JP2022516351A - 抗tigit抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
がん免疫療法は腫瘍に対する認識及び応答を高める免疫系の調節に依存する。そのような調節は、免疫細胞上に存在する共刺激分子の活性化を含む、または共抑制性受容体の阻害を介した複数のメカニズムによって達成することができる。免疫応答の活性化は、抗原特異的応答の開始に重要な抗原提示細胞及び腫瘍細胞の破壊に関与するエフェクター細胞のような多数の細胞集団が関与する複雑なメカニズムである。細胞傷害性T細胞のようなエフェクター細胞の活性化を調節するメカニズムは多数であり、がん免疫療法の文脈では選択の標的を表す。
HCDR1は配列番号16(YTFTSYYMH)を含み、またはそれから成り、
HCDR2は
を含み、またはそれから成り、
HCDR3は
を含み、またはそれから成り、
LCDR1は配列番号61(RASQSVRSSYLA)を含み、またはそれから成り、
LCDR2は配列番号62(GASSRAT)を含み、またはそれから成り、及び
LCDR3は配列番号63(QQYFSPPWT)を含み、またはそれから成る。
本明細書で使用されるとき、用語「免疫グロブリン」には、それが関連する特異的な免疫反応性を持っていようと持っていまいと、2本の重鎖と2本の軽鎖の組み合わせを有するポリペプチドが含まれる。「抗体」は、対象とする抗原(たとえば、TIGIT)に対する有意な既知の特異的な免疫反応性活性を有するそのような集合体を指す。用語「TIGIT抗体」または「抗TIGIT抗体」はTIGITタンパク質に対する免疫的な特異性を示す抗体を指すのに本明細書で使用される。抗体及び免疫グロブリンは、それらの間での鎖間共有結合の有無にかかわらず、軽鎖及び重鎖を含む。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリンの構造は相対的によく理解されている。
1残基の番号付けはKabat,et al,上記の命名法に従う。
2残基の番号付けはChothia,et al,上記の命名法に従う。
3残基の番号付けはMacCallum,et al,上記の命名法に従う。
態様の1つでは、本発明は、ヒトTIGITに結合し、且つ図1に示すHCDR1、HCDR2、及びHCDR3の配列から選択される重鎖CDR1(HCDR1)と重鎖CDR2(HCDR2)と重鎖CDR3(HCDR3)とを含む重鎖可変ドメインを含み、さらに図2に示すLCDR1、LCDR2、及びLCDR3の配列から選択される軽鎖CDR1(LCDR1)と軽鎖CDR2(LCDR2)と軽鎖CDR3(LCDR3)とを含む軽鎖可変ドメインを含む単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。すなわち、本発明は、ヒトTIGITに結合し、且つ重鎖CDR1(HCDR1)と重鎖CDR2(HCDR2)と重鎖CDR3(HCDR3)とを含む重鎖可変ドメインを含み、その際、
(i)HCDR1は配列番号1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、271、274、及び277から成る群から選択され;
(ii)HCDR2は配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、272、275、及び278から成る群から選択され;
(iii)HCDR3は配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、273、276、及び279から成る群から選択され;
且つさらに軽鎖CDR1(LCDR1)と軽鎖CDR2(LCDR2)と軽鎖CDR3(LCDR3)とを含む軽鎖可変ドメインを含み、その際、
(iv)LCDR1は配列番号46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、283、286、及び289から成る群から選択され;
(v)LCDR2は配列番号47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、284、287、及び290から成る群から選択され;
(vi)LCDR3は配列番号48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、285、288、及び291から成る群から選択される、
単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
(i)配列番号1を含むHCDR1、配列番号2を含むHCDR2、配列番号3を含むHCDR3、配列番号46を含むLCDR1、配列番号47を含むLCDR2、及び配列番号48を含むLCDR3;
(ii)配列番号4を含むHCDR1、配列番号5を含むHCDR2、配列番号6を含むHCDR3、配列番号49を含むLCDR1、配列番号50を含むLCDR2、及び配列番号51を含むLCDR3;
(iii)配列番号7を含むHCDR1、配列番号8を含むHCDR2、配列番号9を含むHCDR3、配列番号52を含むLCDR1、配列番号53を含むLCDR2、及び配列番号54を含むLCDR3;
(iv)配列番号10を含むHCDR1、配列番号11を含むHCDR2、配列番号12を含むHCDR3、配列番号55を含むLCDR1、配列番号56を含むLCDR2、及び配列番号57を含むLCDR3;
(v)配列番号13を含むHCDR1、配列番号14を含むHCDR2、配列番号15を含むHCDR3、配列番号58を含むLCDR1、配列番号59を含むLCDR2、及び配列番号60を含むLCDR3;
(vi)配列番号16を含むHCDR1、配列番号17を含むHCDR2、配列番号18を含むHCDR3、配列番号61を含むLCDR1、配列番号62を含むLCDR2、及び配列番号63を含むLCDR3;
(vii)配列番号19を含むHCDR1、配列番号20を含むHCDR2、配列番号21を含むHCDR3、配列番号64を含むLCDR1、配列番号65を含むLCDR2、及び配列番号66を含むLCDR3;
(viii)配列番号22を含むHCDR1、配列番号23を含むHCDR2、配列番号24を含むHCDR3、配列番号67を含むLCDR1、配列番号68を含むLCDR2、及び配列番号69を含むLCDR3;
(ix)配列番号25を含むHCDR1、配列番号26を含むHCDR2、配列番号27を含むHCDR3、配列番号70を含むLCDR1、配列番号71を含むLCDR2、及び配列番号72を含むLCDR3;
(x)配列番号28を含むHCDR1、配列番号29を含むHCDR2、配列番号30を含むHCDR3、配列番号73を含むLCDR1、配列番号74を含むLCDR2、及び配列番号75を含むLCDR3;
(xi)配列番号31を含むHCDR1、配列番号32を含むHCDR2、配列番号33を含むHCDR3、配列番号76を含むLCDR1、配列番号77を含むLCDR2、及び配列番号78を含むLCDR3;
(xii)配列番号34を含むHCDR1、配列番号35を含むHCDR2、配列番号36を含むHCDR3、配列番号79を含むLCDR1、配列番号80を含むLCDR2、及び配列番号81を含むLCDR3;
(xiii)配列番号37を含むHCDR1、配列番号38を含むHCDR2、配列番号39を含むHCDR3、配列番号82を含むLCDR1、配列番号83を含むLCDR2、及び配列番号84を含むLCDR3;
(xiv)配列番号40を含むHCDR1、配列番号41を含むHCDR2、配列番号42を含むHCDR3、配列番号85を含むLCDR1、配列番号86を含むLCDR2、及び配列番号87を含むLCDR3;
(xv)配列番号43を含むHCDR1、配列番号44を含むHCDR2、配列番号45を含むHCDR3、配列番号88を含むLCDR1、配列番号89を含むLCDR2、及び配列番号90を含むLCDR3;
(xvi)配列番号271を含むHCDR1、配列番号272を含むHCDR2、配列番号273を含むHCDR3、配列番号283を含むLCDR1、配列番号284を含むLCDR2、及び配列番号285を含むLCDR3;
(xvii)配列番号274を含むHCDR1、配列番号275を含むHCDR2、配列番号276を含むHCDR3、配列番号286を含むLCDR1、配列番号287を含むLCDR2、及び配列番号288を含むLCDR3;
(xviii)配列番号277を含むHCDR1、配列番号278を含むHCDR2、配列番号279を含むHCDR3、配列番号289を含むLCDR1、配列番号290を含むLCDR2、及び配列番号291を含むLCDR3
から成る群から選択される。
(i)配列番号211のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号212のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(ii)配列番号213のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号214のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(iii)配列番号215のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号216のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(iv)配列番号217のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号218のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(v)配列番号219のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号220のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(vi)配列番号221のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号222のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(vii)配列番号223のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号224のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(viii)配列番号225のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号226のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(ix)配列番号227のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号228のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(x)配列番号229のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号230のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(xi)配列番号231のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号232のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(xii)配列番号233のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号234のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(xiii)配列番号235のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号236のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(xiv)配列番号237のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号238のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(xv)配列番号239のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号240のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(xvi)配列番号327のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号328のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(xvii)配列番号329のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号330のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;ならびに
(xviii)配列番号331のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号332のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン
から成る群から選択される。
本発明はまた、残基Q56及びI109を含むエピトープにてヒトTIGITに結合する抗体またはその抗原結合断片も提供する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は少なくとも残基Q56、N58及びI109にてヒトTIGITを結合する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は残基Q56、N58及びI109及び任意でE60、I68、L73及びH76の1つ以上を含むエピトープにてヒトTIGITを結合する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は残基Q56、N58、E60、I68、L73、H76、及びI109を含むエピトープにてヒトTIGITを結合する。
TIGIT抗体はVHドメイン及びVLドメインの双方が存在する種々の異なる実施形態を取ることができる。用語「抗体」は本明細書では最も広い意味で使用され、それらがヒトTIGITタンパク質に対する適正な免疫的特異性を示す限り、モノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(たとえば、二重特異性抗体)を包含するが、これらに限定されない。用語「モノクローナル抗体」は本明細書で使用されるとき、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、軽微な量で存在してもよい天然に存在する考えられる突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原性部位に向けられる。さらに、抗原上の異なる決定基(エピトープ)に向けられた異なる抗体を通常含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基またはエピトープに向けられる。
特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片はヒトTIGITに対して高親和性を示す。特定の実施形態では、本発明に係る抗体のFab断片は1×10-10~5×10-8M、任意で7×10-10~4×10-8Mの範囲のForteBio(商標)によって測定されるTIGITに対するKDを示す。特定の実施形態では、本発明に係る抗体は1×10-11~5×10-9M、任意で2×10-11~1×10-9Mの範囲のMSDのKDを示す。特定の実施形態では、本発明に係る抗体のFab断片は1×10-10~1×10-9M、任意で1×10-10~7×10-10M、任意で2×10-10~7×10-10Mの範囲でBiacore(商標)によって測定されるTIGITに対するKDを示す。
本発明に係る抗体(たとえば、抗体31282)は驚くべきことに、CD8+T細胞の炎症誘発性活性を促進することにて効果的である。実施例で実証されているように、本発明の抗体または抗原結合断片(特に31282)は、比較基準である抗TIGIT抗体よりも炎症誘発性CD8+T細胞の活性を促進すること(IFNgの放出によって示される)にてさらに効果的である(図24を参照のこと)。比較基準抗体に対するこの改善された有効性はTIGITを発現しているトランスジェニックJurkatレポーター細胞及び初代CD8T細胞において実証された。従って、特定の実施形態では、本明細書で提供されている抗TIGIT抗体または抗原結合断片は、実施例19に記載されているようにJurkatレポーター細胞によって発現させたヒトTIGITに対する5nM未満の活性化EC50を示す。好ましいそのような実施形態では、抗体または抗原結合断片は、約1nM~約4nM、好ましくは約2nM~約4nMのEC50を示す。
本明細書で実証されているように、抗TIGIT抗体はTIGITを発現しているTreg細胞を選択的に枯渇させることができる。すなわち、抗TIGIT抗体はそれらがエフェクターまたはメモリーのCD4またはCD8のT細胞の比率を減らすよりも大きな程度にT細胞の集団全体に対するTIGITを発現しているTreg細胞の比率を減らす。
本発明に係る抗体または抗原結合断片によって示されたさらに驚くべき有利な特性には、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)のT細胞エフェクター機能(たとえば、炎症誘発性サイトカインの放出)を高めることが挙げられる。腫瘍微小環境への曝露は、たぶん抗原過剰曝露及び/または免疫抑制性腫瘍微小環境のせいで、反応不顕性のまたはいわゆる「疲弊した」表現型を示すTILをもたらすことができる。腫瘍自体に浸潤しているので腫瘍のサイズまたは増殖を減らすのに最良に適する場所に位置する細胞なので、TILのエフェクター機能を高めることは望ましい;しかしながら、多数のTILの反応不顕性のまたは疲弊した表現型のせいでそのエフェクター機能を強化するのは難しいと予想される。従って、本発明の抗体への曝露に続くTILの炎症誘発性反応における上昇は驚くべきことであり、抗体が特に有効な治療剤であってもよいことを示している。
付随する実施例で実証されているように、本発明はまた、TIGITの結合についてCD155/PVRと競合しない抗TIGIT抗体も提供する。従って、さらなる態様では、本発明はヒトTIGITの結合についてCD155/PVRと競合しないヒトTIGIT抗体またはその抗原結合断片を提供する。特定のそのような実施形態では、本発明に係るCD155と競合しない抗TIGIT抗体のFab断片は5×10-9~5×10-8M、任意で1×10-8~3×10-8Mの範囲でのForteBio(商標)によって測定されるTIGITに対するKDを示す。
本発明はまた、本発明のTIGIT抗体をコードするポリヌクレオチド分子と、宿主細胞または無細胞発現システムにおける抗原結合ポリペプチドの発現を可能にする調節配列に動作可能に連結された本発明のTIGIT抗体をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターと、この発現ベクターを含有する宿主細胞または無細胞発現システムとを提供する。
(i)配列番号16を含むHCDR1、配列番号17を含むHCDR2、配列番号18を含むHCDR3、配列番号61を含むLCDR1、配列番号62を含むLCDR2、及び配列番号63を含むLCDR3;
(ii)配列番号4を含むHCDR1、配列番号5を含むHCDR2、配列番号6を含むHCDR3、配列番号49を含むLCDR1、配列番号50を含むLCDR2、及び配列番号51を含むLCDR3;
(iii)配列番号7を含むHCDR1、配列番号8を含むHCDR2、配列番号9を含むHCDR3、配列番号52を含むLCDR1、配列番号53を含むLCDR2、及び配列番号54を含むLCDR3;
(iv)配列番号10を含むHCDR1、配列番号11を含むHCDR2、配列番号12を含むHCDR3、配列番号55を含むLCDR1、配列番号56を含むLCDR2、及び配列番号57を含むLCDR3;
(v)配列番号13を含むHCDR1、配列番号14を含むHCDR2、配列番号15を含むHCDR3、配列番号58を含むLCDR1、配列番号59を含むLCDR2、及び配列番号60を含むLCDR3;
(vi)配列番号1を含むHCDR1、配列番号2を含むHCDR2、配列番号3を含むHCDR3、配列番号46を含むLCDR1、配列番号47を含むLCDR2、及び配列番号48を含むLCDR3;
(vii)配列番号19を含むHCDR1、配列番号20を含むHCDR2、配列番号21を含むHCDR3、配列番号64を含むLCDR1、配列番号65を含むLCDR2、及び配列番号66を含むLCDR3;
(viii)配列番号22を含むHCDR1、配列番号23を含むHCDR2、配列番号24を含むHCDR3、配列番号67を含むLCDR1、配列番号68を含むLCDR2、及び配列番号69を含むLCDR3;
(ix)配列番号25を含むHCDR1、配列番号26を含むHCDR2、配列番号27を含むHCDR3、配列番号70を含むLCDR1、配列番号71を含むLCDR2、及び配列番号72を含むLCDR3;
(x)配列番号28を含むHCDR1、配列番号29を含むHCDR2、配列番号30を含むHCDR3、配列番号73を含むLCDR1、配列番号74を含むLCDR2、及び配列番号75を含むLCDR3;
(xi)配列番号31を含むHCDR1、配列番号32を含むHCDR2、配列番号33を含むHCDR3、配列番号76を含むLCDR1、配列番号77を含むLCDR2、及び配列番号78を含むLCDR3;
(xii)配列番号34を含むHCDR1、配列番号35を含むHCDR2、配列番号36を含むHCDR3、配列番号79を含むLCDR1、配列番号80を含むLCDR2、及び配列番号81を含むLCDR3;
(xiii)配列番号37を含むHCDR1、配列番号38を含むHCDR2、配列番号39を含むHCDR3、配列番号82を含むLCDR1、配列番号83を含むLCDR2、及び配列番号84を含むLCDR3;
(xiv)配列番号40を含むHCDR1、配列番号41を含むHCDR2、配列番号42を含むHCDR3、配列番号85を含むLCDR1、配列番号86を含むLCDR2、及び配列番号87を含むLCDR3;
(xv)配列番号43を含むHCDR1、配列番号44を含むHCDR2、配列番号45を含むHCDR3、配列番号88を含むLCDR1、配列番号89を含むLCDR2、及び配列番号90を含むLCDR3;
(xvi)配列番号271を含むHCDR1、配列番号272を含むHCDR2、配列番号273を含むHCDR3、配列番号283を含むLCDR1、配列番号284を含むLCDR2、及び配列番号285を含むLCDR3;
(xvii)配列番号274を含むHCDR1、配列番号275を含むHCDR2、配列番号276を含むHCDR3、配列番号286を含むLCDR1、配列番号287を含むLCDR2、及び配列番号288を含むLCDR3;
(xviii)配列番号277を含むHCDR1、配列番号278を含むHCDR2、配列番号279を含むHCDR3、配列番号289を含むLCDR1、配列番号290を含むLCDR2、及び配列番号291を含むLCDR3
から成る群から選択される。
(i)HCDR1は配列番号16を含むまたはそれから成り、HCDR2は配列番号17を含むまたはそれから成り、HCDR3は配列番号18を含むまたはそれから成り、LCDR1は配列番号61を含むまたはそれから成り、LCDR2は配列番号62を含むまたはそれから成り、且つLCDR3は配列番号63を含むまたはそれから成る。
本明細書で提供されるのはまた、1つ以上の薬学上許容できるキャリアまたは賦形剤と共に製剤化される本発明に係る抗体または抗原結合断片を含む医薬組成物である。そのような組成物は、(たとえば、2以上の異なる)TIGIT抗体を1つまたはその組み合わせを含んでもよい。ヒトでの治療用途のために抗体を製剤化する技法は当該技術で周知であり、たとえば、Wang,et al.,Journal of Pharmaceutical Sciences,Vol.96,pp1-26,2007にて概説されている。
本明細書で実証されているように、本発明の抗体またはその抗原結合断片は追加の治療剤と組み合わせて投与されると特に効果的である。たとえば、本発明の抗体またはその抗原結合断片は免疫チェックポイント阻害剤―具体的に抗ICOSアンタゴニスト抗体または抗PD-1抗体(すなわち、ヒト免疫調節分子PD-1に特異的なアンタゴニスト抗体)と組み合わせて投与されると特に効果的である。抗ICOS抗体または抗PD-1抗体と組み合わせた抗TIGIT抗体の投与は、いずれかの抗体単独と比べて腫瘍増殖にて相乗的な減少を生じる。本発明に係る抗TIGIT抗体と抗PD-L1抗体との組み合わせを用いて類似の効果が観察されると予想される。
HCDR1は配列番号16(YTFTSYYMH)を含み、
HCDR2は
を含み、
HCDR3は
を含み、
LCDR1は配列番号61(RASQSVRSSYLA)を含み、
LCDR2は配列番号62(GASSRAT)を含み、且つ
LCDR3は配列番号63(QQYFSPPWT)を含む。
本明細書で提供されているTIGIT抗体またはその抗原結合断片、医薬組成物及び組み合わせを用いてインビボでがん性腫瘍細胞の増殖を阻害することができるので、腫瘍の治療に有用である。
を含むまたはそれから成り、HCDR3は
を含むまたはそれから成り、LCDR1は配列番号61(RASQSVRSSYLA)を含むまたはそれから成り、LCDR2は配列番号62(GASSRAT)を含むまたはそれから成り、且つLCDR3は配列番号63(QQYFSPPWT)を含むまたはそれから成る。
TIGITのABPは、たとえば、WO2009036379;WO2010105256;WO2012009568;及びXu,et al.,Protein Eng.Des.Sel.,Vol.26(10),pp.663-670(2013))に記載されているように一般的に及び以下で提供されているようにさらに具体的にIgG形式にて酵母細胞の表面上に発現され、提示されるヒト抗体の合成ライブラリから選択した。組換えライブラリから単離されたABPの配列及び特徴は図1~6に提供されている。
3つの成熟戦略:軽鎖の多様化、HCDR1及びHCDR2の多様化、及び選択されたHCDR1とHCDR2の多様性プールの範囲内でのHCDR3の多様化を利用してナイーブなクローンの最適化を行った。
A.酵母における産生
さらなる特性評価のために十分量の最適化した及び最適化していない選択した抗体を産生させるために、酵母クローンを飽和まで増殖させ、次いで振盪しながら30℃で48時間誘導した。誘導の後、酵母細胞をペレットにし、精製のために上清を回収した。プロテインAカラムを用いてIgGを精製し、酢酸pH2.0で溶出した。パパイン消化によってFab断片を生成し、プロテインA(GE LifeSciences)及びKappaSelect(GE Healthcare LifeSciences)によって2段階プロセスで精製した。
さらなる特性評価のために十分量の最適化した及び最適化していない選択した抗体を産生させるために、特異的抗体クローンをコードするDNAベクターを生成し、HEK細胞に形質導入した。抗体可変ドメインについてヒトのコドンで最適化した合成DNA断片はGeneartでオーダーした。マウスのIgカッパのシグナル配列及び各抗体クラスの定常領域を含有しているpUPE発現ベクターに可変ドメインの配列を途切れなくライゲーションした。発現ベクターは制限解析及びDNA配列決定によって検証した。一時的な形質移入にために、確立されたプロトコールに従ってエンドトキシンを含まないDNAmaxiprep(Sigma)を作製し、Freestyle培地(ThermoFisherScientific)にて重鎖及び軽鎖のベクターでHEK293EBNA1細胞に同時形質移入した。形質移入の24時間後、プリマトン(最終容量0.55%)を加えた。形質移入の6日後、馴化培地を回収した。Mabselect sureLX(GE Healthcare)アフィニティクロマトグラフィーによって抗体をバッチごとに精製した。1MのNaClを含有するPBS及びPBSによって2段階で結合した抗体を洗浄した。抗体を20mMのクエン酸塩、150mMのNaCl、pH3で溶出し、1/6容量の1MのK2HPO4/KH2PO4、pH8でおよそpH7に中和した。
A.ForteBioによるKDの測定
選択した抗体のForteBio親和性測定は以前記載された(たとえば、Estep,et al.,Mabs,Vol.5(2),pp.270-278(2013)を参照のこと)ように一般に実施した。手短には、ForteBio親和性測定はAHQセンサーにオンラインでIgGを負荷することによって実施される。センサーをオフラインにてアッセイ緩衝液で30分間平衡化し、次いでベースラインの確立のためにオンラインで60秒間モニターした。負荷したIgGを伴うセンサーを100nMの抗原(ヒトTIGIT-Fc、ヒトTIGIT-HisまたはカニクイザルTIGIT-Fc)に5分間曝し、その後、オフ速度の測定のためにそれらをアッセイ緩衝液に5分間移した。1:1の結合モデルを用いて動態を解析した。ForteBioによって90を超える抗体を親和性について調べ、表3は組換えTIGITタンパク質への強い結合を示す15の選択された抗TIGIT抗体についてのデータを提供する。
選択した抗体の平衡親和性測定は、以前記載された(Estep,et al.,Mabs,Vol.5(2),pp.270-278(2013))ように一般に実施した。手短には、PBS+0.1%のIgGを含まないBSA(PBSA)にて10~100pMにて一定を保持し、10pM~10nMで開始して3~5倍の連続希釈したFabまたはmAbと共にインキュベートした抗原(TIGIT-His単量体)によって溶液平衡滴定(SET)を行った。抗体(PBA中20nM)を標準結合のMSD-ECLプレートに4℃で一晩または室温で30分間コーティングした。次いで700rpmで振盪しながらBSAによって30分間プレートをブロックし、その後洗浄緩衝液(PBSF+0.05%Tween20)で3回洗浄した。SET試料をプレートに入れ、700rpmで振盪しながら150秒間インキュベートし、その後1回洗浄した。プレート上で捕捉された抗原をプレート上で3分間インキュベートすることによってPBSF中250ng/mLスルホタグで標識したストレプトアビジンによって検出した。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄し、次いで界面活性剤を伴った1×Read緩衝液Tを用いてMSD Sector Imager2400機器にて読み取った。Prismにて遊離の抗原の百分率を滴定した抗体の関数としてプロットし、KDを抽出する四元方程式に適合させた。処理能力を改善するために、SET試料の調製を含めてMSD-SET実験全体を通して液体を取り扱うロボットを使用した。選択した抗体をMSDによって親和性について調べたが、表4は組換えTIGITタンパク質への強力な結合を示す7つの抗TIGITクローンについてのデータを提供する。
CM5センサーチップ(GE Healthcare,Marlboro,MA)を接続したBiacoreの8K光学バイオセンサーを用いてHBS-EP緩衝液系(10mMのHEPES、pH7.3、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.05%の界面活性剤P20)にて25℃でバイオセンサー分析を実施した。サンプルホテルを8℃で維持した。標準のアミンカップリング化学反応を用いて、センサーチップの双方のフローセルにヤギ抗ヒトIgG捕捉抗体(Fcγ断片に特異的な、Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,West Grove,PA;109-005-098)を不動化した(11700±200RU)。この表面型は各再生工程の後、新しい分析抗体を再生可能に捕捉するための定型を提供した。フローセル2を用いて捕捉抗体を分析した(60~90RU)一方でフローセル1は参照フローセルとして使用した。30から0.123nMに及ぶ(3倍希釈)抗原濃度をランニング緩衝液で調製した。抗原試料濃度のそれぞれを単回反復として実行した。2つのブランク(緩衝液)注入も実行し、システムの作為を評価し、差し引くのに使用した。抗原濃度すべてについて会合相(300s)及び解離相(600s)を30uL/分の流速で実施した。10mMのグリシン、pH1.5の3回の連続注入(15s、15s及び60s)によって30uL/分の流速で表面を再生した。データを並べ、二重参照し、Biacore8K Evaluationソフトウェア、バージョン1.0を用いて1:1結合モデルに当て嵌めた。選択した抗体をBiacoreによって親和性について調べたが、表5は組換えTIGITタンパク質への強い結合を示す5つの抗TIGITクローンについてのデータを提供する。
A.Octet Red384エピトープビニング/リガンドブロッキング
標準のサンドイッチ形式の交差遮断アッセイを用いて、選択した抗体のエピトープビニング/リガンドブロッキングを実施した。対照の抗標的IgGをAHQセンサー上に負荷し、センサー上の占有されていないFc結合部位を無関係なヒトIgG1抗体でブロックした。次いでセンサーを100nMの標的抗原(hTIGIT、Creative Biomart)に曝し、その後、二次抗標的抗体またはリガンド(抗TIGIT抗体及びCD155またはCD113またはCD112)に曝した。ForteBioのデータ解析ソフトウェア7.0を用いてデータを処理した。抗原会合の後の二次抗体またはリガンドによる追加の結合は占有されていないエピトープ(非競合物)を示す一方で、結合がないことはエピトープブロッキング(競合物またはリガンドのブロッキング)を示す。天然のリガンドとの競合について親型抗体(最適化の前の)を調べたが、表6はCD155、CD112及びCD113に対する競合について得られたデータをまとめている。親型クローン26432はTIGITとの結合についてCD155と競合しないことが見いだされた。他の選択した抗TIGIT抗体はすべて組換えヒトTIGITタンパク質への結合について天然のリガンドと競合する。
ヒトTIGITを過剰発現しているJurkat細胞(Jurkat-hTIGIT)を回収し、105個/ウェルで分配し、完全培地にて以下の濃度:166.6;53.24;17.01;5.43;1.73;0.55;0.17;0.05;0.01;5.78×10-3;1.85×10-3;5.9×10-3nMでの抗ヒトTIGIT抗体と共に37℃で45分間インキュベートした。過剰な抗体を洗い流し、次いで細胞を5μg/mLでのCD155-His(Creative Biomart、PVR-3141H)と共に37℃で45分間インキュベートした。次いで、抗Hisタグ-PE(Biolegend,362603,試験当たり2μL)を用いて結合したCD155-Hisを検出し、4℃で30分間インキュベートした。BD LSRFortessaを用いたFACSによって細胞を解析し、CD155の結合を阻止する半分の濃度(IC50)は幾何平均蛍光に基づいて算出した。
Zeba 40kDa 0.5mLのスピンカラム(Thermo Pierce,カタログ#87766)を用いて抗TIGITのIgG1抗体試料をpH6.5での1Mの硫酸アンモニウム及び0.1Mのリン酸ナトリウムに緩衝液交換した。Dionex ProPac HIC-10カラムにてpH6.5での1.8Mの硫酸アンモニウム及び0.1Mのリン酸ナトリウムから硫酸アンモニウムがない同じ条件まで塩勾配を確立した。勾配を0.75mL/分の流速で17分間流した。流入の最後にアセトニトリル洗浄工程を加え、残りのタンパク質を取り除き、次の注入サイクルの前に7カラム容量にわたってカラムを再平衡化した。A280の吸光度でピーク保持時間をモニターし、溶出での硫酸アンモニウムの濃度を勾配及び流速に基づいて算出した。表8は15の選択した抗TIGIT抗体について得られた結果をまとめている。
A.多特異性試薬の調製
Xu,et.al,mAbs,2013に従って多特異性試薬(PSR)を調製した。手短には、2.5リットルのCHO-S細胞を出発物質として使用した。400mLに満たした500mLの遠心ビンにて2,400×gで5分間、細胞をペレットにした。細胞ペレットを合わせ、次いで25mLの緩衝液Bに再浮遊させ、2,400×gで3分間、ペレットにした。緩衝液を捨て、洗浄を1回繰り返した。細胞を氷上で維持しながらポリトロンホモジナイザーを用いて1×プロテアーゼ阻害剤(Roche,cOmplete,EDTAを含まない)を含有するペレット容量の3倍の緩衝液Bに細胞ペレットを再浮遊させた。次いでホモジネートを2,400×gで5分間遠心分離し、上清を保持し、もう1回ペレットにして(2,400×g/5分)、壊れていない細胞、細胞残渣及び核を確実に除いた;得られた上清が総タンパク質調製物である。次いで上清を2本のNalgene Oak Ridgeの45mLの遠心管に移し、4℃にて40,000×gで40分間ペレットにした。分離した細胞質タンパク質(SCP)を含有する上清を次いできれいなOak Ridge試験管に移し、40,000×gでもう1回遠心分離した。並行して、膜分画(EMF)を含有するペレットを保持し、40,000で20分間遠心分離して残留上清を取り除いた。次いでEMFペレットを緩衝液Bですすいだ。次いで8mLの緩衝液Bを膜ペレットに加え、ペレットを移動させ、ダウンスホモジナイザーに移した。ペレットをホモジネートした後、それらを50mLの円錐管に移し、最終的なEMF調製物を表した。
一般にWO2014/179363に記載されているようにPSR解析を行った。手短には、酵母にて提示されるモノクローナル抗体のPSRプロファイルを特徴付けるために、200万個のIgGを提示している酵母を96穴アッセイプレートに移し、3000×gで3分間ペレットにして上清を除いた。50uLの新しく調製した1:10希釈のストックb-PSRにてペレットを再浮遊させ、氷上で20分間インキュベートする。200uLの冷PBSFで細胞を2回洗浄し、50uLの二次標識ミックス(Extravidin-R-PE、抗ヒトLC-FITC、及びヨウ化プロピジウム)にペレットを再浮遊させる。氷上でミックスを20分間インキュベートし、その後、200uLの氷冷PBSFで2回洗浄する。100uLの氷冷PBSFに細胞を再浮遊させ、HTS試料注入器を用いてFACS Canto(BD Biosciences)にてプレートを実行させる。R-PEチャネルにおける平均蛍光強度についてフローサイトメトリーのデータを解析し、非特異的な結合を評価するために適正な対照に対して正規化した。表9は、クローンのほとんどについて低いスコアを確認している15の選択した抗TIGIT抗体について得られた多特異性試薬結合の結果をまとめている。
A.T細胞サブセットにおけるTIGIT発現のプロファイル
健常個体から新しく単離されたPBMCにおける免疫細胞サブセットでのTIGITの発現を評価するためにフローサイトメトリー解析を行った。コンジュゲートした抗体をEbioscience/Thermo Fisher Scientific、BioLegendまたはBD Biosciencesから購入した。濾過したFACS緩衝液(PBS+2mMのEDTA+0.1%BSA)及びBrilliant染色緩衝液(BD#563794)を用いて製造元の指示によって細胞を染色した。染色に先立って適当なヒトFcBlock(BD #564220)で細胞をブロックし、データ取得に先立ってIC固定緩衝液(eBioscience #00-8222-49)を用いて固定した。データ取得はFACS Fortessa(BD Biosciences)で行い、FlowJoソフトウェア(FlowJo,LLC)で解析した。生細胞は前方散乱と側方散乱にゲートをかけた。種々の免疫細胞サブセットは以下のようにゲートをかけた:CD19+(B細胞)、CD3-CD19-CD14+(単球)、CD3+TCRab-(TCRgd T細胞)、CD3+TCRab+(TCRab T細胞)、CD3-CD19-CD14-HLA-DR-CD56低/高(NK細胞)、CD3-CD19-CD14-HLA-DR+(樹状細胞)、CD3+TCRab+CD4+CD127低CD25+(抑制性T細胞)、CD3+TCRab+CD4+またはCD8+CD45RO-CCR7+(CD4またはCD8ナイーブT細胞)、CD3+TCRab+CD4+またはCD8+CD45RO+(メモリーT細胞)及びCD45RO-CD62L-(エフェクターT細胞)。
A.Jurkat-hTIGIT及びJurkat-mTIGITへの抗TIGIT抗体の結合
ヒトTIGITで形質導入した(Jurkat-hTIGIT)またはマウスTIGITで形質導入した(Jurkat-mTIGIT)JurkatE6.1細胞を用いてヒト抗TIGIT抗体の親和性を測定している。hTIGITまたはmTIGITに対する選択した抗体の親和性を分析するために、ウェル当たり105個の細胞を分配し、100nMの単一用量での抗TIGIT抗体(表3)または漸減濃度(166.6;53.24;17.01;5.43;1.73;0.55;0.17;0.05;0.01;5.78×10-3;1.85×10-3;5.9×10-3nM)の選択した抗体(図9)と共にインキュベートした。抗体はFACS緩衝液にて細胞と共に4℃で20分間インキュベートした。洗浄の後、氷上で細胞を抗ヒトIg(Fcガンマ特異的な)-PE(eBioscience,12-4998-82,2.5μg/mLで)と共に20分間インキュベートし、2回洗浄した。LSR BD Fortessaを用いて幾何平均蛍光強度を解析した。細胞結合は、各抗体について形質移入していない株と比べて形質移入した株におけるPEの中央値蛍光強度として記録した(表3)。EC50結合の算出については、Prismにて4変数曲線適合方程式を用いてhTIGIT-Jurkatへの結合の半分最大濃度(EC50)を算出し、得られた値は図9で説明したデータについて以下のもの;クローン29489については0.082nM;クローン29494については0.07nM;クローン29520については0.119nM及びクローン29527については0.05nMであった。結果は調べた抗TIGIT抗体について膜発現したヒトTIGITに対する強い結合を実証している。
アンタゴニスト抗TIGIT抗体による結合について健常ボランティアから単離されたヒトPBMCを分析した。ウェル当たり5×105個で細胞を分配した。細胞を抗CD16(クローン3G8、BioLegend 302002)、CD32(クローンFLI8.26,BD Bioscience 557333)及びCD64(BD Bioscience 555525)と共に室温で10分間インキュベートし、示した抗ヒトTIGIT抗体をFACS緩衝液にて12.65;4;1.26;0.40;0.126;0.040;0.12及び4×10-3nMの最終濃度で直接加え、4℃で20分間インキュベートした。洗浄の後、細胞を抗ヒトIg(Fcガンマ特異的な)-PE(eBioscience,12-4998-82,2.5μg/mLで)と共に4℃で20分間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、図10A及び10Bの結果のための以下の抗体及びLVDミックス:抗CD4-PercP-Cy5.5(クローA161A1,BioLegend 357414);抗CD8-BV510(クローンSK1,BD Bioscience 563919)及びLVD eFluor 520(eBioscience 65-0867-14)と共にインキュベートした。図10Cについては、細胞を洗浄し、以下の抗体及びLVDミックス:LVD eFluor520(eBioscience 65-0867-14)、抗TCRab-PercP-Cy5.5(クローンIP26、Biolegend 306723)、抗CD4-BV510(クローンSK3、BD Horizon 562970)、抗CD8-APC-Cy7(クローンSK1、Biolegend 344714)、抗CD25-BV605(クローン2A3、Biolegend 562660)、抗CD127-APC(A019D5、Biolegend 351316)、抗CCR7-BV421(クローンG043H7、Biolegend 353207)及び抗CD45RO-PE-Cy7(クローンUCHL1、Biolegend 304229)と共にインキュベートした。
Macaca fascicularisから単離されたPBMCはBioPRIMから入手した。細胞を解凍し、製造元の仕様書に従って1:2(ビーズ:細胞の比)にて非ヒト霊長類用のT細胞活性化/増殖キット(Miltenyi Biotec)を用いて刺激した。翌日、細胞を回収し、数え、ウェル当たり5×104個で分配した。室温にて細胞を抗CD16(クローン3G8,BioLegend 302002)、CD32(クローンFLI8.26,BD Bioscience 557333)及びCD64(BD Bioscience 555525)と共に10分間インキュベートし、選択した抗ヒトTIGIT抗体をFACS緩衝液における12.65;4;1.26;0.40;0.126;0.040;0.12及び4×10-3nMの最終濃度で直接加え、4℃にて20分間インキュベートした。洗浄の後、細胞を抗ヒトIg(Fcガンマ特異的な)-PE(eBioscience,12-4998-82,2.5μg/mLで)と共に4℃で20分間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、図11A及び11Bで説明されているデータのために以下の抗体及びLVDミックス:抗CD4-PercP-Cy5.5(クローンA161A1,BioLegend 357414);抗CD8-BV510(クローンSK1,BD Bioscience 563919)、CD69-APC-Cy7(クローンFN50,BioLegend,310914)及びLVD eFluor 520(eBioscience 65-0867-14)と共にインキュベートした。染色した細胞をBD LSR Fortessaを用いてFACSによって解析した。結合のEC50値はLVD-CD69+CD8+T細胞にゲートをかけた陽性TIGIT染色された細胞の%を用いて算出した。図11に示すように、カニクイザルCD8+T細胞への結合についてのEC50値は、クローン29489については0.487nM、クローン29520については1.73nM及びクローン29527については0.378nMだった。クローン29489及び31282(残基116におけるMからTへの置換がある29489の変異体)を同様に比較し、EC50値が、図11Bに示す例についてそれぞれ0.25nM及び0.26nMだったということは、2つのクローンについてのカニクイザル初代CD8+T細胞に対する類似の且つ強力な親和性を実証している。
A.CHO-TCR-CD155及びJurkat-hTIGITの共培養におけるTIGITのバイオアッセイ
ヒトTIGIT受容体を遮断することの機能的帰結を特徴付けるために、我々は、hTIGITとTCR連結の際に活性化されるルシフェラーゼレポーターを発現するJurkat細胞(Promegaの、解凍してそのまま使用(Thaw-and-Use)のTIGITエフェクター細胞)をヒトCD155及びTCR活性化因子を発現するように操作したCHO-K1細胞株(Promegaの、解凍してそのまま使用のCD155 aAPC/CHO-K1)と共に共培養した。TIGITを過剰発現しているJurkat細胞の活性化はJurkat細胞上のTCRの連結の際のCD155を発現しているCHO-K1細胞との接触によって誘導することができ、アンタゴニスト抗TIGIT抗体の存在下で増大させることができる。Jurkat細胞の活性化を増大させる異なる抗体の能力を比較するために、漸増濃度の抗体の存在下で実験を実施し、EC50値を算出した。
ヒトTIGIT受容体を遮断することの機能的帰結を特徴付けるために、我々は、健常ヒトドナーのPBMCに由来するヒト初代CD8+T細胞を、ヒトCD155を発現し、ヒトT細胞を活性化するように操作されたCHO-K1細胞株と共に共培養した。我々は、操作されたCD155を発現するCHO-K1細胞の存在下でのCD8+T細胞によるIFNgの放出を抗TIGITアンタゴニスト抗体によるhTIGITの遮断によって高めることができることを観察した。IFNgの放出を高めるこれら抗体の能力を比較するために、漸増濃度の抗体の存在下で実験を実施し、EC50値を算出した。
がん患者に由来する腫瘍浸潤リンパ球(TIL)におけるヒトTIGIT受容体を遮断することの機能的帰結を特徴付けるために、我々は、卵巣腹水患者のTILに由来するヒト初代CD8+T細胞を、ヒトCD155を発現し、ヒトT細胞を活性化するように操作されたCHO-K1細胞株と共に共培養した。我々は、操作されたCD155を発現しているCHO-K1細胞の存在下でのCD8+T細胞によるIFNgの放出が抗TIGITアンタゴニスト抗体によるhTIGITの遮断によって高められ得ることを観察した。
A.代替抗TIGITアンタゴニスト抗体に対するマウスCD155の競合アッセイ
このアッセイのために、マウスTIGITを過剰発現するように操作したJurkat細胞(クローンE6-1、ATCC TIB-152)(Jurkat-mTIGIT)を使用した。この抗体がヒトTIGITへの結合と同様にマウスTIGITに対して交差反応性を示したので抗TIGIT抗体26493を代替として使用した。25μLの完全培地(RPMI+10%FBS)にて様々な濃度の抗TIGIT抗体クローン26493(0.03~10μg/mL)と共に細胞を37℃で45分間予め培養した。細胞を1回洗浄し、50μLの完全培地にて4μg/mLのマウスCD155-His-Fcタグタンパク質(Thermo Fisher,50259M03H50)と共にインキュベーターで45分間インキュベートした。細胞を1回洗浄し、PE-抗His抗体(Biolegend,362603)で4℃にて30分間染色した。FACSによって測定した中央値蛍光強度(MFI)をJurkat-mTIGITへのCD155の結合の測定単位として使用した。図15Aは、IC50として2.3nMを特定しているCD155の競合についての抗TIGITクローン26493の用量反応曲線を示す(上の点線はアイソタイプに由来するシグナルを表し、下の点線はCD155なしでの細胞からのシグナルを表す)。これらの結果はマウスTIGITについてCD155リガンドと競合する抗TIGIT抗体の機能的有効性を実証している。
このアッセイではOVAをパルスした標的細胞に向けたOT-ICD8+T細胞の抗原特異的な細胞傷害活性及び抗TIGIT抗体の効果を評価するために、機械的な解離とその後のEasySep(商標)マウスT細胞単離キット(Stemcell,カタログ#19851)を用いたマウスT細胞の陰性選択によってC57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/Crlマウス(Charles River)の脾臓からOT1細胞を単離した。抗原提示細胞として天然にCD155を発現しているPanO2がん細胞をマイトマイシンC(25μg/mL)で処理し、その後OVAペプチド(S7951-1MG,Sigma Aldrich,1μg/ml,37℃で1時間)でパルスした。133nMでの抗TIGIT抗体クローン26493またはアイソタイプ対照の存在下でCD8+T細胞及びPanO2を3日間共培養した。3日目に、ELISAによるIFNgの検出(図15B)のために上清を回収し、細胞傷害性アッセイ(図15C)のためにT細胞を回収した。標的細胞としてOVAをパルスしたPanO2を使用した。製造元の指示書に従って、標的細胞及びパルスしていないPanO2細胞(非標的内部対照)をそれぞれ1×106個にてCFSE(C1157,ThermoFisher)及びCellTrace(商標)Far Red Cell Proliferationキット(C34564,ThermoFisher)によって標識した。これらの細胞を混合し(1:1の比)、ウェル当たり2×104個でプレートに播いた。133nMでの抗TIGIT抗体クローン26493またはアイソタイプ対照の存在下で10:1のエフェクター対標的の比を生じる1×105個/ウェル(エフェクター細胞)にて刺激したOT-1CD8+T細胞を加えた。24時間後、細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理によって浮かせた。次いで細胞を生/死定着性バイオレット死細胞染色キット(Molecular Probes,L34955)によって染色した。次いで標的細胞の細胞傷害性殺傷をフローサイトメトリーによる生存標的細胞の非標的細胞に対する比における変化をモニターすることによって測定した。
A.単剤療法における抗TIGITアンタゴニスト抗体のインビボ抗腫瘍活性
この実験については、抗TIGIT抗体クローン26493はマウスIgG2aアイソタイプで哺乳類細胞にて産生された。8週齢のメスBalb/cマウスに500,000個のCT26結腸癌細胞(ATCC(登録商標)CRL-2638(商標))を皮下に接種した。接種後9日目に、腫瘍体積が平均45mm3前後であれば、マウスを同等の腫瘍体積を持つ処理群に無作為化した(群当たりn=8)。9日目、12日目及び15日目の腹腔内注射によって、マウスを200μgの抗TIGITまたはアイソタイプ対照(mlgG2a、BioXcell)または200μgの抗PD-1(RMP1-14、BioXcell)及び200μgのアイソタイプ対照(mlgG2a、BioXcell)または200μgの抗PD-1(RMP1-14、BioXcell)及び種々の濃度の抗TIGIT(200μg、60μg、20μg)で処理した。腫瘍増殖をモニターし、腫瘍体積は9日目から36日目まで週3回、電子キャリパーによって測定した。腫瘍体積が2000mm3を超えるとマウスを屠殺した。線形混合モデルによって腫瘍増殖曲線を統計的に解析した。処理群間の差異は時間*処理群の相互作用を調べることによって評価した。抗TIGITと抗PD-1の間での相乗効果を調べるために、抗TIGITと抗PD-1の間での相乗効果を調べるために、2つの変数:抗TIGIT(あり/なし)及び抗PD-1(あり/なし)の組み合わせによって処理群を記録した。各処理の相加効果(抗TIGIT*時間及び抗PD-1*時間)の上の相乗効果は相互作用期間抗TIGIT*抗PD-1*時間を調べることによって評価した。
この実験のために、抗TIGITクローン26493をマウスIgG2a及びマウスIgG1のアイソタイプで哺乳類細胞にて産生させた。8週齢のメスBalb/cマウスに500,000個のCT26結腸癌細胞(ATCC(登録商標)CRL-2638(商標))を皮下に接種した。接種後10日目に、腫瘍体積が平均100mm3前後であれば、マウスを同等の腫瘍体積の処理群に無作為化した(群当たりn=10)。単剤療法の評価については、10日目、13日目及び16日目での腹腔内注射によって200μgの抗TIGITまたはアイソタイプ対照(mIgG2a、BioXcell)でマウスを処理した。抗PD-1との併用の評価については、10日目、13日目及び16日目での腹腔内注射によって200μgの抗PD-1(RMP1-14,BioXcell)及び200μgのアイソタイプ対照(mlgG2a,BioXcell)または200μgの抗PD-1(RMP1-14,BioXcell)と200μgの抗TIGITとの併用によりマウスを処理した。腫瘍増殖をモニターし、腫瘍体積は10日目から33日目まで週3回、電子キャリパーによって測定した。腫瘍体積が2000mm3を超えるとマウスを屠殺した。
A.脾臓及び腫瘍のフローサイトメトリー解析
アンタゴニスト抗TIGIT抗体の作用のインビボモードを検討するために、単剤療法及び抗PD-1との併用にて抗TIGIT抗体26493(IgG2a)による処理に続く免疫細胞の浸潤についてフローサイトメトリーによって腫瘍を解析した。実施例12に記載されているようにマウスに接種し、それを処理した。2回目の処理の2日後、マウス(群当たり8匹)を屠殺し、腫瘍を採取した。腫瘍解離キット(Miltenyi Biotec)によって腫瘍を解離させた。直接のエクスビボ染色のために、生存性色素(Molecular Probes,L34955)による染色及びFcブロックの後、細胞を抗CD45、抗CD4、抗CD8及び抗FoxP3(すべてeBioscience)で染色した。エクスビボ刺激については、細胞を細胞刺激カクテル(eBioscience)及びタンパク質輸送阻害剤(eBioscience)と共に3時間インキュベートした。この後に抗CD4抗体及び抗CD8抗体による染色及びFcブロックが続いた。市販の緩衝液(IC固定緩衝液及び透過化緩衝液)による固定及び透過化の後、細胞を抗IL-10及び抗IFNg(すべてeBioscience)で染色した。すべての図において、関連する対照群(単剤療法についてはアイソタイプ対照、併用については抗PD-1)と比べた比率変化は、対照群と比べて低下を表す負の値及び増加を表す正の値で示される。
抗TIGIT抗体の作用のインビボモードを検討するために、単剤療法及び抗PD-1との併用にて抗TIGITで処理した腫瘍の免疫細胞の浸潤をトランスクリプトミクス解析(Nanostring)によって解析した。実施例12に記載されているようにマウスに接種し、それを処理した。抗TIGIT抗体及び/または抗PD-1抗体による3回目の処理の2日後、マウスを屠殺し、腫瘍を採取した。RNAを抽出し、癌免疫学に関与する770の遺伝子の選択の発現をnCounter技術(PanCancer Immune Profiling panel,Nanostring;VIB Nucleomics Coreによって実施された)によって直接定量した。データはnSolverソフトウェア(Nanostring)で解析した。
A.健常ドナーに由来するヒトPBMCにおけるインビトロADCC
健常ドナーから単離したPBMCを完全RPMI培地(10%熱非働化FBS+50Uのペニシリン+50Uのストレプトマイシンで補完され、且つ200IUのIL-2/mLで補完された)に再浮遊させた。2.5×105個のヒトPBMCを96ウェルプレートU底にてウェル当たりで分配した。哺乳類細胞にて産生させた抗ヒトTIGIT抗体クローン26452またはIgG1アイソタイプ対照(Biolegend,403102)を66.6、0.66及び0.006nMの最終濃度で各相当するウェルに加えた。細胞を5%CO2と共に37℃で20時間インキュベートした。次いで細胞を回収し、以下の抗体パネル:LVD eFluor520(eBioscience 65-0867-14)、抗TCRab-PercP-Cy5.5(クローンIP26,Biolegend 306723)、抗CD4-BV510(クローンSK3,BD Horizon 562970)、抗CD8-APC-Cy7(クローSK1,Biolegend 344714)、抗CD25-BV605(クローン2A3,Biolegend 562660)、抗CD127-APC(A019D5,Biolegend 351316)、抗CCR7-BV421(クローンG043H7,Biolegend 353207)及び抗CD45RO-PE-Cy7(クローンUCHL1,Biolegend 304229)で染色した。結果はゲートをかけた生細胞にて提示する。CD45+CD4+またはCD45+CD8+はCD4+またはCD8+のT細胞全体を表す。CD45+RO+CD4+またはCD45+RO+CD8+細胞はメモリーCD4+またはCD8+T細胞を表す一方でCD25高CD127低CD4+はTreg細胞を表す。図20Aに示すように、ゲートをかけたTregにおけるTIGIT+細胞の比率はゲートをかけたメモリーCD8+T細胞及びCD4+T細胞におけるよりも高い。
抗TIGITマウスIgG2a抗体がTIGIT+抑制性T細胞を枯渇させることができることを確認するために、エクスビボADCCアッセイを設定した。8週齢のメスBalb/cマウスに500,000個のCT26結腸癌細胞(ATCC(登録商標)CRL-2638(商標))を皮下に接種した。接種の3週後、腫瘍を採取し、腫瘍解離キット(Miltenyi Biotec)で解離させた。単個細胞浮遊液を133nMの抗TIGIT抗体26493(mIgG1またはmIgG2aのアイソタイプ)と共に20時間インキュベートした(100万個の細胞/200μLのRPMI+10%FBS)。20時間後、生存性色素(Molecular Probes,L34955)で染色し、且つFcをブロックした後、細胞を抗CD4、抗TIGIT、抗CD8及び抗FoxP3の抗体(すべてeBioscience)で染色した。
EpiMatrixタンパク質スコア(De Groot,et al.(2009),Clinical.Immunol.131:189)を用いたコンピューター予測によってクローン29494及び29489と同様にその変異体31282の免疫原性の潜在性を評価した。解析を完了するために、インプット配列を重複する9量体のフレームに分け、各フレームを8つの共通するクラスIIHLA対立遺伝子のパネルに関して評価した。これらの対立遺伝子は「スーパータイプ」である。各1つは多数の追加の「ファミリーメンバー」の対立遺伝子と機能的に同等またはほぼ同等である。まとめて見れば、これら8つのスーパータイプの対立遺伝子はそのそれぞれのファミリーメンバーと共にヒト集団の95%余りを上手く「カバーする」(Southwood,et al.(1998),J.Immunol.160:3363)。対立遺伝子によるフレームの各「評価」はそれぞれ予測されたHLA結合親和性についての言及である。EpiMatrix評価のスコアはおよそ-3から+3までに及び、正規分布する。1.64を上回るEpiMatrix評価のスコアは「ヒット」として定義され、すなわち、潜在的に免疫原性であり、さらなる考慮に値する。
抗体は、その可変ドメイン、特に相補性決定領域(CDR)のアミノ酸配列が桁外れな程度に変化することができるという点で独特のタンパク質である。それは、抗体が多種多様な抗原を認識できるようにするこの変異性である。しかしながら、抗体の成熟を制御する組換え及び突然変異の事象は新しいT細胞エピトープまたは新T細胞エピトープも生じることができる。これらの新エピトープは循環しているT細胞にとって「異物」であると思われ得る。抗体配列における新エピトープの存在は、HAHA反応またはADA(抗薬剤抗体)としても知られるヒト抗ヒト抗体反応の形成をもたらすことができる。
抗体31282を他の特許出願に記載されている抗TIGIT抗体クローンに対して比較した。具体的には、31282を4.1D3.Q1E(4.1D3とも呼ばれる、WO2017/053748から);22G2(WO2016106302から);31C6(WO2016/028656から);313M2(WO2016/191643から);及びTIG1(WO2017/152088から)と比較した。比較した抗体クローンの参照及び配列を以下の表14に示す。
さらなる特性評価のために十分な量の選択された抗TIGITクローンを産生させるために、特異的な抗体クローン(クローン31282_up、4.1D3、22G2、31C6、313M32及びTIG1)をコードするDNAベクターを生成し、ヒトIgG1アイソタイプの産生のためにHEK細胞に形質導入した。抗体可変ドメインのためのヒトコドンで最適化した合成DNA断片をGeneartでオーダーした。各抗体クラスのマウスIgカッパシグナル配列と定常領域とを含有するpUPE発現ベクターに可変ドメインの配列を継ぎ目なくライゲーションした。発現ベクターは制限解析及びDNA配列決定によって検証した。一時的な形質移入のために、エンドトキシンを含まないDNAmaxiprep(Sigma)を作製し、確立されたプロトコールに従って、Freestyle培地(ThermoFisherScientific)にて重鎖及び軽鎖のベクターをHEK293EBNA1細胞に同時形質移入した。形質移入の24時間後にプリマトン(最終容量0.55%)を加えた。形質移入の6日後、馴化培地を回収した。Mabselect sureLX(GE Healthcare)アフィニティクロマトグラフィーによって抗体をバッチごとに精製した。結合した抗体を、1MのNaClを含有するPBS及びPBSによる2工程で洗浄した。抗体を20mMのクエン酸塩、150mMのNaCl、pH3で溶出し、1/6容量の1MのK2HPO4/KH2PO4、pH8によっておよそpH7に中和した。
BiacoreT200の技術であるCM5センサーチップ(FranceのNovalixで実行)を用いてHBS-EP緩衝液系(10mMのHEPES、pH7.3、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.05%のTween20)にて25℃でバイオセンサー解析を行った。サンプルホテルは8℃で維持した。標準のアミンカップリング化学反応を用いて、ヤギ抗ヒトIgG捕捉抗体(Fcγ断片に特異的、Jackson ImmunoResearch Laboratories)をセンサーチップの双方のフローセルに不動化した(10000RU)。この表面型は、各再生工程の後、新しい解析抗体を再生可能な方法で捕捉するための構成を提供した。フローセル2を用いて捕捉抗体を解析する一方でフローセル1は参照フローセルとして使用した。30から0.123nMに及ぶ6つの異なる抗原濃度をランニング緩衝液で調製した。抗原試料濃度のそれぞれは、3.33nMの2つ組での実行を除いて単回の繰り返しとして実行した。2つのブランク(緩衝液)注入も実行し、系の人為的結果を評価し、差し引くのに使用した。抗原濃度すべてについて会合相(300s)及び解離相(600s)を30uL/分の流速で実施した。10mMのグリシン-HCl、pH1.5の3回の連続注入(15s、15s及び60s)によって表面を再生した。得られたセンサーグラムを1:1モデル(適用した濃度すべてについて同じ動的値を想定する)に大域的に適合させた。1:1動的モデルの適合が信頼できなかったので、親和性はクローン313M32については定常状態からも決定したということは、会合時間の終了時でのヒトTIGITとの平衡を示している。様々な抗TIGITクローンについて得られた結果を表15で報告する。
A.Jurkat-hTIGITへの抗TIGITクローンの結合
ヒトTIGITで形質導入したJurkatE6.1細胞(Jurkat hTIGIT)を用いてヒト抗TIGIT抗体の親和性が測定されている。hTIGITに対する選択した抗体の親和性を分析するために、105個の細胞をウェル当たりで分配し、漸減濃度(8;4;2;1;0.5;0.25;0.125;0.062;0.031;0.016;8×10-3及び4×10-3nM)の種々の抗TIGITアンタゴニスト抗体クローンと共にインキュベートした(図2)。抗体をFACS緩衝液にて細胞と共に4℃で20分間インキュベートした。洗浄の後、細胞を抗ヒトIg(Fcガンマ特異的な)-PE(eBioscience,12-4998-82,2.5μg/mlで)と共に氷上で20分間インキュベートし、2回洗浄した。LSR BD Fortessaを用いて蛍光強度を解析し、その表面にTIGITを発現している細胞にてPEの中央値蛍光強度として細胞結合を記録した。
健常ボランティアから単離されたヒトPBMCをアンタゴニスト抗TIGIT抗体による結合について分析した。細胞をウェル当たり1×105個で分配した。細胞を抗CD16(クローン3G8,BioLegend 302002)、CD32(クローンFLI8.26,BD Bioscience 557333)及びCD64(BD Bioscience 555525)と共に室温で10分間インキュベートし、示した抗ヒトTIGIT抗体のクローンをFACS緩衝液における8;4;2;1;0.5;0.25;0.125;0.062;0.031;0.016;8×10-3及び4×10-3nMの最終濃度にて直接加え、4℃で20分間インキュベートした。洗浄の後、細胞を抗ヒトIg(Fcガンマ特異的な)-PE(eBioscience,12-4998-82,2.5μg/mlで)と共に4℃で20分間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、以下の抗体及びLVDミックス:抗CD4-PercP-Cy5.5(クローンA161A1,BioLegend 357414);抗CD8-BV510(クローンSK1,BD Bioscience 563919)及びLVD eFluor660(eBioscience 65-0864-18)と共にインキュベートした。
様々なアンタゴニスト抗TIGIT抗体のクローンによる結合についてがん患者から単離されたヒトPBMCを分析した。細胞をウェル当たり1×105個で分配した。細胞を抗CD16(クローン3G8,BioLegend 302002)、CD32(クローンFLI8.26,BD Bioscience 557333)及びCD64(BD Bioscience 555525)と共に室温で10分間インキュベートし、示した抗ヒトTIGIT抗体をFACS緩衝液にて8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062及び0.031nMの最終濃度で直接加え、4℃で20分間インキュベートした。洗浄した後、細胞を抗ヒトIg(Fcガンマ特異的な)-PE(eBioscience,12-4998-82,2.5μg/mlで)と共に4℃で20分間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、以下の抗体及び生存性色素(LVD)ミックス:抗CD4-PercP-Cy5.5(クローンA161A1,BioLegend 357414);抗CD8-BV510(クローンSK1,BD Bioscience 563919)及びLVD eFluor520(eBioscience 65-0867-14)と共にインキュベートした。細胞を洗浄し、固定し、BD LSR Fortessaを用いて表面染色を定量した。FlowJo V10.1を用いてフローサイトメトリーのデータを解析した。ゲートをかけたLVD-TIGIT+CD8+細胞におけるTIGITのMFIを用いてEC50値を算出した。非線形の回帰曲線を図22Cに示し、値を以下の表18でまとめる。
ヒトTIGITを過剰発現しているJurkat細胞(Jurkat-hTIGIT)を回収し、5.104個/ウェルで分配し、完全培地にて以下の濃度:133.33;42.20;13.33;4.22;1.33;0.422;0.133;0.042;0.0133;4.2×10-3;1.3×10-3;4.2×10-4;1.3×10-4;4.2×10-5nMでの抗ヒトTIGIT抗体と共に37℃で45分間インキュベートした。過剰な抗体を洗い流し、次いで細胞を15μg/mLでのCD155-His(Creative Biomart,PVR-3141H)と共に37℃で45分間インキュベートした。次いで、抗Hisタグ-PE(Biolegend,362603,試験当たり2μL)を用いて、結合したCD155-Hisを検出し、4℃で30分間インキュベートした。BD LSR Fortessaを用いたFACSによって細胞を解析し、細胞全体におけるPEの中央値蛍光強度に基づいて、CD155の結合を阻止する濃度の半分(IC50)を算出した。
A.Jurkat-hTIGIT細胞によるTIGITの機能的アッセイ
ヒトTIGIT受容体を遮断することの機能的帰結を特徴付けるために、我々は、hTIGITとTCR連結の際に活性化されるルシフェラーゼレポーターとを発現しているJurkat細胞(Promegaの、解凍してそのまま使用のTIGITエフェクター細胞)を、ヒトPVR/CD155とTCR活性化因子とを発現するように操作したCHO-K1細胞株(Promegaの、解凍してそのまま使用のCD155 aAPC/CHO-K1)と共に共培養した。TIGITを過剰発現しているJurkat細胞の活性化はJurkat細胞上でのTCRの連結の際にCD155を発現しているCHO-K1細胞との接触によって誘導することができ、アンタゴニスト抗TIGIT抗体の存在下で高めることができる。Jurkat細胞の活性化を高める様々な抗TIGITクローンの能力を比較するために、漸増濃度の抗体の存在下で実験を行い、EC50値を算出した。
ヒトTIGIT受容体を遮断することの機能的帰結を特徴付けるために、我々は、健常ヒトドナーのPBMCに由来するヒト初代CD8+T細胞を、ヒトPVR/CD155を発現し、且つヒトT細胞を活性化するように操作したCHO-K1細胞株と共に共培養した。我々は、操作されたCD155を発現しているCHO-K1細胞の存在下でのCD8+T細胞によるIFNgの放出が抗TIGITアンタゴニスト抗体によりhTIGITを遮断することによって高められ得ることを観察した。これら抗体のIFNgの放出を高める能力を比較するために、漸増濃度の抗体の存在下で実験を行い、EC50値を算出した。
がん患者に由来するT細胞上のヒトTIGIT受容体を遮断することの機能的帰結を特徴付けるために、がん性患者のPBMCに由来するヒト初代CD3+T細胞を、ヒトPVR/CD155を発現し、且つヒトT細胞を活性化するように操作したCHO-K1細胞株(CHO-TCR-CD155)と共に共培養した。我々は、操作したCD155を発現しているCHO-K1細胞の存在下でのCD3+T細胞によるIFNgの放出が抗TIGITアンタゴニスト抗体31282によりhTIGITを遮断することによって高められ得ることを観察した。
この実施例では、新しく単離した対応したPBMCと、腎臓癌のがん患者に由来する解離させた腫瘍細胞(DTC)内の腫瘍浸潤リンパ球とからのT細胞サイトカインの産生を評価するために細胞内フローサイトメトリー染色を行った。DTCについては、特定の腫瘍型についての製造元の指示書に従って、腫瘍を機械的に細かく刻み、次いで、穏やかなMACS解離装置にて回転のもとで腫瘍解離キット(Miltenyi Biotech #130 095 929)と共にインキュベートした。細胞内染色を行う前に、T細胞刺激ビーズカクテル(Dynabeads,Thermo Fisher)で16時間細胞を刺激した。刺激の最後の3時間の間に、タンパク質輸送阻害カクテル(eBioscience)及び細胞刺激カクテル(eBioscience)を細胞に加えた。コンジュゲートした抗体はEbioscience/Thermo Fisher Scientific、BioLegendまたはBD Biosciencesから購入した。表面染色は、濾過したFACS緩衝液(PBS+2mMのEDTA+0.1%BSA)及びブリリアント染色緩衝液(BD #563794)を用いて製造元の指示によって行った。表面染色に先立って、細胞を適当なヒトFcBlock(BD #564220)でブロックした。細胞内染色については、BD Cytofix/cytoperm溶液(BD Biosciences)を用いて細胞を固定し、透過化した。細胞は以下の抗体パネル:抗CD45-BB515(クローンHI30、BD Horizon 564585)、抗CD73-BV421(クローンAD2、BD Horizon 562430)、抗CD8a-BV510(クローンSK1、BD Horizon 563919)、抗CD3-BV650(クローンSK7、BD Horizon 563999)、抗IFNγ-BV711(クローン4S.B3、BD Horizon 564793)、抗IL-2-APC(MQ1-17H12、eBioscience 17-7029-82)、抗CD4-APC-R700(クローンRPA-T4、BD Horizon 564975)、LVD eFluor780(eBioscience 65-0865-14)、抗TIGIT-PE(クローンMBSA43、eBioscience E13456-108)、抗CD39-PE-Dazzle594(クローンA1、Biolegend 328224)及びTNFα-PE-cy7(クローンMab11、eBioscience 25-7349-82)で染色した。データ取得はFACS Fortessa(BD Biosciences)で行い、FlowJoソフトウェア(FlowJo,LLC)によって解析した。生細胞は前方散乱及び側方散乱にゲートをかけた。T細胞サブセットは以下のようにゲートをかけた:PBMCについてはD45+CD3+及びDTCについてはCD45+CD3+CD4+とCD45+CD3+CD8+。サイトカインを分泌しているT細胞は未染色及び未刺激の対照を用いてゲートをかけた。
この実施例では、肺癌患者から単離されたPBMCを完全RPMI培地(10%熱非働化FBS+50Uのペニシリン+50Uのストレプトマイシンで補完された)に再浮遊させた。2.5×105個のヒトPBMCを96ウェルプレートU底にてウェル当たりで分配した。抗ヒトTIGIT抗体クローン31282、ヒトIgG1アイソタイプ対照(BioXcell BE0297)またはリツキシマブ(InvivoGen hcd20-mab1)を6.6nMの最終濃度で相当する各ウェルに加えた。細胞を5%CO2と共に37℃で20時間インキュベートした。次いで細胞を回収し、以下の抗体パネル:LVD eFluor520(eBioscience 65-0867-14)、抗TCRab-PercP-Cy5.5(クローンIP26、Biolegend 306723)、抗CD4-BV510(クローンSK3、BD Horizon 562970)、抗CD8-APC-Cy7(クローンSK1、Biolegend 344714)、抗CD25-BV605(クローン2A3、Biolegend 562660)、抗CD127-APC(A019D5、Biolegend 351316)、抗CCR7-BV421(クローンG043H7、Biolegend 353207)及び抗CD45RO-PE-Cy7(クローンUCHL1、Biolegend 304229)で染色した。結果はゲートをかけた生細胞で提示する。製造元の仕様書に従ってAccuCheck計数ビーズ(Life technologies)を用いて絶対的な定量を行った。μL当たりの細胞の絶対数の計算の後、特異的溶解の%は以下の式=(1-(31282TIGIT抗体で処理した試料におけるμL当たりの細胞の絶対数/対照アイソタイプで処理した試料の3つ組の平均))×100を用いて算出される。結果は3つ組での特異的溶解の平均%±SDとして提示される。ADCC/ADCPのエフェクター細胞の細胞傷害活性は、リツキシマブとのインキュベートの際、ゲートをかけたCD19+細胞における特異的細胞溶解の%を測定することによって評価した。
フローサイトメトリー解析を行って、がん患者に由来する新しく単離した対応するPBMCと解離させた腫瘍細胞(DTC)内の腫瘍浸潤リンパ球とに由来する免疫細胞サブセットにおけるTIGITの発現を評価した。様々な適応症:卵巣癌、腎臓癌、HNSCC、皮膚癌、黒色腫、及び肺癌に由来する試料を取得した。DTCについては、特定の腫瘍型についての製造元の指示書に従って、腫瘍を機械的に細かく刻み、次いで、穏やかなMACS解離装置にて回転のもとで腫瘍解離キット(Miltenyi Biotech #130 095 929)と共にインキュベートした。PBMCは密度勾配培地(Lymphoprep Axis-Shield #1115758)にて全血から単離した。表現型データを健常個体(n=10)から単離した凍結PBMCと比較した。
抗TIGIT mAbであるクローン31282とTIGIT組換えタンパク質との間の相互作用をさらに特性評価し、理解するために、TIGITとの複合体における31282の結晶構造をX線回折によって決定した。
ヒトTIGIT残基23~128はProteros Biostructures GmbHが作製した。N末端HISタグを持つ(トロンビンで切断可能)TIGIT(23~128)をpET15bにクローニングし、37℃で封入体でのBI21(DE3)にてLB培地において発現させた。封入体(IB)をTris/HCl、pH7.4及びTris/HCl、pH7.4、0.05%のBrij-35を含有する緩衝液で洗浄した。IBを6MのGdm/HCl、50mMのTris、pH8.5及び10mMのDTTで変性させた。50mMのTris/HCl、pH8、1mMのGSH、0.5mMのGSSG、150mMのNaClにて折り畳み直しを行った。折り畳み直したタンパク質をHIS-トラップで精製した。トロンビン切断を介してN末端のHISタグを取り外し、50mMのTris/HCl、pH7.5、200mMのNaClにて平衡化したSuperdex-75にてさらに精製した。
Proteros Biostructures GmbHの標準プロトコールを用いて低温プロトコールを確立した。結晶を瞬間凍結し、100Kの温度で測定した。極低温状態を用いてSWISS LIGHT SOURCE(SLS,Villigen,Switzerland)にてFab:TIGIT複合体の結晶からX線回折データを収集した。結晶は空間群P1に属する。プログラムXDS及びXSCALEを用いてデータを処理した。データの収集及び処理の統計は表22にて見いだすことができる。
1SWISS LIGHT SOURCE (SLS, Villigen, Switzerland)
2括弧内の値は最高分解能のビンを指す。
3独立した反射から算出した。
構造を決定し、解析するのに必要な位相情報は分子置換によって得た。Fabの以前解決した構造を検索モデルとして使用した。ソフトウェアパッケージCCP4及びCOOTと共に標準のプロトコールに従ってその後のモデルの構築及び緻密化を行った。自由R因子の計算については、最終モデルの正確性を相互検証する評価基準、測定された反射の約2.5%を緻密化手順から除外した(表23を参照のこと)。
ヒトFab抗体断片の重鎖及び軽鎖はヒト抗体の典型的な折り畳みを示す(図27A)。基本的には同じ全体的な構造を持つ非対称単位にて2つのヘテロ三量体がある。モデルはTIGITの残基23~128、クローン31282の重鎖の残基1~224及びクローン31282の軽鎖の残基1~214を含む。重鎖の一方のショートループ領域は電子密度によって完全に定義されるわけではないので、モデルに含まれていない。
ヒトIgG1アイソタイプの抗TIGIT抗体クローン32959はHEK細胞で産生させ、上記の実施例17に記載されているように精製した。
カニクイザルにi.v.ボーラス注射を介して抗TIGITクローン31282のIgG1またはIgG4を与えた。抗体は2匹(オス1及びメス1)の動物に3つの異なる濃度(0.1mg/kg;1mg/kg;10mg/kg)で投与した。1日目の投与後504時間に至るまで血液を採取した。血液試料を血漿に処理し、ELISA法を用いて抗TIGITクローン31282のIgG1またはIgG4の濃度について分析した。個々の動物の血漿濃度・時間データを用い、Phoenix WinNonlin(バージョン6.3,Pharsight,a Certara Company,Princeton,NJ)の血管内モデルを用いてIV投与後の抗TIGITクローン31282のIgG1及びIgG4についての毒物動態パラメーター値を算出した。
フローサイトメトリー解析を行って、血液癌の異なる適応症のがん患者に由来する血液試料における正常及び腫瘍のT細胞またはB細胞でのTIGITの発現を評価した。
この実験のために、EL4T細胞リンパ腫細胞(ATCC(登録商標)、TIB-39(商標))を、マウスTIGITを安定して発現するように操作した(EL4-mTIGIT)。GFPをコードする類似のベクターで形質導入したEL4細胞を対照として使用した(EL4-GFP)。細胞のプールをサブクローニングしてEL4-mTIGIT及びEL4-GFPのクローンを得た。使用した抗TIGIT抗体は、VH FR3の残基27をLからVに変異させ、VH FR4の残基6をMからTに変異させるように修飾した、抗体29527の修飾された型(マウスTIGITと交差反応する)であり、ヒトIgG1アイソタイプで作製した。修飾した29527抗体(29527m)のVHドメインの配列を以下に示す。抗体29527mのVL配列は29527のVL(配列番号240)に相当する。
抗TIGIT抗体の抗PD-1抗体との併用(実施例12、13及び14)に加えて、共刺激分子である4-1BB、OX40及びGITRに特異的なアゴニスト抗体、と同様にチェックポイント阻害分子ICOSに特異的なアンタゴニスト抗体との併用で抗TIGIT抗体の抗腫瘍有効性も評価した。
γδ(ガンマ・デルタまたはg/d)T細胞は、記載された抗腫瘍活性(Zhao,et al.2018.J.Transl Med.16:122)及び抗ウイルス活性(たとえば、CMV感染)を持つ非従来型のT細胞の集団であり、自己免疫疾患にも関与している(Malik,S.et al.2016.Front Immunol.7:14)。
この実験のために、メスC57Bl/6マウスの右脇腹にて500万個のHepa1-6肝細胞癌腫細胞(Crown Bioscience Inc.)を皮下に接種した。使用した抗TIGIT抗体は、VH FR3の残基27をLからVに変異させ、VH FR4の残基6をMからTに変異させるように修飾した、抗体29527の修飾された型(マウスTIGITと交差反応する)29527mであり、マウスIgG2aアイソタイプで作製した。接種後3日目に腫瘍体積が平均65mm3前後であれば、等しい腫瘍体積を持つ処理群にマウスを無作為化した(群あたりn=10)。腫瘍の接種後3日目、6日目及び9日目に腹腔内注射によって200μgの抗TIGIT抗体またはアイソタイプ対照抗体(mIgG2a,BioXcell BE0085)でマウスを処理した。3日目から20日目まで週2回、腫瘍増殖をモニターし、腫瘍体積を電子ノギスで測定した。腫瘍体積が2000m3を超えるとマウスを屠殺した。線形混合モデルによって腫瘍増殖曲線を統計的に分析した。時間*処理群の相互作用を検定することによって処理群間の差異を評価した。
免疫療法に応答性であると記載されているモデルで観察された抗TIGITアンタゴニストmAbの有効性(実施例12~14、27、28及び30)に加えて、単剤としてのまたは併用での抗TIGIT mAbの有効性も膵臓腺癌モデルの免疫原性がより低いモデル(PancO2)で調べた。
ヒト腫瘍を接種し、ヒトPBMC細胞を養子導入したNSGマウスのヒト化システムにて、マウスTIGITと交差反応しない抗TIGIT mAb 31282の抗腫瘍有効性(表3)を評価した。
γδ(ガンマ/デルタ)T細胞は記載されている抗腫瘍活性(Zhao et al.2018.J.Transl Med.16:122)及び抗ウイルス活性(たとえば、CMV感染)を持つ従来型ではないT細胞の集団であり、自己免疫疾患にも関与している(Malik S et al.2016.Front Immunol.7:14)。
TIGITは免疫細胞で発現されることが知られている標的である。加えて、TIGITの発現は特定の血液癌の徴候におけるCD4+腫瘍細胞でも観察されている(Jariwala et al.(2017)J.Invest Dermatol.137:1;実施例26)。抗TIGIT mAb 31282が抗体依存性細胞傷害(ADCC)を誘導し、TIGITを発現している悪性細胞を枯渇させることができることを評価するためにフローサイトメトリー解析を行った。
抗TIGIT抗体の免疫チェックポイント抗体との併用(実施例12、13、14及び28)に加えて、化学療法剤ドキソルビシンまたはA2ARアンタゴニストとの併用、及びA2ARアンタゴニストとドキソルビシンとの抗TIGIT抗体の三重併用にて抗TIGIT抗体の抗腫瘍有効性を評価した。使用したA2ARアンタゴニストは参照によって本明細書に組み込まれるPCT/EP2019/074208における化合物8bに相当する。
TIGIT受容体への結合について互いに競合する及びTIGITの天然のリガンド(CD155、CD112、CD113)と競合するアンタゴニスト抗TIGIT抗体の存在下でのTIGITの発現の測定を可能にするために、我々はアンタゴニスト抗体と競合しない抗TIGIT抗体についてスクリーニングした。クローン32959はアンタゴニスト抗TIGITクローン31282の存在下でTIGITに結合することができる抗体であると選択された。この能力を実証するために、EDTAで採血した健常ヒトドナーに由来する静脈血を50μLのアリコートに分配し、漸減濃度の未標識クローン31282と共にインキュベートし、37℃で1時間インキュベートした。インキュベートに続いて試料を洗浄し、上清を捨てた。その後、BioLegend由来の抗CD45-PercP(クローンHI30)及びBD bioscience由来のCD4-BV421(クローンL200)、CD8a-BV510(クローンSK1)、CD45RO-BB515(クローンUCHL1)、CD25-BV605(クローン2A3)、CD127-BV786(クローンHIL-7R-M21)、CD56-BV650(クローンNCAM16.2)及びPE標識した31282またはAF647に結合した32959のいずれかを用いたTIGITによって試験試料を染色した。各血液試料は4℃で30分間インキュベートした。BD溶解緩衝液で赤血球を溶解し、白血球をペレットにし、洗浄し、最終的に、PBSで希釈したIC固定緩衝液に再浮遊させた。LSR Fortessa(BD Biosciences)でデータ取得を行い、フローサイトメトリーのデータはFlowJo V10.5.3を用いて分析した。
ヒトIgG1である抗イディオタイプ抗体クローン32869はアンタゴニスト抗TIGITクローン31282への特異的な結合の実証の後、HuCAL(登録商標)ライブラリから選択された。
Claims (34)
- T細胞活性を促進する方法であって、ヒトγδT細胞の集団を、ヒトTIGITに結合する抗体またはその抗原結合断片に接触させることを含む、前記方法。
- インビトロで実施される、請求項1に記載のT細胞活性を促進する方法。
- ヒト対象にてインビボで実施される、請求項1に記載のT細胞活性を促進する方法。
- 前記ヒト対象が、がんを有する、請求項3に記載のT細胞活性を促進する方法。
- 前記ヒト対象がウイルス感染症を有し、任意で前記ウイルス感染症がCMV感染症である、請求項3に記載のT細胞活性を促進する方法。
- 対象にてがんを治療する方法であって、前記対象に、ヒトTIGITに結合する抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、前記方法。
- 前記がんが肝臓癌、肺癌、膵臓癌、及びT細胞リンパ腫から選択される、請求項6に記載の対象にてがんを治療する方法。
- 前記がんが肝細胞癌腫、膵臓癌腫、肺癌腫、及びセザリー症候群から選択される、請求項6または7に記載の対象にてがんを治療する方法。
- γδT細胞の前記集団を、抗PD1抗体、抗PD-L1抗体、抗41BB抗体、抗OX40抗体、抗GITR抗体、及び抗ICOS抗体のうちの1つ以上と接触させることをさらに含む、請求項1~5のいずれか1項に記載のT細胞活性を促進する方法、または請求項6~8のいずれか1項に記載のがんを治療する方法。
- 前記抗体または抗原結合断片が、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3の組み合わせを含み、
前記組み合わせが、
(i)配列番号16を含むHCDR1、配列番号17を含むHCDR2、配列番号18を含むHCDR3、配列番号61を含むLCDR1、配列番号62を含むLCDR2、及び配列番号63を含むLCDR3;
(ii)配列番号4を含むHCDR1、配列番号5を含むHCDR2、配列番号6を含むHCDR3、配列番号49を含むLCDR1、配列番号50を含むLCDR2、及び配列番号51を含むLCDR3;
(iii)配列番号7を含むHCDR1、配列番号8を含むHCDR2、配列番号9を含むHCDR3、配列番号52を含むLCDR1、配列番号53を含むLCDR2、及び配列番号54を含むLCDR3;
(iv)配列番号10を含むHCDR1、配列番号11を含むHCDR2、配列番号12を含むHCDR3、配列番号55を含むLCDR1、配列番号56を含むLCDR2、及び配列番号57を含むLCDR3;
(v)配列番号13を含むHCDR1、配列番号14を含むHCDR2、配列番号15を含むHCDR3、配列番号58を含むLCDR1、配列番号59を含むLCDR2、及び配列番号60を含むLCDR3;
(vi)配列番号1を含むHCDR1、配列番号2を含むHCDR2、配列番号3を含むHCDR3、配列番号46を含むLCDR1、配列番号47を含むLCDR2、及び配列番号48を含むLCDR3;
(vii)配列番号19を含むHCDR1、配列番号20を含むHCDR2、配列番号21を含むHCDR3、配列番号64を含むLCDR1、配列番号65を含むLCDR2、及び配列番号66を含むLCDR3;
(viii)配列番号22を含むHCDR1、配列番号23を含むHCDR2、配列番号24を含むHCDR3、配列番号67を含むLCDR1、配列番号68を含むLCDR2、及び配列番号69を含むLCDR3;
(ix)配列番号25を含むHCDR1、配列番号26を含むHCDR2、配列番号27を含むHCDR3、配列番号70を含むLCDR1、配列番号71を含むLCDR2、及び配列番号72を含むLCDR3;
(x)配列番号28を含むHCDR1、配列番号29を含むHCDR2、配列番号30を含むHCDR3、配列番号73を含むLCDR1、配列番号74を含むLCDR2、及び配列番号75を含むLCDR3;
(xi)配列番号31を含むHCDR1、配列番号32を含むHCDR2、配列番号33を含むHCDR3、配列番号76を含むLCDR1、配列番号77を含むLCDR2、及び配列番号78を含むLCDR3;
(xii)配列番号34を含むHCDR1、配列番号35を含むHCDR2、配列番号36を含むHCDR3、配列番号79を含むLCDR1、配列番号80を含むLCDR2、及び配列番号81を含むLCDR3;
(xiii)配列番号37を含むHCDR1、配列番号38を含むHCDR2、配列番号39を含むHCDR3、配列番号82を含むLCDR1、配列番号83を含むLCDR2、及び配列番号84を含むLCDR3;
(xiv)配列番号40を含むHCDR1、配列番号41を含むHCDR2、配列番号42を含むHCDR3、配列番号85を含むLCDR1、配列番号86を含むLCDR2、及び配列番号87を含むLCDR3;
(xv)配列番号43を含むHCDR1、配列番号44を含むHCDR2、配列番号45を含むHCDR3、配列番号88を含むLCDR1、配列番号89を含むLCDR2、及び配列番号90を含むLCDR3;
(xvi)配列番号271を含むHCDR1、配列番号272を含むHCDR2、配列番号273を含むHCDR3、配列番号283を含むLCDR1、配列番号284を含むLCDR2、及び配列番号285を含むLCDR3;
(xvii)配列番号274を含むHCDR1、配列番号275を含むHCDR2、配列番号276を含むHCDR3、配列番号286を含むLCDR1、配列番号287を含むLCDR2、及び配列番号288を含むLCDR3;
(xviii)配列番号277を含むHCDR1、配列番号278を含むHCDR2、配列番号279を含むHCDR3、配列番号289を含むLCDR1、配列番号290を含むLCDR2、及び配列番号291を含むLCDR3
から成る群から選択される、
請求項1~6のいずれか1項に記載のT細胞活性を促進する方法、または請求項6~9のいずれか1項に記載のがんを治療する方法。 - 前記抗体またはその抗原結合断片が、
配列番号211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、327、329、及び331、ならびにそれらに対して少なくとも90%、95%、97%、98%、または99%の配列同一性を示すアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメイン
を含み、且つ任意で、
配列番号212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、328、330、及び332のアミノ酸配列、ならびにそれらに対して少なくとも90%、95%、97%、98%、または99%の配列同一性を示すアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する、軽鎖可変ドメイン
を含む、
請求項10に記載のT細胞活性を促進する方法、または請求項10に記載のがんを治療する方法。 - 前記抗体またはその抗原結合断片が、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの組み合わせを含み、
前記組み合わせが、
(i)配列番号211のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号212のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(ii)配列番号213のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号214のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(iii)配列番号215のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号216のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(iv)配列番号217のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号218のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(v)配列番号219のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号220のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(vi)配列番号221のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号222のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(vii)配列番号223のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号224のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(viii)配列番号225のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号226のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(ix)配列番号227のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号228のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(x)配列番号229のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号230のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(xi)配列番号231のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号232のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(xii)配列番号233のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号234のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(xiii)配列番号235のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号236のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(xiv)配列番号237のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号238のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(xv)配列番号239のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号240のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(xvi)配列番号327のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号328のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;
(xvii)配列番号329のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号330のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;ならびに
(xviii)配列番号331のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号332のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン
から成る群から選択される、
請求項10及び11のいずれか1項に記載のT細胞活性を促進する方法、または請求項10及び11のいずれか1項に記載のがんを治療する方法。 - 前記抗体またはその抗原結合断片が、
配列番号16を含む重鎖CDR1(HCDR1)、配列番号17を含む重鎖CDR2(HCDR2)、及び配列番号18を含む重鎖CDR3(HCDR3)を含む、重鎖可変ドメイン
を含み、且つ
配列番号61を含む軽鎖CDR1(LCDR1)、配列番号62を含む軽鎖CDR2(LCDR2)、及び配列番号63を含む軽鎖CDR3(LCDR3)を含む、軽鎖可変ドメイン
をさらに含む、
請求項10~12のいずれか1項に記載のT細胞活性を促進する方法、または請求項10~12のいずれか1項に記載のがんを治療する方法。 - ヒトγδT細胞の集団の表面に存在するヒトTIGITに結合し、且つTIGITへの結合についてCD155と競合しない、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
配列番号280を含む重鎖CDR1(HCDR1)、配列番号281を含む重鎖CDR2(HCDR2)、及び配列番号282を含む重鎖CDR3(HCDR3)を含む、重鎖可変ドメイン
を含み、且つ
配列番号292を含む軽鎖CDR1(LCDR1)、配列番号293を含む軽鎖CDR2(LCDR2)、及び配列番号294を含む軽鎖CDR3(LCDR3)を含む、軽鎖可変ドメイン
をさらに含む、前記抗体またはその抗原結合断片。 - 前記重鎖可変ドメインが、配列番号333もしくは367として示されるアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%、95%、97%、98%、もしくは99%の配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖可変ドメインが、配列番号334もしくは368として示されるアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%、95%、97%、98%、もしくは99%の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、請求項14に記載の抗体または抗原結合断片。
- 前記抗体がヒトIgG抗体、好ましくはヒトIgG1抗体である、請求項14及び15のいずれか1項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、または請求項10~13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体が、
細胞表面にヒトTIGITを発現している細胞に対する、抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)、補体依存性細胞傷害(CDC)、及び抗体依存性細胞介在性貪食(ADCP)から選択される、1つ以上のエフェクター機能
を示す、請求項14~16のいずれか1項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、または請求項10~13及び16のいずれか1項に記載の方法。 - 先行請求項のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合断片をコードする、単離されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリヌクレオチドの組み合わせ。
- 抗TIGIT抗体のVHドメイン及び/またはVLドメインをコードする、単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号241~270、335~342、及び369~370から成る群から選択される1つ以上の配列を含む、前記単離されたポリヌクレオチド。
- 抗TIGIT抗体のVHドメイン及びVLドメインをコードする、単離されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリヌクレオチドの組み合わせであって、配列番号251及び配列番号252を含む、前記単離されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリヌクレオチドの組み合わせ。
- 宿主細胞または無細胞発現システムにおける前記抗体または抗原結合断片の発現を可能にする調節配列に動作可能に連結された、請求項18、請求項19、または請求項20に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせ
を含む、発現ベクター。 - 請求項21に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞または無細胞発現システム。
- ヒトγδT細胞の集団の表面に存在するヒトTIGITに結合する抗TIGIT抗体またはその抗原結合断片と、化学療法剤、抗PD1抗体、抗PD-L1抗体、抗41BB抗体、抗OX40抗体、抗GITR抗体、及び抗ICOS抗体のうちの1つ以上とを含む、組み合わせ。
- がんまたはウイルス感染症を治療する方法で使用するための、任意で前記ウイルス感染症がCMV感染症である、請求項23に記載の組み合わせ。
- 抗TIGIT抗体またはその抗原結合断片と化学療法剤とを含む、組み合わせ。
- 前記化学療法剤がドキソルビシンを含む、請求項25に記載の組み合わせ。
- アデノシンA2A受容体(A2AR)アンタゴニストをさらに含む、請求項25または請求項26に記載の組み合わせ。
- 治療法で使用するための、請求項25~27のいずれか1項に記載の組み合わせ。
- がん、任意で結腸癌腫を治療するのに使用するための、請求項25~27のいずれか1項に記載の組み合わせ。
- がんを治療する方法で使用するための、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
前記方法が、化学療法剤と組み合わせて前記抗体を投与することを含み、
前記抗体または抗原結合断片が、
配列番号16を含む重鎖CDR1(HCDR1)、配列番号17を含む重鎖CDR2(HCDR2)、及び配列番号18を含む重鎖CDR3(HCDR3)を含む、重鎖可変ドメイン
を含み、且つ
配列番号61を含む軽鎖CDR1(LCDR1)、配列番号62を含む軽鎖CDR2(LCDR2)、及び配列番号63を含む軽鎖CDR3(LCDR3)を含む、軽鎖可変ドメイン
をさらに含む、
前記抗体またはその抗原結合断片。 - 前記方法が、A2ARアンタゴニストを投与することをさらに含み、
前記抗体または抗原結合断片と、前記化学療法剤と、前記A2ARアンタゴニストとが、組み合わせとして投与される、
請求項30に記載のがんを治療する方法で使用するための単離された抗体またはその抗原結合断片。 - 前記化学療法剤がドキソルビシンである、請求項30または請求項31に記載のがんを治療する方法で使用するための単離された抗体またはその抗原結合断片。
- 前記がんが結腸癌腫である、請求項30~32のいずれか1項に記載のがんを治療する方法で使用するための単離された抗体またはその抗原結合断片。
- 前記組み合わせを投与することが、適切な投薬計画として投与した場合に、患者の生存を増やす、がんを治療する方法で使用するための単離された抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項24に記載の組み合わせ。
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