JP2011505810A5

JP2011505810A5 -

Info

Publication number: JP2011505810A5
Application number: JP2010537235A
Authority: JP
Filing date: 2008-12-03
Publication date: 2012-01-26

Description

ｈ４Ｃ８ＶＬａ遺伝子およびｐＧＥＭ−Ｔ／ＣＬベクターを鋳型として用いて、オーバーラッピングＰＣＲによって、ヒト化抗体の軽鎖遺伝子を合成した。反応条件は、９５℃で１５分；９４℃で５０秒、５８℃で５０秒、７２℃で５０秒を３０サイクル；７２℃で１０分であった。このようにして得られたＰＣＲ産物はｈ４Ｃ８ＶＬａＣＬであり、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位およびシグナルペプチド遺伝子配列、３’末端に翻訳停止コードＴＡＡおよびＥｃｏＲＩ制限酵素部位を含む。シグナルペプチドの配列は配列番号：（ＡＴＧＧＡＴＴＴＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＡＴＴＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＡＡＴＣＡＧＴＧＣＣＴＣＡＧＴＣＡＴＡＡＴＡＴＣＣＡＧＡＧＧＡ）に示す。正しい配列を持つクローンを選択し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩによって消化し、アガロースゲル電気泳動を行った後、ヒト化抗体の軽鎖断片Ｈ４Ｃ８ＶＬａＣＬを回収し、同じくＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩによって消化したプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）とライゲーションして、ヒト化軽鎖真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）（ｈ４Ｃ８ＶＬａＣＬ）を構築した。

モデリングした４Ｃ８モノクローナル抗体の可変領域の三次元構造を分析することにより、ＣＤＲ領域の周囲５Å内の９つのフレームワーク残基、Ｌ３Ｌｅｕ、Ｌ４Ｌｅｕ、Ｌ４６Ｌｅｕ、Ｈ２Ｉｌｅ、Ｈ４６Ｌｙｓ、Ｈ６８Ａｌａ、Ｈ６９Ｌｅｕ、Ｈ８２ａＡｓｎ、およびＨ９１Ｐｈｅが、ヒト化鋳型の対応する位置と異なると同時に、原型である抗体のＣＤＲコンホメーションに影響する可能性があることが発見された。構築されたＣＤＲグラフティング抗体内にこれらのマウス由来アミノ酸残基を残したままヒト化抗体（ｈ４Ｃ８Ｈｂ／ｈ４Ｃ８Ｌｂ）を得ることができる。ｈ４Ｃ８Ｈｂおよびｈ４Ｃ８Ｌｂの可変領域に対するアミノ酸配列を図２に示す。配列番号５および６は、それぞれ、ｈ４Ｃ８Ｈｂのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。配列番号７および８は、それぞれ、ｈ４Ｃ８Ｌｂのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。ｈ４Ｃ８Ｈｂの３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、それぞれ、ＨＣＤＲ１（ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ）、ＨＣＤＲ２（ＷＩＮＴＮＴＧＥＰＫＹＡＥＥＦＫＧ）、ＨＣＤＲ３（ＧＹＧＮＹＡＲＧＡＷＬＡＹ）である（図２−１のＨ４Ｃ８ＶＨｂ参照）。ｈ４Ｃ８Ｌｂの３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、それぞれ、ＬＣＤＲ１（ＲＳＳＱＴＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ）、ＬＣＤＲ２（ＱＶＳＮＲＦＳ）、ＬＣＤＲ３（ＦＱＧＳＨＶＰＲＴ）である（図２−２のＨ４Ｃ８ＶＬｂ参照）。ヒト化抗体の重鎖可変領域遺伝子および軽鎖可変領域遺伝子（ｈ４Ｃ８ＶＨｂ／ｈ４Ｃ８ＶＬｂ）を、それぞれ、オーバーラッピングＰＣＲを用いて合成し、ヒト化抗体（ｈ４Ｃ８Ｈａ／ｈ４Ｃ８Ｌａ）についてと同じ方法を用いて軽鎖発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）（ｈ４Ｃ８ＶＬｂＣＬ）および重鎖発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ｈ４Ｃ８ＶＨｂＣＨ）を構築した。次いで、軽鎖発現ベクターおよび重鎖発現ベクターをＣＯＳ−１細胞に共トランスフェクトした。フローサイトメトリーアッセイを行って抗体の抗原結合活性を決定し、その結果、ＫＧ−１ａに対するこの抗体の結合能は４Ｃ８キメラ抗体の結合能と同様であることが示され、よってこのヒト化抗体（ｈ４Ｃ８Ｈｂ／ｈ４Ｃ８Ｌｂ）をｈ４Ｃ８として設計した。

Claims

少なくとも１つの抗原結合部位を含むヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体であって、前記抗原結合部位が、
配列番号６のアミノ酸１−１２２に示すアミノ酸配列を有する第１の可変領域と、
配列番号８のアミノ酸１−１１３に示すアミノ酸配列を有する第２の可変領域と
を少なくとも含む、ヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体。
前記抗原結合部位が、
１）前記第１の可変領域およびヒト免疫グロブリン重鎖定常領域またはその断片を含む免疫グロブリン重鎖またはその断片と、
２）前記第２の可変領域およびヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域またはその断片を含む免疫グロブリン軽鎖またはその断片と
を含む、請求項１に記載のヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体。
前記ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域またはその断片がγ型であり、前記ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域またはその断片がκ型またはλ型である、請求項１又は２のいずれかに記載のヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体。
配列番号５のヌクレオチド１−３６６に示す、請求項１に記載の第１の可変領域をコードするヌクレオチド配列と、配列番号７のヌクレオチド１−３３９に示す、請求項１に記載の第２の可変領域をコードするヌクレオチド配列とを少なくとも含む、請求項１〜３のいずれかに記載のヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体をコードするヌクレオチド分子。
下記の配列、
ａ）前記第１の可変領域をコードするヌクレオチド配列およびヒト免疫グロブリン重鎖定常領域またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む、免疫グロブリン重鎖またはその断片をコードするヌクレオチド配列と、
ｂ）前記第２の可変領域をコードするヌクレオチド配列およびヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む、免疫グロブリン軽鎖またはその断片をコードするヌクレオチド配列と
を含む、請求項４に記載のヌクレオチド分子。
前記重鎖定常領域のヌクレオチド配列が配列番号１に示され、前記軽鎖定常領域のヌクレオチド配列が配列番号３に示される、請求項５に記載のヌクレオチド分子。
請求項１〜３のいずれかに記載のヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体を含有する免疫コンジュゲート。
免疫磁気ビーズである、請求項７に記載の免疫コンジュゲート。
骨髄造血幹細胞／骨髄造血前駆細胞の選別における、請求項１に記載のヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体の使用。
請求項１〜３のいずれかに記載のヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体の調製方法であって、
１）請求項４から６のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子を使用して発現ベクターを形質転換し、得られた発現ベクターを使用して宿主細胞を形質転換するステップと、
２）前記宿主細胞を培養するステップと、
３）前記宿主細胞によって発現されたヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体を採取、分離および精製するステップと
を含む、方法。