JP2011135864A - Ｏｃｔ４及びＢｍｉ１、またはその上位調節子を用いて体細胞から胚幹細胞類似細胞への逆分化を誘導する組成物及びこれを用いた胚幹細胞類似細胞の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】Ｏｃｔ４遺伝子、Ｂｍｉ１遺伝子、Ｂｍｉ１の上位調節子であるＳｈｈまたはその類似体を用いて体細胞から胚幹細胞類似細胞への逆分化を誘導する組成物、Ｏｃｔ４、Ｂｍｉ１遺伝子、Ｂｍｉ１の上位調節子であるＳｈｈまたはその類似体の導入によって体細胞から胚幹細胞と類似の特性を持つ多能性逆分化幹細胞を製造する製造方法、及びこの方法で生産された胚幹細胞類似細胞を提供する。
【解決手段】体細胞から胚幹細胞類似細胞への逆分化を誘導する組成物は、ａ）Ｂｍｉ１タンパク質またはＢｍｉ１タンパク質をコードする核酸分子；及びｂ）Ｏｃｔ４タンパク質またはＯｃｔ４タンパク質をコードする核酸分子を含む。また、この組成物を用いて胚幹細胞類似細胞を製造する。
【選択図】図３ａ

Description

本発明はＯｃｔ４及びＢｍｉ１、またはその上位調節子を用いて体細胞から胚幹細胞類似細胞への逆分化を誘導する組成物及びこれを用いた胚幹細胞類似細胞の製造方法に関する。より詳しくは、本発明は逆分化因子であるＢｍｉ１、その上位調節子であるＳｈｈ（Ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ）、Ｓｈｈの類似体であるオキシステロール（ｏｘｙｓｔｅｒｏｌ）またはプルモルファミン（ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ）を逆分化誘導因子であるＯｃｔ４とともに導入して体細胞から逆分化誘導（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）過程によって胚幹細胞のような細胞を誘導する新規の組成物及びこれを用いた胚幹細胞類似細胞製造方法に関するものである。

幹細胞は正常な体細胞と異なり、無限に分裂可能な能力を持ち、適切な環境条件の下で特定細胞に分化する能力を持つ。その分化能力は幹細胞の特性によって多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）、また分化単一性（ｕｎｉｐｏｔｅｎｃｙ）に定義される。したがって、幹細胞を培養によって増殖させた後、特定の細胞に分化させる技術は細胞治療の面で多くの疾病を治療することができる潜在力を持っていると言える。

造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、骨髓系幹細胞（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）などの幹細胞は成体にも存在するので、患者自身から抽出することができて、疾病治療の際、免疫拒否反応の問題点を克服することができる利点がある。このような利点は、既存の臓器移植において、臓器提供者の確保が難しかった部分を克服することができる。

しかし、今まで知られた見解によれば、成体幹細胞はただ多分化能で、分化可能な能力に限界を持つ。これはつまり組職特異幹細胞は同一組職類型の細胞にだけ分化することができることで、中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ）（非特許文献１）、骨髓（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ）（非特許文献２）、網膜（ｒｅｔｉｎａ）（ 非特許文献３）と骨格筋（ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ）（非特許文献４）から分離された幹細胞は分化能力も類似組職系統にだけ分化可能であることを意味する。その例として、造血幹細胞は血液に関連した細胞で、神経幹細胞は神経細胞（ｎｅｕｒｏｎ）またはグリア細胞（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）に、骨髓系幹細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）は中胚葉細胞（ｍｅｓｏｄｅｒｍａｌｃｅｌｌ）に分化可能である。さらに、理論的に無限に増殖可能な成体幹細胞であるが、現在までの報告によれば、このような成体幹細胞をインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で増殖させるのに困難さがあり、実際患者から多量の細胞を分離し出すことも難しい。

多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）は前述した成体幹細胞が持っていたさまざまな欠点を克服することができる立派な資源である。この細胞は人体を構成するすべての種類の細胞への分化が可能であり、インビトロで無限に増殖可能である。現在まで知られた多能性幹細胞としては、胚幹細胞、胚生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ）、胚性癌腫細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ）があり、そのうち胚幹細胞は一番多くの研究がなされて、特定細胞への分化方法及び動物疾病モデルに対して研究した機能性検証と臨床利用の際の多様な疾病に対する治療可能性を示した。

しかし、このような胚幹細胞も成体幹細胞の如く臨床利用のために克服しなければならない欠点が存在する。まず、胚幹細胞を得るためには、受精された胚芽を破壊しなければならないので、倫理的な問題点を持っており、胚幹から分化した細胞を患者に移植した場合、免疫拒否反応が起こるという問題点を持っている。

したがって、胚幹細胞のこのような問題点を克服するために多様な接近方法が試みられたが、そのうち一番脚光を浴びたものは、分化した細胞から分化しなかった細胞への逆分化誘導（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）である。逆分化は分化した細胞を用いて胚幹細胞のような多能性幹細胞を作り上げることを総称し、このような方法としては、１）核移植（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ）、２）細胞融合（ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ）、３）細胞抽出物処理（ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、及び４）遺伝子導入による逆分化（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｉＰＳ ｃｅｌｌ）技術がある（非特許文献５）。

ｉＰＳｃｅｌｌ技術は現在まで研究されたどんな技術よりも胚幹細胞に近い細胞を作り上げるのに成功した。このような結果と機作を証明するために初めて技術が発表された２００６年以後現在まで数多い研究論文が溢れ出ている実情である。基本的にはマウスまたはヒトの体細胞に四つの遺伝子（逆分化誘導因子；Ｏｃｔ４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ａｎｄ Ｃ−Ｍｙｃ／Ｏｃｔ４，Ｓｏｘ２，Ｎａｎｏｇ，Ｌｉｎ２８）を導入した後、胚幹細胞の培養条件で長期間培養した場合、胚幹細胞と類似の特性の幹細胞が確立できた。これは、胚幹細胞との遺伝子発現（ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、後成的特性（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）、インビトロ／インビボ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｉｎ ｖｉｖｏ）での３胚葉性分化能力（ｔｈｒｅｅ ｇｅｒｍ ｌａｙｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、テラトマ（ｔｅｒａｔｏｍａ）形成能、キメラマウス生成（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、そしてキメラマウスの生殖細胞系伝達（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）などの特性がよほど類似したものであることが証明された（非特許文献６）。

しかし、このような逆分化過程の機作は、逆分化誘導のために使用された遺伝子の数があまりにも多くて詳細な機作を糾明しにくいので、現在まで明かされた水準が低い状態である。また、逆分化誘導技術が確立されているもかかわらず、実際治療適用のためには技術的に簡便で効率の高い方法を続けて開発しなければならなく、このように開発された技術はいずれも効率と安全性の面で評価されなければならない。

最近発表された研究結果によれば、癌抑制遺伝子であるｐ５３の非活性化（ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）はｉＰＳ細胞の生成効率を高めると報告された（非特許文献７）。ｐ５３遺伝子はＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ ｌｏｃｕｓによって調節される。このｌｏｃｕｓは選択的スプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）によって発現が調節され、Ａｒｆによって生成されたｐ１９^Ａｒｆはｐ５３遺伝子の発現を、Ｉｎｋ４ａによって生成されたｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}はＲｂ遺伝子の発現を誘導すると知られている。この２種の遺伝子ｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}とｐ１９^Ａｒｆの発現を抑制させた場合、ｐ１９^Ａｒｆだけを抑制させた場合よりｉＰＳ生成効率が増加したという報告もある（非特許文献８）。

Ｐｏｌｙｃｏｍｂ ｇｒｏｕｐ（ＰｃＧ）タンパク質は後成的遺伝子抑制者（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｅｒ）であり、ＰｃＧタンパク質の一つであるＢｍｉ１はｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}とｐ１９^Ａｒｆの発現を抑制させることでｐ５３とＲｂの発現を抑制させると報告されている（非特許文献９）。また、Ｂｍｉ１は染色質（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ）の構造を変化させてターゲット遺伝子の発現を抑制すると知られており、このような特性によって神経幹細胞及び造血幹細胞の自己再生（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）に重要な役目をすると知られている。これにより、本発明者らの既存の研究では、マウスの星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）にＢｍｉ１を過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）させることで神経幹細胞への逆分化に成功したことを報告した。このように逆分化された神経幹細胞の特性は実際マウスから分離された神経幹細胞と相当な部分において類似し、その逆分化誘導因子の一つでありながらも神経幹細胞の自己再生に重要な役目をする遺伝子であるＳｏｘ２の発現が増加することを確認した（非特許文献１０）。

一般体細胞の場合、逆分化するためには、四つ（Ｏｃｔ４，Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｃ−Ｍｙｃ）あるいは三つ（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４）の遺伝子が必要であるが、この遺伝子を内生的に発現（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）する細胞に限っては遺伝子の追加導入が必要ではないことが知られている。そのうち代表的なものがマウス／ヒトの神経幹細胞にＯｃｔ４遺伝子一つだけを導入して逆分化幹細胞を確立したという研究結果である。これは、神経幹細胞が内生的にＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｃ−Ｍｙｃを発現するからである（非特許文献１１）。しかし、いまだに体細胞からＯｃｔ４誘導因子のみを用いて多能性を持つ胚幹細胞類似細胞を製造する方法は知られたことがない。

Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５，１７０７−１７１０ １９９２；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７、１４３３−１４３８ ２０００ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６，７１−７４，１９９７；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７，１４４２−１４４６，２０００；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４，１４３−１４７，１９９９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７，２０３２−２０３６，２０００ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６，１４４８２−１４４８６，１９９９；Ｎａｔｕｒｅ ４０１，３９０−３９４，１９９９ Ｃｅｌｌ １３２，５６７−５８２，２００８ Ｃｅｌｌ １２６，６６３−６７６，２００６；Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８，１９１７−１９２０，２００７ Ｎａｔｕｒｅ ４６０，１１３２−１１３５，２００９ Ｎａｔｕｒｅ，４６０，１１４０−１１４４，２００９ Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，２６７８−２６９０，１９９９ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．３７１，２６７−２７２，２００８ Ｎａｔｕｒｅ，４６１，６４９−６５３，２００９

本発明者らはマウスの体細胞にＯｃｔ４の過剰発現とともにＳｏｘ２遺伝子の発現誘導及びｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}とｐ１９^Ａｒｆの発現を抑制させることができるＢｍｉ１の過剰発現によって逆分化された誘導万能幹細胞を確立することができるという仮説を立てた。このような仮説を基にして二つの遺伝子を体細胞に導入した後、胚幹細胞の培養条件で培養した結果、胚幹細胞と類似形態の細胞群を確立することができた。このように確立された細胞群は遺伝子発現(gene expression)、後成的特性(epigenetics)、インビトロ／インビボでの三胚葉性分化能力(three germ layer differentiation)、テラトマ(teratoma)形成能力、キメラマウス生成(chimeric mouse generation)がマウス胚幹細胞と非常に類似していることを確認することで本発明を完成した。

ひいては、この結果に基づき、Ｂｍｉ１を調節することができる上位調節因子によってＢｍｉ１遺伝子を取り替えることができたら、導入しなければならない遺伝子の数を減らすことができると思った。前記Ｂｍｉ１遺伝子は上位調節因子であるＳｈｈ信号体系（Ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ）によって調節されている。ＳｈｈあるいはＳｈｈ類似体(Shh analog)による接近方法の実験結果、Ｂｍｉ１遺伝子の過剰発現システムと同一の結果を確認した。

したがって、本発明の目的は、Ｏｃｔ４遺伝子、Ｂｍｉ１遺伝子、Ｂｍｉ１の上位調節子であるＳｈｈまたはその類似体を用いて体細胞から胚幹細胞類似細胞への逆分化を誘導する組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、Ｏｃｔ４、Ｂｍｉ１遺伝子、Ｂｍｉ１の上位調節子であるＳｈｈまたはその類似体の導入によって体細胞から胚幹細胞と類似の特性を持つ多能性逆分化幹細胞を製造する製造方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記方法で生産された胚幹細胞類似細胞を提供することである。

本発明の他の目的及び利点は下記の発明の詳細な説明、請求範囲及び図面によってより明らかになる。

本発明者らは体細胞にＢｍｉ１及びＯｃｔ４とともに導入するか、Ｂｍｉ１の上位調節子であるＳｈｈ、Ｓｈｈの類似体であるオキシステロール（ｏｘｙｓｔｅｒｏｌｓ）またはプルモルファミン（ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ）を体細胞に処理して神経幹細胞のような細胞に誘導しながらＯｃｔ４を導入し、胚幹細胞の培養条件で培養する場合、すでに分化された細胞タイプである体細胞が多能性を持つ胚幹細胞類似細胞に逆分化（ｄｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）することを見つけて本発明を完成した。

一様態において、本発明は、ａ）Ｂｍｉ１（Ｂｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ １）タンパク質またはＢｍｉ１タンパク質をコードする核酸分子；及びｂ）Ｏｃｔ４タンパク質またはＯｃｔ４タンパク質をコードする核酸分子を含む、体細胞から胚幹細胞類似細胞への逆分化を誘導する組成物を提供する。

本発明において、“胚幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＥＳＣ）類似細胞”という用語は多能性を持つ細胞を意味し、形質転換ない増殖、無限増殖、自己再生産、及び３種のすべての胚芽層から来由したどんな細胞に発達することができる能力を含む胚幹細胞の特性を意味するが、これに制限されない。本発明において、胚幹細胞類似細胞は胚幹細胞、誘導された多能性幹細胞、または誘導万能幹細胞とも記述される。

本発明の胚幹細胞類似細胞を誘導することにおいて、出発体細胞の種類は特に限定されなく、任意の体細胞を用いることができる。例えば、胎芽期（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｐｅｒｉｏｄ）の体細胞の外に成熟した（ｍａｔｕｒｅｄ）体細胞を用いても良い。胚幹細胞類似細胞を疾病の治療に用いる場合には、患者から分離された体細胞を用いることが好ましく、例えば、疾病に関与する体細胞や疾病治療に関与する体細胞などを用いることができる。好ましくは、前記体細胞は繊維芽細胞であり、本発明において、繊維芽細胞はヒト、マウス、馬、羊、豚、山羊、らくだ、羚羊、犬などの動物来由のすべての繊維芽細胞を含む。

本発明のＢｍｉ１及びＯｃｔ４はタンパク質またはそのタンパク質をコードする核酸の形態として提供される。本発明の組成物に使われるＢｍｉ１及びＯｃｔ４は、ヒト、馬、羊、豚、山羊、らくだ、羚羊、犬などの動物来由のすべてのＢｍｉ１及びＯｃｔ４を含み、好ましくは、ヒトのＢｍｉ１及びＯｃｔ４である。また、胚幹細胞類似細胞への逆分化に使われる本発明のＢｍｉ１及びＯｃｔ４タンパク質はその野生型のアミノ酸配列を持つタンパク質だけでなくＢｍｉ１及びＯｃｔ４タンパク質の変異体を含む。

Ｂｍｉ１及びＯｃｔ４タンパク質の変異体とは、Ｂｍｉ１及びＯｃｔ４の天然アミノ酸配列と一つ以上のアミノ酸残基が結実、挿入、非保全的または保全的置換またはこれらの組合せによって相異なる配列を持つタンパク質を意味する。前記変異体は天然タンパク質と同一の生物学的活性を示す機能的等価物であるか、必要によってタンパク質の物理化学的性質が変形された変異体であることができる。物理、化学的環境に対する構造的安全性が増大するか生理学的活性が増大した変異体である。

好ましくは、Ｂｍｉ１及びＯｃｔ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列を持つ核酸の形態として提供される。

Ｂｍｉ１及びＯｃｔ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列は野生型または前述したような変異体形態のＢｍｉ１及びＯｃｔ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列で、一つ以上の塩基が置換、結実、挿入またはこれらの組合せによって変異されることができ、天然で分離されるか化学的合成法によって製造できる。

前述したＢｍｉ１及びＯｃｔ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列を持つ核酸は単鎖または二重鎖であることができ、ＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡ）またはＲＮＡ分子であることができる。

好適な一様態において、本発明において、体細胞の胚幹細胞類似細胞への逆分化を誘導する組成物は、Ｂｍｉ１及びＯｃｔ４タンパク質をコードする核酸を含むＢｍｉ１及びＯｃｔ４タンパク質を発現するベクターを含む。

本発明において、“ベクター”という用語は適当な宿主細胞から目的タンパク質を発現することができる発現ベクターで、遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された必須な調節要素を含む遺伝子作製物を言う。

本発明において、“作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）”という用語は一般的機能を遂行するように核酸発現調節配列と目的とするタンパク質をコードする核酸配列が機能的に連結（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｎｋａｇｅ）されていることを言う。組み換えベクターとの作動的連結は当該技術分野でよく知られた遺伝子組み換え技術を用いて製造することができ、部位−特異的ＤＮＡ切断及び連結は当該技術分野に一般的に知られた酵素などを使う。

本発明において、ベクターはプローモーター、オペレーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、エンハンサーのような発現調節要素の外にも膜標的化または分泌のための信号配列またはリーダー配列を含み、目的によって多様に製造できる。ベクターのプローモーターは構成的または誘導性であることができる。また、発現ベクターはベクターを含む宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含み、複製可能な発現ベクターの場合、複製起源を含む。ベクターは自己複製するか宿主ＤＮＡに統合できる。

本発明において、ベクターはプラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクターなどを含む。好ましくは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、例えばＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、ＭＬＶ（Ｍｕｒｉｎｅｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）、ＡＳＬＶ（Ａｖｉａｎ ｓａｒｃｏｍａ／ｌｅｕｋｏｓｉｓ）、ＳＮＶ（Ｓｐｌｅｅｎ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ＲＳＶ（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、ＭＭＴＶ（Ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ）など、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ関連ウイルス（Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスシンプレックスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）などから由来したベクターを含むが、これに制限されない。本発明の具体的な実施例では、Ｂｍｉ１遺伝子の場合、ＭＬＶ由来のウイルスベクター（Ｍｏｌｏｎｅｙ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｂａｓｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ）としてプロマイシンに対する選別マーカーを含むｐＢａｂｅ ｐｕｒｏベクターを用いた。Ｏｃｔ４遺伝子の場合は、ＭＬＶ由来のウイルスベクターとしてネオマイシン（ｎｅｏｍｙｃｉｎｅ）に対する選別マーカーを含むｐＢａｂｅ ｎｅｏ Ｏｃｔ４ベクターを用いた。

本発明では、Ｂｍｉ１及びＯｃｔ４などのタンパク質をコードする核酸は当該分野の公知方法、例えばベクター形態のネイキッドＤＮＡで細胞内に伝達するか（Ｗｏｌｆｆ ｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０：Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１０３：１２４９−５９，１９９２）、リポソーム（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ）、カチオン性高分子（Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ）などを用いて細胞内に伝達することができる。リポソームは遺伝子伝達のためにＤＯＴＭＡやＤＯＴＡＰなどのカチオン性リン脂質を混合して製造したリン脂質膜であり、カチオン性のリポソームとアニオン性の核酸が一定比率で混合すれば核酸−リポソーム複合体が形成される。

さらに他の好適な様態において、本発明において、体細胞から胚幹細胞類似細胞への逆分化を誘導する組成物は、Ｂｍｉ１及びＯｃｔ４タンパク質をコードする核酸を含むＢｍｉ１及びＯｃｔ４タンパク質を発現するウイルスを含む。

本発明において、“ウイルス”という用語はＢｍｉ１及びＯｃｔ４などのタンパク質をコードする核酸を含むウイルスベクターをパッケージング細胞で形質転換及び感染させて製作した、Ｂｍｉ１及びＯｃｔ４などを発現するウイルスを意味する。

本発明において、Ｂｍｉ１及びＯｃｔ４などのタンパク質を発現するウイルスの製造に使われることができるウイルスはレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルスなどを含むが、これらに制限されない。好ましくは、レトロウイルスである。本発明の具体的な実施例では、ｐＢａｂｅ ｐｕｒｏベクターにＢｍｉ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）を挿入して製造したベクター（ｐＢａｂｅ ｐｕｒｏ Ｂｍｉ１）とｐＢａｂｅ ｎｅｏベクターにヒトのＯｃｔ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号２）を挿入して製造したベクター（ｐＢａｂｅ ｎｅｏ Ｏｃｔ４）を広範囲な哺乳類宿主細胞に感染可能な高力価ウイルスを生成するパッケージング細胞であるＰＴ６７細胞に形質転換させてＢｍｉ１及びＯｃｔ４タンパク質を発現するウイルスを製造して繊維芽細胞を感染させた。

さらに他の様態において、本発明は、Ｂｍｉ１（Ｂ ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ １）遺伝子及びＯｃｔ４遺伝子を体細胞に導入して、体細胞から胚幹細胞類似細胞を製造する方法を提供する。

より具体的に、（ｉ）繊維芽細胞を培地で培養する段階、（ｉｉ）前記培養した繊維芽細胞を、Ｂｍｉ１遺伝子及びＯｃｔ４遺伝子を挿入したベクターを導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させたパッケージング細胞で感染させる段階、（ｉｉｉ）前記感染させた繊維芽細胞を胚幹細胞の培養条件で培養する段階を含む。

前記方法の（ｉ）段階で繊維芽細胞を培養する培地は当該技術分野で繊維芽細胞の培養に通常使われる培地をいずれも含む。培養に使われる培地は一般的に炭素源、窒素源及び微量元素成分を含む。本発明の具体的な実施例では、ＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ、ｗ／ｏ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ）＋１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ウシ胎児血清）＋０．１ｍＭ 非必須アミノ酸（ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）＋０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ））培地で培養した。

前記方法の（ｉｉ）段階で、前記ベクターはｐＢａｂｅ ｐｕｒｏベクターにＢｍｉ１タンパク質をコードする核酸分子を挿入して製造したベクター（ｐＢａｂｅ ｐｕｒｏ Ｂｍｉ１）とｐＢａｂｅ ｎｅｏベクターにヒトのＯｃｔ４タンパク質をコードする核酸分子を挿入して製造したベクター（ｐＢａｂｅ ｎｅｏ Ｏｃｔ４）を広範囲な哺乳類宿主細胞に感染可能な高力価ウイルスを生成するパッケージング細胞であるＰＴ６７細胞に形質転換させてＢｍｉ１及びＯｃｔ４タンパク質を発現するウイルスを製造して繊維芽細胞を感染させる。前記Ｂｍｉ１及びＯｃｔ４タンパク質またはＢｍｉ１及びＯｃｔ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列である核酸は、ヒト、馬、羊、豚、山羊、らくだ、羚羊、犬などの動物来由のすべてのＢｍｉ１及びＯｃｔ４であることができ、野生型及び変異体を含む。本発明の具体的な実施例では、ヒトのＢｍｉ１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｌ１３６８９；配列番号１）及びヒトのＯｃｔ４（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２７０１；配列番号２）を用いた。

前記方法の（ｉｉｉ）段階の胚幹細胞の培養条件は当該技術分野で胚幹細胞培養に通常使われる培地をいずれも含む。本発明の具体的な実施例では、支持細胞がある条件でハイグルコースＤＭＥＭに１５％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ウシ胎児血清）＋０．１ｍＭ 非必須アミノ酸（ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）＋０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）＋１０００ｕｎｉｔ／ｍｌ マウスＬＩＦ（ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ；白血病抑制因子）の培養液で培養しながら２〜３日に一回ずつ継代培養した。

さらに他の様態において、本発明は前記方法で製造された胚幹細胞類似細胞を提供する。

本発明の逆分化方法によって製造された胚幹細胞類似細胞は、胚幹細胞特異的なマーカーであるアルカリ性ホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）及びＳＳＥＡ−１、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２に対する抗体に陽性反応を示し、胚幹細胞の自己再生能力の維持に重要な遺伝子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｃ−ｍｙｃ、Ｋｌｆ４）の発現が胚幹細胞と類似した様相で発現される。また、一般的な胚幹細胞と同様な多能性を持つことを確認した。さらに、本発明の逆分化方法で製造された胚幹細胞類似細胞は自己再生（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）の特徴を持つ。

本発明による胚幹細胞類似細胞は多様なタイプの細胞を提供する良いソース（ｓｏｕｒｃｅ）である。例えば、前記胚幹細胞類似細胞は、細胞分化のための条件の培地で培養し、造血細胞、神経細胞、ベータ細胞、肝細胞、軟骨細胞、上皮細胞、尿路細胞及びその類似細胞に分化誘導できる。

胚幹細胞類似細胞が分化するための培地条件及び方法はＰａｌａｃｉｏｓ， ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ．ＵＳＡ，９２：７５３０−７５３７（１９９５），Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．，６；５４３−５５２（１９９４）、及びＢａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ，１６８：３４２−３５７（１９９５）に開示されている。前記胚幹細胞類似細胞は移植によって数多い治療に応用できる。前記胚幹細胞類似細胞は、糖尿病、パーキンソン病、アルツハイマー病、癌、脊椎損傷、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリック病）、筋ジストロフィー、肝疾患、高コレステロール血症、心臓疾患、軟骨代替、創傷、足部潰瘍、胃腸病、血管疾患、腎臓疾患、尿路疾患、老化関連疾患及び状態のような数多い疾病または疾患の治療に応用できる。その外に、本発明の胚幹細胞類似細胞は薬物開発時評価などにも応用できる。

さらに他の様態において、本発明は、Ｂｍｉ１（Ｂ ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ １）遺伝子を体細胞に導入し、神経幹細胞の培養条件で培養することで、体細胞から神経幹細胞を製造する方法を提供する。

前述した方法によって神経幹細胞に分化が誘導されることを特異的なマーカーの発現（Ｎｅｓｔｉｎ及びＳｏｘ２）で確認した。神経幹細胞を当該分野に知られた通常的な神経幹細胞分化条件で分化を誘導する場合、星状細胞、神経細胞、乏突起膠細胞(ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ)に分化することをそれぞれの該当のマーカーであるＧＦＡＰ、Ｔｕｊ１、Ｏ４が発現することを免疫化学染色法で確認した。

本発明の他の様態において、本発明は、ａ）Ｓｈｈ（Ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）タンパク質、Ｓｈｈタンパク質をコードする核酸分子、オキシステロール（Ｏｘｙｓｔｅｒｏｌ）、プルモルファミン(ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ)及びこの混合物から選択されるＢｍｉ１の上位調節子 ；及びｂ）Ｏｃｔ４タンパク質またはＯｃｔ４タンパク質をコードする核酸分子；を含む体細胞から胚幹細胞類似細胞への逆分化を誘導する組成物を提供する。

前記Ｂｍｉ１遺伝子は上位調節因子であるＳｈｈ信号体系（Ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ）によって調節されている。ＳｈｈあるいはＳｈｈ類似体による接近方法の実験結果がＢｍｉ１遺伝子の過剰発現システムと同一の結果を示すなら、遺伝子導入の数を減らすことができる可能性がある。現在までマウス繊維芽細胞に一つの遺伝子だけで逆分化幹細胞を作った結果がないから、このような接近方法によって新しい逆分化誘導方法を提示することができ、ひいては遺伝子の導入ない逆分化幹細胞株の誘導方法の確立に基盤となる技術を提供することができると考えられた。

このような仮説を基にして前記Ｂｍｉ１を過剰発現させるためにＳｈｈ信号体系（Ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いたが、Ｓｈｈは神経幹細胞の自己再生において重要なサイトカインで直接的にＧｌｉ１タンパク質を調節し、Ｂｍｉ１、Ｓｏｘ２を含む神経幹細胞の主要因子の発現を増加させると報告されている（Ｃｕｒｒ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．９，８７３−８８６，２００９；Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ．６５，４３−５３，２００８）。本発明者らはこのような報告によって最近に星状細胞をＢｍｉ１遺伝子の導入で神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）に逆分化誘導することが可能であるという論文を発表して特許として登録され、Ｓｈｈ処理によっても逆分化誘導が可能であるという結果を特許登録したことがある。このような結果に基づいてマウス繊維芽細胞にＢｍｉ１遺伝子を導入し、神経幹細胞の培養条件に移したとき、神経幹細胞のような細胞への誘導が可能であり、これを神経幹細胞の代表的なマーカーであるｎｅｓｔｉｎとｓｏｘ２の発現から確認することができた。また、神経幹細胞のように星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）、乏突起膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）、神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）への分化誘導が可能であるということをそれぞれの該当マーカーの染色によって確認することができた。Ｓｈｈを処理したときにもＢｍｉ１遺伝子の発現が誘導されて、神経幹細胞のような細胞への誘導が可能であるということを確認した。

このような結果に基づいてＳｈｈを処理しながらＯｃｔ４を導入し、胚幹細胞の培養条件で培養した結果、胚幹細胞と類似形態の細胞群を確立することができ、このように確立された細胞群は遺伝子発現、後成的特性、インビボ／インビトロでの三胚葉性分化能力、テラトマ形成能力がマウス胚幹細胞に非常に似ていることを確認した。

本発明のＳｈｈ及びＯｃｔ４はタンパク質またはそのタンパク質をコードする核酸の形態として提供される。本発明の組成物に使われるＳｈｈ及びＯｃｔ４はヒト、馬、羊、豚、山羊、らくだ、羚羊、犬などの動物来由のすべてのＳｈｈ及びＯｃｔ４を含み、好ましくはヒトのＳｈｈ及びＯｃｔ４である。また、胚幹細胞類似細胞への逆分化に使われる本発明のＳｈｈ及びＯｃｔ４タンパク質はその野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）のアミノ酸配列を持つタンパク質だけでなくＳｈｈ及びＯｃｔ４タンパク質の変異体を含む。

Ｓｈｈ及びＯｃｔ４タンパク質の変異体とは、Ｓｈｈ及びＯｃｔ４の天然アミノ酸配列と一つ以上のアミノ酸残基が結実、挿入、非保全的または保全的置換またはこれらの組合せによって相異なる配列を持つタンパク質を意味する。前記変異体は天然タンパク質と同一の生物学的活性を示す機能的等価物であるか必要によってタンパク質の物理化学的性質が変形された変異体であることができる。物理、化学的環境に対する構造的安全性が増大するか生理学的活性が増大した変異体である。

好ましくは、Ｓｈｈはタンパク質の形態として提供される。例えば、Ｓｈｈを処理して体細胞を胚幹細胞類似細胞に逆分化誘導するために通常使われる培地にＳｈｈタンパク質を処理すれば良い。このように、Ｓｈｈをタンパク質形態として提供すれば容易にＢｍｉ１を誘導することができるので、逆分化を誘導するために導入しなければならない遺伝子数を最小化することができる利点がある。

Ｓｈｈタンパク質は前記培地に有効濃度で含まれるようにする。培地の種類と培養方法など、当分野でよく知られた要素によってＳｈｈタンパク質の有効濃度が影響を受けることができる。本発明の具体的な実施例では、５００ｎｇ／ｍｌの量で処理した。

また、Ｓｈｈ及びＯｃｔ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列を持つ核酸の形態として提供される。

Ｓｈｈ及びＯｃｔ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列は野生型または前述したような変異体形態のＳｈｈ及びＯｃｔ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列であり、一つ以上の塩基が置換、結実、挿入またはこれらの組合せによって変異でき、天然で分離されるか化学的合成法によって製造することができる。

前述したＳｈｈ及びＯｃｔ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列を持つ核酸は単鎖または二重鎖であることができ、ＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡ）またはＲＮＡ分子であることができる。

好適な一様態において、本発明において、体細胞を胚幹細胞類似細胞に逆分化誘導する組成物はＳｈｈ及びＯｃｔ４タンパク質をコードする核酸を含むＳｈｈ及びＯｃｔ４タンパク質を発現するベクターを含む。

さらに他の好適な様態において、本発明において、体細胞から胚幹細胞類似細胞への逆分化を誘導する組成物はＳｈｈ及びＯｃｔ４タンパク質をコードする核酸を含むＯｃｔ４タンパク質を発現するウイルスを含む。

また、本発明者らは、Ｓｈｈシグナルを誘導するために、Ｓｈｈ類似体（Ｓｈｈ ａｎａｌｏｇ）であるヒドロキシコレステロール（ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ；Ｏｘｙｓｔｅｒｏｌ）またはプルモルファミン（ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ）を用いた（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ２７，７０３−７１３，２００９）。ヒドロキシコレステロール（Ｏｘｙｓｔｅｒｏｌ）またはプルモルファミンを神経幹細胞の培養条件でマウス繊維芽細胞に処理したとき、Ｂｍｉ１遺伝子の発現が増加することを確認することができた。この際、Ｓｏｘ２の発現が増加することを確認することができた。また、Ｂｍｉ１遺伝子のターゲット遺伝子であるｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}とｐ１９^Ａｒｆ遺伝子の発現が減っていることを確認することができるので、オキシステロールまたはプルモルファミン処理によるＢｍｉ１、Ｓｏｘ２が調節され、Ｂｍｉ１のターゲット遺伝子の発現が調節されていることを確認することができた。また、オキシステロールまたはプルモルファミンの処理によって誘導された細胞が神経幹細胞のような形状を示し、神経幹細胞の代表的なマーカーであるｎｅｓｔｉｎとｓｏｘ２の発現を確認することができた。これはＢｍｉ１が過剰発現したシステムと同一の結果であるため、Ｓｈｈ類似体であるオキシステロールまたはプルモルファミンの処理による方法が適切であると考えられ、このような接近方法で遺伝子数を減らすことができた。Ｏｃｔ４遺伝子を導入した後、胚幹細胞の培養条件で培養した結果、胚幹細胞と類似の形態の細胞群を確立することができた。このように確立された細胞群は遺伝子発現、後成的特性、インビトロ／インビボでの三胚葉性分化能力、テラトマ形成能力、キメラマウス生成がマウス胚幹細胞に非常に似ていることを確認した。

本発明のオキシステロールは酸化した形態のコレステロールであるヒドロキシコレステロール（ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）である。オキシステロールは急・晩成炎症、胆石形成、胆道癌のような胆道疾患の病態生理に重要な役目をすると知られており、最近脳が発達する段階で特定受容体を活性化させてドパミン生産神経細胞の形成を促進させる役目をすると報告されているだけ、これを用いた逆分化による胚幹細胞類似細胞製造方法が報告されたことはない。

前記オキシステロールはヒドロキシコレステロールであれば特に制限があるものではなく、Ｓｈｈシグナルを誘導することができれば多様な誘導体が使われることができる。例えば、２５−、７β−及び１９−ヒドロキシコレステロール（２５−、７β−、及び１９−ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）を市中で購入して使うことができる。

前記オキシステロールは、神経幹細胞類似細胞への逆分化を誘導するために通常使われる培地に処理すれば良い。このように、Ｓｈｈ類似体であるオキシステロールを処理すれば容易にＢｍｉ１を誘導することができるので、逆分化を誘導するために導入しなければならない遺伝子数を最小化することができる利点がある。

前記オキシステロールは前記培地に有効濃度で含まれるようにする。培地の種類と培養方法など、当分野でよく知られた要素によってオキシステロールの有効濃度は影響を受けることができる。本発明の具体的な実施例では、０．１μＭ〜０．５μＭの量で処理した。

本発明のプルモルファミンはプリン化合物（ｐｕｒｉｎｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）であり、Ｓｈｈ信号体系に関与するものとして知られている。

前記プルモルファミンはＳｈｈシグナルを誘導することができれば特に制限がなく、多様な誘導体が使われることができる。例えば、２−（１−Ｎａｐｈｔｈｏｘｙ）−６−（４−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏａｎｉｌｉｎｏ）−９−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｐｕｒｉｎ）などを市中で購入して使うことができる。

前記プルモルファミンは神経幹細胞類似細胞への逆分化を誘導するために通常使われる培地に処理すれば良い。このように、Ｓｈｈ類似体であるプルモルファミンを処理すれば容易にＢｍｉ１を誘導することができるので、逆分化を誘導するために導入しなければならない遺伝子数を最小化することができる利点がある。

前記プルモルファミンは前記培地に有効濃度で含まれるようにする。培地の種類と培養方法など、当該技術分野でよく知られた要素によってプルモルファミンの有効濃度は影響を受けることができる。本発明の具体的な実施例では、０．５μＭ〜１μＭの量で処理した。

さらに他の様態において、本発明は、体細胞にＳｈｈ（Ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ）タンパク質、Ｓｈｈタンパク質をコードする核酸分子、オキシステロールまたはプルモルファミンを処理してＯｃｔ４遺伝子を体細胞に導入する段階を含む体細胞から胚幹細胞類似細胞を製造する方法を提供する。

より具体的に、（ｉ）繊維芽細胞を培地で培養する段階、（ｉｉ）前記培養した繊維芽細胞にＳｈｈタンパク質、Ｓｈｈタンパク質をコードする核酸分子、オキシステロールまたはプルモルファミンを処理し、Ｏｃｔ４遺伝子を挿入したベクターを導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させたパッケージング細胞で感染させる段階、（ｉｉｉ）前記感染させた繊維芽細胞を胚幹細胞の培養条件で培養する段階を含む。

前記方法の（ｉ）段階で、繊維芽細胞を培養する培地は当該技術分野で繊維芽細胞の培養に通常使われる培地をいずれも含む。培養に使われる培地は一般的に炭素源、窒素源及び微量元素成分を含む。本発明の具体的な実施例では、ＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ、ｗ／ｏ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ）＋１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）＋０．１ｍＭ 非必須アミノ酸（ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）＋０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ））培地で培養した。

前記方法の（ｉｉ）段階で、前記Ｓｈｈタンパク質、オキシステロールまたはプルモルファミンを神経幹細胞の培養条件で処理して神経幹細胞のような細胞への誘導をしながらＯｃｔ４遺伝子を繊維芽細胞に導入することが好ましい。オキシステロールまたはプルモルファミン処理を１日間行った後、Ｏｃｔ４ウイルスによる感染を１６時間の間隔で３回にかけて実施し、Ｓｈｈタンパク質、オキシステロールまたはプルモルファミン処理を続けて行うことが好ましい。この際、Ｓｈｈタンパク質、オキシステロールまたはプルモルファミン処理を総７２時間持続しながら神経幹細胞の培養条件を維持した後、胚幹細胞の培養条件に変えることが胚幹細胞類似細胞への逆分化効率を高めることができるので好ましい。

前記方法の（ｉｉ）段階で、ｐＢａｂｅ ｎｅｏベクターにヒトのＯｃｔ４タンパク質をコードする核酸分子を挿入して製造したベクター（ｐＢａｂｅ ｎｅｏ Ｏｃｔ４）を広範囲な哺乳類宿主細胞に感染可能な高力価ウイルスを生成するパッケージング細胞であるＰＴ６７細胞に形質転換させ、Ｏｃｔ４タンパク質を発現するウイルスを製造して繊維芽細胞を感染させる。前記Ｓｈｈ及びＯｃｔ４タンパク質またはＳｈｈ及びＯｃｔ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列である核酸はヒト、馬、羊、豚、山羊、らくだ、羚羊、犬などの動物来由のすべてのＯｃｔ４であることができ、野生型及び変異体を含む。本発明の具体的な実施例では、ヒトのＯｃｔ４（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２７０１；配列番号２）を用いた。

前記方法の（ｉｉｉ）段階の胚幹細胞の培養条件は当該技術分野で胚幹細胞培養に通常使われる培地をいずれも含む。本発明の具体的な実施例では、支持細胞がある条件でハイグルコースＤＭＥＭに１５％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ウシ胎児血清）＋０．１ｍＭ 非必須アミノ酸（ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）＋０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）＋１０００ｕｎｉｔ／ｍｌ マウスＬＩＦ（ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ；白血病抑制因子）の培養液で培養しながら２〜３日に一回ずつ継代培養した。

さらに他の様態において、本発明は、前記方法で製造された胚幹細胞類似細胞を提供する。

本発明の逆分化方法で製造された胚幹細胞類似細胞は、胚幹細胞特異的なマーカーであるアルカリ性ホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）及びＳＳＥＡ−１、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２に対する抗体に陽性反応を示し、胚幹細胞の自己再生能力の維持に重要な遺伝子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｃ−ｍｙｃ、Ｋｌｆ４）の発現が胚幹細胞に似ている様相で発現する。また、一般的な胚幹細胞と同一の多能性を持つことを確認した。さらに、本発明の逆分化方法で製造された胚幹細胞類似細胞は自己再生（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）の特徴を持つ。

前述したように、本発明によれば、Ｂｍｉ１及びＯｃｔ４遺伝子のみを導入するか、Ｂｍｉ１の上位調節子であるＳｈｈ、Ｓｈｈの類似体であるオキシステロール（ｏｘｙｓｔｅｒｏｌｓ）またはプルモルファミンを体細胞に処理して神経幹細胞のような細胞に誘導しながらＯｃｔ４を導入し、胚幹細胞の培養条件で培養することで、体細胞を多能性の逆分化幹細胞に誘導することができる。

本発明によって逆分化した胚幹細胞類似細胞は、例えば、心筋細胞、インスリン生産細胞、または神経細胞などの細胞に分化して、心不全、インスリン依存性糖尿病、パーキンソン病や脊椎損傷などの多様な疾患に対する幹細胞移植療法に用いることができ、ヒトの胚芽を用いる倫理的問題や移植後の拒否反応を回避することができるので、ごく有用である。また、誘導多能性幹細胞を分化させて生ずる各種細胞（例えば、心筋細胞、肝細胞など）は化合物、薬剤、毒物などの薬効や毒性を評価するためのシステムとして有用に使われることができる。

また、本発明は、Ｂｍｉ１遺伝子を取り替えることができる上位調節因子であるＳｈｈタンパク質、その類似体であるオキシステロールまたはプルモルファミンという化学物質を用いることで、Ｏｃｔ４遺伝子一つだけで逆分化胚幹細胞類似細胞を製造することができるので、逆分化因子の数を減らすことができるようになった。さらに、遺伝子導入ない細胞株の確立をするのに基になる技術を提供する幹細胞分野に非常に有用な発明であると言える。

マウス繊維芽細胞にＯｃｔ４とＳｏｘ２遺伝子を導入した場合（２Ｆ）と、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｂｍｉ１を導入した場合（２Ｆ−Ｂｍｉ１）の２種の方法で逆分化を誘導してその結果を比較したものを示すものであり、マウス繊維芽細胞に２種の因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２）を導入したときと、３種の因子（Ｂｍｉ１、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２）を導入したときの逆分化幹細胞の発生頻度をＡＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）染色によって比較した結果を示すもので、２Ｆで逆分化誘導されなかったが、Ｂｍｉ１遺伝子が加えられて逆分化幹細胞が形成されること（２Ｆ−Ｂｍｉ１−ｉＰＳ）をＡＰ染色によって確認し、左側の図はこれに対する結果を示し、右側の表はコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）数を確認した結果を示す。 マウス繊維芽細胞にＯｃｔ４とＳｏｘ２遺伝子を導入した場合（２Ｆ）と、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｂｍｉ１を導入した場合（２Ｆ−Ｂｍｉ１）の２種の方法で逆分化を誘導してその結果を比較したものを示すものであり、２Ｆ−Ｂｍｉ１−ｉＰＳの場合、胚幹細胞と類似の形態（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）を示しているものを示すものである。 マウス繊維芽細胞にＯｃｔ４とＳｏｘ２遺伝子を導入した場合（２Ｆ）と、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｂｍｉ１を導入した場合（２Ｆ−Ｂｍｉ１）の２種の方法で逆分化を誘導してその結果を比較したものを示すものであり、逆分化幹細胞（２Ｆ−Ｂｍｉ１−ｉＰＳ）と胚幹細胞を免疫化学染色法（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）によって幹細胞で特異的に発現するマーカーであるＳＳＥＡ１、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇの発現を確認した結果を示すもので、この際、ＡＰ染色したとき、ポジティブ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）に現れることを確認することができる。 Ｂｍｉ１遺伝子の導入によってマウス繊維芽細胞を神経幹細胞のような細胞に誘導した結果を示すものであり、Ｂｍｉ１を導入したマウス繊維芽細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）でＢｍｉ１遺伝子の発現を確認し、この際、Ｓｏｘ２遺伝子の発現が増加し、Ｂｍｉ１遺伝子のターゲット遺伝子であるｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}とｐ１９^Ａｒｆの発現が減ることを確認した結果を示すものである。 Ｂｍｉ１遺伝子の導入によってマウス繊維芽細胞を神経幹細胞のような細胞に誘導した結果を示すものであり、Ｂｍｉ１を導入したマウス繊維芽細胞を神経幹細胞の培養条件で培養したとき、細胞の形状が３日後から凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）し、７日目になったとき神経球（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）のような形状を示すことを確認した結果を示すものである。 Ｂｍｉ１遺伝子の導入によってマウス繊維芽細胞を神経幹細胞のような細胞に誘導した結果を示すものであり、神経幹細胞のような細胞を免疫化学染色法によって神経幹細胞の特異的マーカーであるＮｅｓｔｉｎ、Ｓｏｘ２が発現し、ＡＰがポジティブに染色される結果を示すものである。 Ｂｍｉ１遺伝子の導入によってマウス繊維芽細胞を神経幹細胞のような細胞に誘導した結果を示すものであり、Ｂｍｉ１を導入したマウス繊維芽細胞を用いて作られた神経幹細胞が神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）、乏突起膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）に分化したかをそれぞれの細胞で発現する代表的なマーカーであるＴｕｊ１、Ｏ４、ＧＦＡＰが発現することを免疫化学染色法で確認した結果を示すものである。 Ｏｃｔ４とＢｍｉ１遺伝子導入によって逆分化幹細胞に誘導した結果を示すものであり、マウス繊維芽細胞にＢｍｉ１とＯｃｔ４遺伝子を導入した後、逆分化誘導したとき、形成された逆分化幹細胞（ＢＯ−ｉＰＳ）の形態を胚幹細胞と比較した結果を示すもので、右側の結果は逆分化誘導の効率をＯｃｔ４単独の場合と比較して示すものである。Ｏｃｔ４単独では逆分化幹細胞が形成されないのに比べ、Ｂｍｉ１が一緒に導入された場合には、逆分化幹細胞への誘導が可能であり、約５０個程度のコロニーの形成を示すことを確認した結果を示す。 Ｏｃｔ４とＢｍｉ１遺伝子導入によって逆分化幹細胞に誘導した結果を示すものであり、逆分化幹細胞が胚幹細胞で発現する重要な遺伝子の発現が類似の様相で現れていることをＲＴ−ＰＣＲ法で確認した結果を示すものである。 Ｏｃｔ４とＢｍｉ１遺伝子導入によって逆分化幹細胞に誘導した結果を示すものであり、図３ｂで確認した結果をＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法で胚幹細胞の自己再生能力を維持させることに関与している代表的な遺伝子の発現を示し、このような結果によって胚幹細胞に似ている遺伝子発現様相を示すことを確認した結果を示すものである。 Ｏｃｔ４とＢｍｉ１遺伝子導入によって逆分化幹細胞に誘導した結果を示すものであり、逆分化幹細胞が胚幹細胞で特異的に発現するマーカーが発現することを免疫化学染色法で確認した結果を示すものである。 Ｏｃｔ４とＢｍｉ１遺伝子導入によって逆分化幹細胞に誘導した結果を示すものであり、ウェスタンブロット分析法によってＯｃｔ４とＳｏｘ２の発現を胚幹細胞と比較して確認した結果を示すものである。 Ｏｃｔ４とＢｍｉ１遺伝子導入によって逆分化幹細胞に誘導した結果を示すものであり、ＦＡＣＳ分析法によってＳＳＥＡ１とＯｃｔ４の発現を胚幹細胞と比較して確認した結果を示すもので、この際、マウス繊維芽細胞とは異なり、逆分化幹細胞が胚幹細胞に似ている％の発現様相を示すことを確認することができた。 本発明による胚幹細胞類似細胞の後成的変異(epigenetic variations)に関する分析をした結果を示すものであり、胚幹細胞の自己再生能力の維持に関与している主要遺伝子であるＯｃｔ４とＮａｎｏｇのプローモーター部位のメチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）有無に対して亜硫酸水素塩シークエンシング（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）法で分析した結果を示すもので、マウス繊維芽細胞は大部分メチル化している結果を示すが、逆分化幹細胞の場合、胚幹細胞のように脱メチル化（ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）している様相を示すことを確認することができた。また、それぞれのクローンでも同一様相を示している。 本発明による胚幹細胞類似細胞の後成的変異(epigenetic variations)に関する分析をした結果を示すものであり、クロマチン免疫沈降法（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）によってヒストンＨ３（ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３）のアセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）とメチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）有無をｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法で確認した結果を示すもので、逆分化幹細胞（ＢＯ−ｉＰＳ）の場合には、胚幹細胞のようにＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現がプローモーターのヒストン（ｈｉｓｔｏｎｅ）３番がアセチル化したことを確認することができ、一方マウス繊維芽細胞はこの遺伝子のプローモーターのヒストンＨ３のリシン９（ｌｙｓｉｎｅ９）に脱メチル化した結果を示す。 全体遺伝子発現（ｇｌｏｂａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）をＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）法によって比較分析した結果を示すもので、胚幹細胞、マウス繊維芽細胞、逆分化幹細胞をそれぞれ比較した結果、図５の下の結果のように逆分化幹細胞は胚幹細胞と０．９８程度の類似性を示すのに対し、マウス繊維芽細胞は０．６９程度に低い相関（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）程度を示す。図５の上側結果では散布図（ｓｃａｔｔｅｒ ｐｌｏｔ）分析法によって胚幹細胞と遺伝子発現を比較した結果を示す。この際、マウス繊維芽細胞は遺伝子発現がよほど違うことを確認することができるが、逆分化幹細胞とそのクローン細胞の場合、胚幹細胞とかなり類似の遺伝子発現様相を示すことを確認することができた。また、胚幹細胞の主要遺伝子の発現も２倍範囲内にあることを確認することができ、逆分化幹細胞が胚幹細胞と遺伝子発現様相が類似したことを確認することができる。 インビトロとインビボで三胚葉細胞への分化特性を持っているかを確認した結果を示すものであり、胚体（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｂｏｄｙ、ＥＢ）を形成することができるということを示し、この時の細胞で三胚葉（ｔｈｒｅｅ ｇｅｒｍ ｌａｙｅｒ）にあたるマーカーが発現することをＲＴ−ＰＣＲ法で確認した結果を示している。 インビトロとインビボで三胚葉細胞への分化特性を持っているかを確認した結果を示すものであり、胚体形成の後、インビトロで自然発生的分化を誘導したとき、三胚葉にあたる代表的な細胞への分化が誘導されたことをそれぞれにあたる代表的なマーカーの発現を免疫化学染色法で確認した結果を示すもので、内胚葉、中胚葉、外胚葉にあたる代表的な細胞への分化が可能であることを示す。それぞれＧＡＴＡ４、Ｂｒｙ、ＳＭＡ、Ｔｕｊ１で染色して確認した結果を示す。 インビトロとインビボで三胚葉細胞への分化特性を持っているかを確認した結果を示すものであり、インビボで三胚葉性細胞への分化誘導が可能であるかを確認した結果を示すもので、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕｄｅ ｍｏｕｓｅ）の腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）にカプセル（ｃａｐｓｕｌｅ）型で細胞を注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）し、８−１０週後にテラトマが形成されたものを準備し、Ｈ＆Ｅ染色方法によって染色して、三胚葉にあたる代表的な細胞に分化したことを確認した結果を示す。 インビトロとインビボで三胚葉細胞への分化特性を持っているかを確認した結果を示すものであり、胚盤胞（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）に細胞を移植したとき、キメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）が形成されたものを示すものである。 逆分化幹細胞を均質集団（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に分離し、クローンに対して胚幹細胞と比較分析した結果を示すものであり、ＲＴ−ＰＣＲ法によって胚幹細胞における重要な遺伝子の発現を胚幹細胞と比較分析した結果を示すものである。 逆分化幹細胞を均質集団（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に分離し、クローンに対して胚幹細胞と比較分析した結果を示すものであり、この細胞がＡＰ染色にポジティブな結果を示すことを示し、免疫化学染色法によって代表的なマーカーの発現を確認した結果を示すものである。 逆分化幹細胞を均質集団（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に分離し、クローンに対して胚幹細胞と比較分析した結果を示すものであり、このように作られたクローン細胞がインビボでテラトマ形成が可能であるかをＢａｌｂ／ｃヌードマウスの腎臓にカプセルで注入し、８−１０週後に三胚葉性細胞に分化したことを確認した結果を示すものである。 本発明によってＯｃｔ４及びＢｍｉ１を用いて繊維芽細胞の逆分化を誘導して胚幹細胞類似細胞を製造する方法の全体内容を図式化したものである。 Ｓｈｈ処理によるＢｍｉ１誘導結果を示すものである。 Ｓｈｈ処理によるＢｍｉ１誘導結果を示すものである。 Ｓｈｈ処理によるＢｍｉ１誘導結果を示すものである。 Ｓｈｈ処理によるＢｍｉ１誘導結果を示すものである。 Ｓｈｈ処理しながらＯｃｔ４遺伝子を導入して誘導した逆分化幹細胞を胚幹細胞と特性比較分析した結果を示すものである。 Ｓｈｈ処理しながらＯｃｔ４遺伝子を導入して誘導した逆分化幹細胞を胚幹細胞と特性比較分析した結果を示すものである。 Ｓｈｈ処理しながらＯｃｔ４遺伝子を導入して誘導した逆分化幹細胞を胚幹細胞と特性比較分析した結果を示すものである。 Ｓｈｈ処理しながらＯｃｔ４遺伝子を導入して誘導した逆分化幹細胞を胚幹細胞と特性比較分析した結果を示すものである。 Ｓｈｈ処理しながらＯｃｔ４遺伝子を導入して誘導した逆分化幹細胞を胚幹細胞と特性比較分析した結果を示すものである。 本発明による胚幹細胞類似細胞の後成的特性を比較分析した結果を示すものである。 本発明による胚幹細胞類似細胞の後成的特性を比較分析した結果を示すものである。 ＤＮＡマイクロアレイ法によって胚幹細胞と逆分化幹細胞であるＳＯ−ｉＰＳを全体遺伝子上で比較分析した結果を示すもので、散布図法で分析結果を表示したとき、大部分の遺伝子の発現程度が胚幹細胞に似ていることを確認することができ、ピアソン相関関係（ｐｅａｒｓｏｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）分析法によって０．９８程度の類似性を示すことを確認することができた。 インビトロとインビボで三胚葉性細胞への分化能力を持っているかを確認した結果を示すものである。 インビトロとインビボで三胚葉性細胞への分化能力を持っているかを確認した結果を示すものである。 インビトロとインビボで三胚葉性細胞への分化能力を持っているかを確認した結果を示すものである。 Ｓｈｈ類似体であるヒドロキシコレステロール処理によるＢｍｉ１誘導結果を示すものである。 Ｓｈｈ類似体であるヒドロキシコレステロール処理によるＢｍｉ１誘導結果を示すものである。 Ｓｈｈ類似体であるヒドロキシコレステロール処理によるＢｍｉ１誘導結果を示すものである。 Ｓｈｈ類似体であるヒドロキシコレステロール処理によるＢｍｉ１誘導結果を示すものである。 オキシステロールを処理しながらＯｃｔ４遺伝子を導入して誘導した逆分化幹細胞を胚幹細胞と特性比較分析した結果を示すものである。 オキシステロールを処理しながらＯｃｔ４遺伝子を導入して誘導した逆分化幹細胞を胚幹細胞と特性比較分析した結果を示すものである。 オキシステロールを処理しながらＯｃｔ４遺伝子を導入して誘導した逆分化幹細胞を胚幹細胞と特性比較分析した結果を示すものである。 オキシステロールを処理しながらＯｃｔ４遺伝子を導入して誘導した逆分化幹細胞を胚幹細胞と特性比較分析した結果を示すものである。 本発明による胚幹細胞類似細胞の後成的特性を比較分析した結果を示すものである。 本発明による胚幹細胞類似細胞の後成的特性を比較分析した結果を示すものである。 ＤＮＡマイクロアレイ法によって胚幹細胞と逆分化幹細胞であるＯＯ−ｉＰＳを全体遺伝子上で比較分析した結果を示すもので、散布図法で分析結果を表示したとき、大部分の遺伝子の発現程度が胚幹細胞に似ていることを確認することができた（上側パネル）。また、ピアソン相関関係分析法によって０．９８程度の類似性を示すことを確認することができ、これはクローン細胞でも０．９５程度の類似性を示すことを確認することができた。 本発明による胚幹細胞類似細胞がインビトロとインビボで三胚葉性細胞への分化能力を持っているかを確認した結果を示すものである。 本発明による胚幹細胞類似細胞がインビトロとインビボで三胚葉性細胞への分化能力を持っているかを確認した結果を示すものである。 成体マウス繊維芽細胞（Ａｄｕｌｔ ｍｏｕｓｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）にマウス胚芽繊維芽細胞（ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）で逆分化を誘導した条件を適用して逆分化幹細胞株を確立（ＯＯ−ｉＰＳ−ＴＴＦ #１，２）し、その特性分析をした結果を示すものである。 成体マウス繊維芽細胞（Ａｄｕｌｔ ｍｏｕｓｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）にマウス胚芽繊維芽細胞（ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）で逆分化を誘導した条件を適用して逆分化幹細胞株を確立（ＯＯ−ｉＰＳ−ＴＴＦ #１，２）し、その特性分析をした結果を示すものである。 本発明による成体マウス繊維芽細胞から誘導された胚幹細胞類似細胞（ＯＯ−ｉＰＳ−ＴＴＦ #１，２細胞）の後成的特性を比較分析した結果を示すものである。 本発明による成体マウス繊維芽細胞から誘導された胚幹細胞類似細胞（ＯＯ−ｉＰＳ−ＴＴＦ #１，２細胞）の後成的特性を比較分析した結果を示すものである。 本発明による成体マウス繊維芽細胞から誘導された胚幹細胞類似細胞（ＯＯ−ｉＰＳ−ＴＴＦ #１，２細胞）がインビトロとインビボで三胚葉性細胞への分化能力を持っているかを確認した結果を示すものである。 本発明による成体マウス繊維芽細胞から誘導された胚幹細胞類似細胞（ＯＯ−ｉＰＳ−ＴＴＦ #１，２細胞）がインビトロとインビボで三胚葉性細胞への分化能力を持っているかを確認した結果を示すものである。 Ｓｈｈ類似体であるプルモルファミン処理によるＢｍｉ１誘導結果を示すものである。 Ｓｈｈ類似体であるプルモルファミン処理によるＢｍｉ１誘導結果を示すものである。 Ｓｈｈ類似体であるプルモルファミン処理によるＢｍｉ１誘導結果を示すものである。 Ｓｈｈ類似体であるプルモルファミン処理によるＢｍｉ１誘導結果を示すものである。 プルモルファミンを処理しながらＯｃｔ４遺伝子を導入して誘導した逆分化幹細胞を胚幹細胞と特性比較分析した結果を示すものである。 プルモルファミンを処理しながらＯｃｔ４遺伝子を導入して誘導した逆分化幹細胞を胚幹細胞と特性比較分析した結果を示すものである。 プルモルファミンを処理しながらＯｃｔ４遺伝子を導入して誘導した逆分化幹細胞を胚幹細胞と特性比較分析した結果を示すものである。 プルモルファミンを処理しながらＯｃｔ４遺伝子を導入して誘導した逆分化幹細胞を胚幹細胞と特性比較分析した結果を示すものである。 プルモルファミンを処理しながらＯｃｔ４遺伝子を導入して誘導した逆分化幹細胞を胚幹細胞と特性比較分析した結果を示すものである。 本発明による胚幹細胞類似細胞の後成的特性を比較分析した結果を示すものである。 本発明による胚幹細胞類似細胞の後成的特性を比較分析した結果を示すものである。 ＤＮＡマイクロアレイ法によって胚幹細胞と逆分化幹細胞であるＰＯ−ｉＰＳを全体遺伝子上で比較分析した結果を示すもので、散布図法で分析結果を表示したとき、大部分の遺伝子の発現程度が胚幹細胞に似ていることを確認することができ、ピアソン相関関係分析法によって０．９７及び０．９５程度の類似性を示すことを確認することができた。 本発明による胚幹細胞類似細胞がインビトロとインビボで三胚葉性細胞への分化能力を持っているかを確認した結果を示すものである。 本発明による胚幹細胞類似細胞がインビトロとインビボで三胚葉性細胞への分化能力を持っているかを確認した結果を示すものである。 本発明による胚幹細胞類似細胞がインビトロとインビボで三胚葉性細胞への分化能力を持っているかを確認した結果を示すものである。 本発明による胚幹細胞類似細胞がインビトロとインビボで三胚葉性細胞への分化能力を持っているかを確認した結果を示すものである。

以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。これら実施例はただ本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないことは当該技術分野で通常の知識を持った者にとって明らかであろう。

〔実施例１．マウス繊維芽細胞の培養及びＯｃｔ４、Ｂｍｉ１遺伝子導入〕
胚幹細胞類似細胞を製造するために、マウス体細胞の中でマウス繊維芽細胞を用いた。マウス繊維芽細胞はＣＦ１ストレインマウス（ＣＦ１ ｓｔｒａｉｎ ｍｏｕｓｅ）が姙娠してから１３．５日目になったときの胚芽（ｅｍｂｒｙｏ）を準備し、ＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ、ｗ／ｏ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ）＋１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ウシ胎児血清）＋０．１ｍＭ 非必須アミノ酸（ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）＋０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ））培地の組職培養フラスコ（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｌａｓｋ）で培養をした後、３継代（３ｒｄ ｐａｓｓａｇｅ）になったとき、２×１０^５の細胞を６ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に接種（ｓｅｅｄｉｎｇ）した。

レトロウイルスで遺伝子を導入する方法を使うため、ウイルス粒子（ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）をＰＴ６７パッケージング細胞株を用いて準備した。より具体的に、ｐＢａｂｅ ｐｕｒｏベクターにヒトのＢｍｉ１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｌ１３６８９）遺伝子を挿入して製造したｐＢａｂｅ ｐｕｒｏ Ｂｍｉ１（Ｄｒ．Ｇ．Ｐ．Ｄｉｍｒｉ，Ｅｖａｎｓｔｏｎ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｆｅｉｎｂｅｒｇ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｅｖａｎｓｔｏｎ，ＩＬ ６０２０１，ＵＳＡ）とｐＢａｂｅ ｎｅｏベクターにヒトのＯｃｔ４（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２７０１）遺伝子を挿入して製造したｐＢａｂｅ ｎｅｏ Ｏｃｔ４ベクターをＰＴ６７パッケージング細胞株（ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）にターボフェクト（Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社製）を用いて導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した後、プロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎｅ、３μｇ／ｍｌ）（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とネオマイシン（ｎｅｏｍｙｃｉｎｅ、１０００μｇ／ｍｌ）（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で選別した。ＰＴ６７パッケージング細胞株は広範囲な哺乳類宿主細胞に感染可能な高力価ウイルスを生成する細胞である。

それぞれの遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法で確認した後、このように作られた細胞株が８０％程度になったとき、上澄液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を取り、０．４５μｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターでフィルタリング（ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）して細胞破片（ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）を除去した後、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ、６μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ社製）を添加し、１２時間の間隔で分離したマウス繊維芽細胞に３回繰り返して感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）させた。

〔実施例２．Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２とＢｍｉ１遺伝子導入による逆分化誘導〕
マウス繊維芽細胞にＯｃｔ４とＳｏｘ２遺伝子を導入した場合（２Ｆ）とＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｂｍｉ１を導入した場合（２Ｆ−Ｂｍｉ１）の２種の方法で逆分化を誘導し、その結果を比較した。

実施例１によってそれぞれレトロウイルスで挿入する方法で遺伝子を導入し、マウス胚幹細胞の培養条件で逆分化を誘導した。マウス胚幹細胞の培養条件は、支持細胞がある条件でハイグルコースＤＭＥＭに１５％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ウシ胎児血清）＋０．１ｍＭ 非必須アミノ酸（ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）＋０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）＋１０００ｕｎｉｔ／ｍｌ マウスＬＩＦ（ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ；白血病抑制因子）の培養液で培養しながら２〜３日に一回ずつ継代培養を行った。

図１はＯｃｔ４とＳｏｘ２遺伝子を導入したときとＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｂｍｉ１遺伝子を導入したとき、逆分化効率を比較した結果を示す。図１ａに示すように、２ＦであるＯｃｔ４とＳｏｘ２の場合と比較したとき、Ｂｍｉ１遺伝子が導入された場合（２Ｆ−Ｂｍｉ１）にＡＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）がポジティブなコロニーが形成され、個数もめっきり高く現れることを確認することができた（図１ａ）。このような方法で逆分化誘導された細胞の形態（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）を胚幹細胞と比較したとき、胚幹細胞に似ている形状を示していることを確認した（図１ｂ）。逆分化誘導された細胞を胚幹細胞で特異的に発現するマーカーが発現するかを確認するために、ＡＰで染色されるかを確認し、この時の細胞から免疫化学染色法によってＳＳＥＡ１、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ遺伝子が発現することを確認した（図１ｃ）。このような結果によって、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｂｍｉ１が導入されたとき、逆分化誘導が可能であるということを確認することができ、Ｂｍｉ１遺伝子が逆分化誘導に重要な因子ということを証明したと言える。

〔実施例３．Ｂｍｉ１遺伝子の導入によってマウス繊維芽細胞を神経幹細胞のような細胞に誘導〕
実施例１と同様な方法でマウス繊維芽細胞にレトロバイアスを用いてＢｍｉ１遺伝子を導入したとき、Ｂｍｉ１のターゲット遺伝子であるｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}とｐ１９^ａｒｆの発現が減ることをウェスタンブロット分析法で確認した。この際、Ｓｏｘ２遺伝子の発現が増加することを確認した（図２ａ）。

また、Ｂｍｉ１遺伝子を導入した細胞を神経幹細胞の培養条件に変えて培養したとき、細胞の形状が凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）する現象を示し、このような条件で続けて培養した結果、神経球のような形状の細胞に変化することを確認することができた（図２ｂ）。このような細胞はＡＰ染色され、神経幹細胞で代表的に発現するマーカーであるＮｅｓｔｉｎとＳｏｘ２が発現することを免疫化学染色法によって確認することができた（図２ｃ）。また、神経幹細胞のように、星状細胞、神経細胞、乏突起膠細胞に分化することを、それぞれの該当マーカーであるＧＦＡＰ、Ｔｕｊ１、Ｏ４が発現することを免疫化学染色法で確認することで確認した（図２ｄ）。このような結果から、マウス繊維芽細胞にＢｍｉ１遺伝子を導入した場合、神経幹細胞のような細胞への誘導が可能であることを確認することができた。

〔実施例４．Ｏｃｔ４とＢｍｉ１遺伝子導入による逆分化幹細胞への誘導〕
Ｂｍｉ１が導入されたマウス繊維芽細胞が神経幹細胞のような細胞への誘導が可能であり、Ｓｏｘ２の発現を増加させた結果に基づき、Ｏｃｔ４とＢｍｉ１遺伝子のみを導入した後、逆分化を誘導した。Ｏｃｔ４だけで逆分化を誘導したとき、コロニーが形成されなかった結果とは反対に、約５０個のコロニーが形成されることを確認することができた。この時に形成されたコロニーの場合、胚幹細胞に似ている形態を示していることを確認することができた（図３ａ）。このように確立された逆分化幹細胞の場合（ＢＯ−ｉＰＳ）、胚幹細胞で特異的に発現する遺伝子が発現することをＲＴ−ＰＣＲ法及びＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法で証明することができた（図３ｂ及び図３ｃ）。胚幹細胞で特異的に発現するＡＰに染色され、ＳＳＥＡ１、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２が発現することを確認することができた（図３ｄ）。胚幹細胞（ＥＳ）、マウス繊維芽細胞（ＭＥＦ）、逆分化幹細胞（ＢＯ−ｉＰＳ）からタンパク質を抽出し、ウェスタンブロット分析法によって胚幹細胞で発現する主要遺伝子であるＯｃｔ４とＳｏｘ２の発現を確認し、ＦＡＣＳ分析法によってＳＳＥＡ１とＯｃｔ４の発現を確認することができた（図３ｅ及び図３ｆ）。このように、逆分化誘導された細胞で外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）のＯｃｔ４は発現しないことを確認することができ、ゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）上ではＯｃｔ４遺伝子が融合（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）していることをゲノムＤＮＡ ＰＣＲ（Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ＰＣＲ）方法で確認することができた。

〔実施例５．逆分化幹細胞の主要遺伝子のプローモーターのメチル化状態を胚幹細胞と比較分析〕
逆分化幹細胞、胚幹細胞、マウス繊維芽細胞において胚幹細胞の自己再生能力の維持に重要な遺伝子のプローモーター部位を分析するために亜硫酸水素塩シークエンシング法(bisulfite sequencing)を導入して、Ｏｃｔ４とＮａｎｏｇのプローモーター部位のメチル化の有無を分析した。その結果、マウス繊維芽細胞の場合、プローモーター部位が大部分メチル化していたが、逆分化幹細胞の場合、胚幹細胞のようにプローモーター部位が脱メチル化したことを確認することができた。この結果は、同質的（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）クローンの場合でも同一結果を示している（図４ａ）。クロマチン免疫沈降法によって、胚幹細胞と逆分化幹細胞の場合、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ遺伝子のヒストンＨ３がアセチル化していることを確認することができ、マウス繊維芽細胞ではＫ９位置が脱メチル化したことを確認することができた（図４ｂ）。

〔実施例６.ＤＮＡマイクロアレイ法によって胚幹細胞と逆分化幹細胞の遺伝子発現様相比較分析〕
胚幹細胞、マウス繊維芽細胞、逆分化幹細胞での遺伝子の発現様相をマイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）法によって比較分析した後、散布図(scatter plot)で表示した。その結果、逆分化に重要でありながらも胚幹細胞の自己再生能力の維持に重要な遺伝子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｃ−ｍｙｃ、Ｋｌｆ４）の発現が逆分化幹細胞と胚幹細胞で類似の様相で発現することを確認することができた。一方、マウス繊維芽細胞では発現程度が違うことを確認することができた。

また、逆分化幹細胞の場合、同質的（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）クローンでも胚幹細胞に似ている様相を示した。ピアソン相関関係(Pearson correlation)分析法によって胚幹細胞と逆分化幹細胞を比較した結果、０．９８程度の高い類似性を示していることを確認することができた（図５）。

〔実施例７．逆分化幹細胞の分化能力確認及びキメラ形成有無の確認〕
逆分化幹細胞もインビトロで分化能力があるかを確認するために、胚体を形成するかを確認した。この際、三胚葉にあたる遺伝子が発現するかをＲＴ−ＰＣＲ法で確認した結果、胚幹細胞と同一様相を示していることを確認することができた（図６ａ）。形成された胚体を自然発生的分化誘導した結果、三胚葉にあたる代表的な細胞に分化誘導されることをそれぞれの該当マーカーの染色によって確認することができた。免疫化学染色法によってＴｕｊ１、ｂｒｙ、ＳＭＡ、ＧＡＴＡ４の発現を確認して、三胚葉にあたる代表的な細胞に分化誘導されることを確認することができた。したがって、インビトロで分化能力を胚幹細胞と同様に持っていることを確認することができた（図６ｂ）。

インビボでも分化能力を持っているかを確認するために、テラトマ形成が可能であるかを実験した。１０^６の細胞を８０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、胚幹細胞培養液でペレット（ｐｅｌｌｅｔ）培養を２４時間行った後、６週齢Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕｄｅ ｍｏｕｓｅ）の腎臓にカプセル型で注入した。８−１０週後に腎臓を分離し、三胚葉に分化したかを、パラフィンブロック（ｐａｒｒａｆｉｎ ｂｌｏｃｋ）を作ってＨ＆Ｅ染色を行うことで確認した。その結果、三胚葉にあたる細胞に分化したことを確認することができ、この細胞をＣ５７／ＢＬ６の胚盤胞に注入し、代理母に移植した後、Ｆ１でキメラが形成されたことを確認することができた。代理母であるマウスとＣ５７／ＢＬ６のマウスを比較してみると、キメラが形成されたことを確認することができ（図６ｄ）、このような結果によって逆分化幹細胞が胚幹細胞と類似の特性を持っていることが分かった。

〔実施例８．逆分化幹細胞の均質集団でも胚幹細胞と類似の特性を持つかを確認〕
均質集団(homogenous population)でも胚幹細胞と同一特性を示すかを確認するために、単一細胞クローン（ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅ）を作り、この細胞の特性を比較分析した。五つのクローンを作り、胚幹細胞での重要な遺伝子の発現を胚幹細胞と比較分析した結果、トータル（ｔｏｔａｌ）のように類似発現することをＲＴ−ＰＣＲ法によって確認することができた（図７ａ）。また、免疫化学染色法によってＳＳＥＡ１、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２の発現を確認することができた。この際、ＡＰ染色がポジティブになったことを確認することができた（図７ｂ）。また、クローン細胞もインビボでテラトマが形成されることをＨ＆Ｅ染色（Ｈ＆Ｅ ｓｔａｉｎ）によって確認することができた（図７ｃ）。

図８は現在までの研究結果に基づいて本発明を完成するために立てた仮説とこれを立証した結果に基づいて、本発明による新しい逆分化幹細胞製造方法に対する全体的な構成を図式化した結果を示す。Ｂｍｉ１遺伝子という新しい逆分化因子とＯｃｔ４遺伝子の導入によって体細胞を逆分化幹細胞に誘導し、これを取り替えることができる上位調節因子を用いることで、逆分化因子の数を減らすことができる可能性を提示しており、さらに遺伝子導入ない細胞株を確立するのに基盤となる技術を提供していると言える。

〔実施例９．Ｓｈｈまたはその類似体処理によるＢｍｉ１誘導及びＯｃｔ４遺伝子導入〕
実施例１で準備した繊維芽細胞にＳｈｈまたはその類似体オキシステロールとプルモルファミンを処理し、Ｂｍｉ１が誘導されるかを確認した。図９ａ、図１４ａ及び図２２ａはＢｍｉ１遺伝子の上位調節因子として知られたＳｈｈまたはその類似体を処理したとき、下位遺伝子が調節されることをＲＴ−ＰＣＲ法で確認した結果を示している。Ｓｈｈを５００ｎｇ／ｍｌ、ヒドロキシコレステロール（Ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、Ｓｉｇｍａ社製、２５−ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、Ｈ１０１５）を０．１μＭと０．５μＭ、かつプルモルファミン（ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ｃａｔ．Ｎｏ．５４０２２０）を０．５μＭと１μＭでそれぞれ神経幹細胞の培養条件（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｂ２７＋Ｎ２＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）＋２０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ＋２０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ）で処理したとき、Ｇｌｉ１とＢｍｉ１が誘導される。この際、Ｂｍｉ１のターゲット遺伝子であるｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}とｐ１９^Ａｒｆの発現がマウス繊維芽細胞に比べて減ることを確認することができた。

また、細胞の形状が凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）するにつれて神経球のような形態を示していることを確認することができた（図９ｂ、図１４ｂ及び図２２ｂ）。このように誘導された神経幹細胞のような細胞は、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｓｏｘ２が発現することを免疫化学染色法で確認することができ、ＳＳＥＡ１とＡＰ染色にもポジティブな結果を示していることを確認することができた（図９ｃ、図１４ｃ及び図２２ｃ）。このような結果によってＢｍｉ１を調節することができるＳｈｈ処理によってＢｍｉ１が導入された細胞と類似の特性を示していることを確認することができた。

前記Ｓｈｈまたはその類似体ヒドロキシコレステロールまたはプルモルファミンが処理された繊維芽細胞にＯｃｔ４遺伝子をレトロウイルスによって導入した。この際、ウイルス粒子（ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）をＰＴ６７パッケージング細胞株を用いて準備した。より具体的に、ｐＢａｂｅ ｎｅｏベクターにヒトのＯｃｔ４（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２７０１）遺伝子を挿入して製造したｐＢａｂｅ ｎｅｏ Ｏｃｔ４ベクターをＰＴ６７パッケージング細胞株（ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）にターボフェクト（Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社製）を用いて導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した後、ネオマイシン（ｎｅｏｍｙｃｉｎｅ、１０００μｇ／ｍｌ）（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で選別した。ＰＴ６７パッケージング細胞株は広範囲な哺乳類宿主細胞に感染可能な高力価ウイルスを生成する細胞である。

Ｏｃｔ４遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法で確認した後、このように作られた細胞株が８０％程度になったとき、上澄液を取り、０．４５μｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターでフィルタリング（ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）して細胞破片（ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）を除去した後、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ、６μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ社製）を添加して１６時間の間隔で分離したマウス繊維芽細胞に３回繰り返して感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）させた。

この際、Ｓｈｈまたはその類似体ヒドロキシコレステロールまたはプルモルファミン処理を１日間行った後、レトロウイルスシステムを用いてＯｃｔ４遺伝子を４８時間の間に１６時間の間隔で３回にかけて導入しながらＳｈｈ、ヒドロキシまたはプルモルファミン処理を続けた。Ｓｈｈ、ヒドロキシまたはプルモルファミンは総７２時間続けて処理し、Ｓｈｈ、ヒドロキシまたはプルモルファミンを処理する間に神経幹細胞の培養条件を維持した。その後、マウス胚幹細胞の培養条件に変えながら逆分化誘導を行った。図９ｄ、図１４ｄ及び図２２ｄはＳｈｈ、ヒドロキシまたはプルモルファミンを処理しながらＯｃｔ４遺伝子を導入し、胚幹細胞の培養条件で逆分化誘導する過程のプロトコールに対する模式図を示す。これにより、既存の遺伝子導入だけで逆分化誘導した条件と最近報告されたＯｃｔ４とＳｏｘ２にケミカル処理して逆分化を誘導した条件に基づいて修正プロトコールを確立した。このような条件で逆分化誘導したとき、１０〜１４日程度になるとコロニーのような形態が見え始めた。

〔実施例１０．Ｓｈｈまたはその類似体を処理しながらＯｃｔ４遺伝子導入による逆分化幹細胞株確立〕
実施例９での修正プロトコールによって、Ｓｈｈまたはその類似体ヒドロキシコレステロールまたはプルモルファミンを処理しながらレトロウイルスによってＯｃｔ４を導入した後、マウス胚幹細胞の培養条件に移して培養して逆分化幹細胞株を確立することができた。マウス胚幹細胞の培養条件は、支持細胞がある条件でハイグルコースＤＭＥＭに１５％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ウシ胎児血清）＋０．１ｍＭ 非必須アミノ酸（ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）＋０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）＋１０００ｕｎｉｔ／ｍｌ マウスＬＩＦ（ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ；白血病抑制因子）の培養液で培養しながら２〜３日に一回ずつ継代培養を行った。培養の後、１０〜１４日程度からコロニーのような形態の細胞が見え始め、続けて培養した結果、胚幹細胞と類似の形態のコロニーを得ることができた。このような方法によって確立された逆分化幹細胞株をそれぞれＳＯ−ｉＰＳ、ＯＯ−ｉＰＳ、及びＰＯ−ｉＰＳに名付けた。

ＳＯ−ｉＰＳを胚幹細胞と比較して特性を分析した。ＲＴ−ＰＣＲ法によって胚幹細胞において重要な遺伝子として知られた代表的な遺伝子の発現を比較分析した結果、胚幹細胞と類似の発現様相を示した（図１０ａ）。また、自己再生能力の維持に重要な何種の遺伝子を選別してｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法で定量化したとき、胚幹細胞と類似の様相を示し、マウス繊維芽細胞とは異なる結果を示していることを確認することができた（図１０ｂ）。細胞の形状は胚幹細胞と類似することを確認することができ、ＡＰ染色がポジティブになり、代表的なマーカーの発現を免疫化学染色法で確認したとき、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ１、Ｓｏｘ２の発現が胚幹細胞と類似することを確認することができた（図１０ｃ）。ウェスタンブロット分析法によってＯｃｔ４の発現が胚幹細胞のように発現することを確認することができ（図１０ｄ）、ＦＡＣＳ分析法によってＯｃｔ４とＳＳＥＡ１が胚幹細胞でのように非常に多く発現したことを確認することができた（図１０ｅ）。

ＯＯ−ｉＰＳを胚幹細胞と比較して特性を分析した。ＲＴ−ＰＣＲ法によって胚幹細胞において重要な遺伝子として知られた代表的な遺伝子の発現を比較分析した結果、胚幹細胞と類似の発現様相を示した（図１５ａ）。また、このような逆分化幹細胞の同質的（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）クローンでも同様な様相を示すことを確認することができた（図１５ａ）。ウェスタンブロット分析法によってＯｃｔ４、Ｓｏｘ２の発現を確認することができた（図１５ｂ）。ＦＡＣＳ分析法によってＳＳＥＡ１とＯｃｔ４が胚幹細胞と同等な程度の％で発現していることを確認することができた（図１５ｃ）。細胞の形状が胚幹細胞と類似することを確認することができ、ＡＰ染色がポジティブになった結果を示した。また、代表的なマーカーの発現を免疫化学染色法で確認したとき、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ１、Ｓｏｘ２の発現が胚幹細胞と類似することを確認することができた。これは、逆分化幹細胞のクローンでも同様な様相を示していることを確認することができた（図１５ｄ）。

ＰＯ−ｉＰＳを胚幹細胞と比較して特性を分析した。ＲＴ−ＰＣＲ法によって胚幹細胞において重要な遺伝子として知られた代表的な遺伝子の発現を比較分析した結果、胚幹細胞と類似の発現様相を示した（図２３ａ）。この際、外部から由来して（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）挿入されたＯｃｔ４遺伝子の発現は沈黙（ｓｉｌｅｎｃｅ）の結果を示した。また、ゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）上にＯｃｔ４遺伝子が融合（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）していることをゲノムＤＮＡ ＰＣＲ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ＰＣＲ）方法によって確認することができた（図２３ｂ）。このような細胞は、自己再生能力の維持に重要な遺伝子の発現がｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲで定量化したとき、胚幹細胞と類似の発現程度を示した（図２３ｃ）。ＦＡＣＳ分析法によってＳＳＥＡ１とＯｃｔ４が胚幹細胞と同等な程度の％で発現していることを確認することができた（図２３ｄ）。細胞の形状が胚幹細胞と類似することを確認することができ、ＡＰ染色がポジティブになった結果を示した。また、代表的なマーカーの発現を免疫化学染色法で確認したとき、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ１、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇの発現が胚幹細胞と類似することを確認することができた（図２３ｅ）。

〔実施例１１．ＳＯ−ｉＰＳ、ＯＯ−ｉＰＳ及びＰＯ−ｉＰＳの後成的特性研究〕
ＳＯ−ｉＰＳ、ＯＯ−ｉＰＳ、及びＰＯ−ｉＰＳと胚幹細胞を比較して、胚幹細胞の自己再生能力の維持に重要であると知られたＯｃｔ４とＮａｎｏｇのプローモーター部位のメチル化有無を亜硫酸水素塩シークエンシング法で比較分析した。Ｏｃｔ４とＮａｎｏｇのプローモーター部位が脱メチル化したことを確認することができた（図１１ａ、図１６ａ及び図２４ａ）。また、クロマチン免疫沈降法（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ、ＣｈＩＰ）を用いて、胚幹細胞と逆分化幹細胞のＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ遺伝子のプローモーターのヒストン３番がアセチル化して遺伝子発現が活性化した結果を確認することができた（図１１ｂ、図１６ｂ及び図２４ｂ）。一方、マウス繊維芽細胞はリシン９(lysine 9)に脱メチル化したことを確認することができた（図１１ｂ、図１６ｂ及び図２４ｂ）。これは、ＣｈＩＰ分析（ＣｈＩＰ ａｓｓａｙ）の後にあたるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ遺伝子のプローモーター部位のプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を用いてｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法で比較分析した結果である。

〔実施例１２．全体遺伝子発現(global gene expression)を胚幹細胞と比較分析〕
ＳＯ−ｉＰＳ、ＯＯ−ｉＰＳ及びＰＯ−ｉＰＳをＤＮＡマイクロアレイ分析法によって胚幹細胞と比較分析した。散布図でこれを表示した結果、大部分の遺伝子の発現が２倍内に含まれており、特に逆分化誘導の主要因子でありながら胚幹細胞に重要な遺伝子として知られたＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｃ−ｍｙｃ、Ｋｌｆ４が胚幹細胞とほぼ同等な程度で発現していることを確認することができた（図１２、図１７及び図２５）。

また、ＳＯ−ｉＰＳはピアソン相関関係法(Pearson correlation)によって類似程度を数値化した結果、０．９８程度の高い類似性を示していることを確認することができた（図１２）。

一方、ＯＯ−ｉＰＳのクローン細胞でも同等な結果を示していることを確認することができた。また、ピアソン相関関係法によって類似程度を数値化した結果、０．９８程度の高い類似性を示していることを確認することができ、クローンの一つを胚幹細胞と比較したときにも０．９５程度の高い類似性を見せていることを確認することができた（図１７）。

これは、プルモルファミンの濃度を異にして処理して誘導したＰＯ−ｉＰＳ細胞においても同等な結果を示していることを確認することができた。また、ピアソン相関関係法によって類似程度を数値化した結果、０．９７と０．９５程度の高い類似性を示していることを確認することができた（図２５）。

〔実施例１３．インビトロとインビボでの三胚葉性細胞への分化能力比較分析〕
ＳＯ−ｉＰＳ逆分化幹細胞がインビトロで分化能力があるかを確認するために、まず胚幹細胞のように胚体(embryonic body, EB)を形成することを確認した（図１３ａ、図１８ａ及び図２６ａ）。そして、ＥＢ形成後７日目になったとき、三胚葉にあたる遺伝子が発現するかをＲＴ−ＰＣＲ法で確認した結果、胚幹細胞と同一様相を示していることを確認することができた（図１３ａ及び図２６ａの右側パネル）。形成された胚体を０．１％ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）がコーティング（ｃｏａｔｉｎｇ）された組職培養プレート（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ）で自然発生的分化誘導をした結果、三胚葉にあたる代表的な細胞への分化誘導となることをそれぞれの該当マーカーの染色によって確認することができた。免疫化学染色法によってＳＯ−ｉＰＳの場合、Ｔｕｊ１、ｂｒｙ、ＳＭＡ、ＣＫ１８の発現を確認し、ＯＯ−ｉＰＳ場合、Ｎｅｓｔｉｎ、ＳＭＡ、ＣＫ１８の発現を確認し、ＰＯ−ｉＰＳ場合、Ｔｕｊ１、ＳＭＡの発現を確認し、三胚葉にあたる代表的な細胞への分化誘導となることを確認することができた（図１３ｂ、図１８ａ及び図２６ｂ）。

インビボでも分化能力を持っているかを確認するために、１０^６の細胞を８０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、胚幹細胞培養液でペレット（ｐｅｌｌｅｔ）培養を３７℃インキュベーターで２４時間行った後、６週齢Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕｄｅ ｍｏｕｓｅ）の腎臓にカプセル型で注入した。８〜１０週後に腎臓を分離し、三胚葉に分化したかを、パラフィンブロック（ｐａｒｒａｆｉｎ ｂｌｏｃｋ）を作りＨ＆Ｅ染色を行うことで確認した。その結果、三胚葉にあたる細胞で分化したことを確認して、インビボでのテラトマ形成を確認することができた（図１３ｃ、図１８ｂ及び図２６ｃ）。ＰＯ−ｉＰＳの場合、Ｃ５７／ＢＬ６の胚盤胞(blastocyst)に注入し、代理母に移植した後、Ｆ１でキメラ形成されたことを確認することができた。代理母であるマウスとＣ５７／ＢＬ６のマウスを比較してみるとき、キメラ形成されたことを確認することができ（図２６ｄ）、このような結果によって逆分化幹細胞が胚幹細胞と類似の特性を持っていることが分かった。

〔実施例１４．成体マウス繊維芽細胞から分離された細胞にオキシステロールを処理しながらＯｃｔ４遺伝子を導入して逆分化幹細胞株確立（ＯＯ−ｉＰＳ−ＴＴＦ #１，２）〕
マウス繊維芽細胞で確認した逆分化誘導方法を成体マウス繊維芽細胞(adult mouse fibroblast)に適用した。このように逆分化誘導したとき、胚幹細胞に似ている形態の細胞が形成されることを確認することができた（図１９ａ）。これをＯＯ−ｉＰＳ−ＴＴＦ #１，２に名付け、１番と２番はオキシステロール処理濃度をそれぞれ０．１μＭと０．５μＭに異にしたことを意味する。ＯＯ−ｉＰＳ−ＴＴＦ #１，２はＡＰ染色がポジティブになることを確認することができ、免疫化学染色法によってＳＳＥＡ１、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇの発現を確認することができた（図１９ａ）。また、胚幹細胞の主要遺伝子として知られた遺伝子の発現程度をｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法で定量化して比較分析したところ、胚幹細胞と同等な程度の発現様相を示していることを確認することができた（図１９ｂ）。

〔実施例１５．ＯＯ−ｉＰＳ−ＴＴＦ #１，２の後成的特性研究〕
ＯＯ−ｉＰＳ−ＴＴＦ #１，２を胚幹細胞と比較したとき、胚幹細胞の自己再生能力維持に重要であると知られたＯｃｔ４とＮａｎｏｇのプローモーター部位のメチル化有無を亜硫酸水素塩シークエンシング法で比較分析した。Ｏｃｔ４とＮａｎｏｇのプローモーター部位が脱メチル化したことを確認することができた（図２０ａ）。また、クロマチン免疫沈降法でヒストンＨ３にアセチル化していることから、遺伝子発現が活性化していることを確認することができた（図２０ｂ）。

〔実施例１６．ＯＯ−ｉＰＳ−ＴＴＦ #１，２細胞のインビトロとインビボでの三胚葉性細胞への分化能力比較分析〕
ＯＯ−ｉＰＳ−ＴＴＦ #１，２逆分化幹細胞がインビトロで分化能力があるかを確認するために、まず胚体を形成するかを確認した。形成された胚体を０．１％ゼラチンがコーティング（ｃｏａｔｉｎｇ）された組職培養プレート（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ）で自然発生的分化誘導した結果、三胚葉にあたる代表的な細胞への分化誘導となるかをそれぞれの該当マーカーの染色によって確認した。その結果、ＯＯ−ｉＰＳ−ＴＴＦ #１，２細胞がインビトロで胚体を形成し、免疫化学染色法によってＮｅｓｔｉｎ、ＳＭＡ、ＧＡＴＡ４の発現を確認して、三胚葉にあたる代表的な細胞への分化誘導となることを確認することができた（図２１ａ）。インビボでも分化能力を持っているかを確認するために、ＯＯ−ｉＰＳ実験と同様な方法で進み、８〜１０週後に腎臓を分離して、三胚葉に分化したかを、パラフィンブロック（ｐａｒｒａｆｉｎ ｂｌｏｃｋ）を作りＨ＆Ｅ染色することで確認した。その結果、三胚葉にあたる細胞に分化してインビボでテラトマが形成されることを確認することができた（図２１ｂ）。

以上で説明した本発明は前述した実施例及び図面によって限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内でいろいろの置換、変形及び変更が可能であるのは本発明が属する技術分野で通常の知識を持つ者に明らかであろう。

本発明は、逆分化因子であるＢｍｉ１、その上位調節子であるＳｈｈ、Ｓｈｈの類似体であるオキシステロールまたはプルモルファミンを逆分化誘導因子であるＯｃｔ４とともに導入して体細胞からリプログラミング過程によって胚幹細胞のような細胞を誘導する新規の組成物及びこれを用いた胚幹細胞類似細胞製造方法に適用可能である。

Claims (17)

1. ａ）Ｂｍｉ１（Ｂ ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ １）タンパク質またはＢｍｉ１タンパク質をコードする核酸分子；及び
   ｂ）Ｏｃｔ４タンパク質またはＯｃｔ４タンパク質をコードする核酸分子；
   を含むことを特徴とする、体細胞から胚幹細胞類似細胞への逆分化を誘導する組成物。
2. 前記組成物は、
   ａ）Ｂｍｉ１タンパク質をコードする核酸分子が挿入されたＢｍｉ１タンパク質発現ベクター；及び
   ｂ）Ｏｃｔ４タンパク質をコードする核酸分子が挿入されたＯｃｔ４タンパク質発現ベクターを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
3. 前記組成物は、
   ａ）Ｂｍｉ１タンパク質をコードする核酸分子が導入されてＢｍｉ１タンパク質を発現するウイルス；及び
   ｂ）Ｏｃｔ４タンパク質をコードする核酸分子が導入されてＯｃｔ４タンパク質を発現するウイルスを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
4. Ｂｍｉ１遺伝子及びＯｃｔ４遺伝子を体細胞に導入することを特徴とする、体細胞から胚幹細胞類似細胞を製造する方法。
5. （ｉ）繊維芽細胞を培地で培養する段階、（ｉｉ）前記培養した繊維芽細胞をＢｍｉ１遺伝子及びＯｃｔ４遺伝子を挿入したベクターを導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させたパッケージング細胞で感染させる段階、（ｉｉｉ）前記感染させた繊維芽細胞を胚幹細胞の培養条件で培養する段階を含むことを特徴とする、請求項４に記載の体細胞から胚幹細胞類似細胞を製造する方法。
6. 段階（ｉｉ）の前記Ｂｍｉ１遺伝子を挿入したベクターは、ｐＢａｂｅ ｐｕｒｏベクターにＢｍｉ１タンパク質をコードする核酸分子を挿入して製造し、前記Ｏｃｔ４遺伝子を挿入したベクターはｐＢａｂｅ ｎｅｏベクターにＯｃｔ４タンパク質をコードする核酸分子を挿入して製造することを特徴とする、請求項５に記載の体細胞から胚幹細胞類似細胞を製造する方法。
7. 段階（ｉｉ）の前記パッケージング細胞はＰＴ６７パッケージング細胞であることを特徴とする、請求項５に記載の体細胞から胚幹細胞類似細胞を製造する方法。
8. 請求項４〜７のいずれか１項の製造方法によって製造されることを特徴とする、胚幹細胞類似細胞。
9. 前記胚幹細胞類似細胞はアルカリ性ホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）及びＳＳＥＡ−１、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２に対する抗体に陽性反応を示すことを特徴とする、請求項８に記載の胚幹細胞類似細胞。
10. Ｂｍｉ１遺伝子を体細胞に導入し、神経幹細胞の培養条件で培養することを特徴とする、体細胞から神経幹細胞を製造する方法。
11. ａ）Ｓｈｈ（Ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）タンパク質、Ｓｈｈタンパク質をコードする核酸分子、オキシステロール、プルモルファミン（ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ）及びこの混合物から選択されるＢｍｉ１の上位調節子；及び
    ｂ）Ｏｃｔ４タンパク質またはＯｃｔ４タンパク質をコードする核酸分子；
    を含むことを特徴とする、体細胞から胚幹細胞類似細胞への逆分化を誘導する組成物。
12. 前記組成物は、
    ａ）Ｓｈｈタンパク質をコードする核酸分子が挿入されたＳｈｈタンパク質発現ベクター；及び
    ｂ）Ｏｃｔ４タンパク質をコードする核酸分子が挿入されたＯｃｔ４タンパク質発現ベクターを含むことを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記組成物は、
    ａ）Ｓｈｈタンパク質、オキシステロールまたはプルモルファミン；及び
    ｂ）Ｏｃｔ４タンパク質をコードする核酸分子が導入されてＯｃｔ４タンパク質を発現するウイルスを含むことを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
14. 体細胞にＳｈｈタンパク質、Ｓｈｈタンパク質をコードする核酸分子、オキシステロールまたはプルモルファミンを処理し、Ｏｃｔ４遺伝子を体細胞に導入する段階を含むことを特徴とする、体細胞から胚幹細胞類似細胞を製造する方法。
15. （ｉ）繊維芽細胞を培地で培養する段階、（ｉｉ）前記培養した繊維芽細胞にＳｈｈタンパク質、Ｓｈｈタンパク質をコードする核酸分子、オキシステロールまたはプルモルファミンを処理してＯｃｔ４遺伝子を挿入したベクターを導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させたパッケージング細胞で感染させる段階、（ｉｉｉ）前記感染させた繊維芽細胞を胚幹細胞の培養条件で培養する段階を含むことを特徴とする、請求項１４に記載の体細胞から胚幹細胞類似細胞を製造する方法。
16. 段階（ｉｉ）で、前記Ｓｈｈタンパク質、オキシステロールまたはプルモルファミンを神経幹細胞の培養条件で処理して神経幹細胞のような細胞に誘導をしながらＯｃｔ４遺伝子を繊維芽細胞に導入することを特徴とする、請求項１５に記載の体細胞から胚幹細胞類似細胞を製造する方法。
17. 請求項１４〜１６のいずれか１項の製造方法によって製造されることを特徴とする、胚幹細胞類似細胞。