JP2011173812A

JP2011173812A - 動脈硬化症予防治療剤

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Publication number: JP2011173812A
Application number: JP2010037596A
Authority: JP
Inventors: Yuichi Sugiyama; 雄一杉山; Kyuin Hayashi; 久允林; Natsuki Hori; 奈津貴堀
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 2010-02-23
Filing date: 2010-02-23
Publication date: 2011-09-08

Abstract

【課題】全く新しいメカニズムに基づく動脈硬化症予防治療剤を提供することにある。
【解決手段】カルパイン阻害剤を有効成分とするＡＢＣＧ１発現促進剤及び動脈硬化症治療剤。
【選択図】なし

Description

本発明は、マクロファージや血管内皮細胞における酸化脂質の細胞外排泄輸送担体として作用するＡＢＣＧ１の発現を促進し、動脈硬化症の予防治療に有用な医薬に関する。

脂質異常症や糖尿病、高血圧などの生活習慣病により引き起こされる動脈硬化症は、先進国における死因の上位を占める心臓疾患や脳卒中のリスクファクターとなることから、現代における重要な保健的課題である。これまでの研究より、血液中のコレステロール、トリグリセリドを下げることが、動脈硬化の進展を抑制し、心臓疾患や脳卒中の予防につながることが明らかにされているため、現在、動脈硬化症の薬物療法としては、細胞内でのコレステロール合成を司る酵素であるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害するスタチン系薬剤、あるいは核内受容体ＰＰＡＲαを活性化し、脂肪酸合成を抑制するフィブラート系薬剤などが用いられている。しかしながら現状の薬物療法では、多剤を併用した場合においても、日本動脈硬化学会が定める「動脈硬化性疾患予防ガイドライン」や米国の診断基準であるＮａｔｉｏｎａｌＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌＥｄｕｃａｔｉｏｎＰｒｏｇｒａｍＡｄｕｌｔＴｒｅａｔｍｅｎｔＰａｎｅｌIIIの血液中脂質パラメータの管理目標値に到達しないことも多い。また、スタチン系薬剤の横紋筋融解症やフィブラート系薬剤の肝障害など投与患者における副作用の報告も多数あることから、新規薬効機序に基づく、動脈硬化症治療薬の開発が望まれている。

脂質異常症による動脈硬化進展のメカニズムとして、マクロファージ、血管内皮細胞における酸化脂質の蓄積によるマクロファージの泡沫細胞化、血管内皮細胞依存性の血管収縮・拡張制御の破綻が知られている。さらに、近年の遺伝子改変動物を用いた解析から、ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇｃａｓｓｅｔｔｅ，ｓｕｂ−ｆａｍｉｌｙＧｍｅｍｂｅｒ１（ＡＢＣＧ１）が、マクロファージ、血管内皮細胞における酸化脂質の細胞外への輸送担体として同定され、その発現量増加が動脈硬化の進展を抑制することが報告されている（非特許文献１、２）。

一方、カルパインは、カルシウムイオンで活性化される細胞内プロテアーゼであり、肢帯型筋ジストロフィーマ２型、糖尿病、がん、胃腸疾患、アルツハイマー病等に関与していることが知られている（非特許文献３）が、ＡＢＣＧ１や動脈硬化症との関係については全く知られていない。

Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．２００６，９９；１０３１−１０４３ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＬｉｐｉｄｏｌｏｇｙ２００６，１７：２２７−２３２Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．，８３：７３１−８０１，２００３

本発明の課題は、全く新しいメカニズムに基づく動脈硬化症予防治療剤を提供することにある。

そこで本発明者は、マクロファージや血管内皮細胞における酸化脂質の細胞外排泄輸送担体であるＡＢＣＧ１に着目し、当該ＡＢＣＧ１の発現を促進させ、その結果として動脈硬化の進展防止に資する薬剤を見出すべく種々検討してきたところ、全く意外にも、種々のカルパイン阻害作用を有する物質に、優れたＡＢＣＧ１発現促進作用があること、及びＡＢＣＧ１のコレステロール排泄能を亢進する作用があることを見出した。さらに、カルパインのＡＢＣＧ１に対する作用を直接検討したところ、カルパインにはＡＢＣＧ１の分解を促進する作用があることを見出した。従って、カルパインがＡＢＣＧ１を分解することにより、コレステロール等の酸化脂質の細胞外排泄能が低下することにより動脈硬化が進展すること、これに対し、カルパイン阻害剤の投与によりＡＢＣＧ１の発現が促進され、ＡＢＣＧ１による酸化脂質の細胞外排泄能が回復する結果、動脈硬化症が予防治療できることを見出した。

すなわち、本発明は、カルパイン阻害剤を有効成分とするＡＢＣＧ１発現促進剤又は動脈硬化症予防治療剤を提供するものである。
また、本発明は、カルパイン阻害剤及び薬学的に許容される担体を含有するＡＢＣＧ１発現促進用組成物又は動脈硬化症予防治療用組成物を提供するものである。
また、本発明は、カルパイン阻害剤の、ＡＢＣＧ１発現促進剤又は動脈硬化症予防治療剤製造のための使用を提供するものである。
さらに、本発明はカルパイン阻害剤の有効量を投与することを特徴とするＡＢＣＧ１発現促進方法又は動脈硬化症予防治療方法を提供するものである。

本発明によれば、カルパインがＡＢＣＧ１の分解を促進する作用を有するという全く新しい生理作用が見出され、カルパインを阻害することにより、ＡＢＣＧ１の発現が促進され、その結果としてマクロファージや血管内皮細胞における酸化脂質の細胞外排泄能が顕著に促進されるために動脈硬化の進展が防止されるという、全く新しいメカニズムによる動脈硬化症予防治療薬が提供される。

ＨＥＫ２９３細胞におけるカルペプチン（Ａ）及びＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ（Ｂ）のＡＢＣＧ１発現に対する効果を示す図である。ＨＥＫ２９３細胞におけるカルペプチンのＡＢＣＧ１発現量に対する時間依存的な効果を示す図である。マウス腹腔マクロファージにおけるカルペプチンのＡＢＣＧ１発現量に対する効果を示す図である。ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＢＣＧ１のコレステロール排泄機能に対するカルペプチンの効果を示す図である。ＡＢＣＧ１依存性のコレステロール排泄能に対するカルペプチンの効果を示す図である。ＨＥＫ２９３細胞におけるカルペプチンのＡＢＣＧ１分解速度に対する効果を示す図である。ＨＥＫ２９３細胞におけるカルペプチンの細胞膜上ＡＢＣＧ１の分解速度に対する効果を示す図である。カルパインによるＡＢＣＧ１の分解に対する作用を示す図である。カルパインによるＡＢＣＧ１分解に対するカルパイン濃度依存性を示す図である。カルパインによるＡＢＣＧ１の分解の時間依存性を示す図である。ＨＥＫ２９３細胞におけるダムナカンテアールのＡＢＣＧ１発現量に対する効果を示す図である。ＨＥＫ２９３細胞におけるコレステロール排泄機能に対するダムナカンテアールの効果を示す図である。ＨＥＫ２９３細胞におけるコレステロール排泄機能に対するテトラサイクリンの効果を示す図である。

本発明のＡＢＣＧ１発現促進剤及び動脈硬化症予防治療剤の有効成分は、カルパイン阻害作用を有する物質、すなわちカルパイン阻害剤である。
カルパインは、前記のようにカルシウムイオンで活性化される細胞内プロテアーゼであり、筋ジストロフィー、糖尿病、がん、胃腸疾患、アルツハイマー病等に関与することが知られているが、ＡＢＣＧ１や動脈硬化症との関連性についての報告はない。このようなプロテアーゼであるカルパインの阻害剤は広く知られており、カルパインインヒビターＩ（Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＣＨＯ）、カルパインインヒビターII（Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＣＨＯ）、カルパインインヒビターIII（Ｚ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−ＣＨＯ）、カルパインインヒビターIV（Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＣＨ₂Ｆ）、カルパインインヒビターIV−２（Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ）、カルパインインヒビターＶ（Ｍｕ−Ｖａｌ−ＨＰｈ−ＣＨ₂Ｆ）、カルパインインヒビターVI（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ）、カルパインインヒビターVII（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＣＨ₂Ｃｌ）、カルパインインヒビターＸ（Ｚ−Ｌ−Ａｂｕ−ＣＯＮＨ−ｅｔｈｙｌ）、カルパインインヒビターXI（Ｚ−Ｌ−Ａｂｕ−ＣＯＮＨ（ＣＨ₂）₃−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ）、ＳＮＪ−１９４５、カルパインインヒビターXII（Ｚ−Ｌｅｕ−Ｎｖａ−ＣＯＮＨ−ＣＨ₂−２−Ｐｙｒｉｄｙｌ）、カルパインインヒビター２（Ｍｕ−Ｐｈｅ−ＨＰｈ−ＣＨ₂Ｆ）、カルペプチン（Ｚ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＣＨＯ）、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＣＨＮ₂、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＣＨ₂Ｃｌ、Ｚ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−ＣＨＯ、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ、ロイペプチン（Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌｇｉｎｉｖａｌ）、Ｅ−６４（Ｌ−ｔｒａｎｓ−３−カルボキシオキシラン−２−カルボニル）−Ｌ−Ｌｅｕ−アグマチン）、Ｅ−６４−ｃ（Ｌ−ｔｒａｎｓ−３−カルボキシオキシラン−２−カルボニル）−Ｌ−Ｌｅｕ−（３−メチルブチル）アミド）、Ｅ−６４−ｄ（Ｌ−ｔｒａｎｓ−３−エトキシカルボニルオキシラン−２−カルボニル）−Ｌ−Ｌｅｕ−（３−メチルブチル）アミド）、ＰＤ１５０６０６（３−１４−ヨードフェニル）−２−メルカプト−（Ｚ）−２−プロペン酸）、ＰＤ１５１７４６（３−（５−フルオロ−３−インドリル）−２−メルカプト−（Ｚ）−２−プロペン酸）、ＰＤ１４５３０５（２−メルカプト−３−フェニルプロパン酸）、ダムナカンテアール（Ｄａｍｎａｃａｎｔｈｅａｌ）、テトラサイクリン（前記式中、Ｚはベンジルオキシカルボニルを、Ｍｕはモルホリノウレイジルを、ＨＰｈはホモフェニルアラニルを、Ｎｌｅはノルロイシルを、Ｎｖａはノルバリニルを、Ａｂｕは２−アミノブタン酸を示す）等が挙げられる。これらのカルパイン阻害剤は市販されているものを使用することができ、当業者にとって広く認識されているものである。

これらのカルパイン阻害剤のうち、ＡＢＣＧ１発現促進作用、動脈硬化予防治療作用及び安全性の点からカルペプチンのようなジペプチド、トリペプチドの誘導体が好ましい。すなわち、カルペプチン、カルパインインヒビターＩ、カルパインインヒビターII、カルパインインヒビターIII、カルパインインヒビターIV、カルパインインヒビターIV−２、カルパインインヒビターＶ、カルパインインヒビターVI、カルパインインヒビターVII、カルパインインヒビターXII、カルパインインヒビター−２、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＣＨＮ₂、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＣＨ₂Ｃｌ、Ｚ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−ＣＨＯ、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ、ロイペプチン等が好ましい。

後記実施例に示すように、カルパイン阻害剤であるカルペプチン、ダムナカンテアール、テトラサイクリン等はいずれも強いＡＢＣＧ１発現促進作用、及びＡＢＣＧ１のコレステロール排泄機能を顕著に促進することから、ヒトを含む哺乳動物におけるＡＢＣＧ１発現促進剤及び動脈硬化症予防治療剤として有用である。また、本発明のカルパイン阻害剤によるＡＢＣＧ１発現促進作用及びコレステロール排泄促進作用は、カルペプチン、ダムナカンテアール（ノニ抽出物）及びテトラサイクリンという全く化学構造の異なるカルパイン阻害剤でも同様に観察されたこと、さらにはカルパイン自身がＡＢＣＧ１分解促進する作用を有することを確認していることから、カルパイン阻害作用に基づくものであることは明らかである。従って、カルパイン阻害作用を有する物質が、広くＡＢＣＧ１発現促進剤及び動脈硬化予防治療剤として使用できることは明らかである。

カルパイン阻害剤を医薬として用いるにあたっては、必要に応じて薬学的に許容される担体と配合し、予防又は治療目的に応じて各種の投与形態の組成物を採用可能である。該形態としては、例えば、経口剤、注射剤、坐剤、軟膏剤、貼付剤等のいずれでもよく、好ましくは、経口剤である。これらの投与形態は、各々当業者に公知慣用の製剤方法により製造できる。
薬学的に許容される担体としては、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等で配合される。また、必要に応じて防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。

経口用固形製剤を調製する場合は、カルパイン阻害剤に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等とすることができる。そのような添加剤としては、例えば、賦形剤としては、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等を；結合剤としては、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等を；崩壊剤としては、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等を；滑沢剤としては、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等を；着色剤としては、酸化チタン、酸化鉄等を；矯味・矯臭剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等を例示できる。

経口用液体製剤を調製する場合は、カルパイン阻害剤に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等とすることができる。この場合矯味・矯臭剤としては、上記に挙げられたものでよく、緩衝剤としては、クエン酸ナトリウム等が、安定剤としては、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。

注射剤を調製する場合は、カルパイン阻害剤にｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下、筋肉内及び静脈内用注射剤とすることができる。この場合のｐＨ調節剤及び緩衝剤としては、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。安定化剤としては、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。局所麻酔剤としては、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が例示できる。

坐剤を調製する場合は、カルパイン阻害剤に当業界において公知の製剤用担体、例えば、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセリド等を、さらに必要に応じて界面活性剤等を加えた後、常法により製造することができる。

軟膏剤を調製する場合は、カルパイン阻害剤に通常使用される基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等が必要に応じて配合され、常法により混合、製剤化される。基剤としては、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等が挙げられる。保存剤としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が挙げられる。

貼付剤を調製する場合は、通常の支持体に前記軟膏、クリーム、ゲル、ペースト等を常法により塗布すればよい。支持体としては、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布や軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルム或いは発泡体シートが適当である。

本発明の医薬中に配合されるべきカルパイン阻害剤の量は、これを適用すべき患者の症状により、或いはその剤形等により一定ではないが、一般に投与単位形態あたり、経口剤では約０．０５〜１０００ｍｇ、注射剤では約０．０１〜５００ｍｇ、坐剤では約１〜１０００ｍｇとするのが望ましい。

また、上記投与形態を有する医薬の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり一概には決定できないが、通常成人１日あたり約０．０５〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１〜５００ｍｇとすればよく、これを１日１回又は２〜４回程度に分けて投与するのが好ましい。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。しかしながら、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

実施例１
（１）ＨＥＫ２９３細胞におけるカルパイン阻害剤（カルペプチン（Ａ），Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ（Ｂ））のＡＢＣＧ１発現量に対する効果を検討した。
ＡＢＣＧ１強制発現ＨＥＫ２９３細胞（ＡＢＣＧ１−ＨＥＫ２９３）細胞に対して、各濃度でカルパイン阻害剤処理を行い、６時間後に細胞を回収し、細胞可溶液を調製した。調製したサンプルのうち、１０μｇ（図１Ａ）あるいは２０μｇ（図１Ｂ）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＡＢＣＧ１抗体にてウェスタンブロッティングを行った。

（２）ＨＥＫ２９３細胞におけるカルペプチンのＡＢＣＧ１発現量に対する時間依存的な効果を検討した。
ＡＢＣＧ１−ＨＥＫ２９３細胞をカルペプチン（１０μｇ／ｍＬ）で処理し、２、４、６時間後に細胞を回収し、細胞可溶液を調製した。調製したサンプルのうち、１５μｇを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＡＢＣＧ１抗体にてウェスタンブロッティングを行った。

（３）マウス腹腔マクロファージにおけるカルペプチンのＡＢＣＧ１発現量に対する効果を検討した。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊにチオグリコレート培地（２０ｍｇ／ｍＬ）２ｍＬ／匹を腹腔内に投与し、３日後、腹腔マクロファージを単離した。単離したマクロファージは、ＬＸＲアゴニストであるＴＯ９０１３１７（２．５μＭ）で２４時間処理し、さらにカルペプチン（１０μｇ／ｍＬ）を培養液中に添加した。カルペプチン添加の６時間後に単離マクロファージを回収し、細胞可溶液を調製した。調製したサンプルのうち、４０μｇを１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＡＢＣＧ１抗体にてウェスタンブロッティングを行った。

これらの結果を図１〜図３に示す。図１〜３から、カルパイン阻害剤はＡＢＣＧ１の発現を促進する作用を有することが判明した。

実施例２
ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＢＣＧ１のコレステロール排泄機能に対するカルペプチンの効果を検討した。
（１）［³Ｈ］コレステロール（２μＣｉ／ｍＬ）を含む溶液でＡＢＣＧ１−ＨＥＫ、Ｍｏｃｋ−ＨＥＫ細胞を２４時間培養して、［³Ｈ］コレステロールを取り込ませた。カルペプチン（１０μｇ／ｍＬ）で６時間処理を行った後、細胞培養液を０．０２％ＢＳＡを含むｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ培養液に置換した。１２時間後、この０．０２％ＢＳＡ培養液を回収し、細胞を可溶化した。結果を図４に示す。コレステロール排泄量（％）は、０．０２％ＢＳＡ培養液と細胞可溶液に含まれる放射能に対する０．０２％ＢＳＡ培養液の放射能の割合として計算している。各バーは３回の測定の平均値±標準誤差を表す。スチューデントテストによるコントロールとの有意差（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１）。
（２）（１）の結果を用いて、ＡＢＣＧ１−ＨＥＫ細胞とＭｏｃｋ−ＨＥＫ細胞におけるコレステロール排泄値の差分を算出することにより、カルペプチン存在下及びコントロール条件下のＡＢＣＧ１依存的なコレステロール排泄量を評価した。結果を図５に示す。各バーは３回の測定の平均値±標準誤差を表す。スチューデントテストによるコントロールとの有意差（＊＊Ｐ＜０．０１）。

図４及び図５から、カルパイン阻害剤であるカルペプチンはＡＢＣＧ１によるコレステロール排泄機能を促進することが判明した。

実施例３
（１）ＨＥＫ２９３細胞におけるカルペプチンのＡＢＣＧ１分解速度に対する効果を検討した。
カルペプチン（１０μｇ／ｍＬ）及びシクロヘキシイミド（２０μｇ／ｍＬ）を含む細胞培養液でＡＢＣＧ１−ＨＥＫ細胞を培養した。培養開始２、４、６時間後に細胞を回収し、細胞可溶液を調製した。調製したサンプルのうち、１０μｇを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＡＢＣＧ１抗体にてウェスタンブロッティングを行った。結果を図６（Ａ）に示す。図６（Ｂ）は、（Ａ）のｂａｎｄｄｅｎｓｉｔｙをＩｍａｇｅｇａｕｇｅｓｏｆｔｗａｒｅで定量化したものである。各バーは３回の測定の平均値±標準誤差を表す。スチューデントテストによるコントロールとの有意差（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１）。

（２）ＨＥＫ２９３細胞におけるカルペプチンの細胞膜上ＡＢＣＧ１の分解速度に対する効果を検討した。
（１）ＡＢＣＧ１−ＨＥＫ細胞の細胞表面をビオチン化した後、カルペプチン（１０μｇ／ｍＬ）を含む細胞培養液で３７℃で３、６、９時間培養した。培養後、細胞可溶液を調製し、ストレプタビジンビーズを用いて残存しているビオチン化タンパク質を単離した。単離したサンプルは、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＡＢＣＧ１抗体にてウェスタンブロッティングを行った。結果を図７（Ａ）に表す。図７（Ｂ）は、（Ａ）のｂａｎｄｄｅｎｓｉｔｙをＩｍａｇｅｇａｕｇｅｓｏｆｔｗａｒｅで定量化したものである。各バーは３回の測定の平均値±標準誤差を表す。スチューデントテストによるコントロールとの有意差（＊Ｐ＜０．０５）。

図６及び図７から、カルペプチンは、ＡＢＣＧ１の分解速度を有意に抑制することが判明した。

実施例４
（１）カルパインによるＡＢＣＧ１の分解を検討した。
ＡＢＣＧ１−ＨＥＫ細胞から調製した粗膜分画（２０μｇ）を各Ｃａ²⁺濃度及び、カルパイン（１ｕｎｉｔ）を含む溶液（１０ｍＭＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，５ｍＭベンズアミジン，０．５ｍＭフェニルメチルスルホニルクロリド，１０ｍＭ β−メルカプトエタノール［ｐＨ７．５］）中に加えて、３７℃にて３０分間反応させた。反応終了後、サンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＡＢＣＧ１抗体にてウェスタンブロッティングを行った。結果を図８に示す。

（２）カルパインによるＡＢＣＧ１分解に対するカルパイン濃度依存性を検討した。
各濃度のカルパインを含む溶液（５ｍＭＣａＣｌ₂，１０ｍＭＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，５ｍＭベンズアミジン，０．５ｍＭフェニルメチルスルホニルクロリド，１０ｍＭ β−メルカプトエタノール［ｐＨ７．５］）中に、ＡＢＣＧ１−ＨＥＫ細胞から調製した粗膜分画（２０μｇ）を加え、３７℃にて３０分間反応させた。反応終了後、サンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＡＢＣＧ１抗体にてウェスタンブロッティングを行った。結果を図９に示す。

（３）カルパインによるＡＢＣＧ１の分解の時間依存性を検討した。
カルパインを含む溶液（５ｍＭＣａＣｌ₂，１０ｍＭＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，５ｍＭベンズアミジン，０．５ｍＭフェニルメチルスルホニルクロリド，１０ｍＭ β−メルカプトエタノール［ｐＨ７．５］）中に、ＡＢＣＧ１−ＨＥＫ細胞から調製した粗膜分画（２０μｇ）を加え、３７℃にて反応させた。反応終了後、サンプルを１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＡＢＣＧ１抗体にてウェスタンブロッティングを行った。結果を図１０に示す。

（２）８〜１０から、カルパインが濃度依存的、時間依存的にＡＢＣＧ１を分解する作用を有することが判明した。

実施例５
（１）ＨＥＫ２９３細胞におけるノニ抽出物であるダムナカンテアールのＡＢＣＧ１発現量に対する効果を検討した。
ＡＢＣＧ１−ＨＥＫ細胞を各濃度のダムナカンテアールで６時間処理後、細胞を回収し、細胞可溶液を調製した。調製したサンプルのうち、１０μｇを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＡＢＣＧ１抗体にてウェスタンブロッティングを行った。結果を図１１に示す。

（２）ＨＥＫ２９３細胞におけるコレステロール排泄機能に対するダムナカンテアールの効果を検討した。
ＡＢＣＧ１−ＨＥＫ細胞を［³Ｈ］コレステロール（２μＣｉ／ｍＬ）を含む溶液で２４時間培養し、［³Ｈ］コレステロールを取り込ませた。各濃度のダムナカンテアールで６時間処理を行った後、細胞を０．０２％ＢＳＡを含むｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ培養液で培養した。１２時間後、この０．０２％ＢＳＡ培養液を回収し、細胞を可溶化した。結果を図１２に示す。コレステロール排泄量（％）は、０．０２％ＢＳＡ培養液と細胞可溶液に含まれる放射能に対する０．０２％ＢＳＡ培養液の放射能の割合として計算している。各バーは３回の測定の平均値±標準誤差を表す。スチューデントテストによるｃｏｎｔｒｏｌとの有意差（＊Ｐ＜０．０５）。

（３）ＨＥＫ２９３細胞におけるコレステロール排泄機能に対するテトラサイクリンの効果を検討した。
ＡＢＣＧ１−ＨＥＫ，Ｍｏｃｋ−ＨＥＫ細胞を［³Ｈ］コレステロール（２μＣｉ／ｍＬ）を含む溶液で２４時間培養し、［³Ｈ］コレステロールを取り込ませた。テトラサイクリン（１５０μＭ）で６時間処理を行った後、細胞を０．０２％ＢＳＡを含むｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ培養液で培養した。１２時間後、この０．０２％ＢＳＡ培養液を回収し、細胞を可溶化した。コレステロール排泄量（％）は、０．０２％ＢＳＡ培養液と細胞可溶液に含まれる放射能に対する０．０２％ＢＳＡ培養液の放射能の割合として計算している。結果を図１３（Ａ）に示す。各バーは３回の測定の平均値±標準誤差を表す。スチューデントテストによるコントロールとの有意差（＊＊Ｐ＜０．０１）。

（４）（３）の結果を用いて、ＡＢＣＧ１−ＨＥＫ細胞とＭｏｃｋ−ＨＥＫ細胞におけるコレステロール排泄値の差分を算出することにより、テトラサイクリン存在下及びコントロール条件下のＡＢＣＧ１依存的なコレステロール排泄量を評価した。結果を図１３（Ｂ）に示す。各バーは３回の測定の平均値±標準誤差を表す。スチューデントテストによるコントロールとの有意差（＊Ｐ＜０．０５）

図１１〜１３から明らかなように、カルパイン阻害剤であるダムナカンテアール及びテトラサイクリンでもＡＢＣＧ１発現促進作用及びコレステロール排泄能促進効果が確認された。

Claims

カルパイン阻害剤を有効成分とするＡＢＣＧ１発現促進剤。
カルパイン阻害剤が、カルペプチン、カルパインインヒビターＩ、カルパインインヒビターII、カルパインインヒビターIII、カルパインインヒビターIV、カルパインインヒビターIV−２、カルパインインヒビターＶ、カルパインインヒビターVI、カルパインインヒビターVII、カルパインインヒビターXII、カルパインインヒビター−２、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＣＨＮ₂、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＣＨ₂Ｃｌ、Ｚ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−ＣＨＯ、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ及びロイペプチンから選ばれるものである請求項１記載のＡＢＣＧ１発現促進剤。
カルパイン阻害剤を有効成分とする動脈硬化症予防治療剤。
カルパイン阻害剤が、カルペプチン、カルパインインヒビターＩ、カルパインインヒビターII、カルパインインヒビターIII、カルパインインヒビターIV、カルパインインヒビターIV−２、カルパインインヒビターＶ、カルパインインヒビターVI、カルパインインヒビターVII、カルパインインヒビターXII、カルパインインヒビター−２、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＣＨＮ₂、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＣＨ₂Ｃｌ、Ｚ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−ＣＨＯ、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ及びロイペプチンから選ばれるものである動脈硬化症予防治療剤。