JP2011234642A - 鳥類始原生殖細胞に遺伝子を導入する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】トランスジェニック鳥類を創出するための方法として、鳥類始原生殖細胞に対して、高効率に外来遺伝子を導入し、安定発現株を樹立する方法を提供する。
【解決手段】下記の工程1及び2を含む鳥類由来の始原生殖細胞に遺伝子を導入する方法:
(1)鳥類由来の始原生殖細胞を、密度勾配液として培地及びゾルを用いた密度勾配遠心法によって分画する工程1、
(2)工程1によって分画した細胞を回収し、該細胞に遺伝子を導入する工程2。
【選択図】なし
【解決手段】下記の工程1及び2を含む鳥類由来の始原生殖細胞に遺伝子を導入する方法:
(1)鳥類由来の始原生殖細胞を、密度勾配液として培地及びゾルを用いた密度勾配遠心法によって分画する工程1、
(2)工程1によって分画した細胞を回収し、該細胞に遺伝子を導入する工程2。
【選択図】なし
Description
本発明は、鳥類始原生殖細胞に対して高効率に外来遺伝子を導入する方法に関する。
鳥類を用いたトランスジェニック技術は、鳥類の品種改良を目的とするものや、鳥類由来卵をバイオリアクターとしての利用の目的のために、近年、盛んに研究が行われている。そこで、鳥類のトランスジェニック動物を創出するための方法として、従来は、主にレトロウイルスベクターを用いて、鳥類の初期胚の細胞に遺伝子導入する方法がとられてきた。しかしながら、初期胚の細胞に導入することができる遺伝子の大きさには、10kbp程度以下に限られており、そのトランスジェニック動物の用途が限られてしまう点で問題が生じている。
また、近年では様々な細胞に分化する鳥類のES細胞も単離する技術も開発され、鳥類由来のES細胞には10kbをも超える、大型の遺伝子が導入することが可能であるが、鳥類由来のES細胞は生殖細胞に分化することが無いとされており、鳥類由来のES細胞に対して大型の遺伝子が導入することができたとしても、トランスジェニック個体を作製することが出来ないために、上記問題の解決には至らない。
一方、ニワトリの始原生殖細胞を用いた研究から、新たなトランスジェニック個体の作製法が開発された。その方法とは、ニワトリ由来の始原生殖細胞を長期間培養し、ここにプラスミドをはじめとする各種遺伝子を導入し、トランスジェニック個体を創出しようとするものである(非特許文献1)。このような方法には、プラスミド等の外来遺伝子が導入された始原生殖細胞の安定発現株を取得することが必要となり、安定発現株の取得のために高効率に外来遺伝子を導入する技術が望まれている。特に鳥類由来の始原生殖細胞の培養全般に係る作業は、他の一般的な細胞に比べて著しく煩雑で、さらにコストがかかるものであり、多くの鳥類由来の始原生殖細胞を調整することは困難であるために、効率のよい安定発現株を取得方法が切望されている。
また、上記非特許文献1に記載された方法では、6kbp程度の外来遺伝子を導入する程度に留まっており、外来遺伝子が導入された安定発現株を、様々な用途に利用することに鑑みると、より大きなサイズの遺伝子を導入する技術の開発も望まれている。
Robert J. Etches et al., Nature, Vol.441, pp.766-769 (2006)
本発明は、トランスジェニック鳥類を創出するための方法として、鳥類始原生殖細胞に対して、高効率に外来遺伝子を導入し、安定発現株を樹立することを主な目的とする。
上記課題に鑑みて、本発明者が鋭意研究を重ねた結果、鳥類由来の始原生殖細胞に対して所定の処理を施した後に遺伝子を導入すると、その導入効率を顕著に亢進させることを見出した。また、導入された遺伝子を安定的に発現する株を樹立することができる事も見出した。すなわち、本発明は以下の方法を含むものである。
項1 下記の工程1及び2を含む鳥類由来の始原生殖細胞に遺伝子を導入する方法:
(1)鳥類由来の始原生殖細胞を、密度勾配液として培地、及びゾルを用いた密度勾配遠心法によって分画する工程1、
(2)工程1によって分画した細胞を回収し、該細胞に遺伝子を導入する工程2。
(1)鳥類由来の始原生殖細胞を、密度勾配液として培地、及びゾルを用いた密度勾配遠心法によって分画する工程1、
(2)工程1によって分画した細胞を回収し、該細胞に遺伝子を導入する工程2。
項2 ゾルが、ポリビニルピロリドンの被膜を有するシリカ粒子を分散質として含有する上記項1に記載の方法。
項3 ゾル1mL当り、シリカ粒子を1.125〜1.135g含有する上記項2に記載の方法。
項4 シリカ粒子の粒径が、15〜30nmである上記項2又は3に記載の方法。
項5 ゾルが、Percoll(登録商標)である、上記項1に記載の方法。
項6 細胞が、工程1にてゾルを20〜25質量%の含む密度勾配液と、ゾルを45〜55質量%の含む密度勾配液を用いた密度勾配遠心法によって分画した後、ゾルを20〜25質量%含む密度勾配液と、ゾルを45〜55質量%含む密度勾配液の界面に集積する細胞を回収して得られたものである上記項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
本発明の方法によって遺伝子導入した細胞において、一過性に発現するタンパク質の量は、従来の方法によって遺伝子導入した細胞と比較して、遺伝子導入効率が7倍程度にも上昇する。また、本発明の方法を用いることによって、これまでに得ることのできなかった、鳥類由来の始原生殖細胞の安定発現株を得ることができる。
以下に本発明について詳述する。
本発明の鳥類由来の始原生殖細胞に遺伝子を導入する方法は、下記の工程1及び工程2を含むものである。
工程1
鳥類由来の始原生殖細胞を、密度勾配液として培地、及びゾルを用いて密度勾配遠心法によって分画する工程。
工程2
工程1によって分画した細胞を回収し、該細胞に遺伝子を導入する工程。
工程1
鳥類由来の始原生殖細胞を、密度勾配液として培地、及びゾルを用いて密度勾配遠心法によって分画する工程。
工程2
工程1によって分画した細胞を回収し、該細胞に遺伝子を導入する工程。
工程1について
工程1にて用いる鳥類始原生殖細胞は、浮遊性で生殖細胞系列への分化能を有する細胞であり、非特許文献1に記載された方法を用いることによって採取、培養することができる。具体的には、発生初期胚(ニワトリの場合約3日目のHHステージ14−17)の血液を採取し、BRL細胞など適当なフィーダー細胞上にて培養、増殖する細胞を採取すればよい。採取した細胞は、下記に詳述する工程1にて用いる培地に懸濁した状態にして調製すればよい。その懸濁液中の細胞の量は、通常は0.2〜2.0×105細胞/mL程度とすればよい。
工程1にて用いる鳥類始原生殖細胞は、浮遊性で生殖細胞系列への分化能を有する細胞であり、非特許文献1に記載された方法を用いることによって採取、培養することができる。具体的には、発生初期胚(ニワトリの場合約3日目のHHステージ14−17)の血液を採取し、BRL細胞など適当なフィーダー細胞上にて培養、増殖する細胞を採取すればよい。採取した細胞は、下記に詳述する工程1にて用いる培地に懸濁した状態にして調製すればよい。その懸濁液中の細胞の量は、通常は0.2〜2.0×105細胞/mL程度とすればよい。
工程1にて用いる密度勾配遠心法とは、特定の容器内に密度が異なる密度勾配液の層を、段階的に重層することで形成させ、最上層にさらに分離対象となる混合物を重層した後に、該容器を遠心分離工程に供することで、層間の界面にその密度よりも小さい粒子が集まることを利用した分離法である。この方法を、鳥類由来の始原生殖細胞に対して適用することにより、層間の界面に各々異なる特性を有する鳥類由来の始原生殖細胞の群に分画することできる。
本発明においては、密度勾配液として培地、及びゾルを用いることができる。具体的には、本発明の密度勾配液とは培地に対して所定量のゾルを混合させて作製されるものである。上記の密度勾配遠心法を用いるには、その原理に鑑みて、異なる密度の密度勾配溶液を作製する必要があるが、本発明では、培地とゾルを用いて密度勾配液とした際の、密度勾配液全体に対するゾルの質量%によって密度の違いを規定すればよい。このとき、質量%の数値が大きいほど、密度勾配液の密度も大きくなる。
工程1にて用いる密度勾配液は、高い効率で外来遺伝子を導入することのできる、鳥類由来の始原生殖細胞の群を分画できるものであれば特に限定されないが、2種類以上の異なる密度の密度勾配液を用いればよく、好ましくは3種類の異なる密度勾配液を用いればよい。
具体的には、密度勾配液全体に対して10〜15質量%(より好ましくは12〜13質量%)、20〜30質量%(より好ましくは24〜26質量%)、及び45〜50質量%(より好ましくは48〜52質量%)程度ゾルを含む、3種類の異なる密度を有する密度勾配液を用いる方法が挙げられる。
培地とは、通常、鳥類由来の始原生殖細胞に障害を与えないものであれば、特に限定はされないが、例えばDMEM培地、KO−DMEM培地、MEM培地などを挙げることができ、通常の細胞培養時との共通性の観点から、KO−DMEM培地を用いることが好ましい。なお、上記の培地には、鳥類由来の始原生殖細胞を維持するために、血清が含まれていても良い。
血清の濃度は、通常1〜20%であればよく、より好ましくは5〜15%である。また、血清の種類は、特に限定はされないが、ウシ胎仔由来の血清であるFBS、FCS、ニワトリ由来の血清などを挙げることができ、通常の細胞培養時との共通性の観点から、FCSとニワトリ由来血清の混合物を用いることが好ましい。
本発明のゾルとは、鳥類由来の始原生殖細胞に対して毒性を与えることなく十分な生体適合性を有し、密度勾配遠心法による高効率な遺伝子導入が可能となる細胞群を分画する際の、密度勾配液として用いることのできるゾルであればよく、例えば、ポリビニルピロリドンの被膜を有するシリカ粒子を分散質として含有するゾルが挙げられる。
上記のシリカ粒子は、密度勾配遠心法によって高効率に遺伝子導入される鳥類由来の始原生殖細胞を分画するために、本発明のゾル1mL当り通常1.125〜1.135g程度の割合で、分散質として含まれていればよく、さらに好ましくは1.13g程度である。
上記のシリカ粒子の粒径は、密度勾配遠心法によって分画する鳥類由来の始原生殖細胞に障害を与えないために、通常15〜30nm程度であればよい。
上述したゾルのうち、本発明の方法において最も好ましく用いられるものはPercoll(登録商標)である。
工程1では、上述のように調製した2種類以上の異なる密度を有する密度勾配液を、密度の大きい液から順に重層し、最上層に上述した鳥類由来の始原生殖細胞の懸濁液を重層して、遠心分離機に設置して遠心分離工程に供すればよい。遠心分離工程は、通常1000〜1500g程度の遠心力で、15〜25℃程度の条件下にて、15〜30分程度行えばよい。このような遠心分離工程によって、層間の界面に鳥類由来の始原生殖細胞を集積
させ、分画することができる。
させ、分画することができる。
工程2について
工程2は、工程1によって分画した細胞を回収し、該細胞に遺伝子を導入する工程である。
工程2は、工程1によって分画した細胞を回収し、該細胞に遺伝子を導入する工程である。
工程2における細胞の回収方法は、上記の工程1にて、どのような質量%で上述のゾルを含有する密度勾配液を用いたか、何種類の異なる密度の密度勾配液を用いたか等の条件によって異なるが、密度勾配液の全体に対して通常45〜55質量%程度のゾルを含む密度勾配液の層と、それよりも一段階小さい密度の密度勾配液(すなわち、一段階少ない質量%で上記のゾルを含む密度勾配液)との界面に集積し、分画された鳥類由来の始原生殖細胞を回収すればよい。
具体的には、ゾルを20〜25質量%含む密度勾配液と、ゾルを45〜55質量%含む密度勾配液の界面に集積し、分画された細胞を回収することを挙げることができる。
工程2にて用いる細胞への遺伝子導入方法は、公知の遺伝子導入方法であれば、特に限定されること無く用いることができ、導入する鳥類由来の始原生殖細胞の種類、一過性発現か又は安定的発現かといった発現方法などのように、導入する遺伝子の発現形態、導入する遺伝子の大きさ、遺伝子を導入する細胞の強さ、達成されるべき所望の遺伝子導入効率の程度などを勘案して、適宜選択することが可能である。
具体的には、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、燐酸カルシウム法、塩化カルシウム法、アデノウイルスやセンダイウイルスなどのウイルス感染機構を利用するウイルス法、カチオン性リポソームを用いるリポフェクション法などを挙げることができる。本発明においては、高い遺伝子導入効率を達成するために、エレクトロポレーション法を用いることが好ましい。
エレクトロポレーション法を用いたキットとして、Invitrogen社のneon
transfection system、Lonza社のAmaxa Nucleofector等の購入可能なキット付随するシステムを用いてもよい。これらのキット等を用いる際には、販売元より入手可能なプロトコルに沿って、遺伝子導入を実施すればよい。例えば、Amaxa Nucleofectorを用いる際には、遺伝子導入試薬としてNucleofector Vを用い、A−27プロトコルを用いて遺伝子導入することができる。ここで、Nucleofector Vとは、血球系細胞、結合組織細胞、上皮細胞、筋肉細胞、神経細胞への遺伝子導入に適した試薬であり、A−27プロトコルとは、Amaxa Nucleofectorを用いて遺伝子導入する際に最適化された条件の一つである。
transfection system、Lonza社のAmaxa Nucleofector等の購入可能なキット付随するシステムを用いてもよい。これらのキット等を用いる際には、販売元より入手可能なプロトコルに沿って、遺伝子導入を実施すればよい。例えば、Amaxa Nucleofectorを用いる際には、遺伝子導入試薬としてNucleofector Vを用い、A−27プロトコルを用いて遺伝子導入することができる。ここで、Nucleofector Vとは、血球系細胞、結合組織細胞、上皮細胞、筋肉細胞、神経細胞への遺伝子導入に適した試薬であり、A−27プロトコルとは、Amaxa Nucleofectorを用いて遺伝子導入する際に最適化された条件の一つである。
工程2において導入する遺伝子は、DNAであってもRNAであっても良く、それぞれ種類に限定されることは無い。また導入する遺伝子の大きさは、通常20kbp程度までの大きさのものを用いることができ、より好ましくは8〜20kbp程度である。
遺伝子導入後の鳥類由来の始原生殖細胞は、通常の方法を用いて培養・維持すればよく、特に限定される方法は必要とされない。上記工程1及び工程2の方法を用いて遺伝子を導入した鳥類始原生殖細胞は、高効率に外来遺伝子を導入することができるので、安定発現株の樹立に好適に用いることができる。
安定発現株の樹立は、公知の方法を用いることができ、上述の方法によって遺伝子を導入した後に、適当な薬剤を用いて発現株を選択することができる。
本発明の方法を用いることによって、鳥類由来の始原生殖細胞に対して、高い効率で外来遺伝子を導入することが可能となる。とりわけ、20kbp程度のもの大きさの外来遺伝子を導入できる点において、優位な効果を有している。
また、本発明の方法によって導入された遺伝子を、安定的に発現する鳥類由来の始原生殖細胞株を樹立することが可能となる。鳥類由来の始原生殖細胞の遺伝子安定発現株は、従来の方法では樹立することができなかったので、本発明の方法によって得られる、非常に大きな効果である。
さらに、鳥類由来の始原生殖細胞を用いることによって、トランスジェニック鳥類を創出することが可能となるために、トランスジェニック鳥類をバイオリアクターとして用いることにより、様々なタンパク質や生体分子を生合成させることが可能となる
一過的遺伝子導入による検討
50、25、及び12.5質量%のパーコール(GE healthcareBioscience co., Japan)を含むDMEM培地(5質量%FCSを含む)を遠心勾配液として調製し、15mlの遠沈管に3mlずつ、50、25、12.5質量%の順に下から重層して、密度勾配遠心溶液とした。
50、25、及び12.5質量%のパーコール(GE healthcareBioscience co., Japan)を含むDMEM培地(5質量%FCSを含む)を遠心勾配液として調製し、15mlの遠沈管に3mlずつ、50、25、12.5質量%の順に下から重層して、密度勾配遠心溶液とした。
非特許文献1に記載された方法に従って、ニワトリ由来の始原生殖細胞8×104採取し2分割した。片方は対照実験用として、何ら操作を加えずに保存し、もう片方を遠心して回収し、その後3mlの5質量%FCSを含むKO−DMEM培地に懸濁して準備した。既に作製した上述の密度勾配遠心溶液の上部に重層し、1160gの強さで、20分間遠心した。遠心の後、50質量%のパーコールを含むDMEM培地と、25質量%のパーコールを含むDMEM培地の境界面に集積する細胞を回収した。回収した細胞に、新たな5質量%FCSを含むDMEM培地を加えて懸濁し、その後遠心した。同時に対照実験用のニワトリ由来の始原生殖細胞も遠心した。それぞれの細胞を1mlのPBSに懸濁し、800gで1分間遠心後、PBSを除いた細胞をトランスフェクションに用いた。
トランスフェクションは、neon transfection system(invitrogen)を用いて行った。図1に示す14kbのプラスミドを1μg、及び10μlのR−solution用いてトランスフェクションを行なった。1300V、10msの条件下で3回パルスによって行った。
細胞を、非特許文献1に記載された抗生物質を含まない始原生殖細胞用の培地(KO−DMEM、7.5%FCS、2.5%chicken serum)に懸濁しBRL feeder細胞上で24時間培養後、蛍光顕微鏡を用いて観察を行なった(図2)。また、定量的解析の為に培養皿中心部3箇所の重ならない領域で赤色蛍光陽性の細胞数を計測した。その結果対照群28±13個に対し、密度勾配遠心したものでは200±80個で
あり(図3)、密度勾配遠心による遺伝子導入効率の顕著な向上が認められた。
あり(図3)、密度勾配遠心による遺伝子導入効率の顕著な向上が認められた。
安定的遺伝子導入における検討
次に、始原生殖細胞株への安定的遺伝子導入における本研究の有用性について検討した。採取したニワトリ由来の始原生殖細胞の数を1.5×105とした以外は、上述した一過的遺伝子導入による検討と同様にして、始原生殖細胞株を処理した。また、同時に未処理のニワトリ由来の始原生殖細胞も調整した。
次に、始原生殖細胞株への安定的遺伝子導入における本研究の有用性について検討した。採取したニワトリ由来の始原生殖細胞の数を1.5×105とした以外は、上述した一過的遺伝子導入による検討と同様にして、始原生殖細胞株を処理した。また、同時に未処理のニワトリ由来の始原生殖細胞も調整した。
処理後の始原生殖細胞及び対照実験用として調整した未処理の始原生殖細胞のそれぞれを、1mlのPBSに懸濁し、800gで1分間遠心後、PBSを除き、Amaxa Nucleofector(Lonza)を用いて遺伝子導入を行なった。図1の模式図にて示す14kbのプラスミド3μgと、始原生殖細胞を、Nucleofector V中で混合し、その後Nucleofector protocol A−27を用いて始原生殖細胞に導入した。遺伝子導入後の細胞を、抗生物質を含まない始原生殖細胞用の培地に懸濁し12分割し、BRL feeder細胞上で3日間培養後培地にネオマイシン(invivogen)を終濃度300μg/mlとなるように加え、適宜培地交換を行ないながら3週間培養した。そののちネオマイシン耐性のクローンの存在する培養皿を計数した。その結果を図4に示す。
パーコールを用いた密度勾配遠心を行なった群では4つの培養皿でネオマイシン耐性クローンが認められたのに対し対照群では0であった。また、得られたクローンの細胞は全て赤色蛍光を安定的に発現していた(図5)。
Claims (3)
- 下記の工程1及び2を含む鳥類由来の始原生殖細胞に遺伝子を導入する方法:
(1)鳥類由来の始原生殖細胞を、密度勾配液として培地、及びゾルを用いた密度勾配遠心法によって分画する工程1、
(2)工程1によって分画した細胞を回収し、該細胞に遺伝子を導入する工程2。 - ゾルが、ポリビニルピロリドンの被膜を有するシリカ粒子を分散質として含有する請求項1に記載の方法。
- 細胞が、工程1にてゾルを20〜25質量%の含む密度勾配液と、ゾルを45〜55質量%の含む密度勾配液を用いた密度勾配遠心法によって分画した後、工程2にてゾルを20〜25質量%含む密度勾配液と、ゾルを45〜55質量%含む密度勾配液の界面に集積する細胞を回収して得られたものである請求項1又は2に記載の方法。
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JP2010107003A JP2011234642A (ja) | 2010-05-07 | 2010-05-07 | 鳥類始原生殖細胞に遺伝子を導入する方法 |
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- 2010-05-07 JP JP2010107003A patent/JP2011234642A/ja active Pending
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