JP2011130764A - 胚様体分化制御剤 - Google Patents

Abstract

【課題】胚様体の分化制御を図る手段を提供する。
【解決手段】糖鎖関連遺伝子の発現を制御する核酸を有効成分として含有する胚様体分化制御剤。
【選択図】なし

Description

本発明は、糖鎖関連遺伝子発現の制御による胚様体の分化制御に関する。

近年、幹細胞の研究は、発生・分化に関するメカニズム解明や再生医療などにおいて非常に重要な役割を担っている。

幹細胞は、その出現時期により胚性幹細胞、胎児性幹細胞、成体幹細胞に分類される。その中でも胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、胎盤を除くすべての細胞種に分化する能力を有するため、再生医療のための細胞ソースとして注目されており、ＥＳ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで種々の分化細胞に誘導する研究が盛んに行われている。

ＥＳ細胞から特定の細胞種に分化誘導させる場合、その中間段階において、初期胚に類似した構造を有する胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ：ＥＢ）と呼ばれる球形の細胞塊が形成される。目的細胞への分化効率や分化した細胞の機能発現は、胚様体に大きく影響を受けるものと考えられる。そのため、胚様体の分化状態を制御することは、ＥＳ細胞をベースとした再生医療等の実用化において重要な課題となっている。

一方、糖鎖は、細胞の生存に必須であるばかりでなく、がん、免疫、発生・分化や感染症などにおいて特に重要な役割を果たしていることが報告されている。発生分化の過程においては、その分化程度や状態に敏感に影響され、糖鎖を合成する糖転移酵素遺伝子の発現パターンが変化し、合成される糖鎖構造も変化することが知られている。

たとえば、糖転移酵素ＥＸＴ１が細胞の分化制御に関与することが報告されている（特許文献１）。

しかしながら、胚様体の分化に関与する種々の糖鎖又は糖鎖関連遺伝子については報告がなされておらず、かかる糖鎖又は糖鎖関連遺伝子を利用した胚様体分化制御の手段の開発が望まれていた。

特開２００７−３２５５４２号

本発明の課題は、胚様体の分化制御に関与する糖鎖関連遺伝子を同定し、それらを利用して分化制御を図る手段を提供することである。

本発明者らは、上記課題解決のために鋭意検討を行い、所定の糖鎖関連遺伝子の発現を制御することにより、胚様体の分化を制御できることを見いだし、本発明を完成させた。

本発明の要旨は以下の通りである。
〔１〕糖鎖関連遺伝子の発現を制御する核酸を有効成分として含有する胚様体分化制御剤。
〔２〕糖鎖関連遺伝子が、β４ＧａｌＮＡｃＴ３、ＭＧＡＴ５、ｇａｌｅｃｔｉｎ３、ｇａｌｅｃｔｉｎ７、ＧｌｃＣｅｒ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＳＴ３ＧａｌＶ、Ｃｏｒｅ１β３ＧａｌＴ１及びβ３ＧｌｃＮＡｃＴＶからなる群から選ばれる、〔１〕に記載の胚様体分化制御剤。
〔３〕β４ＧａｌＮＡｃＴ３の発現を抑制する核酸を有効成分として含有し、胚様体の未分化性を解除するために用いられる、〔２〕に記載の胚様体分化制御剤。
〔４〕胚様体の外胚葉への分化を抑制し、内胚葉への分化を促進するために用いられる、〔３〕に記載の胚様体分化制御剤。
〔５〕有効成分がｓｉＲＮＡ又は該ｓｉＲＮＡの発現ベクターである、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の胚様体分化制御剤。
〔６〕胚様体が哺乳類のＥＳ細胞に由来する、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の胚様体分化制御剤。
〔７〕幹細胞に対して糖鎖関連遺伝子の発現を制御する核酸を導入し、該幹細胞に由来する胚様体の分化を制御することを特徴とする胚様体分化制御方法。
〔８〕糖鎖関連遺伝子が、β４ＧａｌＮＡｃＴ３、ＭＧＡＴ５、ｇａｌｅｃｔｉｎ３、ｇａｌｅｃｔｉｎ７、ＧｌｃＣｅｒ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＳＴ３ＧａｌＶ、Ｃｏｒｅ１β３ＧａｌＴ１及びβ３ＧｌｃＮＡｃＴＶからなる群から選ばれる、〔７〕に記載の胚様体分化制御方法。
〔９〕幹細胞に対してβ４ＧａｌＮＡｃＴ３の発現を抑制する核酸を導入し、該幹細胞に由来する胚様体の未分化性を解除する、〔８〕に記載の胚様体分化制御方法。
〔１０〕外胚葉への分化を抑制し、内胚葉への分化を促進する、〔９〕に記載の胚様体分化制御方法。
〔１１〕糖鎖関連遺伝子の発現を制御する核酸がｓｉＲＮＡ又は該ｓｉＲＮＡの発現ベクターである、〔７〕〜〔１０〕のいずれかに記載の胚様体分化制御方法。
〔１２〕幹細胞が哺乳類のＥＳ細胞である、〔７〕〜〔１１〕のいずれかに記載の胚様体分化制御方法。
〔１３〕請求項７〜１２のいずれか１項に記載の胚様体分化制御方法で分化制御された細胞。

本発明により、非常に簡便に胚様体分化を制御・管理することができ、ＥＳ細胞をベースとする再生医療の実現に貢献することができる。

本発明分化制御剤を作用させた胚様体における各種胚葉マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示す図である。 本発明分化制御剤を作用させた胚様体における各種胚葉マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示す図である。 本発明分化制御剤を作用させた胚様体における各種胚葉マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示す図である。 本発明分化制御剤を作用させた胚様体における各種胚葉マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示す図である。 本発明分化制御剤を作用させた胚様体における各種胚葉マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示す図である。 本発明分化制御剤を作用させた胚様体における各種胚葉マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示す図である。 本発明分化制御剤を作用させた胚様体における各種胚葉マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示す図である。 本発明分化制御剤を作用させた胚様体における各種胚葉マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示す図である。 β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤにおけるＬａｃｄｉＮＡｃの量をＦＡＣＳ分析で調べた結果を示す図である。図９中、ａは陰性対照の結果を示し、ｂはβ４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤの結果を示す。 β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤにおけるＡＬＰ活性を調べた結果を示す図である。図１０中、ａは陰性対照の結果を示し、ｂはβ４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤの結果を示す。 β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤにおける未分化マーカーＯｃｔ３／４のｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＰＣＲにより調べた結果を示す図である。図１１中、ａは陰性対照の結果を示し、ｂはβ４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤの結果を示す。 β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤにおける未分化マーカーＮａｎｏｇのｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＰＣＲにより調べた結果を示す図である。図１２中、ａは陰性対照の結果を示し、ｂはβ４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤの結果を示す。 ＬＩＦ非存在下で培養して未分化性を解除したマウスＥＳ細胞において、ＬａｃｄｉＮＡｃの量を調べた結果を示す図である。ａはＬＩＦ存在下で培養した結果を示し、ｂはＬＩＦ非存在下で培養した結果を示す。 β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤの細胞増殖速度を調べた結果である。ａは陰性対照の結果を示し、ｂはβ４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤの結果を示す。 β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤにおけるリン酸化ＳＴＡＴ３の量をウェスタンブロットにより調べた結果を示す図である。ａは陰性対照の結果を示し、ｂはβ４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤの結果を示す。

以下、発明を実施するための形態により、本発明を詳説する。

本明細書において「胚様体」とは、ヒトやマウス等の哺乳類由来のＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞を、浮遊培養等の手法により分化させた際に形成される胚様の形態をした細胞塊のことを指す。

［本発明の分化制御剤］
本発明の分化制御剤は、所定の糖鎖関連遺伝子の発現を制御する核酸を有効成分として含有することを特徴とする。

当該糖鎖関連遺伝子としては、目的とする分化状態に応じて、Ｎ結合型糖鎖、ムチン型糖鎖、ガレクチン、糖脂質、ＬａｃＤｉＮＡｃ、ルイス糖鎖、ラクトサミン糖鎖等の合成に関与する遺伝子を任意に選択することができる。例えば、ＭＧＡＴ１、ＭＧＡＴ２、ＭＧＡＴ３、ＭＧＡＴ４Ａ、ＭＧＡＴ４Ｂ、ＭＧＡＴ４Ｃ、ＭＧＡＴ５、ＦＵＴ８、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ１、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ３、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ４、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ５、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ６、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ７、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ９、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ１０、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ１１、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ１２、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ１３、Ｃｏｒｅ１β３ＧａｌＴ１、Ｃｏｒｅ１β３ＧａｌＴ２、Ｃｏｒｅ２ＧｎＴ１、Ｃｏｒｅ２ＧｎＴ２、ｇａｌａｃｔｉｎ１、ｇａｌａｃｔｉｎ２、ｇａｌａｃｔｉｎ３、ｇａｌａｃｔｉｎ４、ｇａｌａｃｔｉｎ７、ｇａｌａｃｔｉｎ８、ｇａｌａｃｔｉｎ９、ｇａｌａｃｔｉｎ１２、ＧａｌＣｅｒＴ、ＧＭ２／ＧＤ２、β３ＧａｌＴ３、ＧｌｃＣｅｒＴ、β３ＧｎＴ５、β３ＧａｌＴ４、ＳＴ３Ｇａｌ５、β４ＧａｌＴ３、β４ＧａｌＴ４、β４ＧａＴ６、β３ＧａｌＴ１、ＦＵＴ４、ＦＵＴ７、ＦＵＴ９、β４ＧａｌＮＡｃＴ３、ｉＧｎＴ、β３ＧｎＴ２、β３ＧｎＴ３、β３ＧｎＴ４、β３ＧａｌＴ２、β３ＧａｌＴ５、β４ＧａｌＴ１、β４ＧａｌＴ２、β４ＧａｌＴ４、β４ＧａｌＴ５等、種々の遺伝子とすることができる。

かかる遺伝子の中でもＭＧＡＴ５は、その発現を抑制することにより、胚様体におけるすべての胚葉（原始内胚葉、遠位内胚葉、近位内胚葉、原始外胚葉、中胚葉、外胚葉）への分化を抑制することが可能である。したがって、ＭＧＡＴ５の発現を抑制する核酸は、例えば、胚様体の分化を抑制するための薬剤（未分化性を維持するための薬剤）の有効成分として用いることができる。

ｇａｌａｃｔｉｎ３は、その発現を抑制することにより、原始内胚葉及び中胚葉への分化を抑制すること、並びに外胚葉への分化を促進させることが可能である。したがって、ｇａｌａｃｔｉｎ３の発現を抑制する核酸は、例えば、胚様体の分化を促進するための薬剤（未分化性を解除するための薬剤）の有効成分として用いることができる。また、胚様体の外胚葉への分化を促進するための薬剤の有効成分としても好適に使用することができる。

ｇａｌａｃｔｉｎ７は、その発現を抑制することにより、原始内胚葉、遠位内胚葉、近位内胚葉及び中胚葉への分化を抑制すること、並びに外胚葉への分化を促進させることが可能であり、特に中胚葉への分化を強力に抑制する。したがって、ｇａｌａｃｔｉｎ７の発現を抑制する核酸は、例えば、胚様体の分化を促進するための薬剤の有効成分として使用することができる。また、胚様体の外胚葉への分化を促進するための薬剤や中胚葉への分化を抑制するための薬剤の有効成分としても好適に使用することができる。

β４ＧａｌＮＡｃＴ３は、その発現を抑制することにより、原始外胚葉、中胚葉及び外胚葉への分化を抑制すること、並びに原始内胚葉、遠位内胚葉、近位内胚葉（すなわち胚体外内胚葉）への分化を促進させることが可能であり、特に外胚葉への分化を強く抑制する。したがって、β４ＧａｌＮＡｃＴ３の発現を抑制する核酸は、例えば、胚様体の分化を促進するための薬剤として使用することができ、胚様体の内胚葉への分化を促進するための薬剤や外胚葉への分化を抑制するための薬剤の有効成分としても好適に使用することができる。

ＧｌｃＣｅｒ ｓｙｎｔｈａｓｅは、その発現を抑制することにより、遠位内胚葉、原始外胚葉、中胚葉及び外胚葉への分化を抑制すること、並びに原始内胚葉への分化を促進させることが可能であり、特に原始外胚葉、中胚葉及び外胚葉への分化を強く抑制する。したがって、ＧｌｃＣｅｒ ｓｙｎｔｈａｓｅの発現を抑制する核酸は、例えば、胚様体の分化を促進するための薬剤の有効成分として使用することができる。また、胚様体の原始内胚葉への分化を促進するための薬剤の有効成分としても好適に使用することができる。

ＳＴ３ＧａｌＶは、その発現を抑制することにより、原始外胚葉、中胚葉及び外胚葉への分化を抑制すること、並びに原始内胚葉、遠位内胚葉、近位内胚葉（すなわち胚体外内胚葉）への分化を促進させることが可能であり、特に外胚葉への分化を強力に抑制する。したがって、ＳＴ３ＧａｌＶの遺伝子発現を抑制する核酸は、例えば、胚様体の分化を促進するための薬剤の有効成分として使用することができる。また、胚様体の内胚葉への分化を促進するための薬剤や外胚葉への分化を抑制するための薬剤の有効成分としても好適に使用することができる。

Ｃｏｒｅ１β３ＧａｌＴ１は、その発現を抑制することにより、原始内胚葉、原始外胚葉及び中胚葉への分化を抑制すること、並びに遠位内胚葉、近位内胚葉への分化を促進させることが可能であり、特に中胚葉への分化を強力に抑制する。したがって、ＳＴ３ＧａｌＶの遺伝子発現を抑制する核酸は、例えば、胚様体の分化を促進するための薬剤の有効成分として使用することができる。また、胚様体の中胚葉への分化を抑制するための薬剤の有効成分としても好適に使用することができる。

β３ＧｌｃＮＡｃＴＶは、その発現を抑制することにより、外胚葉への分化を抑制すること、及び原始内胚葉への分化を促進させることが可能である。したがって、β３ＧｌｃＮＡｃＴＶの遺伝子発現を抑制する核酸は、例えば、胚様体の分化を促進するための薬剤として使用することができる。また、胚様体の原始内胚葉への分化を促進するための薬剤や外胚葉への分化を抑制するための薬剤としても好適に使用することができる。

本発明の分化制御剤の有効成分である核酸は、所定の糖鎖関連遺伝子の発現を制御する核酸であれば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、１本鎖、２本鎖であるかを問わず、いずれをも包含するものとする。また、ペプチド核酸（ＰＮＡ：ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）等の化学合成核酸アナログも本発明の核酸に含まれる。

「糖鎖関連遺伝子の発現を制御する核酸」としては、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、以下ＲＮＡｉと記す）の効果により糖鎖関連遺伝子発現を阻害する機能を有する核酸を用いることができる。ＲＮＡｉを利用した遺伝子発現の抑制は、効果が安定である、実験が容易である、費用が安価である等の利点を有する点で好ましい。

ＲＮＡｉに用いる核酸は、糖鎖関連遺伝子又は当該遺伝子の部分領域と完全な相同性を有することが好ましいが、必ずしも完全同一である必要はない。

上記ＲＮＡｉに用いる核酸としてｓｉＲＮＡ（短鎖二本鎖ＲＮＡ）を用いる場合、その設計にあたっては、糖鎖関連遺伝子の任意の領域を標的候補とすることができる。例えば、胚様体がマウスＥＳ細胞に由来するものであれば、ＭＧＡＴ５遺伝子の塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿１４５１２８）、ｇａｌａｃｔｉｎ３遺伝子の塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿０１０７０５）、ｇａｌａｃｔｉｎ７遺伝子の塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿００８４９６）、β４ＧａｌＮＡｃＴ３遺伝子の塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿１９８８８４）、ＧｌｃＣｅｒ ｓｙｎｔｈａｓｅ遺伝子の塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿０１１６７３）、ＳＴ３ＧａｌＶ遺伝子の塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿０１１３７５）、Ｃｏｒｅ１β３ＧａｌＴ１遺伝子の塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿０５２９９３）、β３ＧｌｃＮＡｃＴＶ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿０５４０５２）等をもとに作製することができる。

より具体的には、上述した配列の一部の領域を標的とし、該領域と同一の塩基配列を有するｓｉＲＮＡを作製することができ、例えば、ＭＧＡＴ５の遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号１）、ｇａｌａｃｔｉｎ３遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号２）、ｇａｌａｃｔｉｎ７遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号３）、β４ＧａｌＮＡｃＴ３遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号４）、ＧｌｃＣｅｒ ｓｙｎｔｈａｓｅ遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号５）、ＳＴ３ＧａｌＶ遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号６）、Ｃｏｒｅ１β３ＧａｌＴ１遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号７）、β３ＧｌｃＮＡｃＴＶ遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号８）等と同一の配列を有するｓｉＲＮＡを作製することができる。

また、上述した配列を標的にするｓｉＲＮＡにおいて、１又は数個の塩基の置換、欠失、挿入又は転位を有するものであっても、上述の糖鎖関連遺伝子の発現を抑制する機能を有するものであれば、本発明の核酸に含まれる。なお、上記「数個」とは、構成する塩基全数の好ましくは２０％未満（２１塩基からなる核酸であれば４塩基以下）、より好ましくは１０％未満（２１塩基からなる核酸であれば２塩基以下）の整数を表す。また、上記「１又は数個」とは、１〜１０個の整数、好ましくは１〜５個の整数を表わす。

さらに、これらのｓｉＲＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下においてハイブリダイズしうる核酸も、本発明の核酸に包含される。ここで、ハイブリダイゼーションは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載の方法により実施することができ、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む溶液中、プローブとともに６５℃で一晩保温するという条件などが挙げられる。また、「ストリンジェントな条件」として好ましくは、６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当する温度及び塩濃度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。

ここで、ｓｉＲＮＡには、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ：ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）のような、分子内において二本鎖ＲＮＡ構造を形成し得る分子も含む。

また、ｓｉＲＮＡは、必ずしも標的配列に対する一組の二本鎖ＲＮＡである必要はなく、標的配列を含んだ領域に対する複数組の二本鎖ＲＮＡの混合物であってもよい。例えば、標的となる糖鎖関連遺伝子のｍＲＮＡ全長又は全長に近い領域に対応する長鎖二本鎖ＲＮＡを予めＤＩＣＥＲ酵素で分解し、その分解産物を本発明の核酸として用いることができる。

さらに、「糖鎖関連遺伝子の発現を制御する核酸」は、上述したＲＮＡを発現し得る発現ベクターであっても良い。かかる発現ベクターとしては、例えば、二本鎖ＲＮＡの一方の鎖をコードするＤＮＡ及び他方の鎖をコードするＤＮＡがそれぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するＤＮＡが挙げられる。かかる発現ベクターは、当業者であれば、一般的な遺伝子工学技術により適宜作製することができる。発現ベクターとして、ｐＢＡｓｉやｐｉＧＥＮＥといったＮａｋｅｄプラスミドベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター等を好適に用いることができる。

「糖鎖関連遺伝子の発現を制御する核酸」は、上述したものの他に、糖鎖関連遺伝子の転写産物又はその一部に対するアンチセンス核酸や、当該遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸等が挙げられる。

アンチセンス核酸の配列は、当該遺伝子又はその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全同一でなくても良い。

本発明の分化制御剤の有効成分となる核酸の合成は、当業者であれば本明細書中に開示されている情報に基づき適宜既存技術を用いて行うことができる。

なお「糖鎖関連遺伝子の発現を制御する核酸」としては、上述した核酸の他に、当該糖鎖関連遺伝子の発現を促進させる機能を有する核酸や、当該糖鎖関連遺伝子を過剰発現し得る核酸を用いることができる。これらの核酸を用いることにより、当該糖鎖関連遺伝子発現抑制時の効果とは逆の効果を得ることが可能である。すなわち、遺伝子発現抑制時に分化促進効果を有するものは分化抑制効果を、同じく分化抑制効果を有するものは分化促進効果を得ることが可能である。

本発明の分化制御剤は、該分化制御剤の有効成分である核酸がＥＳ細胞やｉＰＳ細胞に導入されることで、該ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞に由来する胚葉体中において、特定の遺伝子発現を直接又は間接的に制御することができる。本発明の分化制御剤の有効成分である核酸をＥＳ細胞やｉＰＳ細胞に導入する方法は通常の方法で行うことができる。本発明の分化制御剤は、単独で又は複数組み合わせて使用することにより、目的の分化状態にある細胞（細胞塊）を形成することが可能である。

本発明の分化制御剤は、有効成分である核酸の他、該核酸の安定化剤、緩衝液、防腐剤、塩等の他の成分を含有してもよい。また、本発明の分化制御剤は、レトロウイルスやアデノウイルス等の細胞感染能を有するウイルスの形態であってもよい。

［本発明の分化制御方法］
本発明の胚様体分化制御方法は、対象となる細胞に対して、糖鎖関連遺伝子の発現を制御する核酸を導入し、当該胚様体の分化を制御することを特徴とする。

対象となる細胞とは、未分化な細胞又は脱分化した細胞であり、例えば、哺乳類の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等が挙げられる。

本発明の胚様体分化制御方法に用いる「糖鎖関連遺伝子の発現を制御する核酸」は、上記の胚様体分化制御剤において説明した糖鎖関連遺伝子の発現を制御する核酸と同義である。

対象となる細胞に糖鎖関連遺伝子の発現を制御する核酸を導入するための方法は、通常の方法を採用することができる。
糖鎖関連遺伝子の発現を制御する核酸としてＲＮＡｉ効果による阻害作用を有する核酸を用いる場合には、例えば、合成ｓｉＲＮＡをＥＳ細胞等の細胞内に導入したり、ｓｉＲＮＡを発現しうる発現ベクターをＥＳ細胞等の細胞内に導入して細胞内でｓｉＲＮＡを形成させたりすることで、胚様体の分化を制御することができる。

糖鎖関連遺伝子の発現を制御する核酸の発現ベクターへの挿入に際しては、核酸の機能を損なわない限りにおいて、制限酵素断片の連結や核酸の末端領域の一部切断を行ってもよい。また、かかる発現ベクターは、本発明の分化制御方法を適用する対象細胞で用いることのできるベクターであれば特に限定はされない。例えば、ｐＢＡｓｉやｐｉＧＥＮＥといったＮａｋｅｄプラスミドベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター等から、当業者であれば目的に合わせて適宜選択して使用することが容易である。

［本発明の細胞］
本発明の細胞は、上記本発明の分化制御方法により分化が制御された細胞である。該細胞には、分化開始前の細胞、分化過程の細胞、分化した細胞のいずれもが含まれる。本発明の細胞には、本発明の分化制御方法によって胚様体から分化した組織や器官に含まれる細胞をも含む。

以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の記述に限定されるものではない。

各種標的配列（配列番号１〜８）及びそれと相補的な配列を含むｓｈＲＮＡ発現レトロウイルスベクターｐＳＵＰＥＲ．ｒｅｔｒｏ．ｐｕｒｏ（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ社製）並びに、陰性対照としてＥＧＦＰ配列及びそれと相補的な配列を含む同ベクターをパッケージング細胞であるＰＬＡＴ−Ｅ細胞にトランスフェクションし、レトロウイルスを産生させた。

産生させたレトロウイルスをマウスＥＳ細胞であるＲ１セルライン（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１９９３）８４２４−８４２８に記載、自然科学研究機構 生理学研究所 分子神経生理研究部門 より供与）に感染させた後、５日から７日間ピューロマイシン存在下でセレクションを続け、各種ｓｈＲＮＡ安定発現細胞を得た。

得られたｓｈＲＮＡ安定発現細胞をｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）非存在下、非接着性シャーレであるローセルバインディング６ｃｍディッシュ（Ｎｕｎｃ）にて４日から１２日間培養し、経時的に回収した。

回収した胚様体からｃＤＮＡを作成し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍを用いて常法に従ってリアルタイムＰＣＲを行い、各種胚葉マーカー遺伝子の発現量を測定した。使用したプライマー及びプローブを下記表１に示す。なお、上記の各種ｓｈＲＮＡ安定発現細胞において、ｓｈＲＮＡの標的遺伝子のｍＲＮＡ量が、陰性対照のレトロウイルス感染細胞に比べて半分以下に減少していることをＲＴ−ＰＣＲにより確認した。

結果を図１〜図８に示す。グラフの縦軸は、胚様体における各種胚葉マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現量をβアクチンのｍＲＮＡ発現量で補正し、培養０日目における陰性対象のｍＲＮＡを１とした場合の相対値を示す。

ＭＧＡＴ５遺伝子配列の一部（配列番号１）を標的配列としたＲＮＡｉを行った胚様体においては、中胚葉マーカーＴ及びＧｏｏｓｅｃｏｉｄのｍＲＮＡ発現量が、培養４日目に、陰性対象と比較して約１／２に減少していた。また、その他の胚葉マーカー（原始内胚葉、遠位内胚葉、近位内胚葉、原始外胚葉、外胚葉マーカー）においてもｍＲＮＡ発現の減少が確認された。

ｇａｌｅｃｔｉｎ３遺伝子配列の一部（配列番号２）を標的配列としたＲＮＡｉを行った胚様体においては、原始内胚葉マーカーＧａｔａ６並びに中胚葉マーカーＴ及びＧｏｏｓｅｃｏｉｄのｍＲＮＡ発現が陰性対象と比較して減少していた。一方で、外胚葉マーカーＭａｓｈ１のｍＲＮＡ発現は、培養１２日目に、陰性対象と比較して約２倍に増加していた。

ｇａｌｅｃｔｉｎ７遺伝子配列の一部（配列番号３）を標的配列としたＲＮＡｉを行った胚様体においては、原始内胚葉マーカーＧａｔａ６、遠位内胚葉マーカーＬａｍｉｎｉｎＢ１、近位内胚葉マーカーＢｍｐ２及び中胚葉マーカーＴ及びＧｏｏｓｅｃｏｉｄのｍＲＮＡ発現が減少していた。特に中胚葉マーカーの発現減少は著しく、培養４日目に、陰性対象と比較してＴで約１／５、Ｇｏｏｓｅｃｏｉｄで約１／３に減少していた。一方で、外胚葉マーカーのｍＲＮＡ発現は、培養１２日目に、陰性対象と比較してＭａｓｈ１で約２倍、Ｐａｘ６で約１．３倍に増加していた。

β４ＧａｌＮＡｃＴ３遺伝子配列の一部（配列番号４）を標的配列としたＲＮＡｉを行った胚様体においては、原始内胚葉マーカーＧａｔａ６、遠位内胚葉マーカーＬａｍｉｎｉｎＢ１、近位内胚葉マーカーＢｍｐ２のｍＲＮＡ発現が陰性対象と比較して増加していた。一方で、原始外胚葉マーカーＦｇｆ５のｍＲＮＡ発現は、培養４日目に、陰性対象と比較して約２／３に減少していた。また、中胚葉マーカーのｍＲＮＡ発現も、培養４日目に、陰性対象と比較してＴ及びＧｏｏｓｅｃｏｉｄで約２／３に減少していた。さらに、外胚葉マーカーのｍＲＮＡは、培養１２日目に、陰性対象と比較してＭａｓｈ１で約２／３、Ｐａｘ６で約１／２に減少していた。

ＧｌｃＣｅｒ ｓｙｎｔｈａｓｅ遺伝子配列の一部（配列番号５）を標的配列としたＲＮＡｉを行った胚様体においては、原始内胚葉マーカーＧａｔａ６のｍＲＮＡ発現が増加したが、遠位内胚葉マーカーＬａｍｉｎｉｎＢ１のｍＲＮＡ発現が、培養４日目に、陰性対象と比較して約３／５に減少していた。また、中胚葉マーカーのｍＲＮＡ発現も、培養４日目に、陰性対象と比較してＴで約３／５、Ｇｏｏｓｅｃｏｉｄで約１／２に減少していた。さらに、外胚葉マーカーのｍＲＮＡは、培養１２日目に、陰性対象と比較してＭａｓｈ１で約２／３、Ｐａｘ６で約１／３に減少していた。

ＳＴ３ＧａｌＶ遺伝子配列の一部（配列番号６）を標的配列としたＲＮＡｉを行った胚様体においては、原始内胚葉マーカーＧａｔａ６、遠位内胚葉マーカーＬａｍｉｎｉｎＢ１、近位内胚葉マーカーＢｍｐ２のｍＲＮＡ発現が陰性対象と比較して増加していた。特にＢｍｐ２では、培養４日目に、陰性対象の約２．４倍と著しく増加していた。一方で、原始外胚葉マーカーＦｇｆ５のｍＲＮＡ発現は、培養４日目に、陰性対象と比較して約２／３に減少していた。また、中胚葉マーカーのｍＲＮＡ発現も、培養４日目に、陰性対象と比較してＴで約５／７、Ｇｏｏｓｅｃｏｉｄで約４／５に減少していた。さらに、外胚葉マーカーのｍＲＮＡは１２日目に、陰性対象と比較してＭａｓｈ１で約２／３、Ｐａｘ６で約１／２と著しく減少していた。

Ｃｏｒｅ１β３ＧａｌＴ１遺伝子配列の一部（配列番号７）を標的配列としたＲＮＡｉを行った胚様体においては、中胚葉マーカーのｍＲＮＡ発現が、培養４日目に、陰性対象と比較してＴ及びＧｏｏｓｅｃｏｉｄで約１／５と著しく減少していた。また、原始内胚葉マーカーＧａｔａ６及び原始外胚葉マーカーＦｇｆ５においてもｍＲＮＡ発現の減少が確認された。一方で、遠位内胚葉マーカーＬａｍｉｎｉｎＢ１、近位内胚葉マーカーＢｍｐ２は、培養８日目に、ｍＲＮＡ発現の増加が確認された。

β３ＧｌｃＮＡｃＴＶ遺伝子配列の一部（配列番号８）を標的配列としたＲＮＡｉを行った胚様体においては、培養１２日目に、外胚葉マーカーの発現が、陰性対象と比較してＭａｓｈ１で４／５、Ｐａｘ６で１／２に減少していた。

続いて、β４ＧａｌＮＡｃＴ３遺伝子配列の一部（配列番号４）を標的配列としてＲＮＡｉを行ったマウスＥＳ細胞（以下、β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤと呼ぶ。）について、その分化の態様をさらに詳細に調べた。なお、以下で陰性対照として使用しているのは、特に断りのない限り、ＥＧＦＰ配列を標的配列としてＲＮＡｉを行ったマウスＥＳ細胞である。

［β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤに存在するＬａｃｄｉＮＡｃの解析］
β４ＧａｌＮＡｃＴ３は、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをドナー基質、ＧｌｃＮＡｃβ１−をアクセプター基質とし、β１−４結合によってＧａｌＮＡｃを転移し、ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造（ＬａｃｄｉＮＡｃ構造）を合成する酵素である。そこで、β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤにおけるＬａｃｄｉＮＡｃの量をＦＡＣＳ分析により調べた。
具体的には、β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤをＬＩＦ存在下、ゼラチンコートディッシュ（Ｎｕｎｃ）にて１日間培養後にピューロマイシン存在下で１日間培養した後、ＥＤＴＡで処理して細胞を回収し、この細胞懸濁液をＦＡＣＳ緩衝液（０．５質量％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．１質量％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ溶液）で希釈したＦＩＴＣ標識ＷＦＡレクチン（ＥＹ社製）溶液中でインキュベートした。洗浄後、ＦＡＣＳＡｒｉａ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ（ベクトンディッキンソン社製）を用いてＦＡＣＳ分析を行った。
結果を図９に示す。
図９に示すように、β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤにおいて、陰性対照よりもＬａｃｄｉＮＡｃ構造の存在量が減少（蛍光強度が減少）していることがわかった。

［β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤのＡＬＰ活性の解析］
未分化で自己複製能を有した状態のＥＳ細胞では、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）が高レベルで発現していることが知られている。そこで、β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤにおけるＡＬＰ活性を調べた。
具体的には、β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤをＬＩＦ存在下、ゼラチンコートディッシュ（Ｎｕｎｃ）にて２日間培養した。その後低密度にまきなおしてから５日後に、ＢＣＩＰ−ＮＢＴ溶液キット（ナカライテスク社製）を用いてＡＬＰ活性を発色性基質により発色させた。顕微鏡下でＡＬＰ陽性細胞数を数えることでＡＬＰ陽性細胞数を測定した。
結果を図１０に示す。
図１０に示すように、β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤにおいて陰性対照よりもＡＬＰ陽性細胞数が減少していた。この結果は、β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤは未分化性が維持できておらず、分化が促進されていることを示している。

［β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤにおける未分化マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現量の解析］
さらに、未分化マーカーであるＯｃｔ３／４とＮａｎｏｇのｍＲＮＡ量についてリアルタイムＰＣＲにより調べた。
具体的には、β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤをＬＩＦ存在下、ゼラチンコートディッシュ（Ｎｕｎｃ）にて４日間培養した後回収し、回収した細胞からｃＤＮＡを作成し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍを用いて常法に従ってリアルタイムＰＣＲを行った。使用したプライマー及びプローブを下記表２に示す。

Ｏｃｔ３／４の結果を図１１に、Ｎａｎｏｇの結果を図１２に示す。
図１１及び１２に示すように、いずれのマーカーについても、そのｍＲＮＡ量が陰性対照に比べて顕著に低下していた。この結果も、β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤは未分化性が維持できておらず、分化が促進されていることを支持する。

［ＬａｃｄｉＮＡｃと未分化性の関係］
マウスＥＳ細胞をＬＩＦ非存在下で培養すると、ＬＩＦ／ＳＴＡＴ３シグナルが働かなくなり、その結果未分化性が維持できなくなって分化が促進されることが知られている。上述したように、β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤではＬａｃｄｉＮＡｃの量が減少しており、未分化性も解除されている。実際にＬＩＦ非存在下で培養して未分化性を解除したマウスＥＳ細胞において、ＬａｃｄｉＮＡｃの量がどのように変化するかを上記と同様にＦＡＣＳ分析により調べた。
結果を図１３に示す。
図１３に示すように、ＬＩＦ非存在下で培養したＥＳ細胞では、ＬＩＦ存在下で培養した場合に比べて、ＬａｃｄｉＮＡｃの量が減少していることがわかった。この結果は、ＥＳ細胞の未分化性の維持にＬａｃｄｉＮＡｃが関与していることを示す。

［β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤの増殖速度の解析］
β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤをＬＩＦ存在下、ゼラチンコートディッシュ（Ｎｕｎｃ）にて培養したときの増殖速度をＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学社製）を用いて測定した。
結果を図１４に示す。
図１４に示すように、β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤでは、陰性対照に比べて増殖速度が顕著に低下していた。一般に分化が開始された細胞は、未分化細胞に比べて増殖が遅くなる傾向がある。したがってこの結果もβ４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤにおいて未分化性が解除され、分化が促進されていることを支持する。

［β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤにおけるＬＩＦ／ＳＴＡＴ３シグナルの解析］
ＬＩＦ／ＳＴＡＴ３シグナルは、マウスＥＳ細胞の未分化性を維持するために重要なシグナル経路であり、未分化状態ではＬＩＦ／ＳＴＡＴ３シグナルが活性化されていることが知られている。そこで、β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤにおけるＬＩＦ／ＳＴＡＴ３シグナルの状態をウェスタンブロットにより調べた。
具体的には、β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤをＬＩＦ存在下、ゼラチンコートディッシュ（Ｎｕｎｃ）にて１日間培養後、ピューロマイシンの存在下で１日間培養した。続いて細胞を血清及びＬＩＦの非存在下で４時間培養後、ＬＩＦを添加し、又は添加せずに２０分培養してから回収し、溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭＮ_３ＶＯ_４、１０ｍＭ ＮａＦ、プロテアーゼインヒビター（シグマ社製）を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４）で溶解した。この細胞溶解液を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社製）にトランスファーした。このメンブレンをブロッキング後、プライマリー抗体として抗リン酸化ＳＴＡＴ３抗体（マウスＩｇＧ、ベクトンディッキンソン社製）を、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）をそれぞれ反応させた。洗浄後、メンブレン上のペルオキシダーゼをＥＣＬ Ｐｌｕｓ試薬（ＧＥヘルスケア社製）を用いて発色させた。なお、プライマリー抗体として抗ＳＴＡＴ３抗体（マウスＩｇＧ、ベクトンディッキンソン社製）を用いて同様の実験を行った。リン酸化ＳＴＡＴ３（ｐ−ＳＴＡＴ３）の量は、プライマリー抗体として抗ＳＴＡＴ３抗体を用いたときのバンド強度に対する、プライマリー抗体として抗リン酸化ＳＴＡＴ３抗体を用いたときのバンド強度の割合として評価した。なお、バンド強度はＮＩＨｉｍａｇｅで測定した。
結果を図１５に示す。
図１５に示すように、ＬＩＦ存在下、β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤでは陰性対照に比べてＳＴＡＴ３のリン酸化が抑制されていることから、ＬＩＦ／ＳＴＡＴ３シグナルの働きが低下していることがわかる。この結果は、β４ＧａｌＮＡｃＴ３−ＫＤにおいて、ＬＩＦ／ＳＴＡＴ３シグナルを介した未分化性維持機構が抑制され、分化が促進されていることを示す。なお、図１５の結果から、ＬＩＦ非存在下では、ＳＴＡＴ３のリン酸化が検出できないことも確認できた。

本発明は、非常に簡便に胚様体分化を制御・管理することを可能とするため、医療・バイオテクノロジーに関わる広範な技術に使用できる。特に再生医療分野において、特定の分化状態にある胚様体を意図的に作製することができると共に、胚様体の品質管理に利用することができる。

Claims (13)

1. 糖鎖関連遺伝子の発現を制御する核酸を有効成分として含有する胚様体分化制御剤。
2. 糖鎖関連遺伝子が、β４ＧａｌＮＡｃＴ３、ＭＧＡＴ５、ｇａｌｅｃｔｉｎ３、ｇａｌｅｃｔｉｎ７、ＧｌｃＣｅｒ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＳＴ３ＧａｌＶ、Ｃｏｒｅ１β３ＧａｌＴ１及びβ３ＧｌｃＮＡｃＴＶからなる群から選ばれる、請求項１に記載の胚様体分化制御剤。
3. β４ＧａｌＮＡｃＴ３の発現を抑制する核酸を有効成分として含有し、胚様体の未分化性を解除するために用いられる、請求項２に記載の胚様体分化制御剤。
4. 胚様体の外胚葉への分化を抑制し、内胚葉への分化を促進するために用いられる、請求項３に記載の胚様体分化制御剤。
5. 有効成分がｓｉＲＮＡ又は該ｓｉＲＮＡの発現ベクターである、請求項１〜４に記載の胚様体分化制御剤。
6. 胚様体が哺乳類のＥＳ細胞に由来する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の胚様体分化制御剤。
7. 幹細胞に対して糖鎖関連遺伝子の発現を制御する核酸を導入し、該幹細胞に由来する胚様体の分化を制御することを特徴とする胚様体分化制御方法。
8. 糖鎖関連遺伝子が、β４ＧａｌＮＡｃＴ３、ＭＧＡＴ５、ｇａｌｅｃｔｉｎ３、ｇａｌｅｃｔｉｎ７、ＧｌｃＣｅｒ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＳＴ３ＧａｌＶ、Ｃｏｒｅ１β３ＧａｌＴ１及びβ３ＧｌｃＮＡｃＴＶからなる群から選ばれる、請求項７に記載の胚様体分化制御方法。
9. 幹細胞に対してβ４ＧａｌＮＡｃＴ３の発現を抑制する核酸を導入し、該幹細胞に由来する胚様体の未分化性を解除する、請求項８に記載の胚様体分化制御方法。
10. 外胚葉への分化を抑制し、内胚葉への分化を促進する、請求項９に記載の胚様体分化制御方法。
11. 糖鎖関連遺伝子の発現を制御する核酸がｓｉＲＮＡ又は該ｓｉＲＮＡの発現ベクターである、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の胚様体分化制御方法。
12. 幹細胞が哺乳類のＥＳ細胞である、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の胚様体分化制御方法。
13. 請求項７〜１２のいずれか１項に記載の胚様体分化制御方法で分化制御された細胞。

Images