JP2011506268A - 薬物含有ナノ粒子 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
薬剤溶出ステント(Drug eluting stent; DES)を含めた冠動脈に対するインターベンション(Percutaneous coronary intervention; PCI)技術の発達に伴い、従来問題となっていたPCI後再狭窄は減少した。しかし、現在世界で用いられているDESは免疫抑制剤(例えばシロリムス(sirolimus))および抗がん剤(例えばパクリタキセル(paclitaxel))を用いたものであり、従来のベアメタルステント(BMS)と比べてDESは再狭窄を抑制できても致死的な病態である急性冠症候群(Acute coronary syndrome; ACS)の長期予後における頻度はBMSより高いと報告されており、生命予後も改善しないことが明らかになっている。
・内皮細胞におけるICAM-1、VCAM-1などの接着因子の発現抑制など内皮機能の保護改善
・平滑筋細胞における遊走、増殖、MMP(matrix metalloproteinase)産生抑制
・単球の分化、炎症性サイトカイン産生抑制
・マクロファージにおけるABCA1を介したコレステロール逆輸送の促進などの直接作用により抗動脈硬化作用を発揮すると考えられている。
PPARγアゴニストを不安定プラークに選択的に送達することができれば、プラークの破綻とそれに引き続く急性冠症候群を予防し生命予後を改善することが期待される。
(1)ピオグリタゾンまたはその塩および生体適合性高分子を含有するナノ粒子;
(2)生体適合性高分子が乳酸・グリコール酸共重合体である前記(1)記載のナノ粒子;
(3)ピオグリタゾンまたはその塩の含有量がピオグリタゾンとして0.1〜10重量%である前記(1)記載のナノ粒子;
(4)動脈硬化性疾患の予防または治療のための前記(1)記載のナノ粒子;
(5)非経口投与用である前記(4)記載のナノ粒子;
(6)前記(1)記載のナノ粒子を含む動脈硬化性疾患の予防または治療のための医薬製剤;
(7)前記(1)記載のナノ粒子を含む動脈硬化性疾患の予防または治療のための非経口投与用医薬製剤;
(8)前記(1)記載のナノ粒子を担持したステント;
(9)前記(1)記載のナノ粒子を担持した動脈硬化性疾患の予防または治療のためのステント;
(10)哺乳動物に、前記(1)記載のナノ粒子の有効量を投与することを特徴とする当該哺乳動物における動脈硬化性疾患の予防または治療方法;
(11)動脈硬化性疾患の予防または治療用医薬を製造するための、前記(1)記載のナノ粒子の使用;
(12)哺乳動物の血管内に、前記(8)記載のステントを留置することを特徴とする当該哺乳動物における動脈硬化性疾患の予防または治療方法;
(13)動脈硬化性疾患の予防または治療用のステントを製造するための、前記(1)記載のナノ粒子の使用等に関する。
(14)カチオン性高分子をさらに含有する前記(1)記載のナノ粒子;
(15)カチオン性高分子がキトサンである前記(14)記載のナノ粒子;
(16)前記(14)記載のナノ粒子を担持したステント;
(17)前記(14)記載のナノ粒子を担持した動脈硬化性疾患の予防または治療のためのステント等に関する。
本発明のナノ粒子は、ピオグリタゾンまたはその塩と生体適合性高分子を含有し、ナノ単位の大きさの粒子(ナノスフェア)としたものである。
ピオグリタゾン含有PLGAナノ粒子の調製
0.5重量%ポリビニルアルコール(日本合成化学製;ゴーセノールEG-05(登録商標))水溶液を調製し、貧溶媒とした。また、乳酸・グリコール酸共重合体(和光純薬工業製;PLGA7520、乳酸/グリコール酸=75/25、重量平均分子量20,000)(1 g)をアセトン(40 mL)に溶解させ、これにピオグリタゾン塩酸塩(40 mg)を溶解したメタノール(20 mL)を添加混合し、ポリマー溶液とした。この溶液を先の貧溶媒中に40℃、400 rpmで攪拌下、4 mL/分で滴下し、ピオグリタゾン含有PLGAナノ粒子の懸濁液を得た。アセトンとメタノールを減圧下にて1.5時間留去した後、凍結乾燥してピオグリタゾン含有PLGAナノ粒子粉末を得た。
得られた粉末の水への再分散性は良好であり、ナノ粒子粉末を精製水中に再分散させた際の平均粒子径を動的光散乱法により測定したところ、314 nmであった。ナノ粒子粉末中のピオグリタゾンの含有量は2.37重量%であった。
ApoE欠損マウスにおけるプラーク破綻の抑制効果
実施例1で得られたピオグリタゾン含有ナノ粒子を用いて、ApoE欠損マウスにおけるプラーク破綻の抑制効果を試験した。
オスのApoE欠損マウス(C57Bl/6J background)をJackson研究所(米国)より購入し使用した。飲水は自由とし、試験開始までは普通食を与え飼育した。
ApoE欠損マウスに16週齢より高脂肪食(21%ラード、0.15%コレステロール含有)を与え、20週齢よりアンジオテンシンII(1.9 mg/kg/日)の腹腔内投与を開始した。
対照群には、薬物を含有しないPLGAナノ粒子(8.75 mg/マウス/週)を投与した。
ピオグリタゾン含有ナノ粒子群には、実施例1で得られたピオグリタゾン含有PLGAナノ粒子(8.75 mg/マウス/週)を投与した(ピオグリタゾンとして210 μg、7 mg/kg/週相当を含有)。
各ナノ粒子(8.75 mg)をリン酸緩衝生理食塩水(0.5 mL)に懸濁して、20週齢から23週齢まで週1回、計4回、静脈内投与した。
アンジオテンシンIIを28日間投与後、心臓よりリン酸緩衝生理食塩水、中性緩衝ホルマリンにて洗浄、固定した後、右腕頭動脈を摘出した。パラフィン切片作成後、Elastica van Gieson染色を行い、プラーク破綻、線維性被膜(fibrous cap)の厚さの評価を行った。
結果を表1に示す。
THP-1による単球走化因子(MCP-1)産生に対する抑制効果
(1)試験方法
ヒト単球細胞株THP-1(ヒューマンサイエンス振興財団ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手)を0.5%胎児ウシ血清、1%ペニシリンを含有するRPMI培地で5×105 cells/well/500 μLに調整し、48ウェルプレートに播いた(0日目)。1日目にピオグリタゾン塩酸塩、または実施例1で得られたピオグリタゾン含有PLGAナノ粒子(ピオグリタゾンとしての濃度;1.0、10 μM)を添加し、2日目にLPS 1 μg/mLを加え刺激を行った。
3日目に上清を回収し、ヒトMCP-1 ELISA kit(BIOSOURCE社)を用いMCP-1の定量を行った。
ピオグリタゾン含有ナノ粒子を用いることにより、より少量のピオグリタゾンの投与でMCP-1産生抑制効果が得られることがわかった。
実施例1と同様の方法で蛍光色素であるフルオレセインイソチオシアネート(FITC)含有ナノ粒子を作成し、ApoE欠損マウスへの静脈注射後の体内動態を試験した。
実施例1に記載の方法において、ピオグリタゾン塩酸塩に代えてFITC (100 mg)を用いた以外は、同様に処理することにより、FITC含有ナノ粒子粉末を得た。
オスのApoE欠損マウス(C57Bl/6J background)をJackson研究所(米国)より購入し使用した。飲水は自由とし、試験開始までは普通食を与え飼育した。
ApoE欠損マウスに16週齢より高脂肪食(21%ラード、0.15%コレステロール含有)を与え、20週齢よりアンジオテンシンII(1.9 mg/kg/日)の腹腔内投与を開始した。
(1)で得られたFITC含有ナノ粒子(8.75 mg)をリン酸緩衝生理食塩水(0.5 mL)に懸濁し、21週齢時にマウスに静脈内投与した。2時間後に静脈血を採取、赤血球溶血後の白血球を、TexasRedで標識した抗CD11bまたは抗Gr-1抗体で染色し、フローサイトメトリーで検討した。また、48時間後に右腕頭動脈を摘出し、パラフィン切片作成後、HE染色およびFITC免疫染色により動脈硬化プラークにおけるFITCを取り込んだマクロファージの同定を行った。
FITC含有ナノ粒子をマウスへ静脈注射したところ、2時間後の末梢血では、CD11b(+)Gr-1(-)である単球に選択的にFITCの取り込みを認めた。また、48時間後に右腕頭動脈を摘出し組織学的検討を行ったところ、腕頭動脈・動脈硬化巣内のマクロファージにFITC免疫染色を認めた。
これより、本発明のナノ粒子が単球・マクロファージ選択的キャリアとなることがわかった。
ピオグリタゾン含有ナノ粒子によるマクロファージ遺伝子発現制御
実施例1で得られたピオグリタゾン含有ナノ粒子の静脈注射による、マクロファージの遺伝子発現への効果を試験した。
オスのApoE欠損マウス(C57Bl/6J background)をJackson研究所(米国)より購入し使用した。飲水は自由とし、試験開始までは普通食を与え飼育した。
ApoE欠損マウスに16週齢より高脂肪食(21%ラード、0.15%コレステロール含有)を与え、20週齢よりアンジオテンシンII(1.9 mg/kg/日)の腹腔内投与を開始した。
対照群には、薬物を含有しないPLGAナノ粒子(8.75 mg/マウス/週)を投与した。
ピオグリタゾン含有ナノ粒子群には、実施例1で得られたピオグリタゾン含有PLGAナノ粒子(8.75 mg/マウス)を投与した(ピオグリタゾンとして210μg、7 mg/kg体重相当を含有)。
各ナノ粒子(8.75 mg)をリン酸緩衝生理食塩水(0.5 mL)に懸濁して、21週齢時に静脈注射で単回投与した。
PLGAナノ粒子またはピオグリタゾン含有ナノ粒子の静脈注射と同時に、腹腔内にチオグリコレート培地(Difco社)2 mLを投与した。3日後に腹腔内マクロファージを採取し、mRNAを抽出した。RT-PCR法により、対照群およびピオグリタゾン含有ナノ粒子群マクロファージにおける各種遺伝子の発現を測定し、発現レベルを比較した。
対照群マクロファージに対してピオグリタゾン含有ナノ粒子群マクロファージで顕著に発現が亢進および抑制された遺伝子を表2に示す。ピオグリタゾン含有ナノ粒子群マクロファージでは、コレステロールの逆輸送を促進するABCA1の発現が亢進する一方、単球走化因子であるMCP-1やRANTES等のCCケモカインの発現が抑制されていた。
マウスの血管傷害モデルおける新生内膜形成の抑制効果
実施例1で得られたピオグリタゾン含有ナノ粒子を用いて、マウス血管傷害モデルにおける新生内膜形成の抑制効果を試験した。
オスの野生型マウス(C57Bl/6J)を日本クレアより購入し使用した。飲水および摂餌は自由とし、試験終了まで普通食を与え飼育した。
8-10週齢の野生型マウスをペントバルビタールで深麻酔し、右大腿動脈を露出させ6-0絹糸で血管の両端を結紮し、血流を一時的に遮断した。分枝を切開しワイヤー(直径0.15インチ、No.C-SF-15-15,COOK)を腸骨動脈側に5 mm挿入し、血管に傷害を与えた。
ワイヤー傷害後、実験動物を溶媒対照群およびピオグリタゾン含有ナノ粒子群に割り付けた。ワイヤーを抜去し、分枝から溶媒、ピオグリタゾン含有PLGAナノ粒子溶液それぞれ100 μLを5分間かけ動脈内投与した。
溶媒対照群には、溶媒(リン酸緩衝生理食塩水)のみを単回投与した。
ピオグリタゾン含有ナノ粒子群には、実施例1で得られたピオグリタゾン含有PLGAナノ粒子(ナノ粒子として0.5 mg/マウス相当、ピオグリタゾン濃度として0.015 mg/マウス(0.5 mg/kg体重)相当を含有)を単回投与した。投与後、分枝部分を結紮し、血流を再開させ皮膚を縫合した。
さらにワイヤー傷害直後、ピオグリタゾン塩酸塩(ピオグリタゾンとして0.15 mg/マウス(5 mg/kg体重))の高用量(臨床用量の10倍量)単回腹腔内投与群を設けた。
血管傷害28日後、心臓よりリン酸緩衝生理食塩水、中性緩衝ホルマリンにて洗浄、固定した後、右大腿動脈を摘出した。パラフィン切片作製後、Elastica van Gieson染色および増殖細胞核抗原(PCNA)に対する免疫組織化学的染色を行い、内膜・中膜比、新生内膜面積、中膜面積および細胞増殖の評価を行った。免疫組織化学的染色は全細胞数に対する増殖細胞の割合をカウントし算出した。
結果を表3および表4に示す。ピオグリタゾン含有ナノ粒子の投与は、溶媒対照群に対して内膜・中膜比、新生内膜面積の顕著な減少を認めた。また、ピオグリタゾン含有ナノ粒子は、ピオグリタゾン塩酸塩よりも強力に平滑筋細胞の増殖を抑制した。新生内膜形成は中膜から内膜への平滑筋細胞の遊走と増殖により進展することから、この増殖抑制作用がピオグリタゾン含有ナノ粒子による新生内膜形成の抑制に寄与することが示された。
ナノ粒子の培養ラット冠動脈平滑筋細胞への早期送達、長期停留効果
試験例3(1)で作成したFITC含有ナノ粒子を用いて、培養ラット冠動脈平滑筋細胞への送達性、停留性試験を行った。
ラット大動脈平滑筋細胞(TOYOBOより入手)を、10%胎児ウシ血清を含有するDMEM培地(Sigma)でサブコンフルエントの細胞密度になるようにスライドグラスチャンバー上に播いた(0日目)。2日目、FITCまたはFITC含有ナノ粒子(ナノ粒子濃度として0.5 mg/mL)を含有する培地に交換した。
培地交換後、5分後および24時間後にそれぞれメタノールを用いて固定し、Propidium iodide (Vector laboratories, Inc.)を用いて核染色を行った後、蛍光顕微鏡を用いて観察を行った。視野ごとの総核数および蛍光陽性細胞数をカウントし、蛍光陽性細胞の割合を算出した。
FITCのみを含有する培地を添加した細胞では陽性細胞はまったく認められなかった(0%)が、FITC含有ナノ粒子を含有する培地を添加した細胞では5分間で90%以上の蛍光陽性細胞が認められ、24時間後でも同様に90%以上の蛍光陽性細胞が認められた。即ち、FITC含有ナノ粒子は培養ラット大動脈平滑筋細胞に、5分という極めて短時間に高率に送達され、しかも24時間以上の長期にわたり安定して停留する特性を有することが明らかになった。従って、実施例1で作成したピオグリタゾン含有ナノ粒子も、同様に冠動脈平滑筋細胞に早期に送達し、かつ長期にわたって停留する効果を有することが示唆された。
培養ヒト冠動脈平滑筋細胞増殖の抑制効果
実施例1で得られたピオグリタゾン含有ナノ粒子を用いて、培養ヒト冠動脈平滑筋細胞の増殖抑制効果を試験した。
ヒト冠動脈平滑筋細胞(Lonza Walkersville Inc., Walkersville, MD, USAより入手)を5%胎児ウシ血清、1%ペニシリンを含有するSmBM培地(Lonza)で5×103 cells/well/500 μLに調整し、48ウェルプレートに播いた(0日目)。2日目に培地を交換し、0.1%胎児ウシ血清、1%ペニシリンを含有するSmBM培地で2日間、飢餓状態にした。3日目に溶媒(リン酸緩衝生理食塩水)のみ、または実施例1で得られたピオグリタゾン含有PLGAナノ粒子(ピオグリタゾンとしての濃度;10 μM)を添加し、10%胎児ウシ血清、1%ペニシリンを含有するSmBM培地中で培養を3日間行った。10%胎児ウシ血清がヒト冠動脈平滑筋の細胞増殖活性を有することは広く知られており、本試験では増殖刺激剤としてこれを用いた。
培養開始から7日目にメタノールで固定し、Diff-Quick 染色液(Sysmex Corporationより購入)で細胞を染色し、視野あたりの細胞数をカウントした。
結果を表5に示す。ピオグリタゾン含有ナノ粒子群では10%ウシ胎児血清刺激による平滑筋細胞増殖を顕著に抑制した。
(1)ピオグリタゾン含有キトサン修飾PLGAナノ粒子の調製
PLGA(和光純薬工業製;PLGA7520、乳酸/グリコール酸=75/25、重量平均分子量20,000)(2 g)をアセトン(20 mL)に溶解した後、メタノール(10 mL)に溶解したピオグリタゾン塩酸塩(100 mg)を添加してポリマー溶液とした。これを、40℃で攪拌している2wt%のポリビニルアルコール(PVA、クラレ製)水溶液(50 mL)に、4 mL/minの一定速度で滴下した。この時、アセトン、メタノールおよび水の相互拡散によるエマルション液滴界面の乱れによる自己乳化作用によって、ナノメートルサイズのエマルション滴が調製される。その後、アセトンとメタノールを留去して得られたPLGAナノ粒子懸濁液を遠心分離(遠心加速度41000G、-20℃、20分)してPLGAナノ粒子の沈殿を回収し、精製水中に再懸濁させ、PLGA表面に吸着しなかった余剰なPVAを除去した。ここに0.02wt%キトサン(片倉チッカリン製)水溶液(50 mL)を添加し、1時間攪拌混合した後、−45℃で凍結乾燥してピオグリタゾン含有キトサン修飾PLGAナノ粒子を粉末化した。
(1)で得られたピオグリタゾン含有キトサン修飾PLGAナノ粒子を精製水中に懸濁させ、ナノ粒子(0.25wt%)懸濁液を作製した。長さ15 mmステンレス(SUS316L)製マルチリンク様ステントをステント加工前の内径1.1 mm, 外径1.3 mmのステンレス製パイプに通し、陰極とした。陽極には炭素棒を配した。ナノ粒子懸濁液を上面が開口した内径8.5 mm、外径9.5 mm、高さ23 mmの電解浴に満たし、ステント本体が装着されたステンレス製パイプをステント本体部分がナノ粒子懸濁液に完全に浸漬し、かつステンレス製パイプの一部が液面から突出するように電解浴に起立させた。そして、炭素棒が陽極、ステンレス製パイプが陰極となるように外部電源発生装置(DC power supply, Nippon Stabilizer Industry Co., Ltd.)および電流計を直列に接続し、電流5 mA定電圧を維持するよう電圧を調整し、10分間通電した。ステント本体とステンレス製パイプは同一の材質で製造されており導電性が等しいため、ステント本体に均一に通電することが可能である。通電終了後、ステント本体をステンレス製パイプから取り外して乾燥させた。
霊長類ステント狭窄モデルにおける再狭窄の抑制効果
実施例2で得られたピオグリタゾン含有ナノ粒子溶出ステントを用いて、霊長類ステント狭窄モデルにおける再狭窄の抑制効果を試験した。
オスの5歳カニクイザルを有限会社プライメイトより購入し使用した。飲水は自由とし、試験開始までは普通食を与え飼育した。
試験開始から解剖時まで高脂肪食(0.5%コレステロール含有)を与えた。
試験開始から1ヵ月後に左右腸骨動脈に実施例2で得られたピオグリタゾン含有ナノ粒子溶出ステント、FITC含有ナノ粒子溶出ステントおよびベアメタルステントを留置した。留置より28日後に、心臓よりリン酸緩衝生理食塩水、中性緩衝ホルマリンにて洗浄、固定した後、ステントを留置した動脈を摘出した。樹脂切片作製後、ヘマトキシリンエオシン染色を行い、新生内膜面積の評価を行った。
結果を表6に示す。
マウス下肢虚血モデルにおけるピオグリタゾン含有ナノ粒子の血管新生促進効果
実施例1で得られたピオグリタゾン含有ナノ粒子を用いて、マウス下肢虚血モデルにおける血管新生促進効果を試験した。
オスの野生型マウス(C57BL/6J)を日本クレアより購入し使用した。飲水および摂餌は自由とし、試験終了まで普通食を与え飼育した。
8週齢の野生型マウスをペントバルビタールで深麻酔し、左大腿動脈/静脈を露出させ、6-0絹糸で浅大腿動脈及び静脈(大腿深動脈及び静脈の下から膝窩動脈及び静脈)を結紮し、切除して虚血モデルを作製した。
下肢虚血モデル作製後、実験動物を(1)溶媒対照群、(2)ピオグリタゾン含有ナノ粒子群の2群に割り付けた。モデル作製直後、左大腿筋に溶媒あるいはピオグリタゾン含有ナノ粒子を溶媒に懸濁した懸濁液(ナノ粒子として0.9 mg/100 μL相当、ピオグリタゾン濃度として0.027 mg/100 μL)をそれぞれ100 μL筋肉内注射した(投与量 1.125 mg/kg相当)。溶媒には、リン酸緩衝生理食塩水を用いた。投与後、皮膚を縫合した。
虚血後21日目に、laser Doppler perfusion image (LDPI) analyzer (Moor Instruments)を用いて虚血肢(左肢)及び非虚血肢(右肢)の血流量の評価を行った。下肢血流比は非虚血肢に対する虚血肢のLDPIシグナルの割合で求めた。
結果を表7に示す。
Claims (13)
- ピオグリタゾンまたはその塩および生体適合性高分子を含有するナノ粒子。
- 生体適合性高分子が乳酸・グリコール酸共重合体である請求項1記載のナノ粒子。
- ピオグリタゾンまたはその塩の含有量がピオグリタゾンとして0.1〜10重量%である請求項1記載のナノ粒子。
- 動脈硬化性疾患の予防または治療のための請求項1記載のナノ粒子。
- 非経口投与用である請求項4記載のナノ粒子。
- 請求項1記載のナノ粒子を含む動脈硬化性疾患の予防または治療のための医薬製剤。
- 請求項1記載のナノ粒子を含む動脈硬化性疾患の予防または治療のための非経口投与用医薬製剤。
- 請求項1記載のナノ粒子を担持したステント。
- 請求項1記載のナノ粒子を担持した動脈硬化性疾患の予防または治療のためのステント。
- 哺乳動物に、請求項1記載のナノ粒子の有効量を投与することを特徴とする当該哺乳動物における動脈硬化性疾患の予防または治療方法。
- 動脈硬化性疾患の予防または治療用医薬を製造するための、請求項1記載のナノ粒子の使用。
- 哺乳動物の血管内に、請求項8記載のステントを留置することを特徴とする当該哺乳動物における動脈硬化性疾患の予防または治療方法。
- 動脈硬化性疾患の予防または治療用のステントを製造するための、請求項1記載のナノ粒子の使用。
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