JP2011511776A5

JP2011511776A5 -

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Publication number: JP2011511776A5
Application number: JP2010544836A
Authority: JP
Filing date: 2009-01-30
Publication date: 2011-12-15

Description

動物において、同じことはもはや当てはまらない。血中に注射される場合、粒子は吸収され、微生物粒子を貪食する細胞により消化される。組織又は腫瘍に注射される場合、それらのサイズ（１００〜１０００ｎｍ）は、注射部位を超えて位置する細胞に向かう、それらの拡散を防止する。それにもかかわらず、最近の研究（非特許文献３〜４）は、粒子をポリエチレングリコール残基で覆うことにより（ステルス粒子）、細胞結合を全体的に阻害することなく、血液の食細胞を回避することが可能であることを示す。

（式中、Ｒ^７及びＲ^８は同一であっても異なっていてもよく、低級アルキレン基を表わし、(aa)_n2はアルギニン、リジン、オルニチン、ヒスチジン又はジアミノプロピオン酸のようなカチオン性側鎖を有する、天然のアミノ酸を含むペプチドであり、ｎ２＝２〜２０である）に相当する］
に相当するカチオン性siRNAのために行われる。

精製：オリゴヌクレオチドは、Poly-Pak II（登録商標）カラム（Glen Research/Eurogentec）を用い、供給業者により与えられる使用説明書に従って精製された。最終的な溶出は、アセトニトリル／水の混合液（５０／５０）を用いて行われたが、２０および３０個のスペルミンを含むオリゴヌクレオチドについては除かれ、これは、１／２０に希釈されたアセトニトリル／２８％アンモニア水（２０／８０）の使用を必要とした。オリゴヌクレオチドを含むフラクションは、それらの１滴を蛍光薄層シリカプレート上に置くことによって明らかにされ、直ぐに混合され、凍結乾燥させられ、溶媒が除去され、かつ、分解が回避された。白色粉末がこのようにして得られた。

それぞれ０、１、３及び５個のスペルミンを含む、全体として負に荷電したオリゴヌクレオチドを、０〜１００％の範囲の直線的な勾配のＢを有する陰イオン交換ＨＰＬＣ（Macherey Nagel SAX 1000-8）により１５分間かけて分析した（Ａ：ＫＨ_２ＰＯ_４２０ｍＭ、ＡｃＣＮ２０％；Ｂ：Ａ、１ＭＮａＣｌ）。ＨＰＬＣプロファイルを図２に示す。

各サンプル１０μＬを９６ウェルのプレート上に沈着させた。ルミノメータ（Mediators PhL又はBerthold Centro LB690）を用いてプレートを分析した。各サンプルについて、ルシフェラーゼタンパク質により触媒される反応により放射される光を測定し、１０秒の期間で規格化した。

− ルシフェラーゼGL3の配列のセンス(ss)及びアンチセンス(as)鎖から形成されるsiRNA＜ＧＬ３ｓｓ＞＜ＧＬ３ａｓ＞は活性ではない；
− この同じsiRNAは、それがカチオン性脂質INTERFERinによりベクター化させられる場合、ルシフェラーゼの発現を失わせる；
− 分子内への１〜３個のスペルミンの導入は、ルシフェラーゼの発現にほとんど効果がない；
− siRNAへの２０〜３０個のスペルミンの導入は、INTERFERinベクターを用いて得られる消退に匹敵する消退を誘導する；
− ３０個のスペルミンを有するsiRNAの有効性は、脂質媒体と組み合わせて更に約１０倍に上昇する。

− INTERFERinによりベクター化させられたスペルミンを有しないsiRNAのコントロールは１ｎＭで効果を示す；
− 細胞が、グラフトされたスペルミン及びINTERFERinを有しないsiRNAとインキュベートされる場合に、ルシフェラーゼGL3の発現は濃度に関係なく低下しない；
− ２０及び３０個のスペルミンを含むsiRNAの存在下、ルシフェラーゼの濃度依存は減少する。

ネガティブコントロール（細胞単独の１００％発現）及びポジティブコントロール（INTERFERinによりベクター化させられた配列GL3のsiRNAの存在下におけるルシフェラーゼGL3の２７％の発現）の後に、siRNA＜ＧＬ３ｓｓ＞＜ＧＬＳ３ａｓ＞Ｓ_１（この時、アンチセンス鎖の５’位にグラフトされたスペルミンを含む）が試験された。