CN101969934B - 包含药物的纳米颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含吡格列酮或其盐和生物相容性聚合物的纳米颗粒、用于预防或治疗动脉硬化疾病的包含所述纳米颗粒的药物制剂和载有所述纳米颗粒的支架。使用本发明的纳米颗粒，可以抑制动脉硬化斑块的破裂，并且其可用于预防或治疗动脉硬化疾病。

Description

包含药物的纳米颗粒
技术领域
本发明涉及包含吡格列酮(pioglitazone)或其盐的纳米颗粒，和包含该纳米颗粒的药物制剂和支架(stent)。
发明背景
随着包括药物洗脱支架(DES)的冠状动脉介入治疗(经皮冠状动脉介入治疗；PCI)技术的进步，通常是所关心的问题的PCI后再狭窄已经减少。然而，目前世界上使用的DES包含免疫抑制剂(例如西罗莫司)或抗癌剂(例如紫杉醇)，与常规裸金属支架(BMS)相比，尽管DES可以抑制再狭窄，但是已经报道了其在长期的预后显示出较高的急性冠状动脉综合征(ACS)发病率，这是一种比BMS更致命性的病理学，并且也已阐明其没有改善重要预后(vital prognosis)。
因此，推测的原因为，尽管急性冠状动脉综合征主要是由于动脉硬化斑块破裂(斑块破裂)引起，其是一种相对轻度至中度的损害，而不是严重的狭窄损害(其通常为PCI的目标)，但是，使用免疫抑制剂或抗癌剂的DES通过经由防止平滑肌细胞生长抑制新内膜(neointimal)增厚来抑制再狭窄，并且其非特异性细胞增殖抑制作用防止了血管内皮再生并且形成了变成血栓的非稳定性斑块，从而增加了ACS的发病率。
因此，为了改善重要预后，防止引起急性冠状动脉综合征的斑块破裂很重要，并且发展具有新内膜增厚抑制作用和斑块稳定作用(通过不防止血管内皮再生)等等的支架被认为是一种有效的治疗策略。
过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)是一种核受体，其由配体活化并且起转录因子作用。PPAR具有亚型a、γ和β/δ，并且深度参与碳水化合物、脂质等的代谢和细胞分化。已知在动脉硬化损害中，PPARγ在血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞上表达。
在动脉硬化中，认为PPARγ激动剂通过直接作用而给予抗动脉硬化作用，所述直接作用比如
·通过例如，抑制内皮细胞中的粘着因子比如ICAM-1、VCAM-1等的表达来保护和改善内皮功能等，
·抑制平滑肌细胞的迁移和生长和平滑肌细胞中MMP(基质金属蛋白酶)生成，
·抑制单核细胞分化和炎症细胞因子生成，
·促进在巨噬细胞等中ABCA1介导的胆固醇逆转运。
吡格列酮，其是一种胰岛素敏化剂，具有PPARγ激动剂作用和细胞凋亡抑制作用，并且已知可用于治疗动脉粥样硬化疾病、预防或治疗旁路手术后的血管再闭塞和再狭窄、和预防或治疗介入(经皮穿刺冠状动脉成形术、经皮冠状动脉血管重建、支架术、冠状动脉内窥镜检查、血管内超声、经皮穿刺冠状动脉血栓溶解疗法等)后的血管增厚(WO99/25346、WO02/087580等)。
而且，作为药物递送系统，包封核酸化合物的纳米颗粒(JP-A-2007-119396)和用包封生理活性物质的纳米颗粒涂层的药物洗脱支架(JP-A-2007-215620)是已知的。
发明内容
预期向不稳定的斑块选择性递送PPARγ激动剂将会防止斑块破裂和继发的急性冠状动脉综合征，及改善重要预后。
然而，已知具有PPARγ激动剂作用的格列酮(glitazone)药物可引起作为全身给药(口服给药)副作用的水肿。
因此，使用药物递送系统(DDS)有效地递送少量药物至靶器官(血管)可以使全身性副作用最小，并且提供有希望的治疗，即使是对于不能使用格列酮药物的患者。
本发明旨在提供一种可用于预防或治疗动脉硬化疾病的新的药物制剂。
本发明人已经发现可以通过使用包含吡格列酮或其盐的纳米颗粒将吡格列酮(其是一种PPARγ激动剂)或其盐有效地递送到不稳定的斑块，以抑制斑块破裂的发生，并且其可是可用于预防或治疗动脉硬化疾病的药物制剂。
因此，本发明涉及
(1)纳米颗粒，其包括吡格列酮或其盐和生物相容性(biocompatible)聚合物；
(2)前述(1)的纳米颗粒，其中所述生物相容性聚合物为乳酸-乙醇酸共聚物；
(3)前述(1)的纳米颗粒，其中吡格列酮或其盐的含量以吡格列酮计为0.1至10wt％；
(4)前述(1)的纳米颗粒，其用于预防或治疗动脉硬化疾病；
(5)前述(4)的纳米颗粒，其用于肠胃外给药；
(6)包括前述(1)的纳米颗粒的药物制剂，其用于预防或治疗动脉硬化疾病；
(7)用于肠胃外给药的包括前述(1)的纳米颗粒的药物制剂，其用于预防或治疗动脉硬化疾病；
(8)载有前述(1)的纳米颗粒的支架；
(9)载有前述(1)的纳米颗粒的支架，其用于预防或治疗动脉硬化疾病；
(10)预防或治疗哺乳动物中动脉硬化疾病的方法，包括向哺乳动物给药有效量的前述(1)的纳米颗粒；
(11)前述(1)的纳米颗粒在制备用于预防或治疗动脉硬化疾病的药剂中的用途；
(12)预防或治疗哺乳动物中动脉硬化疾病的方法，包括将前述(8)的支架放置在哺乳动物的血管中；
(13)前述(1)的纳米颗粒在制备用于预防或治疗动脉硬化疾病的支架中的用途，等。
另外，本发明涉及
(14)前述(1)的纳米颗粒，进一步包括阳离子聚合物；
(15)前述(14)的纳米颗粒，其中所述阳离子聚合物为脱乙酰壳多糖；
(16)载有前述(14)的纳米颗粒的支架；
(17)载有前述(14)的纳米颗粒的支架，其用于预防或治疗动脉硬化疾病，等。
本发明的纳米颗粒具有通过有效地递送吡格列酮或其盐至不稳定的斑块抑制斑块破裂发生的作用，和在血管损害部位的稳定的长期滞留作用，以及对血管损伤之后新内膜形成的抑制作用。因此，本发明的纳米颗粒可用于预防或治疗动脉硬化疾病、支架内再狭窄等。使用本发明的纳米颗粒，可以有效地将少量药物递送到靶器官(血管)，其使得能够减少全身性副作用。另外，因为药物可以从纳米颗粒逐渐释放，所以可以提供持续性更优良的药物制剂。
在腿局部缺血中，PPARγ激动剂被认为在局部缺血组织中，通过直接作用显示出血管生成作用，所述直接作用例如通过内皮细胞中eNOS的经促进的表达的内皮功能保护-改善作用。
本发明的纳米颗粒通过特异性地并且有效地递送吡格列酮或其盐至局部缺血部位的血管内皮细胞而具有改善和保护内皮功能的作用。其作用机制被认为是基于eNOS的经促进的表达。因此，本发明的纳米颗粒可用于治疗局部缺血性疾病。使用本发明的纳米颗粒，可以有效地将少量药物递送到局部缺血性器官(血管的内皮细胞)，其使得能够减少全身性副作用。而且，因为药物可以从纳米颗粒逐渐释放，所以可以提供持续性更优良的药物制剂。
而且，本发明的药物制剂和支架也具有抑制斑块破裂发生的作用。因此，它们可用于预防或治疗动脉硬化疾病、支架内再狭窄等。
特别地，载有本发明的纳米颗粒的支架具有抑制支架术后新内膜形成的作用，并且可用于预防或治疗动脉硬化疾病、支架内再狭窄等。
而且，本发明的纳米颗粒、药物制剂和支架也具有抑制单核细胞趋化因子(MCP-1)生成的作用。因此，它们可用于预防或治疗涉及MCP-1的疾病，例如用于预防或治疗炎症疾病。
发明详述
本发明的纳米颗粒包括吡格列酮或其盐和生物相容性聚合物，并且形成为具有纳米尺寸的颗粒(纳米球)。
虽然本发明的纳米颗粒的制备方法不受特别地限制，只要其可以将吡格列酮或其盐和生物相容性聚合物处理成平均颗粒尺寸少于1,000nm的颗粒，但是可以优选地使用球形结晶方法(spherical crystallizationmethod)，其为一种非高剪切力颗粒制备方法。
所述球形结晶方法是一种这样的方法，其通过在化合物合成的最后阶段控制晶体的形成/生长过程来设计球形晶体颗粒，和通过直接控制其性质加工所述颗粒。球形结晶方法中的一种是乳液溶剂扩散方法(emulsion solvent diffusion method，ESD方法)。
ESD方法是一种通过下述原理制备纳米球的技术。在该方法中，使用两种溶剂：可以将乳酸-乙醇酸共聚物(在下文中称为PLGA)等溶解的良溶剂，其是包含药物的基础聚合物，和相反不能溶解PLGA的不良溶剂。作为良溶剂，有机溶剂比如丙酮等，其溶解PLGA并且可与不良溶剂混溶。作为不良溶剂，通常使用聚乙烯醇的水溶液等。
作为操作步骤，首先将PLGA溶于良溶剂中，并且向其中加入药物溶液并与良溶剂混合，同时防止PLGA沉淀。将得到的包含PLGA和药物的混合物滴加至不良溶剂中，同时搅拌。结果，该混合物中的良溶剂(有机溶剂)快速扩散和转移到不良溶剂中，其进而引起良溶剂在不良溶剂中的自乳化，形成具有亚微粒尺寸的良溶剂的乳滴。而且，因为由于良溶剂和不良溶剂的相互扩散引起乳液中的有机溶剂连续地扩散到不良溶剂中，PLGA和药物在所述乳滴中的溶解度降低，最后，产生包含药物的球形晶体颗粒PLGA纳米球。
根据上述球形结晶方法，因为可以通过物理化学方法形成纳米颗粒和得到的纳米颗粒基本上是球形的，所以可以容易地形成均匀的纳米颗粒而不需要考虑残留催化剂和起始材料化合物问题。此后，在减压下蒸发有机溶剂(良溶剂)(溶剂蒸发步骤)，得到包含药物的纳米颗粒粉末。得到的粉末直接填充到容器中，或者，当必要时，在通过冷冻干燥等形成可再分散的聚集颗粒(复合颗粒)形成复合物(复合物形成步骤)之后，填充到容器中。
根据将包含在纳米颗粒中的药物、生物相容性聚合物的种类等来确定良溶剂和不良溶剂的种类，并且不受特别地限制。因为使用生物相容性纳米颗粒作为将作用于人体的药物制剂的起始材料，因而需要使用对人体具有高安全性和引起更少环境负担的生物相容性纳米颗粒。
这样的不良溶剂的实例包括水和加入表面活性剂的水，例如，优选地使用聚乙烯醇水溶液(加入作为表面活性剂的聚乙烯醇的水)。不同于聚乙烯醇的表面活性剂的实例包括卵磷脂、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素等。当剩余过量的聚乙烯醇时，可以在溶剂蒸发步骤之后进行通过离心等除去聚乙烯醇的步骤(除去步骤)。
所述良溶剂的实例包括具有低沸点的几乎不溶于水的有机溶剂，如卤代烷烃、丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚、环己烷、苯、甲苯等。例如，优选地使用对环境和人体引起较少不利影响的丙酮，和丙酮与甲醇的混合物。
聚乙烯醇在水溶液中的浓度、丙酮和甲醇的混合比例和结晶条件都没有特别地限制，并且可以根据将包含在纳米颗粒中的药物的种类、球形成粒的晶体的颗粒大小(本发明中为纳米级)等适当地确定。随着聚乙烯醇在水溶液中的浓度增加，聚乙烯醇对纳米颗粒表面的粘附变得更优异，并且干燥后在水中的再分散性变得更加得到改进；然而，当聚乙烯醇在水溶液中的浓度超过给定的水平，不良溶剂的粘度增加，不利地影响良溶剂的扩散性。
尽管取决于聚乙烯醇的聚合度和皂化值将会发生变化，但是，在纳米颗粒形成之后蒸发有机溶剂和通过冷冻干燥等粉末化纳米颗粒的情况下，聚乙烯醇在水溶液中的浓度优选地不少于0.1wt％且不超过10wt％，更优选地为约2wt％。在纳米颗粒形成之后从悬浮液中蒸发有机溶剂和该纳米颗粒被用于在支架上承载该纳米颗粒的步骤的情况下，聚乙烯醇在水溶液中的浓度优选地设置为不超过0.5wt％，特别优选地约0.1wt％。
另外，当通过下述电泳或喷雾法将纳米颗粒承载在支架上时，优选地将阳离子聚合物加入到不良溶剂中以使纳米颗粒表面带正电荷。
所述阳离子聚合物的实例包括脱乙酰壳多糖和脱乙酰壳多糖衍生物；其中多个阳离基团键合到纤维素的阳离子纤维素；聚氨基化合物，比如聚乙烯亚胺、聚乙烯基胺、聚烯丙基胺等；聚氨基酸，比如聚鸟氨酸、聚赖氨酸等；聚乙烯基咪唑、聚(乙烯基氯化吡啶
Figure GSB00000556204300061
)、烷基氨基甲基丙烯酸酯季盐聚合物(DAM)、烷基氨基甲基丙烯酸酯季盐-丙烯酰胺共聚物(DAA)等，并且特别优选地使用脱乙酰壳多糖或其衍生物。
脱乙酰壳多糖是一种天然聚合物，其中键合了许多葡糖胺(一种具有氨基的糖)分子，并且包含在虾、蟹和昆虫的壳中。因为脱乙酰壳多糖特征性地具有乳液稳定性、形状保持性、生物可降解性、生物相容性、抗菌性等，所以其广泛地用作化妆品、食品、服装材料、药品等的起始原料。通过将脱乙酰壳多糖加入到不良溶剂中，可以制备对活生物没有不利影响的高度安全的纳米颗粒。
使用具有通过部分地季铵化脱乙酰壳多糖(其本性是阳离子的)实现的较高的阳离子度(cationicity)的脱乙酰壳多糖衍生物(阳离子脱乙酰壳多糖)，比如N-[2-羟基-3-(三甲基铵)丙基]脱乙酰壳多糖氯化物等等，是优选的，因为颗粒之间的排斥力变得更强和颗粒的稳定性得到增加。
另外，为了改善药物在良溶剂中的亲和力和分散稳定性，可以将阳离子脂质比如DOTAP等加入该良溶剂中以与药物形成络合物。然而，应当谨慎地确定其加入量，因为在细胞中释放的阳离子脂质可引起细胞毒性。
可以在通过冷冻干燥等的粉末化期间将如上所述获得的纳米颗粒加工成可再分散的聚集的颗粒复合物(纳米复合物)。在这种情况下，优选地与有机物质或无机物质形成可再分散的复合物，并干燥具有所述纳米颗粒的复合物。当例如使用糖醇或蔗糖时，糖醇或蔗糖变为赋形剂，并且可以增强所述纳米颗粒的操作性能。糖醇的实例包括甘露糖醇、海藻糖、山梨醇、赤藓醇、麦芽糖醇(maltitose)、木糖醇(xylitose)等。在这些中，海藻糖是特别优选的。
通过形成复合物，可以获得复合物颗粒，其是一种在使用前可容易地操作的纳米颗粒的聚集颗粒，并且当使用中与水接触时，返回到纳米颗粒并且恢复高反应性等性质。可选地，可以使用流化床干燥制粒方法(例如，使用Aglomaster AGM，由Hosokawa Micron Corporation制造)代替冰冻干燥法来形成使得能够以可再分散状态整合的复合物。
作为将在本发明中使用的生物相容性聚合物，对活生物刺激轻微和毒性低、生物相容且可生物降解(在给药之后分解和被代谢)的聚合物是期望的。另外，其优选是以缓释方式逐渐释放被包封的药物的颗粒。作为这样的材料，PLGA可以是特别优选使用的。
PLGA的分子量(重均分子量)优选地为5,000至200,000，更优选地为15,000至25,000。乳酸∶乙醇酸的组成比为1∶99至99∶1，乳酸∶乙醇酸优选地为1∶0.333。因为乳酸和乙醇酸的含量在25wt％至65wt％的PLGA是非晶的且可溶于有机溶剂比如丙酮等中，所以其是优选使用的。
可生物降解的、生物相容的聚合物的实例进一步包括聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚天冬氨酸等。另外，也可以使用其共聚物比如天冬氨酸-乳酸共聚物(PAL)和天冬氨酸-乳酸-乙醇酸共聚物(PALG)，并且所述聚合物也可以具有可以转变成带电基团的基团或官能团，比如氨基酸。
不同于以上的生物相容性聚合物的实例包括聚链烯(polyalkylene)比如聚乙烯和聚丙烯、聚乙烯基化合物比如聚乙烯醇、聚乙烯醚和聚乙烯基酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚氧化乙烯、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、纤维素及其它多糖、以及肽或蛋白质、和其共聚物及它们的混合物。
之后，将得到的纳米颗粒悬浮液直接地再分散在水中并用于接下来的纳米颗粒附着步骤，或者，当必要时，在减压下在蒸发有机溶剂(其为良溶剂)(溶剂蒸发步骤)之后，和进一步地，当必要时，通过冷冻干燥等粉末化该纳米颗粒后，再分散在水中，并用于接下来的纳米颗粒附着步骤。将悬浮液形式的纳米颗粒直接用于下一步骤中是优选的，因为由于不存在冷冻干燥等可以简化制备步骤，并且可以减少加入到不良溶剂中的聚乙烯醇的量。
当粉末化纳米颗粒时，优选将它们与粘合剂(例如海藻糖等)一起转化成可再分散的聚集的颗粒复合物以得到复合物颗粒，因为可以获得在使用前容易操作的纳米颗粒的聚集颗粒，当使用中与水接触时，其返回到纳米颗粒(水溶解了粘合剂)。
当通过下述的电泳法或喷雾法将纳米颗粒承载在支架上时，优选地将得到的纳米颗粒与阳离子聚合物的溶液混合，以使纳米颗粒表面带正电。作为阳离子聚合物，可以提及类似于上述实例的那些。特别地，优选地使用脱乙酰壳多糖或其衍生物。作为用于阳离子聚合物溶液的溶剂，可以提及作为前述的“不良溶剂”示例的那些。特别地，优选地使用阳离子聚合物的水溶液。阳离子聚合物在所述溶液中的浓度优选地不少于0.01wt％，且不超过1.0wt％。
对将在本发明中使用的包含药物的纳米颗粒没有特别地限制，只要其具有的平均颗粒尺寸小于1,000nm。为了增加向受影响部分的递送效率，平均颗粒尺寸优选地设定为不超过600nm，更优选地不超过500nm，仍然更优选100nm至400nm等。
在本发明中，纳米颗粒的平均颗粒尺寸指通过动态光散射方法测定的平均颗粒尺寸。
对吡格列酮的盐没有特别地限制，只要其为可药用盐，并且所述盐的实例包括与无机酸的盐(例如，与盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等的盐)；与有机酸的盐(例如，与甲酸、乙酸、三氟乙酸、邻苯二甲酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等的盐)，等。优选的为盐酸盐。
可以通过调节在纳米颗粒形成期间加入的药物量、加入的阳离子聚合物的种类和量、及形成纳米颗粒的生物相容性聚合物的种类来控制吡格列酮或其盐在纳米颗粒中的含量。吡格列酮或其盐在纳米颗粒中的含量优选地以吡格列酮计为0.1至10wt％，更优选地为1至10wt％。
因为通过把本发明的纳米颗粒承载在支架上可以将药物(吡格列酮或其盐)安全有效地递送到靶位点(血管)，所以所述方法可以是一种用于预防或治疗动脉硬化疾病等的有效方法。
作为在支架上承载纳米颗粒的方法，可以使用包括通过在纳米颗粒悬浮液中浸渍、雾化涂覆(mist coating)等将纳米颗粒物理附着在支架体上的方法。可选地，也可以使用包括将阳离子聚合物化合物加入到纳米颗粒中以使纳米颗粒表面带正电，和电附着纳米颗粒以坚固并且均匀地涂覆支架体的方法。这样的方法的实例包括(1)电泳，包括在生物相容性纳米颗粒悬浮液中带电(electrification)，支架体作为负极(negative electrode)，和(2)喷雾法，包括将包含生物相容性纳米颗粒的滴附着到带负电的支架表面上。可以根据在JP-A-2007-215620中描述的方法实施这些方法。
支架体的形状可以通过编织和模制纤维材料、用激光将金属管切成网状结构等形成，或者，可以使用常规已知的各种形状，比如冠型、圆柱型等。所述支架体可以是球膨胀型(balloon expansion type)或自膨胀型，并且可以根据应用部位适当地确定支架体的尺寸。例如，当用于心脏冠状动脉时，膨胀前的外径通常优选地为1.0至3.0mm，长度为约5.0至50mm。
而且，当纳米颗粒通过电泳附着时，所述支架体需要由导电材料比如金属等制成。用于支架体的金属的实例包括不锈钢、镁、钽、钛、镍-钛合金、Inconel(注册商标)、金、铂、铱、钨、钴合金等。当所述支架是自膨胀型时，超弹性(superelastic)合金等等比如镍-钛等是优选的，因为需要恢复原始形状。另一方面，当其为球膨胀型时，在膨胀之后不容易恢复原始形状的不锈钢等是优选的，并且优选地使用在抗腐蚀性方面最优良的SUS316L。
非金属的导电材料的实例包括导电聚合物，比如聚苯胺、聚吡咯、聚噻吩、聚异硫茚(polyisothianaphtene)、聚亚乙基二氧基噻吩等，导电陶瓷等。可选地，可以使用通过加入导电填充剂、或通过由涂覆等进行的表面导电处理赋予导电性的非导电树脂。
当不可生物降解的材料比如不锈钢等用作支架体材料时，因为由于长期支架术可能在血管内壁上发展出炎症，因而可能引起再狭窄，所以需要每几个月就进行经皮穿刺冠状动脉成形术(PTCA)以再次实施支架术，其对患者带来了沉重负担。然而，因为在支架术之后，由镁(一种可生物降解的金属)制造的支架体在体内逐渐降解和在几个月内消失，所以可以抑制由于支架术引起的炎症发展。
特别地，通过将由可生物降解的聚合物比如PGA、PLA、PLGA、PAL等作为生物相容性聚合物形成的纳米颗粒附着到镁支架体，可以提供在支架术后在给定时期内在体内完全消失并且对于活生物负担较少的药物洗脱支架(drug eluting stent，DES)。在这种情况下，用于形成所述纳米颗粒的可生物降解的聚合物优选地具有比在下述浸渍步骤中渗透到纳米颗粒层中的可生物降解的聚合物的生物降解速率低的生物降解速率。
在此，因为在电泳期间每单位小时吸引到支架表面的纳米颗粒的量随着更高的电压施加到正极(positive electrode)和负极之间而增加，所以可以在短时间内在支架表面上形成纳米颗粒层。另一方面，因为大量纳米颗粒发生附着，所以难以形成均匀的纳米颗粒层。因此，在电泳期间施加的电压可以根据期望的纳米颗粒层的均匀性和形成效率适当地设定。
现在解释喷雾法。所述喷雾法包括通过带电，将带正电荷的生物相容性纳米颗粒的微细悬浮液滴电附着到带负电的支架体表面。其实例包括：包括通过超声作用雾化纳米颗粒悬浮液的超声雾化方法、包括使用喷雾器或喷枪将纳米颗粒悬浮液吹到支架表面的喷雾法或喷枪法，等。
在所述喷雾法中，支架体通过带电也带负电荷。因此，与在电泳的情况下相同，与无支架体带电的喷雾处理相比，带正电荷-改性的纳米颗粒层的附着明显更坚固，可以制备显示支架体和纳米颗粒之间的良好粘附性并且抗腐蚀性优良的DES。另外，因为滴中的纳米颗粒主动附着到支架体，所以也可以增加纳米颗粒到雾化的或喷雾的滴很难直接附着的支架侧面和背面的附着效率。省略了对进行喷雾法的支架体的形状和材料的说明，因为其与电泳的情况相同。
而且，除了通过电泳或喷雾法在支架表面上形成纳米颗粒层的步骤之外，也可以设定在其上层压纳米颗粒层的步骤(在下文中称为第二附着步骤)。在该第二附着步骤中，因为沿着在支架表面上形成的均匀的纳米颗粒层层压新的纳米颗粒层，所以即使增加每单元小时附着的纳米颗粒的量，也可以均匀有效地形成具有期望层厚度的纳米颗粒层。前述的电泳、超声雾化方法、喷雾法、喷枪法等可以用于所述第二附着步骤。当超声雾化方法、喷雾法、喷枪法等用于该第二附着步骤时，支架体优选地是带负电的，以更有效并且坚固地层压纳米颗粒层。
在没有任何处理的情况下，在安装在体内后在短时间内，在支架表面上形成的纳米颗粒层立刻溶解，药效的持续性控制变得困难。另一方面，当完全干燥所述纳米颗粒层时，纳米颗粒更坚固地互相聚集形成不溶性纳米颗粒涂层，其可防止纳米颗粒从支架表面溶解和结合到细胞中。因此，如上所述，优选地在支架表面上形成纳米颗粒层，在该层被完全干燥之前将纳米颗粒层浸入可生物降解的聚合物的溶液中(浸渍步骤)，并且通过干燥固化该层(干燥步骤)。
当将在支架表面上形成的且在完全干燥之前的纳米颗粒层浸入可生物降解的聚合物的溶液中时，所述可生物降解的聚合物溶液渗透到形成纳米颗粒层的纳米颗粒之间的间隙中。当干燥用于溶解所述可生物降解的聚合物的溶剂和保留在所述纳米颗粒层中的水时，形成可生物降解的聚合物层。结果，由于所述可生物降解的聚合物，每个纳米颗粒保持没有发生聚集，并且由于在将DES安装在体内之后所述可生物降解的聚合物层的降解，所述纳米颗粒逐渐地洗脱出来。
所述可生物降解的聚合物的实例包括衍生自微生物的聚合物，比如聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯等、胶原、醋酸纤维素、细菌纤维素、高-直链淀粉玉米淀粉、淀粉、天然聚合物比如脱乙酰壳多糖等，等等。在这些中，更优选地使用在体内降解速率比用于形成纳米颗粒的生物相容性聚合物比如PLGA等快的胶原等。通过合适地选择这样的可生物降解的聚合物的种类、分子量等，附着于支架表面的纳米颗粒的洗脱速率变成可控制的。虽然也可以使用PGA、PLA、PLGA、PAL等作为可生物降解的聚合物，但是使用具有较小分子量的那些以超过纳米颗粒的降解速率。
在如上获得的DES中，因为承载在支架体上的纳米颗粒具有带正电荷的表面，所以在从支架表面上洗脱之后其细胞粘附力增加。因此，可以增加纳米颗粒向其中放置支架的损害部位中的细胞的引入效率。
而且，通过将药物(吡格列酮或其盐)加入到其中浸渍纳米颗粒层的可生物降解的聚合物溶液中，包含在所述纳米颗粒外部的可生物降解的聚合物层中的药物可以快速地起作用，而包含在所述纳米颗粒内部的药物可以缓慢并且持续地起作用。可以根据所需的瞬即效应、持续性水平等适当地确定纳米颗粒和支架的药物含量。
即，当需要在给药之后效果的长期持续性时，药物只需要包含在纳米颗粒的内部，而当需要在给药后立即表现出效果时，药物也只需要包含在纳米颗粒外部的可生物降解的聚合物层中。
本发明的支架中吡格列酮或其盐的含量优选地为1至1000μg，更优选10至50μg，以吡格列酮计。
本发明的包含药物的纳米颗粒可以根据常规方法安全地单独给药或者以包含药理学可接受载体的药物制剂(药物组合物)的形式给药，例如片剂(包括糖衣片、薄膜包衣片等)、粉末剂、颗粒剂、胶囊、液体、乳剂、混悬剂、注射剂、吸入剂、栓剂、缓释制剂(例如，舌下片、微胶囊等)、硬膏剂、口腔崩解片、口腔可分解的膜剂等，口服或肠胃外给予(例如，皮下、局部、直肠、静脉内、动脉内、气管内、经肺给药等)。本发明的药物制剂优选地肠胃外给药，更优选地静脉内给药、动脉内给药、气管内给药、经肺给药等。
上述药理学可接受的载体的实例包括通常用作制剂物质的各种有机和无机载体物质，比如用于固体制剂的赋形剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂，用于液体制剂的溶剂、增溶剂、助悬剂、等渗剂(isotonicityagent)、缓冲剂和缓和剂(soothing agent)等。当必要时，视情况而定也可以使用适量的常用添加剂，比如防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂、吸附剂、润湿剂等。
所述赋形剂的实例包括乳糖、蔗糖、D-甘露糖醇、淀粉、玉米淀粉、结晶纤维素、轻质无水硅酸等。润滑剂的实例包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石、胶态二氧化硅等。所述粘合剂的实例包括结晶纤维素、蔗糖、D-甘露糖醇、糊精、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、淀粉、蔗糖、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等。所述崩解剂的实例包括淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、低取代的羟丙基纤维素等。所述溶剂的实例包括注射用水、醇、丙二醇、聚乙二醇(macrogol)、芝麻油、玉米油、橄榄油等。所述增溶剂的实例包括聚乙二醇、丙二醇、D-甘露糖醇、苯甲酸苄酯、乙醇、三氨基甲烷、胆固醇、三乙醇胺、碳酸钠、柠檬酸钠等。所述助悬剂的实例包括表面活性剂，比如硬脂基三乙醇胺、十二烷基硫酸钠、氨基丙酸月桂基酯、卵磷脂、苯扎氯铵、苄索氯铵、单硬脂酸甘油酯等；亲水性聚合物，比如聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素等，等等。所述等渗剂的实例包括葡萄糖、D-山梨醇、氯化钠、甘油、D-甘露糖醇等。所述缓冲剂的实例包括缓冲剂比如磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐等，等等。所述缓和剂的实例包括苯甲醇等。所述防腐剂的实例包括对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯甲醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸等。所述抗氧化剂的实例包括亚硫酸盐、抗坏血酸、α-生育酚等。
吡格列酮或其盐的剂量根据给药对象、给药途经和症状而变化，并且没有特别地限制。例如，对于向成年患者动脉内给药以治疗动脉硬化疾病而言，活性成分吡格列酮的剂量为约1至约560mg，优选约1至约200mg，更优选约1至约100mg，其取决于所述症状理想地以每天约1至3个部分给药。
在本发明的药物制剂(药物组合物)中吡格列酮或其盐的含量为整个制剂(组合物)的约0.1至约10wt％。
本发明的纳米颗粒具有优异的斑块破裂发展抑制作用、斑块稳定作用、单核细胞趋化因子(MCP-1)生成抑制作用、在血管损伤部位的稳定的长期滞留作用、在血管损伤之后的新内膜形成抑制作用、在局部缺血部位中的血管生成促进作用等。
本发明的纳米颗粒、药物制剂和支架是低毒性的，并且可用于预防或治疗例如动脉硬化疾病。所述动脉硬化疾病的实例包括动脉硬化(例如动脉粥样硬化等)、心肌梗死、(急性)冠状动脉综合征比如不稳定型心绞痛等、外周性动脉阻塞、经皮穿刺冠状动脉成形术(PTCA)后的再狭窄、支架术后的再狭窄、心脏局部缺血性疾病(例如心绞痛等)、间歇性跛行、脑中风、脑梗死、脑栓塞、脑出血、腔隙性脑梗死、脑血管性痴呆、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、低HDL血症(hypoHDL-emia)、高脂血症等。
另外，本发明的纳米颗粒、药物制剂和支架也可以用于预防或治疗支架内再狭窄。
而且，本发明的纳米颗粒、药物制剂和支架可用于预防或治疗涉及MCP-1的疾病(例如炎症疾病等)。所述炎症疾病的实例包括肺病，比如肺纤维化、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺动脉高压等，等等。
实施例
通过参照实施例和试验实施例，将在下文中更详细地阐述本发明，所述实施例和试验性实施例不应当被看作是限制性的。
实施例1
包含吡格列酮的PLGA纳米颗粒的制备
配制0.5wt％聚乙烯醇(Gosenol EG-05(注册商标)，由The NipponSynthetic Chemical Industry Co.，Ltd.制备)的水溶液，将其用作不良溶剂。另外，将乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA7520，乳酸/乙醇酸＝75/25，重均分子量20,000，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(1g)溶于丙酮(40mL)中，并且与在甲醇(20mL)中的吡格列酮盐酸盐(40mg)混合，将该混合物用作聚合物溶液。在40℃，以4mL/min将该溶液滴加到之前获得的不良溶剂中，同时以400rpm搅拌，得到包含吡格列酮的PLGA纳米颗粒悬浮液。在减压下，蒸发丙酮和甲醇1.5小时，冷冻干燥残余物，得到包含吡格列酮的PLGA纳米颗粒粉末。
获得的粉末在水中的再分散性良好。通过动态光散射方法测量所述纳米颗粒粉末在再分散于净化水中之后的平均颗粒尺寸，实测值为314nm。吡格列酮在所述纳米颗粒粉末中的含量为2.37wt％。
试验实施例1
在ApoE-敲除(knockout)小鼠中的斑块破裂抑制作用
使用在实施例1中获得的包含吡格列酮的纳米颗粒，在ApoE-敲除小鼠中试验斑块破裂抑制作用。
(1)试验动物
雄性ApoE-敲除小鼠(C57B1/6J来历(background))购自JacksonLaboratory(USA)并使用。允许小鼠饮水，并饲喂正常饮食，直到开始试验。
(2)饮食和血管紧张素II给予
从第16周龄开始，给予ApoE-敲除小鼠高脂肪饮食(包含21％的猪油和0.15％的胆固醇)，和从第20周龄开始腹膜内给予血管紧张素II(1.9mg/kg/天)。
(3)给药方法和剂量
向对照组给药不含药物的PLGA纳米颗粒(8.75mg/小鼠/周)。
向包含吡格列酮的纳米颗粒组给药在实施例1中获得的包含吡格列酮的PLGA纳米颗粒(8.75mg/小鼠/周，以吡格列酮计包含210μg，相当于7mg/kg/周)。
将各纳米颗粒(8.75mg)悬浮在磷酸盐缓冲的盐水(0.5mL)中，从第20周龄至23周龄静脉内给药，每周一次，总共四次。
(4)评价方法
在给予血管紧张素II 28天之后，经由心脏用磷酸盐缓冲的盐水和缓冲的中性福尔马林洗涤并固定右头臂动脉，并分离。制备石蜡切片，用Elastica van Gieson染色，并且评价斑块破裂和纤维帽的厚度。
(5)结果
结果显示在表1中。
表1
Figure GSB00000556204300151
*P＜0.05vs对照组
由此，发现给药包含吡格列酮的纳米颗粒显著地抑制动脉硬化模型-ApoE-敲除小鼠中斑块破裂的发展。另外，也发现给药包含吡格列酮的纳米颗粒显著地增加纤维帽的厚度和稳定斑块。
试验实施例2
对THP-1生成单核细胞趋化因子(MCP-1)的抑制作用
(1)试验方法
用包含0.5％胎牛血清和1％青霉素的RPMI培养基调节人单核细胞细胞系THP-1(从Health Science Research Resources Bank，Japan HealthSciences Foundation获得)至5×105个细胞/孔/500μL，并接种在48孔板上(第0天)。在第1天，加入吡格列酮盐酸盐或在实施例1中获得的包含吡格列酮的PLGA纳米颗粒(浓度以吡格列酮计：1.0，10μM)，并且在第2天，通过加入LPS 1μg/ml进行刺激。
(2)评价方法
在第3天，收集上清液，并使用人MCP-1ELISA试剂盒(BIOSOURCE)测定MCP-1。
(3)结果
发现，使用包含吡格列酮的纳米颗粒，可以通过给药较少量的吡格列酮获得MCP-1生成抑制作用。
试验实施例3
通过类似于实施例1中方法的方法，制备包含异硫氰酸荧光素(FITC)-的纳米颗粒(荧光染料)，并且试验静脉注射至ApoE-敲除小鼠之后的体内动力学。
(1)包含FITC的纳米颗粒
通过与实施例1中相同方式的处理，不同在于使用FITC(100mg)代替吡格列酮盐酸盐，获得包含FITC的纳米颗粒粉末。
(2)试验动物
雄性ApoE-敲除小鼠(C57B1/6J来历)购自Jackson Laboratory(USA)并使用。允许小鼠饮水，并饲喂正常饮食，直到开始试验。
(3)饮食和血管紧张素II给予
从第16周龄开始，给予ApoE-敲除小鼠高脂肪饮食(包含21％的猪油和0.15％的胆固醇)，和从第20周龄开始腹膜内给予血管紧张素II(1.9mg/kg/天)。
(4)给药方法、剂量和评价方法
将在(1)中获得的包含FITC的纳米颗粒(8.75mg)悬浮在磷酸盐缓冲的盐水(0.5mL)中，并且静脉内给药至小鼠(21周龄)。在2小时之后，收集静脉血，在红细胞溶血之后用抗-CD11b或抗-Gr-1抗体染色白细胞和通过流式细胞仪检查，所述抗体用TexasRed标记。而且，48小时后，分离右头臂动脉，制备石蜡切片，通过HE染色和FITC免疫染色鉴定在动脉硬化斑块中显示FITC吸收的巨噬细胞。
(5)结果
当将包含FITC的纳米颗粒静脉内注射给小鼠时，2小时后，在外周血中的CD11b(+)Gr-1(-)单核细胞中观察到选择性FITC吸收。当48小时后分离右头臂动脉和进行组织学检查时，在头臂动脉和动脉硬化损害中的巨噬细胞中观察到FITC免疫染色。
由此，发现本发明的纳米颗粒能够是单核细胞/巨噬细胞选择性载体。
试验实施例4
通过包含吡格列酮的纳米颗粒控制巨噬细胞基因表达
试验静脉注射在实施例1中获得的包含吡格列酮的纳米颗粒对巨噬细胞基因表达的影响。
(1)试验动物
从Jackson Laboratory(USA)购买雄性ApoE-敲除小鼠(C57B1/6J来历)并使用。允许小鼠饮水，并饲喂正常饮食，直到开始试验。
(2)饮食和血管紧张素II给予
从第16周龄开始，给予ApoE-敲除小鼠高脂肪饮食(包含21％的猪油和0.15％的胆固醇)，和从第20周龄开始腹膜内给予血管紧张素II(1.9mg/kg/天)。
(3)给药方法和剂量
向对照组给药不含药物的PLGA纳米颗粒(8.75mg/小鼠/周)。
向包含吡格列酮的纳米颗粒组给药在实施例1中获得的包含吡格列酮的PLGA纳米颗粒(8.75mg/小鼠，以吡格列酮计包含210μg，相当于7mg/kg体重)。
将各纳米颗粒(8.75mg)悬浮在磷酸盐缓冲的盐水(0.5mL)中，在第21周龄通过静脉注射一次给药。
(4)评价方法
与静脉注射PLGA纳米颗粒或包含吡格列酮的纳米颗粒同时，腹膜内给药巯基乙酸盐培养基(Difco，2mL)。在3天之后，收集腹膜内巨噬细胞，并且提取mRNA。通过RT-PCR测量对照组和包含吡格列酮的纳米颗粒组的巨噬细胞中的各种基因表达，并比较表达水平。
(5)结果
与对照组巨噬细胞相比，在包含吡格列酮的纳米颗粒组巨噬细胞中显示显著增加或抑制的表达的基因显示在表2中。在包含吡格列酮的纳米颗粒组巨噬细胞中，促进胆固醇的逆转运的ABCA1的表达增加，而CC趋化因子比如MCP-1、RANTES等(其是单核细胞趋化因子)的表达受到抑制。
表2
由此，发现给药的包含吡格列酮的纳米颗粒被选择性地递送到ApoE-敲除小鼠体内的单核细胞/巨噬细胞，并且可以控制基因表达，包括MCP-1抑制。
试验实施例5
在小鼠血管损伤模型中新内膜形成抑制作用
使用在实施例1中获得的包含吡格列酮的纳米颗粒，试验在小鼠血管损伤模型中新内膜形成抑制作用。
(1)试验动物
从CLEA Japan，Inc.购买雄性野生型小鼠(C57B1/6J)并使用。允许小鼠饮水和消耗食物，并饲喂正常饮食直至开始试验。
(2)血管损伤模型的制备
用戊巴比妥深麻醉8-至10-周龄野生型小鼠，并暴露右侧股动脉。用6-0丝线结扎血管两端，以暂时性切断血液流动。切开支路(branch)，在髂动脉侧插入线材(wire)(直径0.15英寸，No.C-SF-15-15，COOK)5mm以损害血管。
(3)给药方法和剂量
在线材损害之后，将试验动物分成溶剂对照组和包含吡格列酮的纳米颗粒组。除去所述线材，经5分钟，从所述支路各自动脉内给药100μL的溶剂和包含吡格列酮的PLGA纳米颗粒溶液。
溶剂对照组仅给药溶剂(磷酸盐缓冲的盐水)，仅一次。
包含吡格列酮的纳米颗粒组给药在实施例1中获得的包含吡格列酮的PLGA纳米颗粒一次(以纳米颗粒计，包含0.5mg/小鼠，对应于吡格列酮的浓度0.015mg/小鼠(0.5mg/kg体重))。在给药之后，结扎支路部分，恢复血液流动，并缝合皮肤。
在线材损害之后，立即形成高剂量(临床剂量的10倍量)吡格列酮盐酸盐(以吡格列酮计，0.15mg/小鼠(5mg/kg体重))单次腹膜内给药组。
(4)评价方法
在血管损伤之后28天，经由心脏洗涤右侧股动脉并用磷酸盐缓冲的盐水和缓冲的中性福尔马林固定，并分离。制备石蜡切片，用Elasticavan Gieson染色，免疫组织化学染色增殖细胞核抗原(PCNA)，并评价内膜/中膜比、新内膜面积、中膜面积和细胞增殖。对于免疫组织化学染色，计数增殖的细胞和计算其与总细胞数的比值。
(5)结果
结果显示在表3和表4中。与溶剂对照组相比，给药包含吡格列酮的纳米颗粒引起内膜/中膜比和新内膜面积显著减小。另外，包含吡格列酮的纳米颗粒比吡格列酮盐酸盐更强地抑制平滑肌细胞增殖。因为，由于平滑肌细胞从中膜至内膜的迁移和增殖引起新内膜形成的发展，所以显示出包含吡格列酮的纳米颗粒的增殖抑制作用对新内膜形成抑制的贡献。
表3
Figure GSB00000556204300201
*P＜0.05vs对照组
表4
Figure GSB00000556204300202
*P＜0.05vs高剂量全身给药组
由此，发现在血管损伤之后，给药包含吡格列酮的纳米颗粒显著地抑制血管内的新内膜形成。另外，阐明了包含吡格列酮的纳米颗粒具有比10倍量的吡格列酮盐酸盐更强的作用。阐明其作用机制部分地涉及平滑肌细胞过度增殖抑制作用。
试验实施例6
快速递送纳米颗粒至培养的大鼠冠状动脉平滑肌细胞及其长期滞留效果
使用在试验实施例3(1)中制备的包含FITC的纳米颗粒，进行在培养的大鼠冠状动脉平滑肌细胞中的递送和滞留试验。
(1)试验方法
将大鼠主动脉平滑肌细胞(从TOYOBO获得)接种在载玻片室上，在包含10％胎牛血清的DMEM培养基(Sigma)中达到近汇合细胞密度(第0天)。在第2天，将培养基改变成含有FITC或包含FITC的纳米颗粒的培养基(纳米颗粒浓度0.5mg/mL)。
(2)评价方法
在培养基交换之后5分钟和24小时，用甲醇固定细胞，用碘化丙啶(Vector laboratories，Inc.)染色细胞核，并进行荧光显微镜观察。对每个视场计数细胞核和荧光阳性细胞的总数，并计算荧光阳性细胞的比例。
(3)结果
添加有仅包含FITC的培养基的细胞根本没有显示出阳性细胞(0％)，但是添加有包含含有FITC的纳米颗粒的培养基的细胞在5分钟内显示出90％或更多的荧光阳性细胞，甚至在24hr之后仍显示出90％或更多的荧光阳性细胞。即，阐明了在非常短的5分钟时间内，包含FITC的纳米颗粒以高速递送到培养的大鼠主动脉平滑肌细胞，并且稳定地保持24hr和更长的长时期。因此，其暗示在实施例1中制备的包含吡格列酮的纳米颗粒具有类似的快速递送至冠状动脉平滑肌细胞并且滞留很长时间的效果。
试验实施例7
对培养的人冠状动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用
使用在实施例1中获得的包含吡格列酮的纳米颗粒，试验对培养的人冠状动脉平滑肌细胞的生长抑制作用。
(1)试验方法
用包含5％胎牛血清和1％青霉素的SmBM培养基(Lonza)调节人冠状动脉平滑肌细胞(购自Lonza Walkersville Inc.，Walkersville，MD，USA)至5×103细胞/孔/500μL，并接种在48孔板上(第0天)。在第2天，改变培养基，用包含0.1％胎牛血清和1％青霉素的SmBM培养基产生饥饿状态2天。在第3天，加入仅仅溶剂(磷酸盐缓冲的盐水)或在实施例1中获得的包含吡格列酮的PLGA纳米颗粒(浓度，以吡格列酮计算；10μM)，并且将细胞在包含10％胎牛血清和1％青霉素的SmBM培养基中培养3天。10％胎牛血清的人冠状动脉平滑肌细胞增殖活性是普遍已知的，并且在该试验中其用作生长刺激剂。
(2)评价方法
在开始培养的第7天，用甲醇固定细胞，用Diff-Quick染色液(购自Sysmex Corporation)染色和计数每个视场的细胞数。
(3)结果
结果显示在表5中。在包含吡格列酮的纳米颗粒组中，显著地抑制了10％胎牛血清刺激的平滑肌细胞增殖。
表5
Figure GSB00000556204300221
*P＜0.05vs对照组
由此，阐明了在实施例1中制备的包含吡格列酮的纳米颗粒具有强的血管平滑肌细胞增殖抑制作用。
实施例2
(1)包含吡格列酮的脱乙酰壳多糖-改性的PLGA纳米颗粒的制备
将PLGA(PLGA7520，乳酸/乙醇酸＝75/25，重均分子量20,000，由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制备)(2g)溶于丙酮(20mL)中，加入溶于甲醇(10mL)中的吡格列酮盐酸盐(100mg)，得到聚合物溶液。在40℃，以4mL/min的恒定速率将该溶液滴加到2wt％的聚乙烯醇(PVA，由KURARAY CO.，LTD.制备)的水溶液(50mL)中，同时搅拌。此时，因为自乳化作用制备了纳米尺寸的乳滴(该自乳化作用由丙酮、甲醇和水的相互扩散在乳滴表面产生的湍流引起)。此后，蒸发丙酮和甲醇，离心获得的PLGA纳米颗粒悬浮液(离心加速度41000G，-20℃，20min)，得到PLGA纳米颗粒沉淀物，将其再悬浮在净化水中以除去没有吸附在PLGA表面上的过量PVA。向其中加入0.02wt％脱乙酰壳多糖(由Katakura Chikkarin Co.，Ltd.制备)的水溶液(50mL)，搅拌该混合物1hr，并在-45℃冷冻干燥，以粉末化包含吡格列酮的脱乙酰壳多糖改性的PLGA纳米颗粒。
得到的粉末在水中的再分散性良好。通过动态光散射方法测量所述纳米颗粒粉末在再分散在净化水中之后的平均颗粒尺寸，实测值为584nm。吡格列酮在所述纳米颗粒粉末中的含量为2.42wt％。
(2)包含吡格列酮的纳米颗粒洗脱支架的制备
将在(1)中获得的包含吡格列酮的脱乙酰壳多糖改性的PLGA纳米颗粒悬浮在净化水中，得到纳米颗粒(0.25wt％)悬浮液。在加工支架之前，使不锈钢(SUS316L)多联支架(multi-link stent)(长度15mm)穿过不锈钢管(内径1.1mm，外径1.3mm)，以得到负极。将碳棒设置为正极。将该纳米颗粒悬浮液装入具有上开口表面的电解槽(内径8.5mm，外径9.5mm，高度23mm)中，并且将安装有支架体的不锈钢管直立设置在电解槽中，使所述支架体将完全浸入所述纳米颗粒悬浮液中，并且不锈钢管的一部分将从液体表面伸出。然后，串联连接外部电源装置(直流电源，Nippon Stabilizer Industry Co.，Ltd.)和安培计，使碳棒成为正极和不锈钢管成为负极，调节电压以保持电流5mA恒压，并供电10分钟。因为支架体和不锈钢管是由相同的材料制备的并且具有相同的电导率，所以支架体可以均匀地带电。在完成带电后，从不锈钢管中移出支架体，并干燥。
试验实施例8
在灵长类支架内狭窄模型中的再狭窄抑制作用
使用在实施例2中获得的包含吡格列酮的纳米颗粒洗脱支架，试验在灵长类支架内狭窄模型中的再狭窄抑制作用。
(1)试验动物
从Primate Corporation购买雄性5岁龄猕猴(Macaca fascicularis)并使用。允许猴子饮水，并饲喂正常饮食，直到开始试验。
(2)饮食
从试验开始至解剖给予高脂肪饮食(包含0.5％的胆固醇)。
(3)评价方法
在从试验开始的第1个月，将在实施例2中获得的包含吡格列酮的纳米颗粒洗脱支架、包含FITC的纳米颗粒洗脱支架和裸金属支架放置到左髂动脉和右髂动脉中。在支架术的第28天，洗涤其中已经安装支架的动脉，经由心脏用磷酸盐缓冲的盐水和缓冲的中性福尔马林固定，并分离。制备树脂切片，用苏木精-伊红染色，并评价新内膜面积。
(4)结果
结果显示在表6中。
表6
Figure GSB00000556204300241
*P＜0.05vs裸金属支架组，
+P＜0.05vs包含FITC的纳米颗粒洗脱支架组
由此，发现包含吡格列酮的纳米颗粒洗脱支架显著地抑制支架术后的新内膜形成和抑制再狭窄。
试验实施例9
在小鼠后肢局部缺血模型中包含吡格列酮的纳米颗粒的血管生成促进作用
使用在实施例1中获得的包含吡格列酮的纳米颗粒，试验在小鼠后肢局部缺血模型中的血管生成促进作用。
(1)试验动物
从CLEA Japan，Inc.购买雄性野生型小鼠(C57BL/6J)并使用。允许小鼠饮水和消耗食物，并饲喂正常饮食，直到试验结束。
(2)后肢局部缺血模型的制备
用戊巴比妥深麻醉8周龄野生型小鼠，暴露左侧股动脉/静脉。用6-0丝线结扎股浅动脉和静脉(从股深动脉和静脉之下到腘动脉和静脉)，并切开，以得到局部缺血模型。
(3)给药方法和剂量
在制备后肢局部缺血模型之后，将试验动物分成2组(1)溶剂对照组，和(2)包含吡格列酮的纳米颗粒组。在制备模型之后，立即将溶剂或通过将包含吡格列酮的纳米颗粒悬浮在溶剂中获得的悬浮液(以纳米颗粒计0.9mg/100μL，以吡格列酮浓度计0.027mg/100μL)分别以100μL肌内注射到左大腿肌肉(相当于剂量1.125mg/kg)。对于溶剂，使用磷酸盐缓冲的盐水。在给药之后，缝合皮肤。
(4)评价方法
在局部缺血之后第21天，使用激光多普勒灌注影像(LDPI)分析器(Moor Instruments)评价局部缺血肢体(左肢)和非局部缺血肢体(右肢)的血液流动。作为局部缺血肢体的LDPI信号与非局部缺血肢体的LDPI信号的比值确定测定后肢血液流动比。
(5)结果
结果显示在表7中。
表7
Figure GSB00000556204300251
*P＜0.05vs对照组
虽然已经认识到7周连续口服给药(总剂量147mg/kg)高浓度吡格列酮(3mg/kg)的效果(参见Biomedicine&Pharmacotherapy 62(2008)46-52)，但是从以上发现给药包含非常少量(1/130)吡格列酮的纳米颗粒显著地促进血管生成，推测这是由于内皮功能改善作用引起的。
本申请基于在日本提交的申请No.2007-322409和2008-125071，在此将其内容通过引用引入本文。

Claims (10)

1.纳米颗粒，其包括吡格列酮盐酸盐和生物相容性聚合物，其中所述生物相容性聚合物为乳酸-乙醇酸共聚物。
2.权利要求1的纳米颗粒，其中所述吡格列酮盐酸盐的含量以吡格列酮计为0.1至10wt％。
3.权利要求1的纳米颗粒，其用于预防或治疗动脉硬化疾病。
4.权利要求3的纳米颗粒，其用于肠胃外给药。
5.包括权利要求1的纳米颗粒的药物制剂，其用于预防或治疗动脉硬化疾病。
6.用于肠胃外给药的包括权利要求1的纳米颗粒的药物制剂，其用于预防或治疗动脉硬化疾病。
7.载有权利要求1的纳米颗粒的支架。
8.载有权利要求1的纳米颗粒的支架，其用于预防或治疗动脉硬化疾病。
9.权利要求1的纳米颗粒在制备用于预防或治疗动脉硬化疾病的药剂中的用途。
10.权利要求1的纳米颗粒在制备用于预防或治疗动脉硬化疾病的支架中的用途。
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