗的な組み合わせを含有する治療有効量の医薬組成物を、被検者に対して投与することを包含する。
当業者であれば、本発明の上記組成物の投与を使用して、ＮＡＤ＋の合成を刺激することを直接の標的とし、そうすることによって、ＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷を含めた酸化ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷を治療するための薬効を提供し得ることができ、Ｈ２Ｏ２、Ｏ２・−、・ＯＨ、およびＮＯなどの活性酸素種のレベルの上昇を伴うことが理解できよう。ＮＡＤ＋の合成量が増加すると、ＤＮＡの修復においておよびサーチュイン酵素に関与するＰＡＲＰ酵素に対して余分な基質が提供され、また、ニコチンアミド代謝が増加し、それゆえ、ＰＡＲＰおよびサーチュインの酵素活性の強力な阻害剤が除去される。そこで、本発明の該方法は、ＮＡＤ＋レベルの決定的な減少を軽減する手段を提供し、細胞死の酸化ストレスによって誘起されるＰＡＲＰの活性化の増加レベルをつりあわせる。
ＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷を含めた、酸化ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷に関連する、本発明の方法による治療に適した疾病および状態としては、紫外線または電離放射線（例えばｘ線、γ線）に対する曝露、化学薬品、感染、炎症、またはミトコンドリアの効率低下が原因になって、ＲＯＳレベルの上昇が起こる疾病および状態などがあげられるが、これらの例に限定されるものではない。本発明の方法は、皮膚の通常の細胞老化または加速的な老化の治療、ＵＶによって誘起される皮膚細胞（つまりケラチノサイトおよび線維芽細胞）のＤＮＡ損傷の治療および修復、ならびにアルツハイマー病およびパーキンソン病を含めた神経変性疾患および障害の治療および修復に適している。上記の構成に加えて、あるいは、上記の構成の替わりに、本発明の方法は、癌を含めた、ＤＮＡ損傷に関連する疾病および状態の治療に適している。上記の疾病は非限定的な例であって、本発明の組成物は、酸化ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷に関連するその他の状態および疾病の治療に使用可能であることが、当業者であれば理解できよう。
キット
本発明は、リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を包含する、ＮＡＤ＋の合成を増加させるためのキットを提供する。
さらに、本発明は、リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を包含する、被検者において、酸化ストレスに関連する疾病または状態を治療するためのキットを提供する。
さらに、本発明は、リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を包含する、被検者において、ＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷を含めた、ＤＮＡ損傷に関連する疾病または状態を治療するためのキットを提供する。
上記リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体は、シス異性体、トランス異性体、またはこれらの混合物であってもよい。キットに包含されていてもよいリスベラトロールの類似体としては、リスベラトロールのメトキシル化類似体、シス−リスベラトロールグルコシド（シス−ｐｉｃｅｉｄ）、およびトランス−リスベラトロール−３−Ｏ−β−グルコシド（トランス−ｐｉｃｅｉｄ）などがあげられるが、これらの例に限定されるものではない。
上記キットは、任意の数の付加的な構成要素を包含していてもよい。非限定的な例として、この付加的な構成要素には、参照試料、緩衝液、標識、およびアッセイを実施するための説明書なとが含まれていてもよい
次に、特定の例を参照して本発明を説明するが、これは、本発明の範囲を限定すると解釈すべきものではない。
〔実施例〕
実施例１：ヒトの胎児のアストロサイトにおける、ＩＤＯ阻害剤１−ＭＴによる、ＮＡＤ＋合成の新生経路の抑制。
ヒトの胎児の初代アストロサイトを、２４ウェルの培養プレート（〜１０５個の細胞／ウェル）に播種した。各ウェルは、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および０．５％のグルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）を補充した、１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０の細胞培養培地を含んでいた。培養物を２４時間放置して平衡化させ、つづいて、ＩＤＯ阻害剤１−メチルトリプトファン（１−ＭＴ）（１００μＭ）を、単独でまたはＬ−トリプトファン（１００μＭ）もしくはニコチン酸（１００μＭ）のいずれかと組み合わせて用いて、処理した。この薬剤の添加につづいて、培養を、５％のＣＯ２中で３７℃で２４時間インキュベーションし、つづいて細胞のＮＡＤ＋の濃度を分析した。細胞物をＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ値７．４）で洗浄し、ニコチンアミド（１０ｍＭ）をＰＡＲＰ阻害剤として含有するホモジネート溶液中で超音波処理した。それから、細胞のホモジネートの試料を、ビシン緩衝液（１２０ｍＭ）、エタノール（０．６Ｍ）、フェニジンメチルサルフェート(phenyzine methyl sulfate ; PMS)（２ｍＭ）、ＭＴＴ（０．５ｍＭ）、およびアルコール脱水素酵素（１ｍｇ／ｍｌ）を含有する反応混合物に添加した。ＮＡＤ＋およびＮＡＤＨのレベルを、バイオラド×６８０型ミクロプレート読み取り装置（バイオラド社、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）において５７０ｎｍのフィルターを使って、試薬のブランク値に対して分光測定で数量化した。
細胞一個当たりのＮＡＤ＋（Ｈ）の濃度を、タンパク質のさまざまなレベルについて、細胞のホモジネート中のタンパク質の総量を参照することによって調節した。
総タンパク質量を、ブラッドフォードのタンパク質アッセイ法を使って決定した。１０μｌの細胞のホモジネート試料（ＮＡＤ＋アッセイにおいて使用したもの）を、２３０μｌのミリＱ水および６０μｌのブラッドフォード試薬とともに各ウェルに手早く添加し、１０分〜１５分間放置して平衡化させた。それから、プレートを、バイオラド×６８０型ミクロプレート読み取り装置（バイオラド社、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）において５９５ｎｍのフィルターを使って読み取った。
トリプトファンからＮＡＤ＋の新生合成の完全な阻害は、競合的なＩＤＯ阻害剤１−ＭＴ（１ｍＭ、２４ｈ）によって誘起される。その結果、細胞内のＮＡＤ＋レベルが大きく減少した（図３）。過剰な量のＬ−トリプトファンまたはサルベージ経路の基質であるニコチン酸のいずれかを補充すると、１−ＭＴのみによる処理に比較して、ＮＡＤ＋の枯渇が部分的に逆転した（図３）。
実施例２：Ｈ２Ｏ２は、ヒトの胎児のアストロサイトにおいて、ＰＡＲＰ活性を増加させる。
ヒトの胎児の初代アストロサイトを、２４ウェルの培養プレート（〜１０５個の細胞／ウェル）に播種した。各ウェルは、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および０．５％のグルタミックス(Glutamix)を補充した、１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０の細胞培養培地を含んでいた。培養物を２４時間放置して平衡化させ、つづいて、酸化促進剤Ｈ２Ｏ２を０μＭから１０００μＭまで濃度を増加させて用いて、処理した。このＨ２Ｏ２の添加につづいて、培養物を、５％のＣＯ２中で３７℃で１５分間インキュベーションし、つづいて２回洗浄し、トリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ値８．１）にＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）、トリトンＸ−１００（１％）、およびＮＡＤ＋（２０μＭ）を含有する２００μＬのＰＡＲＰアッセイ緩衝液中で、均質化／溶解ざせ、さらに３７℃で６０分間放置してインキュベーションした。ＮＡＤ＋は、ＰＡＲＰ酵素にとっての唯一の基質であって、この反応中に劣化するので、酵素活性全体が、アッセイ緩衝液におけるＮＡＤ＋の濃度の減少を定量化することによって、決定される。ＮＡＤ＋の消費量は、上述のように、ＮＡＤ＋（Ｈ）マイクロサイクリングアッセイによって測定される。
ＰＡＲＰ−１の活性は、１０μＭ〜１００μＭのＨ２Ｏ２に２０分間曝露した後、培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおいて大幅に増加した（図４）（Ｈ２Ｏ２に暴露しなかった場合に比較するとαｐ＜０．０５、１０μＭのＨ２Ｏ２の場合に比較するとβｐ＜０．０５、２０μＭのＨ２Ｏ２の場合に比較するとχｐ＜０．０５、５０μＭのＨ２Ｏ２の場合に比較するとδｐ＜０．０５）。
実施例３：Ｈ２Ｏ２は、ヒトの胎児のアストロサイトにおいて、細胞内ＮＡＤ＋を減少させる。
ヒトの胎児の初代アストロサイトを、２４ウェルの培養プレート（〜１０５個の細胞／ウェル）に播種した。各ウェルは、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および０．５％グルタミックスを補充した、１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０の細胞培養培地を含んでいた。培養物を２４時間放置して平衡化させ、つづいて、酸化促進剤Ｈ２Ｏ２を０μＭから１０００μＭまで濃度を増加させて用いて、処理した。このＨ２Ｏ２の添加につづいて、培養物を、５％のＣＯ２中で３７℃で１５分間インキュベーションし、つづいて２回洗浄し、３００μＬのＰＢＳに再懸濁し、氷上に載置した。つづいて、上記の実施例１に記載のように、超音波処理を行い、細胞のＮＡＤレベルを即時分析した。
細胞内のＮＡＤ＋は、１０μＭ〜１００μＭのＨ２Ｏ２に２０分間曝露した後、培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおいて大幅に減少した（図５）（０μＭのＨ２Ｏ２のコントロールの場合に比較すると＊ｐ＜０．０５、５０μＭのＨ２Ｏ２の場合に比較すると＊＊ｐ＜０．０５、１００μＭのＨ２Ｏ２の場合に比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５）。ＮＡＤ＋レベルの減少は、測定したＰＡＲＰ−１活性と負の相関関係を有していた（図４に示す）。
実施例４：Ｈ２Ｏ２は、ヒトの胎児のアストロサイトにおいて、ＬＤＨ放出の誘起する。
ヒトの胎児の初代アストロサイトを、２４ウェルの培養プレート（〜１０５個の細胞／ウェル）に播種した。各ウェルは、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および０．５％グルタミックスを補充した、１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０の細胞培養培地を含んでいた。培養物を２４時間放置して平衡化させ、つづいて、酸化促進剤Ｈ２Ｏ２を０μＭから１０００μＭまで濃度を増加させて用いて、処理した。このＨ２Ｏ２の添加につづいて、培養物を、５％のＣＯ２中で３７℃で２０分間インキュベーションし、つぎに、上清を採取して分析し、ＬＤＨの活性を求めた。ＬＤＨは細胞質の酵素であるので、細胞培養で得られた上清へのＬＤＨの漏出量は、全体的な細胞生存率の尺度として広く使用される。５０μｌのピルビン酸（１１．５ｍＭ）を、５０μｌの細胞培養で得られた上清に手早く添加する。さらに、１００μｌのＮＡＤＨ溶液（７００μＭ）をウェルに添加する。バイオラド×６８０型ミクロプレート読み取り装置（バイオラド社、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使って３４０ｎｍの吸光度の変化を５分間監視し、得られた曲線の直線部分における吸光度の最大変化率を算出することによって、ＬＤＨの活性を分光測定で測定する。
ＬＤＨの活性（細胞死の尺度）は、１０μＭ〜１００μＭのＨ２Ｏ２に２０分間曝露した後、培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおいて大幅に増加した（図６）（０μＭのＨ２Ｏ２のコントロールの場合に比較すると＊ｐ＜０．０５、１０μＭのＨ２Ｏ２の場合に比較すると＊＊ｐ＜０．０５、５０μＭのＨ２Ｏ２の場合に比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５、１００μＭのＨ２Ｏ２の場合に比較するとΨ＜０．０５）。ＬＤＨの放出の増加が、測定した細胞内のＮＡＤレベルの減少量と直接的な相関関係を有していた（図５に示す）。
実施例５：抗酸化剤は、ヒトの胎児のアストロサイトおよびヒトの神経芽細胞腫細胞において、Ｈ２Ｏ２によって誘起される細胞内のＮＡＤ＋の枯渇を阻害する。
酸素ラジカルによって誘起されるストレスは、効果的な抗酸化療法によって寛解され得る。ケルセチンは、よく実証された抗酸化活性を有する、植物に由来するポリフェノール化合物である。ヒトの胎児のアストロサイトにおいてＨ２Ｏ２によって誘起されるＮＡＤの枯渇を調節するケルセチンの能力を、テストした。
ヒトの胎児の初代アストロサイトを、２４ウェルの培養プレート（〜１０５個の細胞／ウェル）に播種した。各ウェルは、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および０．５％グルタミックスを補充した、１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０の細胞培養培地を含んでいた。培養物を２４時間放置して平衡化させ、つづいて、ＤＭＳＯ（０．２％）だけを用いるか、または０．２％ＤＭＳＯおよびケルセチン（５０μＭ）を併用して用いるかのいずれかによって、処理した。さらに２４時間インキュベーションした後、Ｈ２Ｏ２を選択した培養物に添加し（図７を参照）、５％のＣＯ２中で３７℃で２０分間インキュベーションした。つづいてＰＢＳで２回洗浄し、〜３００μＬのＰＢＳで超音波処理を行った。その結果得られたホモジネート(homegenate)を氷上に載置した。つづいて、上記の実施例１に記載のように、細胞のＮＡＤ＋レベルを即時分析した。
ＮＡＤ＋レベルは、１０μＭ〜１００μＭのＨ２Ｏ２に２０分間曝露した後、ケルセチンの存在下で一晩培養した場合、培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおいてほぼ保存された（図７）（＊ｐ＜０．０５、Ｈ２Ｏ２だけを用いる場合に比較すると＊＊ｐ＜０．００５）。
ヒトの神経芽細胞腫細胞における、ＮＡＤ＋レベルに対するメラトニンの効果も調べた。ヒトの神経芽細胞腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）を、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのｌ−グルタミン、および１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充した、ＲＰＭＩ１６４０の細胞培養培地で、９５％の空気／５％のＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で３７℃で保持した。実験を実施する前に、細胞を、約５×１０５個の密度になるまで、２４ウェルの培養プレートに播種し、一晩インキュベーションした。実験当日に、上記培地を吸引し、廃棄した。細胞を５００μＬのＰＢＳで２回洗浄し、つづいて、１０μＭの鉄、１０μＭのアスコルビン酸（鉄をＦｅ２＋の酸化状態で維持するため）、および１００μＭのＨ２Ｏ２を含有するＰＢＳを、１ウェル当たり１ｍｌ添加した。この鉄を、抗酸化性を有するメラトニン（２μＭ〜２００μＭ）とともに５分間インキュベーションし、つづいてＨ２Ｏ２を添加した。すべての処理物を、５％のＣＯ２中で３７℃でさらに３０分間インキュベーションした。それから培養物をＰＢＳで２回洗浄し、〜３００μＬのＰＢＳで超音波処理を行った。その結果得られたホミジネートを氷上に載置した。つづいて、上記の実施例１に記載のように、細胞のＮＡＤ＋レベルを即時分析した。
図８は、１００μＭのＨ２Ｏ２で処理した、ヒトの培養神経芽細胞腫細胞において、細胞内のＮＡＤ＋レベルの枯渇が、２μＭ、２０μＭ、および２００μＭのメラトニンを用いた事前処理によって阻害されていることを示している（Ｃｔｒｌに比較すると＊ｐ＜０．０５、１００μＭのＨ２０２の場合と２０μＭのＭｅｌ ＋ Ｈ２０２の場合とを画すると＊＊ｐ＜０．０５、２μＭのＭｅｌ ＋ Ｈ２０２の場合と２００μＭのＭｅｌ ＋ Ｈ２０２の場合とを比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５）。
ヒトの神経芽細胞腫細胞における、ＮＡＤ＋レベルに対するビタミンＥの効果も調べた。ヒトの神経芽細胞腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）を、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのｌ−グルタミン、および１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充した、ＲＰＭＩ１６４０の細胞培養培地で、９５％の空気／５％のＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で３７℃で保持した。実験を実施する前に、細胞を、約５×１０５個の密度になるまで、２４ウェルの培養プレートに播種し、一晩インキュベーションした。実験当日に、上記培地を吸引し、廃棄した。細胞を５００μＬのＰＢＳで２回洗浄し、つづいて、１０μＭの鉄、１０μＭのアスコルビン酸（鉄をＦｅ２＋の酸化状態で維持するため）、および１００μＭのＨ２Ｏ２を含有するＰＢＳを、１ウェル当たり１ｍｌ添加した。この鉄を、抗酸化性を有するビタミンＥ（２μＭ〜２００μＭ）とともに５分間インキュベーションし、つづいてＨ２Ｏ２を添加した。すべての処理物を、５％のＣＯ２中で３７℃でさらに３０分間インキュベーションした。それから培養物をＰＢＳで２回洗浄し、〜３００μＬのＰＢＳで超音波処理を行った。その結果得られたホミジネートを氷上に載置した。つづいて、上記の実施例１に記載のように、細胞のＮＡＤ＋レベルを即時分析した。
図９は、１００μＭのＨ２Ｏ２で処理した、ヒトの培養神経芽細胞腫細胞において、細胞内のＮＡＤ＋レベルｋ枯渇が、２μＭ、２０μＭ、および２００μＭのビタミンＥを用いた事前処理によって阻害されていることを示している（Ｃｔｒｌに比較すると＊ｐ＜０．０５）。
これらの結果は、酸化ストレスによって誘起されるＮＡＤ＋の枯渇が、抗酸化剤だけを有効な投与量で用いた処理によって、寛解され得ることを実証している。
実施例６：クリオキノールは、ヒトの初代アストロサイトににおいて、・ＯＨによって誘起されるＮＡＤ＋の枯渇を低減する。
Ｈ２Ｏ２の、利用可能な酸化還元活性を有する金属イオンとのフェントン反応は、ヒドロキシラジカル（ＯＨ・）の生成の原因となる。
アルツハイマー病などの神経変性疾患において巨大分子が酸化的に修飾されることが増加するのは、その相当な程度が、膜透過性の酸化物質である過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の細胞内での生成の、非効率的なミトコンドリア活性に起因する増加、神経外でのＨ２Ｏ２の生成の増加、ミクログリアの活性化、およびＡβ沈着物に由来するようである。この反応性の高いフリーラジカルには、ＰＡＲＰの活性化およびＮＡＤ＋の枯渇を引き起こす、深刻なＤＮＡ損傷を誘起する潜在的な力がある。
Ｆｅ２＋やＣｕ＋などの酸化還元活性を有する金属を効果的なキレート化すれば、・ＯＨによって媒介されるＰＡＲＰの活性化が低下し、つづいてＮＡＤの枯渇が寛解されるという仮説について、試験を実施した。ヒトの神経芽細胞腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）を、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのｌ−グルタミン、および１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充した、ＲＰＭＩ１６４０の細胞培養培地で、９５％の空気／５％のＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で３７℃で保持した。実験を実施する前に、細胞を、約５×１０５個の密度になるまで、２４ウェルの培養プレートに播種し、一晩インキュベーションした。実験当日に、上記培地を吸引し、廃棄した。細胞を５００μＬのＰＢＳで２回洗浄し、つづいて、１０μＭの鉄、１０μＭのアスコルビン酸（鉄をＦｅ２＋の酸化状態で維持するため）、および１００μＭのＨ２Ｏ２を含有するＰＢＳを、１ウェル当たり１ｍｌ添加した。この鉄を、キレート剤クリオキノール（１μＭ〜１００μＭ）とともに５分間インキュベーションし、つづいてＨ２Ｏ２を添加した。すべての処理物を、５％のＣＯ２中で３７℃でさらに３０分間インキュベーションした。それから培養物をＰＢＳで２回洗浄し、〜３００μＬのＰＢＳで超音波処理を行った。その結果得られたホミジネートを氷上に載置した。つづいて、上記の実施例１に記載のように、細胞のＮＡＤ＋レベルを即時分析した。
Ｈ２Ｏ２で処理したヒトの神経芽細胞腫細胞における、細胞内のＮＡＤ＋の濃度に対する、親油性キレート剤であるクリオキノール（ＣＱ）の用量反応の効果を、図１０に示す（Ｃｔｒｌに比較すると＊ｐ＜０．０５、Ｈ２０２ ＋ Ｆｅの場合と比較すると＊＊ｐ＜０．０５、１０μＭ ＣＱ ＋ Ｈ２０２ ＋ Ｆｅの場合と比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５）。これらの結果は、・ＯＨによって誘起されるＮＡＤ＋の枯渇が、細胞透過性のキレート薬だけを用いた処理によって、投与量に依存はするものの効果的に低減されることを実証している。
実施例７：リスベラトロールは、細胞内のＮＡＤ＋を増加させる。
ヒトの胎児の初代アストロサイトを、２４ウェルの培養プレート（〜１０５個の細胞／ウェル）に播種した。各ウェルは、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および０．５％グルタミックスを補充した、１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０の細胞培養培地を含んでいた。培養物を２４時間放置して平衡化させ、つづいて、リスベラトロール（１００μＭ）を用いて、処理した。さらに２４時間インキュベーションした後、Ｈ２Ｏ２を選択した培養物に添加し、５％のＣＯ２中で３７℃で２０分間インキュベーションした。つづいてＰＢＳで２回洗浄し、〜３００μＬのＰＢＳで超音波処理を行った。その結果得られたホモジネートを氷上に載置した。つづいて、上記の実施例１に記載のように、細胞のＮＡＤ＋レベルを即時分析した。
リスベラトロールは、コントロールレベルを超える範囲において、細胞内のＮＡＤ＋を大幅に増加させた（＊ｐ＜０．０５）。ヒトの初代アストロサイトにおいてＨ２Ｏ２だけを使用する場合と比較すると、＊＊ｐ＜０．０５であった（図１１）。リスベラトロールは中程度の見かけ上の抗酸化活性しか示さなかった（ＮＡＤ＋の枯渇はわずかに減少）が、酸化ストレスにを受けていない細胞内における、細胞内のＮＡＤ＋に対するリスベラトロールの効果は際立っており、細胞内のＮＡＤ＋の濃度が約７５％の増加を示した。また、恒常的な酸化活性が低減したために、その他の抗酸化剤の場合、無処置のコントロールを超える範囲において、ＮＡＤ＋レベルの中程度の増加が観察されたが、リスベラトロールの効果は、これらの他の抗酸化剤のうちで最良のものより１００％大きかった。実施例８：リスベラトロールは、初代細胞において、ＩＤＯ阻害剤１−ＭＴまたはＱＰＲＴ阻害剤ＰＡの存在下で、細胞内のＮＡＤ＋を増加させる。ヒトの胎児の初代アストロサイトを、２４ウェルの培養プレート（〜１０５個の細胞／ウェル）に播種した。各ウェルは、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および０．５％グルタミックスを補充した、１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０の細胞培養培地を含んでいた。培養物を２４時間放置して平衡化させ、つづいて、リスベラトロール（１００μＭ）、１−ＭＴ（１ｍＭ）、ＰＡ（１ｍＭ）、リスベラトロール（１００μＭ） ＋ １−ＭＴ（１ｍＭ）、およびリスベラトロール（１００μＭ） ＋ ＰＡ（１ｍＭ）を用いて、処理した。さらに２４時間インキュベーションした後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、〜３００μＬのＰＢＳで超音波処理を行った。その結果得られたホモジネートを氷上に載置した。つづいて、上記の実施例１に記載のように、細胞のＮＡＤ＋レベルを即時分析した。
細胞内のＮＡＤ＋に対するリスベラトロールの効果は、リスベラトロールだけを使用するか、または１−ＭＴ、１ｍＭ（ＩＤＯの阻害剤、デノボＮＡＤ合成における第１の酵素）、およびＰＡ１ｍＭ（ＱＰＲＴの阻害剤、デノボＮＡＤ合成における下流の酵素）の存在下で併用するかのいずれかにおいて、水平になる（図１２）（１−ＭＴだけで処理する場合と比較すると＊ｐ＜０．０５、ＰＡだけで処理する場合と比較すると＊＊ｐ＜０．０５）。どちらの阻害剤も、各酵素の活性を完全に遮断すると考えられる濃度で使用した。どちらの阻害剤も、リスベラトロールの効果を抑止できなかった。このことは、リスベラトロールには、サルベージ経路によってＮＡＤ＋の合成を誘起できる可能性があることを暗示している。
実施例８：ＮＭＮＡＴの阻害剤であるタンニン酸は、リスベラトロールによって媒介される、細胞内のＮＡＤ＋の増加を抑止する。
ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）を含めた各種ソースからＮＡＤ＋を生成するためには、サルベージ経路によって、約５つの酵素が使用される（図１参照）。ＮＭＮＡＴを阻害して、その効果を、リスベラトロールによって引き起こされる、先に観察した細胞内のＮＡＤ＋レベルの上昇に対して評価した。ヒトの胎児の初代アストロサイトを、２４ウェルの培養プレート（〜１０５個の細胞／ウェル）に播種した。各ウェルは、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および０．５％グルタミックスを補充した、１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０の細胞培養培地を含んでいた。培養物を２４時間放置して平衡化させ、つづいて、タンニン酸（１００μＭ）またはリスベラトロール（１００μＭ）またはリスベラトロール（１００μＭ）およびタンニン酸（１００μＭ）を用いて、処理した。培養物を、５％のＣＯ２中で３７℃でさらに２４時間インキュベーションした。つづいてＰＢＳで２回洗浄し、〜３００μＬのＰＢＳで超音波処理を行った。その結果得られたホモジネートを氷上に載置した。つづいて、上記の実施例１に記載のように、細胞のＮＡＤ＋レベルを即時分析した。
タンニン酸（２４時間、１００μＭ）を用いて処理したことによって、細胞内のＮＡＤ＋レベルに対するリスベラトロールの効果が完全に抑止された（図１４）。タンニン酸（１００μＭ）だけを用いた処理では、ＮＡＤ＋レベルを２４時間の潜伏期間中に大幅に低下させるにはいたらなかった（図１４）（リスベラトロールだけによる処理に比較した場合＊ｐ＜０．０５、コントロールに比較した場合＊＊ｐ＜０．０５）。これらの結果は、タンニン酸によるＮＭＮＡＴの完全抑制によって、リスベラトロールによって媒介される、先に観察された細胞内のＮＡＤ＋の増加が防止できたことを示唆している。したがって、リスベラトロールの存在下における細胞内のＮＡＤ＋レベルの上昇は、ＮＭＮＡＴ活性のアップレギュレートによって、最もよく説明できると考えられる。
実施例９：リスベラトロールは、ヒトの脳のアストロサイトにおいて、ＮＭＮＡＴ活性を増加させる。
細胞のホモジネート全体における、ヒトのアストロサイトのＮＭＮＡＴ活性に対するリスベラトロールの効果を、図１５に示す。ヒトの脳のアストロサイトを、トリプソン処理し(trypsonised)、２回洗浄し、つぎにＨＥＰＥＳ緩衝液中で再懸濁した。つづいて、超音波の短いバーストによって均質化した。そして細胞の微粒子を遠心分離によって除去し、上清を使用してＮＭＮＡＴ活性の分析を行った。２００μＭのリスベラトロールを、わずかな体積の上清に添加した。つぎにこの試料およびリスベラトロールを含まない（コントロール）試料におけるＮＭＮＡＴ活性を、Balducci et al. Anal. Biochem. (1995). 228: 64-68を修正したプロトコールを使って決定した。標準アッセイを、１ｃｍのパスを有する１ｍｌのキュベット内で、最終的な体積を８５０μｌとして３７℃で実施した。反応混合物には、３９０μｌのエタノール試薬、ＭｇＣｌ２（４０ｍＭ）、１００μｌのＡＴＰ（１２．５ｍＭ）、５０μｌのＡＤＨ（０．５ｍｇ／ｍｌ）、および適切な量のｈｒ−ＮＭＮＡＴ１を含有する、２４０μｌのＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ、ｐＨ値７．４）が含まれていた。反応は、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）を０．６２５ｍＭの最終濃度まで添加することによって、開始させた。１０分間の吸光度の増加を、Ｃａｒｙ ５０ＢＩＯ ＵＶ分光光度計（Ｖａｒｉａｎ社、Ｓｙｄｎｅｙ）を用いて、３４０ｎｍで連続的に記録した。１分間当たりの吸光度の変化を、線形プログレス曲線の勾配から算出し、１分間当たりのＮＡＤＨの生成量（ｎＭ／分）を、ＮＡＤＨ検量線を使って決定した。
２００μＭのリスベラトロールを用いた処理によって、ヒトの脳のアストロサイトの細胞のホモジネート全体において、ＮＭＮＡＴ活性が、コントロール（リスベラトロール処理していないもの）に比較すると６７％増加した。ＮＭＮＡＴの活性に対するリスベラトロールの効果を、ヒトの組換え型ＮＭＮＡＴ（ｈｒＮＭＮＡＴ：Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）（図１６）を使って、直接確認した。リスベラトロールの存在によって、細胞抽出液全体においてＮＭＮＡＴ活性が、大幅に（約７０％）増加した（図１６）。リスベラトロールの投与によって、依存的に、最大反応速度が＞５００％に増加し、Ｋｍが約３分の１に減少した。標準アッセイを、１ｃｍのパスを有する１ｍｌのキュベット内で、最終的な体積を８５０μｌとして３７℃で実施した。反応混合物には、３９０μｌのエタノール試薬、ＭｇＣｌ２（４０ｍＭ）、１００μｌのＡＴＰ（１２．５ｍＭ）、５０μｌのＡＤＨ（０．５ｍｇ／ｍｌ）、および適切な量のｈｒ−ＮＭＮＡＴ１を含有する、２４０μｌのＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ、ｐＨ値７．４）が含まれていた。反応は、ＮＭＮを０．６２ｍＭの最終濃度まで添加することによって、開始させた。ＮＭＮＡＴ活性を、リスベラトロール（５０μＭ、１００μＭ、および２００μＭ）について測定した。１０分間の吸光度の増加を、Ｃａｒｙ ５０ＢＩＯ ＵＶ分光光度計（Ｖａｒｉａｎ社、Ｓｙｄｎｅｙ）を用いて、３４０ｎｍで連続的に記録した。１分間当たりの吸光度の変化を、線形プログレス曲線の勾配から算出し、１分間当たりのＮＡＤＨの生成量（ｎＭ／分）を、ＮＡＤＨ検量線を使って決定した。
これらの結果は、リスベラトロールがＮＡＤのサルベージ経路の酵素ＮＭＮＡＴに対して直接作用しており、この作用は酵素活性の未知のアロステリックなアップレギュレートを介して行われている可能性がもっとも高いことを、強く示唆するものである。
実施例１０：クリオキノールおよびビタミンＥは、Ｈ２Ｏ２およびＦｅに曝露された神経芽細胞腫細胞において、ＮＡＤ＋枯渇を低減させる。
ヒトの神経芽細胞腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）を、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのｌ−グルタミン、および１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充した、ＲＰＭＩ１６４０の細胞培養培地で、９５％の空気／５％のＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で３７℃で保持した。実験を実施する前に、細胞を、約５×１０５個の密度になるまで２４ウェルの培養プレートに播種し、一晩インキュベーションした。実験当日に、上記培地を吸引し、廃棄した。それから細胞を５００μＬＤＰＢＳで２回洗浄し、つづいて、１０μＭの鉄または銅、１０μＭのアスコルビン酸（鉄をＦｅ２＋の酸化状態で維持するため）、および１００μＭのＨ２Ｏ２を含有するＤＰＢＳを、１ウェル当たり１ｍｌ添加した。この鉄を、キレート剤であるクリオキノール（ＣＱ）および／または２０μＭの上記抗酸化ビタミンＥ（ＶｉｔＥ）とともに５分間インキュベーションし、つづいてＨ２Ｏ２を添加した。すべての組み合わせを、３０分間インキュベーションした。つづいて、上記の実施例１に記載のように、ＮＡＤ＋のアッセイを実施した。
キレート剤、クリオキノール、および抗酸化剤であるビタミンＥで処理することによって、神経芽細胞腫細胞において、フリーラジカルによって誘起されるＮＡＤ＋の枯渇に対する相乗的な保護がなされた（図１８）。
実施例１１：ヒト皮膚細胞（ケラチノサイト、線維芽細胞）の培養物における、細胞内のＮＡＤおよび細胞外のＬＤＨの活性に対する、Ｕ．Ｖ．照射、＋／−補充の効果。
ヒト皮膚細胞（ケラチノサイト）を、５×１０６個の密度で、Ｐｅｒｍａｎｏｘのチャンバースライド（ＮＵＮＣ）で２週間成長させた。この方法は、本分野において一般的に使用され、当業者にとって周知であるので、本明細書において使用した方法を詳細に説明する必要はない。
細胞に対して、曝露しないまま放置するか、またはＵＶＢ（〜２００ｍＪｃｍ−２）に１５分間曝露するか、いずれかの処理を行った。つぎに、０．１μＭ〜１００μＭのクリオキノール（ＣＬＱ）（図１９ａ）、ピコリンアミド（ＰＡＭ）（図１９ｂ）、メラトニン（ＭＥＬ）（図１９ｃ）、またはリスベラトロール（ＲＥＳ）（図１９ｄ）のうちのいずれかを、２４時間の単剤療法として、培地に補充した。
細胞を２４時間放置してインキュベーションし、つづいて、細胞内のＮＡＤ（図１９ａ〜図１９ｄから図２１）および細胞外のＬＤＨ（図２１）を分析した。図１９ａ〜図１９ｄは、細胞内のＮＡＤ濃度、＋／−ＵＶ曝露、＋／−補充を示している。図１９ｅ〜図１９ｈは、上清のＬＤＨの活性、＋／−ＵＶＥ曝露、＋／−補充を示している。
図１９ａ〜図１９ｄは、ＮＡＤレベルが大幅に低下し、これに対応して、ＵＶＢ照射を受けたヒト線維芽細胞において、上清（細胞死を示唆するもの、図１９ｅ〜図１９ｈ）のＬＤＨの活性が増加することを示している。各治療法の最小有効濃度（ＭＥＣ）は、０．１μＭ ＭＥＬ、０．１μＭ ＣＬＱ、１０μＭ ＭＥＬ、および５０μＭ ＲＥＳ（それぞれの投与群についてＮ＝３）であった。
図２０ａおよび図２０ｂは、一般に、ＲＥＳを包含する二剤併用療法は、他のどの二剤の組み合わせと比べても、ずっとうまく細胞内のＮＡＤを再生成でき、細胞死（ＬＤＨの活性）を全体的に最小化できることを示している。重要なことは、選択された二剤併用療法の組み合わせによって、ＮＡＤレベルを元へ戻し、細胞死（ＬＤＨの活性）を非ＵＶ処理のコントロールレベルにまで低減することができたことである。図２０ａは、ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから２４時間後のＮＡＤの回復時にＲＥＳ、＋／−ＰＡＭ、＋／−ＣＬＱ、＋／−ＭＥＬを用いて処理した後の、ＮＡＤ濃度に対する、二剤併用の補充物の効果を示している。（グレースケールにおいて）影の薄い方のバーは、ＲＥＳを包含する処理を示している。図２０ｂは、ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬまたはＲＥＳ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＰＡＭを用いて２４時間処理した後の、ＬＤＨの放出（細胞死）に対する、二剤併用の補充物の効果を示している。
図２１ａも、ＲＥＳ／ＭＥＬ／ＰＩＣを用いた三剤併用療法が、ＮＡＤレベルを元へ戻し、細胞死（ＬＤＨの活性）を非ＵＶ処理のコントロールレベルにまで低減することができることを示している。図２１は、ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから２４時間後のＮＡＤの回復時に、ＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＰＡＭを用いて処理した後の、ＮＡＤ濃度に対する、三剤併用の補充物（選択された組み合わせ）の効果を示している。処理用補充物それぞれについて、ＥＣ３３に等しい濃度を使用して三剤の組み合わせを行った。
実施例１２：ヒト皮膚細胞（ケラチノサイト、線維芽細胞）における、ＤＮＡ損傷および修復に対する、Ｕ．Ｖ．照射の効果。
ヒト皮膚細胞（ケラチノサイトおよび線維芽細胞）を、５×１０６個の密度で、Ｐｅｒｍａｎｏｘのチャンバースライド（ＮＵＮＣ）で２週間成長させた。この方法は、本分野において一般的に使用され、当業者にとって周知であるので、本明細書において使用した方法を詳細に説明する必要はない。
細胞を、ＵＶＢ（〜２００ｍＪｃｍ−２）に１５分間曝露した。つぎに、以下に列挙するもののうちいずれかを、培地に補充した。すなわち、
・単剤療法としての、１００μＭのクリオキノール（Ｃ）、１００μＭピコリンアミド（Ｐ）、１００μＭメラトニン（Ｍ）、または１００μＭのリスベラトロール（Ｒ）と、
・二剤併用療法としての、１０μＭ（Ｒ） ＋ ５０μＭ（Ｍ）、１０μＭ（Ｒ） ＋ ０．１μＭ（Ｃ）、または９０μＭ（Ｒ） ＋ ０．０８μＭ（Ｐ）と、
・三剤併用療法としての、０．６５μＭ（Ｐ） ＋ ３３μＭ（Ｃ） ＋ ５μＭ（Ｒ）または０．３μＭ（Ｐ） ＋ ３３μＭ（Ｃ） ＋ ５μＭ（Ｒ）とのうちのいずれかである。
単剤療法に使用した投与量は、どの治療法についても、すべてＩＣ１００に等価であった。また、二剤併用療法に使用した適量の組み合わせは、｛ＩＣ５０（Ｒ） ＋ ＩＣ５０（Ｍ）｝、｛ＩＣ１０（Ｒ） ＋ ＩＣ９０（Ｃ）｝、｛ＩＣ９０（Ｒ） ＋ ＩＣ１０（Ｐ）｝であった。さらに、三剤併用療法に使用した適量の組み合わせは、｛ＩＣ３３（Ｒ） ＋ ＩＣ３３（Ｍ） ＋ ＩＣ３３（Ｃ）｝｛ＩＣ３３（Ｒ） ＋ ＩＣ３３（Ｍ） ＋ ＩＣ３３（Ｐ）｝であった。
細胞を２４時間放置してインキュベーションし、つづいて、ＤＮＡ損傷を分析した（ケラチノサイトについては図２２ａおよび２２ｂ、線維芽細胞については図２３ａおよび２３ｂを参照）。
免疫細胞化学の可視化および半定量化のために、細胞をアセトン／メタノール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で、−２０℃で２０分間固定した。つぎに、細胞をＰＢＳで３回すすぎ、ＰＢＳにおいて０．０２５％のトリトン×１００とともに室温で１０分間インキュベーションすることによって、膜を用いた穏やかな透過処理を実施した。洗浄後、細胞を、５％の正常なヤギの血清（ＮＧＳ）とともに、ＰＢＳにおいて室温で４５分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回すすぎ、５％のＮＧＳで希釈した一次抗体６〜４ＰＰ ｍＡｂ（コスモバイオ株式会社、日本）とともに、３７℃で１時間インキュベーションした。つぎに、細胞を５％のＮＧＳ溶液で洗浄し、適切な標識二次抗体（Ａｌｅｘａ５９４と結合した、ヤギの抗ネズミＩｇＧ）とともに３７℃で１時間インキュベーションした。核を、ＤＡＰＩを使って、室温で１μｇ／ｍｌで５分間染色した。３７℃でＰＢＳで数回洗浄した後、カバーガラスを、フルオロモウント−Ｇを担持するガラススライドの上に手早く載せ、デジタルＳｅｎｓｉＣａｍに関連するオリンパスＢ×６０型蛍光顕微鏡を使って、詳細に観測した。それぞれの標識化実験について、以下の３つのコントロールを実施した。すなわち、１）ｍＡｂｓのアイソタイプの抗体コントロールおよびｐＡｂｓの血清コントロールと、２）二次的な標識抗体だけを用いたインキュベーションと、３）非標識細胞の自己蛍光の推定とである。強度を、ＩｍａｇｅＪ１０．２を使って数量化（半数量化）した。３つの別々の顕微鏡レベルのフィールドを、各処理について分析した。データのＳＥＭは＜５％であった。
図２２ａおよび図２３ａは、補充をせずにＵＶ処理された細胞のＤＮＡ損傷（中央のカラム）について、強い染色を示している。ＤＮＡ損傷シグナルの強度が単剤療法の場合にはほかに比べてわずかに弱く、二剤併用療法の場合にはさらに弱く、三剤併用療法（Ｎ＝３、ケラチノサイト、それぞれの投与群についてＮ＝１の線維芽細胞）で処理した細胞では−ｖｅコントロール（つまりＵＶ損傷がない試料）と比べて差がなかった。なお、もっとも効果的な単剤療法（ＩＣ１００）でも、ＩＣ１００当量の二剤併用療法ほどには効果的でなく、その二剤併用療法でも、ＩＣ１００当量の三剤併用療法ほどには効果的でなかった。
図２２ｂおよび図２３ｂは、ＩＣＣで染色された各部分の蛍光強度の半定量を示しており、三剤併用療法がもっとも効果的なＤＮＡ修復を達成していることの、明確でグラフィカルな証拠を示唆している。
実施例１３：ヒト皮膚細胞（線維芽細胞）の培養物における、ＤＮＡ修復に対する、Ｕ．Ｖ．照射、＋／−補充の効果。
ヒト皮膚細胞（線維芽細胞）を、５×１０６個の密度で、Ｐｅｒｍａｎｏｘのチャンバースライド（ＮＵＮＣ）で２週間成長させた。この方法は、本分野において一般的に使用され、当業者にとって周知であるので、本明細書において使用した方法を詳細に説明する必要はない。
細胞に対して、曝露しないまま放置するか、またはＵＶＢ（〜２００ｍＪｃｍ−２）に１５分間曝露するか、いずれかの処理を行った。つぎに、１００μＭのクリオキノール（ＣＬＱ）、ピコリンアミド（ＰＡＭ）、メラトニン（ＭＥＬ）、またはリスベラトロール（ＲＥＳ）のうちのいずれかを、２４時間の単剤療法として、培地に補充した。
細胞を２４時間放置してインキュベーションし、つづいて、細胞内の残留性ＤＮＡ損傷（ｄｓＤＮＡの切断）を分析した（図２４）。残留性のｄｓＤＮＡの切断がＵＶ処理したコントロールの場合より少なければ、このことが、ＤＮＡ修復の効率を示唆している。図２４は、ヒトの初代線維芽細胞において、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ（１００μＭ）、ＭＥＬ（１００μＭ）、ＣＬＱ（０．１μＭ）、またはＰＡＭ（１００μＭ）を用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対するモノセラピー補充の効果を示している。使用した濃度は、どの治療法についても、ＥＣ１００に等価であった。
図２４は、ＲＥＳ、ＰＡＭ、ＣＬＱ、またはＭＥＬを用いた単剤療法によって、ｄｓＤＮＡの切断量が大幅に低減されることを示している。見かけ上の最大の改善はＭＥＬで処置した群の場合に観察され、損傷ＤＮＡが〜４０％減少した。
図２５は、ＲＥＳ＋ＭＥＬ、ＲＥＳ＋ＣＬＱ、またはＲＥＳ＋ＰＡＭを用いた二剤併用療法によっても、ｄｓＤＮＡの切断量が大幅に低減されることを示している。最大の改善はＭＥＬで処置した群の場合に観察され、損傷ＤＮＡが＞６０％減少した。図２５は、ヒトの初代線維芽細胞において、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬ、ＲＥＳ＋ＣＬＱ、またはＲＥＳ＋ＰＡＭを用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対する二剤併用の補充物の効果を示す。使用した濃度は、ＥＣ５０／ＥＣ５０、ＥＣ１０／ＥＣ９０、およびＥＣ９０／ＥＣ１０にそれぞれ等価であった。
ただし、図２６は、ＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＰＡＭを用いた三剤併用療法によって、ｄｓＤＮＡの切断量がさらに大幅に低減されることを示している。ＤＮＡの修復の最大の改善は、ＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＰＡＭで処置した群の場合に観察され、損傷ＤＮＡが＞８０％減少した。図２６は、ヒトの初代線維芽細胞において、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＰＡＭを用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対する三剤併用の補充物の効果を示している。
まとめると、このデータは、ＲＥＳを包含する二剤併用療法が、どの単剤療法と比較しても、（細胞内のＮＡＤの再生成について先に観察したように）ＤＮＡの修復を（ＥＣ１００の濃度であっても）はるかによく亢進することを明瞭に示している。該データは、三剤併用療法が、二剤併用療法より、ＤＮＡ修復の亢進において（ＥＣ１００当量の組み合わせを使っても）はるかに効果的であったことをも示している。
実施例１４：ヒト皮膚細胞（ケラチノサイト）の培養物における、ＤＮＡ修復に対する、ＵＶ照射、＋／−補充の効果。
ヒト皮膚細胞（ケラチノサイト）を、５×１０６個の密度で、Ｐｅｒｍａｎｏｘのチャンバースライド（ＮＵＮＣ）で２週間成長させた。この方法は、本分野において一般的に使用され、当業者にとって周知であるので、本明細書において使用した方法を詳細に説明する必要はない。
細胞に対して、曝露しないまま放置するか、またはＵＶＢ（〜２００ｍＪｃｍ−２）に１５分間曝露するか、いずれかの処理を行った。つぎに、１００μＭのクリオキノール（ＣＬＱ）、ピコリンアミド（ＰＡＭ）、メラトニン（ＭＥＬ）、またはリスベラトロール（ＲＥＳ）のうちのいずれかを、２４時間の単剤療法として、培地に補充した。
細胞を２４時間放置してインキュベーションし、つづいて、細胞内の残留性ＤＮＡ損傷（ｄｓＤＮＡの切断）を分析した（図２７）。残留性のｄｓＤＮＡの切断がＵＶ処理したコントロールの場合より少なければ、このことが、ＤＮＡ修復の効率を示唆している。
図２７は、ＲＥＳ、ＰＡＭ、ＣＬＱ、またはＭＥＬを用いた単剤療法によって、ｄｓＤＮＡの切断量が大幅に低減されることを示している。見かけ上の最大の改善はＭＥＬで処置した群の場合に観察され、損傷ＤＮＡが〜３０％減少した。図２７は、ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ（１００μＭ）、ＭＥＬ（１００μＭ）、ＣＬＱ（０．１μＭ）、またはＰＡＭ（１００μＭ）を用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対するモノセラピー補充の効果を示す。使用した濃度は、どの治療法についても、ＥＣ１００に等価であった。
図２８は、ＲＥＳ＋ＭＥＬ、ＲＥＳ＋ＣＬＱ、またはＲＥＳ＋ＰＡＭを用いた二剤併用療法によっても、ｄｓＤＮＡの切断量が大幅に低減されることを示している。最大の改善はＭＥＬで処置した群の場合に観察され、損傷ＤＮＡが〜４０％減少した。図２８は、ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬ、ＲＥＳ＋ＣＬＱ、またはＲＥＳ＋ＰＡＭを用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対する二剤併用の補充物の効果を示す。使用した濃度は、ＥＣ５０／ＥＣ５０、ＥＣ１０／ＥＣ９０、およびＥＣ９０／ＥＣ１０にそれぞれ等価であった。
ただし、図２９は、ＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＰＡＭを用いた三剤併用療法によって、ｄｓＤＮＡの切断量がさらに大幅に低減されることを示している。ＤＮＡの修復の最大の改善は、ＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＰＡＭで処置した群の場合に観察され、損傷ＤＮＡが〜６０％減少した。図２９は、ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＰＡＭを用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対する三剤併用の補充物の効果を示す。
まとめると、このデータは、二剤併用療法が、どの単剤療法と比較しても、（細胞内のＮＡＤの再生成について先に観察したように）ＤＮＡの修復を（ＥＣ１００の濃度であっても）はるかによく亢進することを明瞭に示している。該データは、三剤併用療法が、二剤併用療法より、ＤＮＡ修復の亢進において（ＥＣ１００当量の組み合わせをを使っても）はるかに効果的であることをも示している。
実施例１５：相乗的な組成物。
ヒトのヒトの胎児の初代アストロサイトを、Guillemin et al. J. Neurochem. (2001) 78(4): 842-853に記載されているように、培養した。細胞内のＮＡＤ＋レベルを、Grant and Kapoor J. Neurochem. (1998) 70(4): 1759-1763に記載された方法を使って測定した。Bradford Anal. Biochem. (1976) 53: 452-458に記載されたブラッドフォードのタンパク質アッセイ法を使って、細胞のホモジネート中のタンパク質の量を測定することによって、細胞内のＮＡＤ＋の濃度を、培養物間の細胞数のバラツキについて調節した。
約１×１０５個の細胞を２４ウェルの培養プレートに播種し、Guillemin et al. J. Neurochem. (2001) 78(4): pp.842-853に先に記載されたように、２４時間培養状態で保持した。選択した濃度の個々薬剤または合剤（クリオキノール１０μＭ、メラトニン５μＭ、リスベラトロール１００μＭ）を、１０μＬの部分標本において、１ｍｌの培地に添加した。２４時間後に、培地を除去して２回洗浄し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と置き替えた。つぎに、１００μＭのＨ２Ｏ２を含有する、３００μＬのＰＢＳを、それぞれの培養ウェルに添加し、５％のＣＯ２中で３７℃で１５分間放置してインキュベーションした。つぎに、ＰＢＳを、それぞれの培養物から吸引し、新鮮なホモジネート混合物と置き替えた。そして、細胞を、超音波処理し、ＮＡＤ＋（Ｈ）および総タンパク質量について、ホモジネートを分析した。
図３０は、Ｈ２Ｏ２（１００μＭ）によって誘起される酸化ストレスを１５分間加えた後、メラトニンを５μＭ（抗酸化剤）および／またはクリオキノールを１０μＭ（Ｆｅ２＋／Ｃｕ＋、キレート剤）および／またはリスベラトロールを１００μＭ（ＮＭＮＡＴ、酵素活性化薬剤）を用いた２４時間の事前処理の、細胞内のＮＡＤ＋レベルに対する効果を示す。ＮＡＤ＋レベルは、三剤併用療法によって処理された細胞において、どの１つの薬剤またはどの２つの薬剤の組み合わせを用いた処理法と比較しても、大幅に高かった。
Ｈ２Ｏ２処理
図３０は、細胞がＨ２Ｏ２で処理されると、その結果、細胞内のＮＡＤレベルが大きく減少することを示している。この結果は、ヒドロキシラジカル（フェントン反応）によって誘起されるＤＮＡ損傷、およびその結果生じる、ＮＡＤを基質として使用するＤＮＡ修復酵素ＰＡＲＰの、過度な活性化に起因する。
単剤療法
強力な抗酸化性を有するメラトニンまたはＦｅ＋＋／Ｃｕ＋のキレート剤であるクリオキノールを用いて事前処理することによって、ＮＡＤ＋の枯渇が大幅に低減される（図３０）。ただし、リスベラトロールだけを用いた事前処理では、酸化性を有する（Ｈ２Ｏ２）傷害だけの場合と比較して、細胞内のＮＡＤ＋の大きな変化を示さなかった。
二剤併用療法
クリオキノール、メラトニン、またはリスベラトロールのうちの任意の２つの薬剤を用いた事前処理では、どの単剤療法と比較しても、酸化性を有する（Ｈ２Ｏ２）傷害の後、ＮＡＤ＋レベルがかなり高い程度に保存された（図１９）。リスベラトロール(resveratol)を包含する二剤併用療法では、リスベラトロールを包含しない処理法と比較してＮＡＤ＋レベルがかなり高い程度に保存され（図１９）、相乗効果があることを示唆している。
三剤併用療法
クリオキノール＋メラトニン＋リスベラトロールの３つの薬剤すべてを用いて事前処理することによって、どの単剤療法または二剤併用療法と比較しても、酸化性を有する（Ｈ２Ｏ２）傷害の後、ＮＡＤ＋レベルがかなり高い程度に保存された（図１９）（＊ｐ＜０．０５、Ｈ２Ｏ２だけの場合に比較すると＊＊ｐ＜０．０５、二剤併用療法による処理それぞれに比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５）。
〔産業上の利用可能性〕
本発明は、被検者においてＤＮＡ修復およびＮＡＤ＋の合成を誘起するための方法および組成物に関して使用され得る。特に、本発明は、酸化ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷に関連する状態および疾病を予防および治療するための方法および医薬組成物に関して使用され得る。
ニコチンアミド（ＮＡＭ）またはニコチン酸（ＮＡ）から始まる、サルベージ経路を介したＮＡＤ＋の合成を示す図である。 トリプトファンから始まる、新生経路を介したＮＡＤ＋の合成を示す図である。 培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおける、細胞内のＮＡＤ＋レベルに対する、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤１−ＭＴの効果を示すグラフである。ヒトの胎児のアストロサイトを、１−ＭＴだけ、または１−ＭＴ／Ｌ−トリプトファン（ｌ−Ｔｒｙｐ）と１−ＭＴ／ニコチン酸（Ｎｉｃ ａ）との組み合わせを用いて処理した。コントロールに比較すると＊ｐ＜０．０５、１−ＭＴだけを用いた処理に比較すると＊＊ｐ＜０．０５、Ｌ−ｔｒｙｐおよび１−ＭＴを用いて処理した細胞に比較すると＊＊＊＊ｐ＜０．０５であった。 培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおける、ＰＡＲＰ活性に対する、異なる濃度の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の効果を示すグラフである。Ｈ２Ｏ２を使用しなかった場合に比較するとαｐ＜０．０５、１０μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較するとβｐ＜０．０５、２０μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較するとχｐ＜０．０５、５０μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較するとδｐ＜０．０５であった。 培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおける、細胞内のＮＡＤ＋に対する、異なる濃度の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の効果を示すグラフである。０μＭのＨ２Ｏ２コントロールに比較すると＊ｐ＜０．０５、５０μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較すると＊＊ｐ＜０．０５、１００μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５であった。 異なる濃度の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）に曝露された後の、培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおける、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を示すグラフである。０μＭのＨ２Ｏ２コントロールに比較すると＊ｐ＜０．０５、１０μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較すると＊＊ｐ＜０．０５、５０μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５、１００μＭのＨ２Ｏ２を使用した場合に比較するとΨ＜０．０５であった。 培養されたヒトの胎児のアストロサイトにおける、Ｈ２Ｏ２によって媒介されるＮＡＤ＋の枯渇に対する、ケルセチンの効果を示すグラフである。＊ｐ＜０．０５、また、Ｈ２Ｏ２だけを使用した場合に比較すると＊＊ｐ＜０．００５であった。 メラトニンを用いた処理をした後の、ヒトの培養神経芽細胞腫細胞における、細胞内のＮＡＤ＋レベルに対する、Ｈ２Ｏ２の効果を示すグラフである。Ｃｔｒｌに比較すると＊ｐ＜０．０５、１００μＭのＨ２０２の場合と２０μＭのＭｅｌ ＋ Ｈ２０２の場合とを比較すると＊＊ｐ＜０．０５、２μＭのＭｅｌ ＋ Ｈ２０２ の場合と２００μＭのＭｅｌ ＋ Ｈ２０２の場合とを比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５であった。 ビタミンＥを用いて処理した後の、ヒトの培養神経芽細胞腫細胞における、細胞内のＮＡＤ＋レベルに対する、Ｈ２Ｏ２の効果を示すグラフである。Ｃｔｒｌに比較すると＊ｐ＜０．０５であった。 アスコルビン酸および第一鉄の存在下でＨ２Ｏ２を用いて処理した後の、ヒトの神経芽細胞腫細胞における、細胞内のＮＡＤ濃度に対する、親油性キレート剤であるクリオキノール（ＣＱ）の用量反応の効果を示すグラフである。Ｃｔｒｌに比較すると＊ｐ＜０．０５、Ｈ２０２ ＋ Ｆｅの場合に比較すると＊＊ｐ＜０．０５、１０μＭのＣＱ ＋ Ｈ２０２ ＋ Ｆｅの場合に比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５であった。 Ｈ２Ｏ２によって媒介されるＮＡＤ＋の枯渇に対する、リスベラトロールの効果を示すグラフである。リスベラトロールは、細胞内のＮＡＤ＋を、コントロール（＊ｐ＜０．０５）を超えて大幅に増加させた。ヒトの初代アストロサイトにおいてＨ２Ｏ２だけを使用した場合に比較すると＊＊ｐ＜０．０５であった。 新生経路を介した、リスベラトロールによって誘起されるＮＡＤ＋の合成に対する、キヌレニン経路阻害剤１−ＭＴの効果を示すグラフである。 ＮＡＤ＋の合成に対する、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）阻害剤であるタンニン酸の効果を示す、用量反応曲線のグラフである。ＩＣは抑制濃度を示す。 リスベラトロールによって媒介されるＮＡＤ＋の合成に対する、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）阻害剤であるタンニン酸の効果を示すグラフである。リスベラトロールを用いて処理しただけの場合に比較すると＊ｐ＜０．０５、コントロールに比較すると＊＊ｐ＜０．０５であった。 ヒトの脳のアストロサイトにおける、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）活性に対する、リスベラトロールの効果を示すグラフである。 ヒトの脳のアストロサイトにおける、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）活性に対する、各種濃度のリスベラトロールの効果を示す表である。 酸化ストレスがＤＮＡ損傷を誘起する、共通のメカニズムを示す図である。 酸化促進剤（Ｈ２Ｏ２）および鉄（Ｆｅ）に曝露した後、キレート剤（クリオキノール−ＣＱ）および抗酸化剤（ビタミンＥ）を用いて処理した神経芽細胞腫細胞における、ＮＡＤ＋生成を示すグラフである。 図１９ａ〜図１９ｄは、細胞内のＮＡＤ濃度、＋／−ＵＶ曝露、＋／−補充をグラフに表したものである。図１９ｅ〜図１９ｈは、上清のＬＤＨの活性、＋／−ＵＶ曝露、＋／−補充をグラフに表したものである。 ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから２４時間後のＮＡＤの回復時にＲＥＳ、＋／−ＰＡＭ、＋／−ＣＬＱ、＋／−ＭＥＬを用いて処理した後の、ＮＡＤ濃度に対する、二剤併用の補充物の効果を示すグラフである。 ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬまたはＲＥＳ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＰＡＭを用いて２４時間処理した後の、ＬＤＨの放出（細胞死）に対する、二剤併用の補充物の効果を示すグラフである。 ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから２４時間後のＮＡＤの回復時に、ＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＰＡＭを用いて処理した後の、ＮＡＤ濃度に対する、三剤併用の補充物（選択された組み合わせ）の効果を示すグラフである。 ケラチノサイトの免疫細胞化学を可視化したものであり、補充をせずにＵＶ処理された細胞のＤＮＡ損傷（中央カラム）が、強く染色していることを示している。 ケラチノサイトの、ＩＣＣで染色された各部分について、蛍光強度の半定量を示すグラフである。 線維芽細胞の免疫細胞化学を可視化したものであり、補充をせずにＵＶ処理された細胞のＤＮＡ損傷（中央カラム）が、強く染色していることを示している。 線維芽細胞の、ＩＣＣで染色された各部分について、蛍光強度の半定量を示すグラフである。 ヒトの初代線維芽細胞において、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ（１００μＭ）またはＭＥＬ（１００μＭ）またはＣＬＱ（０．１μＭ）またはＰＡＭ（１００μＭ）を用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対するモノセラピー補充の効果を示すグラフである。 ヒトの初代線維芽細胞において、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬ、ＲＥＳ＋ＣＬＱ、ＲＥＳ＋ＰＡＭを用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対する二剤併用療法の補充物の効果を示すグラフである。使用した濃度は、ＥＣ５０／ＥＣ５０、ＥＣ１０／ＥＣ９０、ＥＣ９０／ＥＣ１０にそれぞれ等価であった。 ヒトの初代線維芽細胞において、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＰＡＭを用いて処理２４時間した後の、ＤＮＡ修復に対する三剤併用療法の補充物の効果を示すグラフである。 ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ（１００μＭ）またはＭＥＬ（１００μＭ）またはＣＬＱ（０．１μＭ）またはＰＡＭ（１００μＭ）を用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対するモノセラピー補充の効果を示すグラフである。 ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬ、ＲＥＳ＋ＣＬＱ、ＲＥＳ＋ＰＡＭを用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対する二剤併用療法の補充物の効果を示すグラフである。使用した濃度は、ＥＣ５０／ＥＣ５０、ＥＣ１０／ＥＣ９０、ＥＣ９０／ＥＣ１０にそれぞれ等価であった。 ヒトの初代ケラチノサイトにおいて、ＵＶＢに曝露してから、ＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＣＬＱまたはＲＥＳ＋ＭＥＬ＋ＰＡＭを用いて２４時間処理した後の、ＤＮＡ修復に対する三剤併用療法の補充物の効果を示すグラフである。 Ｈ２Ｏ２によって誘起される酸化ストレスを１５分間与えた後、抗酸化剤（メラトニン）および／またはクリオキノール）、キレート剤および／またはリスベラトロールを用いて２４時間かけて行った事前処理の、ヒトの胎児のアストロサイトにおける細胞内のＮＡＤレベルに対する効果を示すグラフである。＊ｐ＜０．０５、Ｈ２Ｏ２だけを使用した場合に比較すると＊＊ｐ＜０．０５、二剤併用療法によるそれぞれの処理に比較すると＊＊＊ｐ＜０．０５であった。

Claims (42)

  1. 被検者においてＮＡＤ＋の合成を誘起する方法であって、
    治療有効量のリスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を、被検者に対して投与することを包含する方法。
  2. ＮＡＤ＋の合成の上記誘起は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）酵素の活性を増加させる、請求項１に記載の方法。
  3. ＮＡＤ＋の合成の上記誘起は、サーチュイン酵素の活性を増加させる、請求項１または２に記載の方法。
  4. 上記ＰＡＲＰ酵素は、ＰＡＲＰ−１またはＰＡＲＰ−２である、請求項２または３に記載の方法。
  5. 上記サーチュイン酵素は、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、およびＳＩＲＴ７からなる群より選択される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 酸化ストレスに関連する疾病または状態を防止または治療する方法であって、
    治療有効量のリスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を、被検者に対して投与することを包含し、
    上記投与は、被検者においてＮＡＤ＋の合成を誘起する方法。
  7. ＤＮＡ損傷に関連する疾病または状態を防止または治療する方法であって、
    治療有効量のリスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を、被検者に対して投与することを包含する方法。
  8. 上記疾病または状態は神経変性疾患である、請求項６または７に記載の方法。
  9. 上記神経変性疾患はアルツハイマー病またはパーキンソン病である、請求項８に記載の方法。
  10. 上記疾病または状態は、皮膚の加速的な老化に関連する、請求項６または７に記載の方法。
  11. 上記疾病または状態は、ＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷である、請求項６または７に記載の方法。
  12. 上記皮膚細胞は、ケラチノサイトおよび線維芽細胞である、請求項１１に記載の方法。
  13. ＤＮＡ損傷に関連する上記疾病または状態は、癌である、請求項７または１０に記載の方法。
  14. 上記疾病または状態は、紫外光に対する曝露、電離放射線、化学薬品に対する曝露、感染、炎症、ミトコンドリアの効率の低下、またはこれらの組み合わせによってもたらされる、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  15. 上記リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体は、トランス異性体である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 機能的に同等な上記類似体は、リスベラトロールのヒドロキシル化類似体、リスベラトロールのメトキシル化類似体、シス−リスベラトロールグルコシド（シス−ｐｉｃｅｉｄ）、およびトランス−リスベラトロール−３−Ｏ−β−グルコシド（トランス−ｐｉｃｅｉｄ）からなる群より選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  17. 上記治療有効量のリスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体は、三剤併用療法として投与される、請求項１に記載の方法。
  18. ＮＡＤ＋の合成を増加させるために使用される医薬組成物であって、
    治療有効量のリスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を包含する医薬組成物。
  19. 酸化ストレスに関連する疾病または状態を予防または治療するために使用される医薬組成物であって、
    治療有効量のリスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を包含し、
    被検者においてＮＡＤ＋の合成を誘起する医薬組成物。
  20. ＤＮＡ損傷に関連する疾病または状態を予防または治療するために使用される医薬組成物であって、
    治療有効量のリスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を含み、
    被検者においてＮＡＤ＋の合成を誘起する医薬組成物。
  21. 上記疾病または状態は、ＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷である、請求項２０に記載の方法。
  22. 上記皮膚細胞は、ケラチノサイトおよび線維芽細胞である、請求項２１に記載の方法。
  23. 酸化ストレスに関連する疾病または状態を予防または治療するために使用される医薬組成物であって、
    ＮＡＤ＋の合成を誘起することができる少なくとも１つの薬剤と、有効量の、下記の（ａ）および（ｂ）のうち１つまたは両方との相乗的な組み合わせを含み、
    （ａ）は、少なくとも１つの抗酸化剤であり、
    （ｂ）は、少なくとも１つのキレート薬である医薬組成物。
  24. ＮＡＤ＋の合成を誘起することができる少なくとも１つの上記薬剤が、リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体である、請求項２３に記載の医薬組成物。
  25. 上記抗酸化剤は、メラトニン、ビタミンＥ、ビタミンＣ、メチオニン、タウリン、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、およびグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＸ）、Ｌ−エルゴチオネインＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、ビタミンＡ、βカロチン、レチノール、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン−３−没食子酸、フラベノイド、Ｌ−エルゴチオネイン、イデベノン、およびセレンからなる群より選択される、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。
  26. 上記キレート薬が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ベルサンテ二ナトリウムカルシウム）（ＣａＮａ２−ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、αリポ酸（ＡＬＡ）、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）、ジメルカプロール（ＢＡＬ）、デフェロキサミン、Ｄ−ペニシラミン、ジメルカプロール、アミノフェノキシエタン−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）デファラシロックス、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、２−ピリジンカルボン酸（ピコリン酸）、２，３−ピリジンジカルボン酸（キノリン酸）、２−アミノ安息香酸（アントラニル酸）、キヌレン酸、キサンツレン酸、および８−ヒドロキシキノリン（およびこれらの機能性誘導体）からなる群より選択される、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  27. 酸化ストレスに関連する疾病または状態を治療するための方法であって、
    ＮＡＤ＋の合成を誘起することができる少なくとも１つの薬剤と、有効量の、下記の（ａ）および（ｂ）のうち１つまたは両方との相乗的な組み合わせを含有する、治療有効量の医薬組成物を、被検者に対して投与することを包含し、
    （ａ）は、少なくとも１つの抗酸化剤であり、
    （ｂ）は、少なくとも１つのキレート薬である方法。
  28. ＤＮＡ損傷に関連する疾病または状態を治療するための方法であって、
    ＮＡＤ＋の合成を誘起することができる少なくとも１つの薬剤と、有効量の、下記の（ａ）および（ｂ）のうち１つまたは両方との相乗的な組み合わせを含有する、治療有効量の医薬組成物を、被検者に対して投与することを包含し、
    （ａ）は、少なくとも１つの抗酸化剤であり、
    （ｂ）は、少なくとも１つのキレート薬である方法。
  29. 上記疾病または状態は、ＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷である、請求項２８に記載の方法。
  30. 上記皮膚細胞は、ケラチノサイトおよび線維芽細胞である、請求項２９に記載の方法。
  31. ＮＡＤ＋の合成を誘起することができる少なくとも１つの上記薬剤が、リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体である、請求項２７または２８に記載の方法。
  32. 上記リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体が、三剤併用療法として、治療有効量で投与される、請求項３１に記載の方法。
  33. 上記抗酸化剤が、メラトニン、ビタミンＥ、ビタミンＣ、メチオニン、タウリン、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、およびグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＸ）、Ｌ−エルゴチオネインＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、ビタミンＡ、βカロチン、レチノール、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン−３−没食子酸、フラベノイド、Ｌ−エルゴチオネイン、イデベノン、およびセレンからなる群より選択される、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
  34. 上記キレート薬が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ベルサンテ二ナトリウムカルシウム）（ＣａＮａ２−ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、αリポ酸（ＡＬＡ）、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）、ジメルカプロール（ＢＡＬ）、デフェロキサミン、Ｄ−ペニシラミン、ジメルカプロール、アミノフェノキシエタン−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）デファラシロックス、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）２−ピリジンカルボン酸（ピコリン酸）、２，３−ピリジンジカルボン酸（キノリン酸）、２−アミノ安息香酸（アントラニル酸）、キヌレン酸、キサンツレン酸、および８−ヒドロキシキノリン（およびこれらの機能性誘導体）からなる群より選択される、請求項２７〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  35. 被検者においてＮＡＤ＋の合成を増加させるためのキットであって、
    リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を包含するキット。
  36. 被検者において酸化ストレスに関連する疾病または状態を治療するためのキットであって、
    リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を包含するキット。
  37. 被検者においてＤＮＡ損傷に関連する疾病または状態を治療するためのキットであって、
    リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体を包含するキット。
  38. 上記リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体が、三剤併用療法として、治療有効量で投与される、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の疾病または状態を治療するためのキット。
  39. 上記疾病または状態が、ＵＶによって誘起される皮膚細胞のＤＮＡ損傷である、請求項３７に記載の方法。
  40. 上記皮膚細胞が、ケラチノサイトおよび線維芽細胞である、請求項３８に記載の方法。
  41. 上記リスベラトロールまたは機能的に同等なリスベラトロールの類似体もしくは誘導体が、トランス異性体である、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載のキット。
  42. 機能的に同等な上記類似体が、リスベラトロールのヒドロキシル化類似体、リスベラトロールのメトキシル化類似体、シス−リスベラトロールグルコシド（シス−ｐｉｃｅｉｄ）、およびトランス−リスベラトロール−３−Ｏ−β−グルコシド（トランス−ｐｉｃｅｉｄ）からなる群より選択される、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載のキット。
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