JP2011160772A - タンパク質の表層提示用の真核微生物及びその利用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】タンパク質の表層提示用の真核微生物を、真核微生物の表層側に配置され、セルロソームのスキャホールディンタンパク質に由来し、結合選択性の異なる2以上のコヘシンドメインを備える1又は2以上のコヘシンタンパク質を備えるようにする。
【選択図】なし
Description
(コヘシンタンパク質)
コヘシンタンパク質は、1又は2以上のコヘシンドメインを備えるタンパク質であって、真核微生物の細胞表層に配置されている。コヘシンタンパク質は、コヘシンドメインを有して真核微生物の細胞表層に配置されるものであればよい。コヘシンタンパク質は、真核微生物において1又は2以上備えられている。
コヘシンタンパク質が備える、1又は2以上のコヘシンドメインは、セルロソームのスキャホールディンタンパク質が備えるコヘシンドメインに由来している。セルロソームは、すでに説明したように、細菌の細胞表層に形成されるセルラーゼとそのセルラーゼが結合する骨格タンパク質(スキャホールディンタンパク質)との複合体である。セルロソームは、以下の表1に挙げられるセルロソーム生産微生物に由来して多数知られている。
本明細書の開示によれば、2以上のタンパク質を細胞表層に保持する真核微生物であって、上記タンパク質の表層提示用真核微生物の1又は2以上のコヘシンタンパク質上に、コヘシンドメインに選択的に結合するドッケリンドメインを有するそれぞれ2以上の前記タンパク質を保持する、真核微生物が提供される。こうしたタンパク質細胞表層提示真核微生物によれば、細胞表層において、所望のパターンで2以上のタンパク質が配置されるため、これらタンパク質のもっとも有効な機能発現を期待できる。
ドッケリドメインを有するタンパク質は、コヘシンタンパク質上にコヘシン−ドッケリン結合により結合されて真核微生物の細胞表層に提示される。ドッケリンドメインとしては、例えば、表1に挙げられるセルロソーム生産微生物に由来して多数知られているが、真核微生物の表層に保持されているコヘシンタンパク質のコヘシンドメインにコヘシン−ドッケリン結合により結合するドッケリンドメインを用いる。こうしたドッケリンドメインは、すでに説明した方法によって、コヘシンドメインとの組み合わせで決定される。好ましいドッケリンドメインとしては、すでに記載した好ましいコヘシンドメインに結合するドッケリンドメインが挙げられる。したがって、例えば、C. thermocellum、Ruminococcus flavefacience、B. cellulosolvens及びA. fulgidusからなる群から選択される微生物のドッケリンドメインが挙げられる。そして、真核微生物の細胞表層に提示されたコヘシンドメインの組み合わせに応じて適宜決定される。なお、ドッケリンドメインは、セルロソーム生産微生物に由来する天然のドッケリンドメイン又は対応するコヘシンドメインに対する結合性を有する限りそのドッケリンドメインのアミノ酸配列において1又は2以上の変異(付加、挿入、欠失及び置換)を導入した改変ドッケリンドメインであってもよい。
本明細書に開示される有用物質の生産方法は、ドッケリンドメインを有するタンパク質を表層提示する真核微生物であって、前記タンパク質がセルラーゼ活性を有するタンパク質である真核微生物を用いてセルロース含有材料を糖化し、発酵する工程、を備えることができる。この生産方法によれば、この真核微生物を用いてセルロース含有材料を直接分解糖化し、グルコース等として利用できることになる。前記発酵工程の実施により、用いた真核微生物が有している有用物質生産能力に応じて有用物質が生産される。
pHU-HOR7p-Cel8A-CtDoc:S.cerevisiae BY4741、実施例2で作製したpDL-HOR7p-CtCohAGA2が導入された酵母
pHU-HOR7p-Cel8A-CcDoc:S.cerevisiae BY4741、実施例2で作製したpDL-HOR7p-CcCohAGA2が導入された酵母
pHU-HOR7p-Cel8A-RfDoc:S.cerevisiae BY4741、実施例2で作製したpDL-HOR7p-RfCohAGA2が導入された酵母
pHU-HOR7p-Cel8A-BcDoc:S.cerevisiae BY4741、実施例2で作製したpDL-HOR7p-BcCohAGA2が導入された酵母
pHU-HOR7p-Cel8A-AfDoc:S.cerevisiae BY4741、実施例2で作製したpDL-HOR7p-AfCohAGA2が導入された酵母
pHU-HOR7p-Cel8A-AcDoc:S.cerevisiae BY4741、実施例2で作製したpDL-HOR7p-AcCohAGA2が導入された酵母
Claims (17)
- タンパク質の表層提示用の真核微生物であって、
前記真核微生物の表層側に配置され、セルロソームのスキャホールディンタンパク質に由来し、結合選択性の異なる2以上のコヘシンドメインを備える1又は2以上のコヘシンタンパク質を備える、真核微生物。 - 前記コヘシンドメインは、クロストリジウム・サーモセラム(Clostridium thermocellum)のコヘシンドメイン又はその改変体を含む、請求項1に記載の真核微生物。
- 前記コヘシンドメインは、ルミノコッカス・フラボファシエンス(Ruminococcus flavefaciens)のコヘシンドメイン又はその改変体を含む、請求項1又は2に記載の真核微生物。
- 前記コヘシンドメインは、バクテロイデス・セルロソルベンス(Bacterioides cellulosolvens)のコヘシンドメイン又はその改変体を含む、請求項1〜3のいずれかに記載の真核微生物。
- 前記コヘシンドメインは、アーケオグロバス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)のコヘシンドメイン又はその改変体である、請求項1〜4のいずれかに記載の真核微生物。
- 前記コヘシンドメインは、クロストリジウム・サーモセラム(Clostridium thermocellum)、ルミノコッカス・フラボファシエンス(Ruminococcus flavefaciens)、バクテロイデス・セルロソルベンス(Bacterioides cellulosolvens)及びアーケオグロバス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)からなる群から選択される2種以上の微生物のコヘシンドメイン又はその改変体を含む、請求項1に記載の真核微生物。
- 前記コヘシンドメインは、クロストリジウム・サーモセラム(Clostridium thermocellum)及びルミノコッカス・フラボファシエンス(Ruminococcus flavefaciens)のコヘシンドメイン又はその改変体を含む、請求項6に記載の真核微生物。
- 前記コヘシンドメインは、さらに、バクテロイデス・セルロソルベンス(Bacterioides cellulosolvens)のコヘシンドメイン又はその改変体を含む、請求項7に記載の真核微生物。
- 前記コヘシンタンパク質は、セルロース結合ドメインを含む、請求項1〜8のいずれかに記載の真核微生物。
- 前記コヘシンタンパク質を前記真核微生物内で自己生産するための外来性DNAを保持する、請求項1〜9のいずれかに記載の真核微生物。
- さらに、前記コヘシンタンパク質を選択的に結合可能な骨格タンパク質結合ドメインを有して前記細胞の表層に配置される1又は2以上の第2の骨格タンパク質を備える、請求項1〜10のいずれかに記載の真核微生物。
- 2種類以上のタンパク質を細胞表層に保持する真核微生物であって、
請求項1〜11のいずれかに記載の真核微生物の前記コヘシンタンパク質上に、2以上の前記コヘシンドメインに選択的に結合するドッケリンドメインを有する2以上のタンパク質を保持する、真核微生物。 - 前記タンパク質は、セルロースを分解する酵素群から選択される、請求項12に記載の真核微生物。
- 前記タンパク質は、少なくともβ−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼからなる群から選択される2種以上を含む、請求項12又は13に記載の真核微生物。
- 前記タンパク質を前記真核微生物内で自己生産するための外来性DNAを保持する、請求項12〜14のいずれかに記載の真核微生物。
- 酵母である、請求項12〜15のいずれかに記載の真核微生物。
- 有用物質の生産方法であって、
請求項12〜16のいずれかに記載の真核微生物であって、前記タンパク質がセルラーゼ活性を有するタンパク質である真核微生物を用いてセルロース含有材料を糖化し、発酵する工程、を備える、方法。
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