JP2011186060A - レーザ走査型顕微鏡および制御方法 - Google Patents

Abstract

【課題】歪のない画像を取得する。
【解決手段】レーザ光を走査する走査ミラーから試料に向かう光路に配置される集光レンズおよび対物レンズの間に形成される一次結像面に校正部材２０を配置する。校正部材２０は、レーザ光を観察視野内で走査する際に一次結像面をレーザ光が通過する通過範囲に対応して開口する開口部４１と、開口部４１の近傍に規定の間隔で複数のマークが印された校正用目盛り４２−１乃至４２−４とを有する。本発明は、例えば、走査型レーザ顕微鏡に適用できる。
【選択図】図２

Description

本発明は、レーザ走査型顕微鏡および制御方法に関する。

従来、試料に照射されるレーザ光を走査し、試料から発せられた反射光または蛍光を光検出器に導入して、その検出光の強度とレーザ光の走査位置とを関連付けることで、レーザ光の走査範囲内の画像を取得し、試料の観察を行うレーザ走査型顕微鏡がある。

一般的に、レーザ走査型顕微鏡では、例えば、制御装置から出力される駆動信号に従ってガルバノモータが走査ミラーを駆動してレーザ光を走査しており、試料上の画像取得範囲においてレーザ光が一定速度で移動するような制御が行われる。

ところが、駆動信号が直線的であっても、ガルバノモータの機械的な特性などにより、実際には、走査ミラーが駆動信号に忠実に追従しないため、試料上の画像取得範囲においてスポットが一定速度で移動しないことがある。このような場合、画像に歪が発生することになり良好な観察を行うことができない。そのため、駆動信号に対して非線形にレーザ光が走査されても、歪のない画像を取得する手法が提案されている。

例えば、特許文献１には、格子状の反射パターンが描かれているスケールを走査ミラーの裏面に配置し、その走査ミラーの裏面で反射された反射光から得られるクロックに基づいて画像を取得する手法が開示されている。また、特許文献２には、試料上の集光位置の値が変化せずに一定となるような既知の波形を用いてレーザ光の走査を行う手法が開示されている。

特開２０００−１４７３９５号公報 特開２００３−４３３６７号公報

しかしながら、特許文献１に開示されている手法では、任意の倍率または解像度の画像を取得することは困難であり、特許文献２に開示されている手法では、上述の機械的な特性による画像の歪を確実に除去することは困難であり、任意の倍率または解像度で、歪のない画像を確実に取得することが求められている。

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、歪のない画像を取得することができるようにするものである。

本発明のレーザ走査型顕微鏡は、レーザ光を試料上の観察視野内で走査し、前記試料からの光を用いて前記試料の画像を取得する走査型レーザ顕微鏡であって、前記レーザ光を走査する走査手段と、前記走査手段から前記試料に向かう光路に配置される第１および第２のレンズと、前記第１および第２のレンズの間に形成される結像面に配置される板状の校正部材とを備え、前記校正部材は、前記レーザ光を前記試料上の観察視野内で走査する際に前記結像面を前記レーザ光が通過する通過範囲に対応して形成された開口部と、前記開口部の近傍に規定の間隔で複数のマークが印された校正用目盛りとを有することを特徴とする。

本発明の校正部材は、レーザ光を試料上で走査し、前記試料からの光を用いて前記試料の画像を取得する走査型レーザ顕微鏡における前記レーザ光の光路上に形成される結像面に配置される校正部材であって、前記レーザ光を前記試料上の観察視野内で走査する際に前記結像面を前記レーザ光が通過する通過範囲に対応して形成された開口部と、前記開口部の近傍に規定の間隔で複数のマークが印された校正用目盛りとを備えることを特徴とする。

本発明の制御方法は、レーザ光を試料上で走査し、前記試料からの光を用いて前記試料の画像を取得する走査型レーザ顕微鏡の制御方法であって、前記走査型レーザ顕微鏡は、前記レーザ光を前記試料上の観察視野内で走査する際に前記レーザ光の光路上に形成される結像面を前記レーザ光が通過する通過範囲に対応して形成された開口部と、前記開口部の近傍に規定の間隔で複数のマークが印された校正用目盛りとを有する校正部材を備え、前記校正部材が有する前記校正用目盛りに前記レーザ光を走査させて複数の前記マークの位置を測定し、測定された信号と前記規定の間隔に対応する理論信号との誤差を解消するように、前記レーザ光を走査する走査手段を駆動させる駆動信号を校正するステップを含むことを特徴とする。

本発明のレーザ走査型顕微鏡においては、試料に向かう光路に配置される第１および第２のレンズの間に形成される結像面に配置される板状の校正部材に、レーザ光を試料上の観察視野内で走査する際に結像面をレーザ光が通過する通過範囲に対応して形成された開口部と、開口部の近傍に規定の間隔で複数のマークが印された校正用目盛りとが設けられている。

本発明の校正部材においては、レーザ光を試料上の観察視野内で走査する際に結像面をレーザ光が通過する通過範囲に対応して形成された開口部と、開口部の近傍に規定の間隔で複数のマークが印された校正用目盛りとが設けられている。

本発明の制御方法においては、校正部材が有する校正用目盛りにレーザ光を走査させて複数のマークの位置が測定され、測定された信号と規定の間隔に対応する理論信号との誤差を解消するように駆動信号が校正される。

本発明のレーザ走査型顕微鏡および制御方法によれば、歪のない画像を取得することができる。

本発明を適用したレーザ走査型顕微鏡の一実施の形態の構成例を示す図である。 校正部材を示す図である。 ３つのパターンの校正用目盛りの例を示す図である。 校正処理で利用されるマークと、それらのマークに応じて得られる強度信号とを示す図である。 駆動信号を校正する手順について説明する図である。 Ｘ軸とＹ軸との直交度について説明する図である。 レーザ走査型顕微鏡による測定処理を説明するフローチャートである。

以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。

図１は、本発明を適用したレーザ走査型顕微鏡の一実施の形態の構成例を示す図である。

図１のレーザ走査型顕微鏡１１は、ステージ１２に載置された試料１３上でレーザ光を走査し、試料１３からの光を用いて試料１３の画像を取得する。レーザ走査型顕微鏡１１は、２つの光源１４−１および１４−２を備えており、光源１４−１から出力されるレーザ光は光学系１５−１において走査されるとともに、光源１４−２から出力されるレーザ光は光学系１５−２において走査される。

光学系１５−１において走査されるレーザ光は、ミラー１６により試料１３に向かう光軸に沿って反射されて、その光軸上に配置されているダイクロイックミラー１７を透過する。また、光学系１５−２において走査されるレーザ光は、ダイクロイックミラー１７により試料１３に向かう光軸に沿って反射される。即ち、ダイクロイックミラー１７は、光学系１５−１からのレーザ光の光路と、光学系１５−２からのレーザ光の光路とを合成する光路合成手段である。

光源１４−１から出力されるレーザ光は、光学系１５−１において、集光レンズ２１−１により平行光とされ、ダイクロイックミラー２２−１を透過し、Ｘ走査ミラー２３−１およびＹ走査ミラー２４−１を備えて構成されるガルバノスキャナにより、ミラー１６に向かって反射される。そして、Ｘ軸走査手段２５−１およびＹ軸走査手段２６−１が、制御装置３２の制御に従って、Ｘ走査ミラー２３−１およびＹ走査ミラー２４−１を駆動することによりレーザ光が走査される。

同様に、光源１４−２から出力されるレーザ光は、光学系１５−２において、集光レンズ２１−２により平行光とされ、ダイクロイックミラー２２−２を透過し、Ｘ走査ミラー２３−２およびＹ走査ミラー２４−２を備えて構成されるガルバノスキャナにより、ダイクロイックミラー１７に向かって反射される。そして、Ｘ軸走査手段２５−２およびＹ軸走査手段２６−２が、制御装置３２の制御に従って、Ｘ走査ミラー２３−２およびＹ走査ミラー２４−２を駆動することによりレーザ光が走査される。

ダイクロイックミラー１７を透過した光学系１５−１からのレーザ光、および、ダイクロイックミラー１７により反射された光学系１５−２からのレーザ光は、集光レンズ１８により一旦結像された後、対物レンズ１９により集光されて試料１３上にスポットを形成する。集光レンズ１８によりレーザ光が結像される一次結像面には、校正部材２０が配置されている。なお、校正部材２０については、図２を参照して後述する。

ここで、レーザ走査型顕微鏡１１では、光学系１５−１および１５−２においてレーザ光が走査されることにより、レーザ光のスポットは、試料１３上の所定範囲を走査することができるが、より広範囲の走査を実現するために、駆動機構２７がステージ１２をＸ−Ｙ方向（試料１３に照射されるレーザ光の光軸をＺ方向として、Ｚ方向に直交する方向）に駆動するように構成されている。なお、駆動機構２７は、ユーザによる手動で駆動する手動機構や、電気的に制御されて駆動する電動機構などにより構成される。

そして、試料１３に含まれている蛍光材料にレーザ光が照射されると、その蛍光材料から蛍光が発せられ、対物レンズ１９および集光レンズ１８を介してレーザ光の経路を逆に辿る。

例えば、光源１４−１から出力されたレーザ光により発せられた蛍光は、光学系１５−１のレーザ光の経路を逆に辿って、ダイクロイックミラー２２−１に向かう。ダイクロイックミラー２２−１に入射した蛍光は、レーザ光よりも波長が長いためダイクロイックミラー２２−１で反射し、集光レンズ２８−１により集光されて光検出器２９−１に入射する。光検出器２９−１は、入射した光を、その強度に応じた電気信号に変換して強度信号画像化回路３０−１に出力する。

同様に、光源１４−２から出力されたレーザ光により発せられた蛍光は、光学系１５−２のレーザ光の経路を逆に辿って、ダイクロイックミラー２２−２で反射し、集光レンズ２８−２により集光されて光検出器２９−２に入射し、その強度に応じた電気信号が強度信号画像化回路３０−２に出力される。

強度信号画像化回路３０−１は、制御装置３２の制御に従ったタイミングで、即ち、試料１３上のスポットの位置に応じたＸ走査ミラー２３−１およびＹ走査ミラー２４−１の角度に関連付けられたタイミングで、光検出器２９−１から出力される電気信号をサンプリングし、その結果得られる強度信号を試料１３上の走査面に対応した強度信号列とすることで画像化する。同様に、強度信号画像化回路３０−２は、光検出器２９−２から出力される電気信号をサンプリングして、試料１３上の走査面を画像化する。そして、強度信号画像化回路３０−１および３０−２は、画像信号を表示装置（図示せず）に出力して表示させたり、記憶装置（図示せず）に出力して記憶させる。

また、強度信号画像化回路３０−１および３０−２は、後述するように、校正部材２０に対する測定が行われる場合、光検出器２９−１および２９−２から出力される電気信号をサンプリングして得られる強度信号を、マーク位置信号抽出部３１−１および３１−２に供給する。

マーク位置信号抽出部３１−１および３１−２は、校正部材２０に対する測定により得られる強度信号から、校正部材２０に印されている所定のマークの位置に応じてピークが現れるような測定信号（図４参照）を抽出し、その測定信号を制御装置３２に供給する。

制御装置３２は、図示しない上位の装置から供給される走査条件に従って、レーザ走査型顕微鏡１１の各部の制御を行う。

例えば、制御装置３２は、水平同期信号、水平サンプリング有効信号、強度信号サンプリング同期信号、垂直同期信号などの各種のタイミング信号を強度信号画像化回路３０−１および３０−２に供給し、強度信号画像化回路３０−１および３０−２による強度信号のサンプリングを制御する。

また、制御装置３２は、鋸形状の駆動信号をＸ軸走査手段２５−１および２５−２並びにＹ軸走査手段２６−１および２６−２に供給し、Ｘ走査ミラー２３−１および２３−２並びにＹ走査ミラー２４−１および２４−２の回転角度を制御してレーザ光を走査して、試料１３上のレーザ光のスポットの位置を制御する。

ここで、例えば、制御装置３２は、書き換え可能なメモリ（例えば、RAM（Random Access Memory）など）に、駆動信号の波形を生成するための波形データを格納し、所定の基準クロックから生成される読み出しクロックに従ったタイミングで、メモリから波形データを読み出して出力する。波形データは、試料１３上の画像取得範囲においてスポットが一定速度で移動するように、一定の間隔の読み出しクロックに対して直線的な波形が生成されるように、即ち、一定の割合で値が増加するように、走査条件に従って所定の制御プログラムにより生成される。

ところで、このような直線的な波形データから生成される駆動信号により走査手段が走査ミラーを駆動しても、ガルバノモータなどの機械的な特性により、実際には、試料１３上の画像取得範囲においてスポットが一定速度で移動しないことがある。

そこで、レーザ走査型顕微鏡１１では、制御装置３２が、マーク位置信号抽出部３１−１および３１−２から供給される測定信号に基づいて、試料１３上の画像取得範囲においてスポットが一定速度で移動するように駆動信号を校正し、その校正後の駆動信号により試料１３の画像を取得する処理が行われる。

例えば、制御装置３２は、所定の基準クロックから読み出しクロックを生成するときに、読み出しクロックの間隔を調整して駆動信号のゲインを調整したり、読み出しクロックの開始タイミングを調整することで駆動信号のオフセットを調整したりする。

そして、レーザ走査型顕微鏡１１では、制御装置３２からＸ軸走査手段２５−１にＸ走査軸の駆動信号が供給されると、Ｘ軸走査手段２５−１によりＸ走査ミラー２３−１が所定の往復運動を行い、試料１３からの蛍光が、Ｘ走査ミラー２３−１の角度に応じた強度信号として、即ち、試料１３上で形成されるスポットの位置に応じた強度信号として強度信号画像化回路３０−１により検出されるため、スポットの位置と強度信号とを関連付けることにより画像が構築される。そして、Ｘ走査ミラー２３−１によりＸ方向へ１ラインの走査が行われるたびに、Ｙ走査ミラー２４−１により垂直方向へ１ライン分移動させることを繰り返すことにより、１ラインずつ垂直方向に異なる水平方向の強度信号列が蓄積され、二次元の画像を得ることができる。また、光学系１５−１への処理と同様に、光学系１５−２においても画像を取得することができる。

次に、図２を参照して、校正部材２０について説明する。

校正部材２０には、板状の部材が用いられ、校正部材２０の中央には、矩形の開口部４１が形成されている。また、校正部材２０では、開口部４１の４辺の近傍に、それぞれの辺に沿って規定の間隔で、レーザ光の走査により反射信号の取得可能なマークが印された校正用目盛り４２−１乃至４２−４が設けられている。図１に示したように、校正部材２０は、集光レンズ１８と対物レンズ１９との間の光路上の、集光レンズ１８によりレーザ光が結像される一次結像面に配置される。

開口部４１は、試料１３に照射されるレーザ光を通過させるために設けられており、試料１３を観察する際に試料１３上にレーザ光を走査させて画像を取得する範囲である観察視野へのレーザ光の照射の妨げとならないように、観察時において一次結像面を通過するレーザ光の通過範囲よりも若干広い大きさとされている。

また、校正部材２０が一次結像面に配置されることで、視野範囲外にレーザ光が照射されるように制御されて校正部材２０にレーザ光が照射された場合には、校正部材２０の表面に焦点が合致する。従って、視野範囲外にレーザ光が照射されるように制御し、校正用目盛り４２−１乃至４２−４に沿ってレーザ光を走査させることで、校正用目盛り４２−１乃至４２−４を測定することができ、その測定結果として、校正用目盛り４２−１乃至４２−４のマークの位置に応じてピークが現れる検出信号が出力される。

校正用目盛り４２−１乃至４２−４では、予め決められた規定の間隔でマークが印されており、制御装置３２には、校正部材２０で採用されている校正用目盛り４２−１乃至４２−４での規定の間隔が登録されている。

従って、レーザ走査型顕微鏡１１では、登録されている規定の間隔に対応する理論信号と、校正用目盛り４２−１乃至４２−４の測定結果として得られる測定信号とに基づいた校正処理を行うことができる。つまり、Ｘ軸に沿ってマークが印されている校正用目盛り４２−１および４２−２を測定することで、Ｘ走査ミラー２３−１および２３−２を駆動させる駆動信号の校正を行うことができ、Ｙ軸に沿ってマークが印されている校正用目盛り４２−３および４２−４を測定することで、Ｙ走査ミラー２４−１および２４−２を駆動させる駆動信号の校正を行うことができる。

なお、校正用目盛り４２−１乃至４２−４は、それぞれ同一のパターンのマークが印されており、以下、適宜、校正用目盛り４２−１乃至４２−４それぞれを区別する必要がない場合、校正用目盛り４２と称する。

また、校正用目盛り４２で印されるマークのパターンとしては、図２に示されるような中央付近で間隔が狭くなるようなパターンの他、マークの間隔が予め決定されているものであれば、様々なパターンを採用することができる。

例えば、図３には、３つのパターンの校正用目盛り４２の例が示されている。

校正用目盛り４２Ａは、図２に示した校正用目盛り４２のパターンと同様に、マークの間隔が不均等とされ、中央に近くなるに従って、マークの間隔が狭くなるようなパターンとされている。

また、校正用目盛り４２Ａでは、それぞれ同じ長さの３種類のマークが用いられている。校正用目盛り４２Ａの中心には、白抜きの中心マークＣが印されており、中心マークＣは、校正用目盛り４２Ａの原点（校正用目盛り４２−１および４２−２であればＸ座標の原点、校正用目盛り４２−３および４２−４であればＹ座標の原点）を表している。

また、校正用目盛り４２Ａの全体に渡って、太線の低倍率用マークが印されており、校正用目盛り４２Ａの中央近傍に、細線の高倍率用マークが印されている。低倍率用マークおよび高倍率用マークは、中心マークＣに対して対称となるように印されており、低倍率用マークの間隔は、高倍率用マークの間隔よりも狭くなっている。

レーザ走査型顕微鏡１１において、試料１３の観察を高倍率で行う場合には、校正用目盛り４２Ａの中央近傍に印されている高倍率用マークを利用して校正処理が行われ、試料１３の観察を高倍率で行う場合には、校正用目盛り４２Ａの全体に渡って印されている低倍率用マークを利用して校正処理が行われる。

校正用目盛り４２Ｂでは、その全体に渡って、白抜きの中心マークＣ、太線の低倍率用マーク、細線の高倍率用マークが混在している。即ち、校正用目盛り４２Ｂでは、全体に渡って等間隔で低倍率用マークが印されているとともに、低倍率用マークどうしの中間となる位置に中心マークＣが印されている。図３の例では、６つの中心マークＣ_１乃至Ｃ_６が印されている。そして、中心マークＣ_１乃至Ｃ_６それぞれに対して対称となり、それぞれの中心マークＣ_１乃至Ｃ_６に近くなるに従って間隔が狭くなるように、高倍率用マークが印されている。

このような校正用目盛り４２Ｂを利用することで、観察視野の中央以外の任意の箇所で、高倍率での観察を行う際の校正処理を行うことができる。

校正用目盛り４２Ｃでは、校正用目盛り４２Ｃの長手方向に直交する方向に、観察倍率ごとのマークが印されており、図３の例では、図３の上側に低倍率用マークが印され、その下側に高倍率用マークが印されている。

このような校正用目盛り４２Ｃを利用する際には、観察倍率に応じたマークの位置でレーザ光を走査させることができ、例えば、観察倍率が低倍率であるとき、高倍率用マークが検出されることを回避したり、観察倍率が高倍率であるとき、低倍率用マークが検出されることを回避することができる。即ち、それぞれの観察倍率に応じたマークだけを検出することができる。

このように、校正部材２０には、規定の間隔でマークが印された校正用目盛り４２が設けられている。そして、レーザ走査型顕微鏡１１では、試料１３の観察を行う前に、校正用目盛り４２を測定し、測定信号に基づいて駆動信号を校正する校正処理が行われる。校正処理では、校正用目盛り４２の中心マークＣと、観察倍率での最大視野となる両端のマークとが用いられる。

図４には、校正処理で利用されるマークと、それらのマークに応じて得られる強度信号とが示されている。

校正処理においては、校正用目盛り４２の中心マークＣ、観察倍率でのマイナス方向の視野限界の近傍にあるマークＬ、および、観察倍率でのプラス方向の視野限界の近傍にあるマークＲが利用される。即ち、中心マークＣを原点として、マークＬとマークＲとの間隔が、観察倍率での最大視野を表している。

そして、校正用目盛り４２にレーザ光を走査することで、校正用目盛り４２のマークの位置に応じてピークが現れる信号が測定される。即ち、マークＬ、中心マークＣ、およびマークＲに沿ってレーザ光を走査することで、中心マークＣに応じてピークＰ_Ｃが現れ、マークＬに応じてピークＰ_Ｌが現れ、マークＲに応じてピークＰ_Ｒが現れるような信号が測定される。

例えば、Ｘ軸の駆動信号に対する校正処理を行う場合には、Ｙ軸の駆動信号を観察視野よりも外側となるように制御して、Ｙ軸のプラス方向の校正用目盛り４２−１の位置にＹ軸の駆動信号を固定して校正用目盛り４２−１に対してレーザ光を走査させ、マイナス方向の校正用目盛り４２−２の位置にＹ軸の駆動信号を固定して校正用目盛り４２−２に対してレーザ光を走査させる。このとき、Ｘ軸方向に、観察倍率（校正を行う倍率）で通常のレーザ光の走査を行い、光検出器２９に入射する光の強度に基づいて、マーク位置信号抽出部３１から制御装置３２に測定信号が供給される。なお、校正用目盛り４２の測定用に、光検出器２９とは別に、専用の光検出器を設けてもよい。

上述したように、制御装置３２には、校正部材２０に設けられている校正用目盛り４２の規定の間隔が予め設定されており、駆動信号に対する測定位置にズレが発生していない場合に得られる信号、即ち、規定の間隔に対応してピークが現れる信号（以下、適宜、理論信号と称する）と、実際に測定された信号（以下、適宜、測定信号と称する）とを比較して、駆動信号の校正が行われる。

次に、図５を参照し、駆動信号を校正する手順について説明する。

図５の一番上には、理想的な走査が行われた場合に測定されると期待される、規定の間隔に対応してピークＰ_Ｌ、ピークＰ_Ｃ、およびピークＰ_Ｒが現れる理論信号が示されており、その理論信号の下側に測定信号が示されている。駆動信号に対する測定位置にズレが発生しているため、理論信号のピークＰ_Ｌ、ピークＰ_Ｃ、およびピークＰ_Ｒに対して、測定信号のピークＰ_Ｌ’、ピークＰ_Ｃ’、およびピークＰ_Ｒ’にはズレが発生している。

このようなズレが発生しているとき、まず、測定信号の振幅（ピークＰ_Ｌ’とピークＰ_Ｒ’との間隔）が、理論信号の振幅（ピークＰ_ＬとピークＰ_Ｒとの間隔）に一致するように、振幅を調整するゲイン調整が行われる。ゲイン調整は、例えば、駆動信号を読み出す読み出し信号のピッチを調整することにより行われる。図５の例では、読み出し信号のピッチを広くすることで、測定信号の振幅が広がるようにゲイン調整が行われる。

ゲイン調整を行った後、測定信号のピークＰ_Ｃ’が、理論信号のピークＰ_Ｃに一致するようにオフセットさせるオフセット調整が行われる。オフセット調整は、例えば、駆動信号を読み出す読み出し信号の開始タイミングを調整することにより行われる。図５の例では、読み出し信号の開始タイミングを遅らせることで、測定信号を遅らせてピークを一致させるオフセット調整が行われる。

このようなゲイン調整およびオフセット調整を行った後、校正部材２０の校正用目盛り４２を再度測定し、調整後の測定信号と理論信号とのズレが所定の誤差範囲内となるようにゲイン調整およびオフセット調整を繰り返して、測定信号と理論信号とが略一致する（所定の誤差範囲内となる）ように駆動信号が校正される。

なお、図１に示すように、レーザ走査型顕微鏡１１が複数の光学系を備えている場合、それぞれの光学系について、同様の校正処理を行うことで、各光学系が共通の座標系で観察を行うことができるように駆動位置が統一される。従って、例えば、光学系１５−１を使用した観察で得られた座標情報に基づいて、光学系１５−２を使用した観察を行っても、それぞれの座標系は一致しているので、座標情報がずれることなく観察を行うことができる。

ところで、上述したような校正処理は、Ｘ軸とＹ軸とが完全に直交するように光学系がセットされている場合には、Ｘ軸の駆動信号を校正する場合には、校正用目盛り４２−１および４２−２のいずれか一方を測定するだけでよく、Ｙ軸の駆動信号を校正する場合には、校正用目盛り４２−３および４２−４のいずれか一方を測定するだけでよい。しかしながら、Ｘ軸とＹ軸とが完全に直交していない場合には、一方の軸を駆動させると、他方の軸で決定しているはずの座標値が変化してしまう。そのため、校正用目盛り４２−１および４２−２の両方を測定するとともに、校正用目盛り４２−３および４２−４の両方を測定することで、完全に直交していないことによる誤差を測定することができ、より正確な校正を行うことができる。

図６を参照し、Ｘ軸とＹ軸との直交度について説明する。

図６Ａおよび図６Ｂには、Ｘ走査ミラー２３の駆動軸とＹ走査ミラー２４の駆動軸とが完全に直交している場合における試料１３の走査面上でのレーザ光の軌跡が示されている。

図６Ａに示すように、Ｘ走査ミラー２３の駆動軸とＹ走査ミラー２４の駆動軸とが完全に直交している場合、Ｘ走査ミラー２３を固定した状態で、Ｙ走査ミラー２４を駆動させてＸ走査ミラー２３の駆動軸上でレーザ光を走査すると、Ｙ走査ミラー２４の位置に関係なく、試料１３の走査面上におけるレーザ光のＸ座標は固定され、レーザ光の軌跡はＹ軸の方向と一致する。

同様に、Ｙ走査ミラー２４を固定した状態で、Ｘ走査ミラー２３を駆動させてレーザ光を走査したとき、図６Ｂに示すように、Ｘ走査ミラー２３の位置に関係なく、試料１３の走査面上におけるレーザ光のＹ座標は固定され、レーザ光の軌跡はＸ軸の方向と一致する。

これに対し、図６Ｃおよび図６Ｄには、Ｘ走査ミラー２３の駆動軸とＹ走査ミラー２４の駆動軸とが完全に直交していない場合における試料１３の走査面上でのレーザ光の軌跡が示されている。

図６Ｃに示すように、Ｘ走査ミラー２３の駆動軸とＹ走査ミラー２４の駆動軸とが完全に直交していない場合、Ｘ走査ミラー２３を固定した状態で、Ｙ走査ミラー２４を駆動させてＸ走査ミラー２３の駆動軸上でレーザ光を走査すると、Ｘ走査ミラー２３を固定しているにもかかわらず、試料１３の走査面上におけるレーザ光のＸ座標が変化し、レーザ光の軌跡はＹ軸の方向に対してズレが発生する。

同様に、Ｙ走査ミラー２４を固定した状態で、Ｘ走査ミラー２３を駆動させてレーザ光を走査したとき、図６Ｄに示すように、Ｙ走査ミラー２４を固定しているにもかかわらず、試料１３の走査面上におけるレーザ光のＹ座標が変化し、レーザ光の軌跡はＸ軸の方向に対してズレが発生する。

このように、Ｘ走査ミラー２３の駆動軸とＹ走査ミラー２４の駆動軸とが完全に直交していない場合において、図６Ｅに示すように、校正用目盛り４２−１および４２−２を測定することで、レーザ光の軌跡のＹ軸の方向に対するズレを求めることができるとともに、図６Ｆに示すように、校正用目盛り４２−３および４２−４を測定することで、レーザ光の軌跡のＸ軸の方向に対するズレを求めることができる。

図６Ｅには、校正用目盛り４２−１および４２−２を測定した結果得られる見かけ上の中心マークＣ、マークＬ、マークＲが視野の上下に点で示されており、上下の中心マークＣに対応する点を結ぶ直線が、Ｙ軸に対してズレているため、このズレを解消するように校正が行われる。同様に、図６Ｆには、校正用目盛り４２−３および４２−４を測定した結果得られる見かけ上の中心マークＣ、マークＬ、マークＲが視野の左右に点で示されており、左右の中心マークＣに対応する点を結ぶ直線が、Ｘ軸に対してズレているため、このズレを解消するように校正が行われる。

このように、Ｘ走査ミラー２３の駆動軸とＹ走査ミラー２４の駆動軸とが完全に直交していなくても、光軸を中心として対称となるように校正用目盛り４２−１乃至４２−４を配置し、校正用目盛り４２−１乃至４２−４を測定することで、駆動軸のズレに応じた校正を行うことができ、歪のない画像を得ることができる。

次に、図７は、レーザ走査型顕微鏡１１による測定処理を説明するフローチャートである。

例えば、ユーザがレーザ走査型顕微鏡１１の電源スイッチ（図示せず）を操作して、レーザ走査型顕微鏡１１を起動すると処理が開始され、ステップＳ１１において、校正用目盛り４２−１乃至４２−４の測定が行われる。

即ち、制御装置３２は、Ｙ軸の駆動信号を観察視野よりも外側となるように制御し、Ｘ軸の駆動信号（走査条件から求められた駆動信号）により観察倍率でＸ走査ミラー２３を駆動するように制御して、校正用目盛り４２−１および４２−２に対してレーザ光を走査させる。これにより、マーク位置信号抽出部３１から、校正用目盛り４２−１および４２−２のマークの位置に応じてピークが現れる測定信号が制御装置３２に出力される。同様に、校正用目盛り４２−３および４２−４に対してレーザ光を走査させて、校正用目盛り４２−３および４２−４のマークの位置に応じてピークが現れる測定信号が制御装置３２に出力される。

ステップＳ１２において、制御装置３２は、ステップＳ１１で供給された測定信号と、予め設定されている理論信号とに基づいて、図５を参照して説明したように、ゲイン調整およびオフセット調整を行って、駆動信号を校正する。

ステップＳ１３において、制御装置３２は、校正後の駆動信号を使用して、ステップＳ１１での処理と同様に、再度、校正用目盛り４２−１乃至４２−４の測定を行い、その結果得られる測定信号が制御装置３２に供給される。

ステップＳ１４において、制御装置３２は、ステップＳ１３で供給された測定信号と、予め設定されている理論信号との誤差を求め、その誤差が所定の誤差範囲内であるか否かを判定する。

ステップＳ１４において、制御装置３２が、求められた誤差が誤差範囲内でないと判定した場合、処理はステップＳ１２に戻り、その誤差を解消するように同様の処理が繰り返される。

一方、ステップＳ１４において、制御装置３２が、求められた誤差が誤差範囲内であると判定した場合、処理はステップＳ１５に進み、試料１３に対してレーザ光を走査させて、試料１３の画像を取得する処理が行われる。

以上のように、レーザ走査型顕微鏡１１では、校正部材２０を利用して駆動信号を校正することにより、試料１３上の観察視野においてレーザ光の走査速度が一定となるので、歪のない画像を確実に取得することができる。

また、レーザ走査型顕微鏡１１の起動時に駆動信号を校正する処理を行うことにより、例えば、レーザ走査型顕微鏡１１が起動してからレーザ光の出力が安定するまでの待機時間を利用して駆動信号を校正する処理を行うことができ、観察時間を有効に使用することができる。また、レーザ走査型顕微鏡１１が起動するたびに校正処理を行うことで、レーザ走査型顕微鏡１１の経年劣化などにも応じて、駆動信号を校正することができる。

また、ステップＳ１２乃至１４の処理は、制御装置３２において自動的に行われるので、例えば、ユーザが、誤差に基づいて手動で調整を行う必要がなく、観察を容易に行うことができる。また、レーザ走査型顕微鏡１１の個体ごとの誤差にも対応することができる。

また、複数の光学系（走査系）の間で同一の校正部材２０により校正を行うので、各光学系の走査位置がずれることも回避される。これにより、複数の光学系を切り替えて行われる観察を容易に行うことができる。

また、校正部材２０では、レーザ光を観察視野内で走査する際に一次結像面をレーザ光が通過する通過範囲に対応して開口部４１が設けられるとともに、開口部４１の近傍に校正用目盛り４２−１乃至４２−４が設けられているので、校正部材２０を配置したことによって、試料１３の観察に影響を及ぼすことを回避し、確実に駆動信号の校正を行うことができる。

また、上述した特許文献１に開示されている手法においては、走査ミラーの裏面で反射された反射光から得られるクロックを生成するスリットを用いる必要があることから、任意の倍率または解像度の画像を取得することは困難であるとともに、反射光を得るための光源および検出系が必要であることから高コストであった。これに対し、レーザ走査型顕微鏡１１においては、図３を参照して説明したように、様々の倍率用のマークが印されている校正部材２０を用いることで、任意の倍率および解像度で歪のない画像を取得することができるとともに、特許文献１に開示されている手法よりも低コストで実現することができる。

また、Ｘ走査ミラー２３およびＹ走査ミラー２４を駆動させる駆動信号を校正する他、例えば、強度信号画像化回路３０が光検出器２９−１から出力される電気信号をサンプリングするサンプリング周期を校正することによっても、歪のない画像を取得することができる。

さらに、駆動信号やサンプリング周期などを校正する他、強度信号画像化回路３０が出力する画像信号に応じた画像を処理する画像処理装置（図示せず）に、制御装置３２が、測定信号と理論信号との誤差を供給し、その誤差に基づいて画像に発生する歪を除去するように画像の補正を行わせるようにしてもよい。なお、この場合、画像を取得する前に校正用目盛り４２の測定を行っても、画像を取得した後に校正用目盛り４２の測定を行ってもよい。また、画像の補正は、画像取得と同時に行っても、取得した画像を保存した後に行ってもよい。

また、上述したように、ゲイン調整およびオフセット調整を行うので、取得する画像の数画素につき１つのマークが印された校正用目盛り４２を使用しても、マーク間は演算により補完することができ、例えば、取得する画像の画素数分の校正用目盛りを必要とすることはない。

また、例えば、所定の時間毎に画像の取得を間歇的に行うことを長時間繰り返すような（一般にタイムラプスと呼ばれる）観察を行う場合には、一定の期間が経過したときに駆動信号を校正する処理を再度行うことで、安定的に、正確な測定を行うことができる。

なお、制御装置３２は、CPU（Central Processing Unit）、ROM（Read Only Memory）、RAM（Random Access Memory）、フラッシュメモリ（例えば、EEPROM（Electronically Erasable and Programmable Read Only Memory））などを備えて構成されており、ROMまたはフラッシュメモリに記憶されているプログラムをRAMにロードして実行することで、レーザ走査型顕微鏡１１の各部を制御する。なお、CPUが実行するプログラムは、あらかじめROMおよびフラッシュメモリに記憶されているものの他、適宜、フラッシュメモリにダウンロードして更新することができる。

なお、上述のフローチャートを参照して説明した各処理は、必ずしもフローチャートとして記載された順序に沿って時系列に処理する必要はなく、並列的あるいは個別に実行される処理（例えば、並列処理あるいはオブジェクトによる処理）も含むものである。また、プログラムは、１のCPUにより処理されるものであっても良いし、複数のCPUによって分散処理されるものであっても良い。

なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。

１１ レーザ走査型顕微鏡， １２ ステージ， １３ 試料， １４−１および１４−２ 光源， １５−１および１５−２ 光学系， １６ ミラー， １７ ダイクロイックミラー， １８ 集光レンズ， １９ 対物レンズ， ２０ 校正部材， ２１−１および２１−２ 集光レンズ， ２２−１および２２−２ ダイクロイックミラー， ２３−１および２３−２ Ｘ走査ミラー， ２４−１および２４−２ Ｙ走査ミラー， ２５−１および２５−２ Ｘ軸走査手段， ２６−１および２６−２ Ｙ軸走査手段， ２７ 駆動機構， ２８−１および２８−２ 集光レンズ， ２９−１および２９−２ 光検出器， ３０−１および３０−２ 強度信号画像化回路， ３１−１および３１−２ マーク位置信号抽出部， ３２ 制御装置， ４１ 開口部， ４２−１乃至４２−４ 校正用目盛り

Claims (7)

1. レーザ光を試料上で走査し、前記試料からの光を用いて前記試料の画像を取得する走査型レーザ顕微鏡において、
   前記レーザ光を走査する走査手段と、
   前記走査手段から前記試料に向かう光路に配置される第１および第２のレンズと、
   前記第１および第２のレンズの間に形成される結像面に配置される板状の校正部材と
   を備え、
   前記校正部材は、
   前記レーザ光を前記試料上の観察視野内で走査する際に前記結像面を前記レーザ光が通過する通過範囲に対応して形成された開口部と、
   前記開口部の近傍に規定の間隔で複数のマークが印された校正用目盛りと
   を有する
   ことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
2. 前記走査手段を駆動させる駆動信号を出力して、前記レーザ光の走査を制御する制御手段を
   さらに備え、
   前記制御手段は、
   前記校正部材が有する前記校正用目盛りに前記レーザ光を走査させて複数の前記マークの位置を測定し、
   測定された信号と前記規定の間隔に対応する理論信号との誤差を解消するように、前記駆動信号を校正する
   ことを特徴とする請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
3. 前記制御手段は、前記レーザ走査型顕微鏡の起動時に前記駆動信号を校正する処理を実行する
   ことを特徴とする請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
4. 前記制御手段は、前記校正用目盛りの複数の前記マークのうちの、中心のマークと、観察倍率での最大視野を表す両端のマークとを利用し、前記両端のマークの測定信号に基づいて前記駆動信号のゲインを調整し、前記中心マークの測定信号に基づいて前記駆動信号のオフセットを調整する
   ことを特徴とする請求項２または３に記載のレーザ走査型顕微鏡。
5. 前記走査手段を駆動させる駆動信号を出力して、前記レーザ光の走査を制御する制御手段と、
   前記試料からの観察光の強度に応じた強度信号をサンプリングして画像信号を取得する画像化手段と
   をさらに備え、
   前記制御手段は、
   前記校正部材が有する前記校正用目盛りに前記レーザ光を走査させて前記マークの位置を測定し、
   測定された信号と前記規定の間隔に対応する理論信号との誤差に基づいて、前記画像化手段により取得された画像の補正を行わせる
   ことを特徴とする請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
6. レーザ光を試料上で走査し、前記試料からの光を用いて前記試料の画像を取得する走査型レーザ顕微鏡における前記レーザ光の光路上に形成される結像面に配置される校正部材において、
   前記レーザ光を前記試料上の観察視野内で走査する際に前記結像面を前記レーザ光が通過する通過範囲に対応して形成された開口部と、
   前記開口部の近傍に規定の間隔で複数のマークが印された校正用目盛りと
   を備えることを特徴とする校正部材。
7. レーザ光を試料上で走査し、前記試料からの光を用いて前記試料の画像を取得する走査型レーザ顕微鏡の制御方法において、
   前記走査型レーザ顕微鏡は、前記レーザ光を前記試料上の観察視野内で走査する際に前記レーザ光の光路上に形成される結像面を前記レーザ光が通過する通過範囲に対応して形成された開口部と、前記開口部の近傍に規定の間隔で複数のマークが印された校正用目盛りとを有する校正部材を備え、
   前記校正部材が有する前記校正用目盛りに前記レーザ光を走査させて複数の前記マークの位置を測定し、
   測定された信号と前記規定の間隔に対応する理論信号との誤差を解消するように、前記レーザ光を走査する走査手段を駆動させる駆動信号を校正する
   ステップを含むことを特徴とする制御方法。

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