JP2011074065A - 悪性腫瘍治療薬 - Google Patents
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Abstract
【課題】ステビオシド由来の悪性腫瘍治療薬として有用な新たな化合物を提供する。
【解決手段】一般式（１）
（式中、Ｒ1はトリフルオロメチルビニル基、フェニル基又はメチルフェニルビニル基を示す）
で表されるステビオール誘導体、及びこれを有効成分とする医薬。
【選択図】なし
【解決手段】一般式（１）
（式中、Ｒ1はトリフルオロメチルビニル基、フェニル基又はメチルフェニルビニル基を示す）
で表されるステビオール誘導体、及びこれを有効成分とする医薬。
【選択図】なし
Description
本発明は、ステビア由来のジテルペノイドの新規な化学修飾物及びこれを有効成分とする悪性腫瘍治療薬に関する。
植物は古来より医薬品資源として注目されており、これまでにも様々な医薬品あるいは医薬品素材が植物中に見出されている。植物由来の悪性腫瘍治療薬としては、イチイ科の植物からの抽出物であるパクリタキセル（タキソール）；クロタキカズラ科クサミズキ、タマミズキ科カンレンボクに含まれるアルカロイドであるカンプトテシン；及びキョウチクトウ科ニチニチソウに含まれるインドールアルカロイドであるビンクリスチン、ビンブラスチン等が知られている。
ステビオシドは、ステビア（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ Ｂｅｒｔｏｎｉ：キク科）の葉に豊富に存在するジテルペノイド配糖体であり、甘味料として広く知られており、また抗炎症作用及び発がん抑制作用を有することが知られている（非特許文献１）。また、本発明者らは、ステビオシドから製造したイソステビオールの微生物による構造修飾物の抗発がんプロモーター作用（非特許文献２）、ＤＮＡポリイソメラーゼ及びメポイソメラーゼ阻害活性（非特許文献３）について報告した。さらに、ステビオシドの加水分解生成物であるイソステビオール及びステビオールを化学修飾し、それらの腫瘍細胞傷害活性についても報告されている（非特許文献４〜６）。
Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２５，１４８８−１４９０（２００２）
Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，６７，４０７−４１０（２００４）
Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，７７，２１２７−２１４０（２００５）
Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２００４，５２，１１１７
Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００９，１９，１８１８
第５２回香料・テルペンおよび精油化学に関する討論会講演要旨集２ＰIII−４（平成２０年１０月）
しかしながら、これらステビオシド誘導体のがんに対する作用は十分でなく、さらに強力な抗悪性腫瘍活性を有する化合物の創出が望まれる。
従って、本発明の課題は、ステビオシド由来の悪性腫瘍治療薬として有用な新たな化合物を提供することにある。
従って、本発明の課題は、ステビオシド由来の悪性腫瘍治療薬として有用な新たな化合物を提供することにある。
そこで、本発明者は、ステビオシドの加水分解生成物であるステビオールの化学修飾を行い、５位のカルボキシル基の変換に着目した。まず、５位のカルボキシル基を還元して、５−ヒドロキシメチル体とし、当該ヒドロキシメチル基をトリフルオロメチルアクリロイル化、ベンゾイル化又はメチルシンナミル化した化合物を合成し、それらの腫瘍細胞傷害活性を検討したところ、これらの化合物が胃癌、肺癌及び乳癌細胞に対する強力な傷害活性を有すること、さらにはアポトーシス誘導作用も有することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、一般式（１）
（式中、Ｒ1はトリフルオロメチルビニル基、フェニル基又はメチルフェニルビニル基を示す）
で表されるステビオール誘導体を提供するものである。
で表されるステビオール誘導体を提供するものである。
また、本発明は、一般式（１）で表される化合物を有効成分とする医薬を提供するものである。
さらに、本発明は、一般式（１）で表される化合物を有効成分とするアポトーシス誘導薬を提供するものである。
さらに、本発明は、一般式（１）で表される化合物を有効成分とするアポトーシス誘導薬を提供するものである。
本発明によれば、胃癌、肺癌及び乳癌等の患者数が多く、死亡率も高い悪性腫瘍に対して有用な悪性腫瘍治療薬が提供できる。本発明化合物は、アポトーシス誘導作用により悪性腫瘍細胞傷害活性を示すと考えられる。
一般式（１）中、Ｒ1はトリフルオロメチルビニル基、フェニル基又はメチルフェニルビニル基を示す。ここでメチルフェニルビニル基には、２−メチルフェニルビニル基、３−メチルフェニルビニル基、４−メチルフェニルビニル基が挙げられる。
本発明化合物を列挙すれば、次のとおりである。
本発明化合物（１）は、例えばステビオール（Ａ）をメチルエステル化して得られるステビオールメチルエステル（Ｂ）を還元して得られる化合物（Ｃ）に、安息香酸、メチルケイヒ酸、トリフルオロメチルアクリル酸を用いてアシル化することにより製造することができる。
（式中、Ｒ1は前記と同じ）
ステビオール（Ａ）は、ステビアから抽出することにより得られるステビオシド（式（Ａ）のステビオースの１３−Ｏ−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→２）−β−Ｇｌｃ，１９−Ｄ−β−Ｄ−Ｇｌｃ配糖体）を加水分解することにより得ることができる（非特許文献４）。ステビオール（Ａ）のメチルエステル化反応は、ステビオール（Ａ）にジアゾメタン等のメチル化剤を反応させることにより行うことができる。
化合物（Ｂ）の還元は、例えば水素化アルミニウムリチウム（ＬｉＡｌＨ4）等の還元剤を用いて行われる。反応は、例えばジエチルエーテル、ジオキサン等のエーテル系溶媒等の存在下に、ＬｉＡｌＨ4を添加して、室温〜還流温度で０．５〜１０時間行えばよい。
化合物（Ｃ）とＲ1ＣＯＯＨとの反応は、ジ−２−ピリジルチオノカーボネート等の縮合剤及び４−ジメチルアミノピリジン等の有機塩基の存在下に室温から還流温度で０．５〜５０時間行えばよい。
得られた本発明化合物（１）は、洗浄、再結晶、各種クロマトグラフィー等の手段により精製することができる。
後記実施例から明らかなように、本発明化合物（１）は、胃癌細胞、肺癌細胞、乳癌細胞等に対して優れた細胞傷害活性を有する。また、その細胞傷害活性はアポトーシス誘導活性に基づくものである。従って、本発明化合物は、ヒトを含む哺乳動物の悪性腫瘍治療薬として有用である。
本発明の悪性腫瘍治療薬の対象となる悪性腫瘍としては、固形腫瘍が好ましい。固形腫瘍としては、肺癌、大腸癌、胃癌、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌などの上皮細胞癌；及び平滑筋肉腫、骨肉腫などの肉腫が挙げられるが、特に胃癌、肺癌、乳癌が好ましい。
本発明の悪性腫瘍治療薬の対象となる悪性腫瘍としては、固形腫瘍が好ましい。固形腫瘍としては、肺癌、大腸癌、胃癌、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌などの上皮細胞癌；及び平滑筋肉腫、骨肉腫などの肉腫が挙げられるが、特に胃癌、肺癌、乳癌が好ましい。
本発明の医薬は本発明化合物（１）に賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、被覆剤、乳化剤、懸濁化剤、溶剤、安定化剤、吸収助剤、軟膏基剤等の１以上の薬学的に許容される担体を適宜添加し、常法により経口投与用、注射投与用、直腸内投与用、外用などの剤形に製剤化することによって得られる。
経口投与用の製剤としては、顆粒、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁剤等が；注射投与用の製剤としては、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、点滴注射用の製剤などが；直腸内投与用の製剤としては、坐薬軟カプセル等が好ましい。
本発明の医薬は上記の如き製剤として、ヒトを含む哺乳動物に投与することができる。
本発明の医薬は、本発明化合物として、１日当り約１〜５００ｍｇ／ｋｇを１〜４回投与するのが好ましい。
経口投与用の製剤としては、顆粒、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁剤等が；注射投与用の製剤としては、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、点滴注射用の製剤などが；直腸内投与用の製剤としては、坐薬軟カプセル等が好ましい。
本発明の医薬は上記の如き製剤として、ヒトを含む哺乳動物に投与することができる。
本発明の医薬は、本発明化合物として、１日当り約１〜５００ｍｇ／ｋｇを１〜４回投与するのが好ましい。
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
参考例１
ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−ｅｎｅ−１３，１９−ｄｉｏｌ（エント−カウル−１６−エン−１３，１９−ジオール）（Ｃ）の調製
ステビオールメチルエステル（１９５ｍｇ）をジエチルエーテル（４３ｍＬ）に溶解し、水素化アルミニウムリチウム（４３０ｍｇ）を加え、５時間加熱還流を行った。水、希塩酸で処理後、ジエチルエーテルで抽出した。ジエチルエーテル層は、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄後、溶媒を除去した。反応生成物はシリカゲル薄層クロマトグラフィー（展開液：ヘキサン−酢酸エチル＝７：３）にて精製し，ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−ｅｎｅ−１３，１９−ｄｉｏｌ（９８ｍｇ）を得た。
ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−ｅｎｅ−１３，１９−ｄｉｏｌ（エント−カウル−１６−エン−１３，１９−ジオール）（Ｃ）の調製
ステビオールメチルエステル（１９５ｍｇ）をジエチルエーテル（４３ｍＬ）に溶解し、水素化アルミニウムリチウム（４３０ｍｇ）を加え、５時間加熱還流を行った。水、希塩酸で処理後、ジエチルエーテルで抽出した。ジエチルエーテル層は、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄後、溶媒を除去した。反応生成物はシリカゲル薄層クロマトグラフィー（展開液：ヘキサン−酢酸エチル＝７：３）にて精製し，ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−ｅｎｅ−１３，１９−ｄｉｏｌ（９８ｍｇ）を得た。
実施例１
ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−ｅｎｅ−１３，１９−ｄｉｏｌ １９−Ｏ−ｂｅｎｚｏａｔｅ（エント−カウル−１６−エン−１３，１９−ジオール １９−Ｏ−ベンゾエート；化合物（１ａ）の調製
ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−ｅｎｅ−１３，１９−ｄｉｏｌ（２０ｍｇ）をトルエン（０．４ｍＬ）に溶解し、安息香酸（３８ｍｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（４−ＤＭＡＰ；１６ｍｇ）、及びｄｉ−２−ｐｙｒｉｄｙｌ ｔｈｉｏｎｏｃａｒｂｏｎａｔｅ（ＤＰＴＣ；３０ｍｇ）を加え室温で２４時間攪拌した。水で希釈後、ジエチルエーテルで抽出した。ジエチルエーテル層は水洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、溶媒を除去した。反応生成物はシリカゲル薄層クロマトグラフィー（展開液：ヘキサン−酢酸エチル＝７：３）にて精製し、化合物（１ａ）（８．４ｍｇ）を得た。
ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−ｅｎｅ−１３，１９−ｄｉｏｌ １９−Ｏ−ｂｅｎｚｏａｔｅ（エント−カウル−１６−エン−１３，１９−ジオール １９−Ｏ−ベンゾエート；化合物（１ａ）の調製
ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−ｅｎｅ−１３，１９−ｄｉｏｌ（２０ｍｇ）をトルエン（０．４ｍＬ）に溶解し、安息香酸（３８ｍｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（４−ＤＭＡＰ；１６ｍｇ）、及びｄｉ−２−ｐｙｒｉｄｙｌ ｔｈｉｏｎｏｃａｒｂｏｎａｔｅ（ＤＰＴＣ；３０ｍｇ）を加え室温で２４時間攪拌した。水で希釈後、ジエチルエーテルで抽出した。ジエチルエーテル層は水洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、溶媒を除去した。反応生成物はシリカゲル薄層クロマトグラフィー（展開液：ヘキサン−酢酸エチル＝７：３）にて精製し、化合物（１ａ）（８．４ｍｇ）を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 1.08 (s; 3H), 1.09 (s; 3H), 4.12 (d, J = 11.0Hz; 1H), 4.49 (d, J = 11.0Hz; 1H), 4.82 (brs; 1H), 4.99 (brs; 1H), 7.45 (t, J = 7.8Hz; 2H), 7.56 (t, J = 7.4Hz; 1H), 8.04 (brd, J = 7.1Hz; 2H); HR-ESI-MS (positive ion mode) : m/z 431.2554 (C27H36O3Na計算値:431.2562).
実施例２
ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−ｅｎｅ−１３，１９−ｄｉｏｌ １９−Ｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｉｎｎａｍａｔｅ（エント−カウル−１６−エン−１３，１９−ジオール １９−Ｏ−４―メチルシンナメート；化合物（１ｂ）の調製
ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−ｅｎｅ−１３，１９−ｄｉｏｌ（３１ｍｇ）をトルエン（１．２ｍＬ）に溶解し、４−メチルケイ皮酸（３２ｍｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（４−ＤＭＡＰ；２１ｍｇ）、及びｄｉ−２−ｐｙｒｉｄｙｌ ｔｈｉｏｎｏｃａｒｂｏｎａｔｅ（ＤＰＴＣ；４５ｍｇ）を加え室温で２４時間攪拌した。水で希釈後、ジエチルエーテルで抽出した。ジエチルエーテル層は水洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、溶媒を除去した。反応生成物はシリカゲル薄層クロマトグラフィー（展開液：ヘキサン−酢酸エチル＝７：３）にて精製し、化合物（１ｂ）（１７ｍｇ）を得た。
ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−ｅｎｅ−１３，１９−ｄｉｏｌ １９−Ｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｉｎｎａｍａｔｅ（エント−カウル−１６−エン−１３，１９−ジオール １９−Ｏ−４―メチルシンナメート；化合物（１ｂ）の調製
ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−ｅｎｅ−１３，１９−ｄｉｏｌ（３１ｍｇ）をトルエン（１．２ｍＬ）に溶解し、４−メチルケイ皮酸（３２ｍｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（４−ＤＭＡＰ；２１ｍｇ）、及びｄｉ−２−ｐｙｒｉｄｙｌ ｔｈｉｏｎｏｃａｒｂｏｎａｔｅ（ＤＰＴＣ；４５ｍｇ）を加え室温で２４時間攪拌した。水で希釈後、ジエチルエーテルで抽出した。ジエチルエーテル層は水洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、溶媒を除去した。反応生成物はシリカゲル薄層クロマトグラフィー（展開液：ヘキサン−酢酸エチル＝７：３）にて精製し、化合物（１ｂ）（１７ｍｇ）を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 1.01 (s; 3H), 1.07 (s; 3H), 2.37 (s; 3H), 4.00 (d, J = 11.0Hz; 1H), 4.36 (d, J = 11.0Hz; 1H), 4.81 (brs; 1H), 4.98 (brs; 1H),6.38 (d, J = 16.0Hz; 1H), 7.18 (d, J = 8.2Hz; 2H), 7.42 (d, J = 8.2Hz; 2H), 7.63 (d, J = 16.0Hz; 1H); HR-ESI-MS (positive ion mode) : m/z 471.2881 (C30H40O3Na計算値:471.2875).
実施例３
ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−ｅｎｅ−１３，１９−ｄｉｏｌ １９−Ｏ−３−ｍｅｔｈｙｌｃｉｎｎａｍａｔｅ（エント−カウル−１６−エン−１３，１９−ジオール １９−Ｏ−３―メチルシンナメート；化合物（１ｃ）の調製
ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−ｅｎｅ−１３，１９−ｄｉｏｌ（４０ｍｇ）をトルエン（１．６ｍＬ）に溶解し、３−メチルケイ皮酸（４６ｍｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（４−ＤＭＡＰ；２８ｍｇ）、及びｄｉ−２−ｐｙｒｉｄｙｌ ｔｈｉｏｎｏｃａｒｂｏｎａｔｅ（ＤＰＴＣ；６３ｍｇ）を加え室温で２４時間攪拌した。水で希釈後、ジエチルエーテルで抽出した。ジエチルエーテル層は水洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、溶媒を除去した。反応生成物はシリカゲル薄層クロマトグラフィー（展開液：ヘキサン−酢酸エチル＝７：３）にて精製し、化合物（１ｃ）（３５ｍｇ）を得た。
ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−ｅｎｅ−１３，１９−ｄｉｏｌ １９−Ｏ−３−ｍｅｔｈｙｌｃｉｎｎａｍａｔｅ（エント−カウル−１６−エン−１３，１９−ジオール １９−Ｏ−３―メチルシンナメート；化合物（１ｃ）の調製
ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−ｅｎｅ−１３，１９−ｄｉｏｌ（４０ｍｇ）をトルエン（１．６ｍＬ）に溶解し、３−メチルケイ皮酸（４６ｍｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（４−ＤＭＡＰ；２８ｍｇ）、及びｄｉ−２−ｐｙｒｉｄｙｌ ｔｈｉｏｎｏｃａｒｂｏｎａｔｅ（ＤＰＴＣ；６３ｍｇ）を加え室温で２４時間攪拌した。水で希釈後、ジエチルエーテルで抽出した。ジエチルエーテル層は水洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、溶媒を除去した。反応生成物はシリカゲル薄層クロマトグラフィー（展開液：ヘキサン−酢酸エチル＝７：３）にて精製し、化合物（１ｃ）（３５ｍｇ）を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 1.01 (s; 3H), 1.07 (s; 3H), 2.37 (s; 3H), 4.01 (d, J = 11.0Hz; 1H), 4.36 (d, J = 11.0Hz; 1H), 4.82 (brs; 1H), 4.98 (brs; 1H),6.42 (d, J = 16.0Hz; 1H), 7.19 (d, J = 7.3Hz; 1H),7.27 (t, J = 7.8Hz; 1H), 7.33 (d, J = 6.9Hz; 1H), 7.34 (s; 1H), 7.63 (d, J = 16.0Hz; 1H); HR-ESI-MS (positive ion mode): m/z 471.2885 (C30H40O3Na計算値:471.2875).
実施例４
ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−ｅｎｅ−１３，１９−ｄｉｏｌ １９−Ｏ−２−ｍｅｔｈｙｌｃｉｎｎａｍａｔｅ（エント−カウル−１６−エン−１３，１９−ジオール １９−Ｏ−２―メチルシンナメート；化合物（１ｄ）の調製
ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−ｅｎｅ−１３，１９−ｄｉｏｌ（３０ｍｇ）をトルエン（１．２ｍＬ）に溶解し、２−メチルケイ皮酸（３５ｍｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（４−ＤＭＡＰ；２３ｍｇ）、及びｄｉ−２−ｐｙｒｉｄｙｌ ｔｈｉｏｎｏｃａｒｂｏｎａｔｅ（ＤＰＴＣ；４６ｍｇ）を加え室温で２４時間攪拌した。水で希釈後、ジエチルエーテルで抽出した。ジエチルエーテル層は水洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、溶媒を除去した。反応生成物はシリカゲル薄層クロマトグラフィー（展開液：ヘキサン−酢酸エチル＝７：３）にて精製し、化合物（１ｄ）（２８ｍｇ）を得た。
ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−ｅｎｅ−１３，１９−ｄｉｏｌ １９−Ｏ−２−ｍｅｔｈｙｌｃｉｎｎａｍａｔｅ（エント−カウル−１６−エン−１３，１９−ジオール １９−Ｏ−２―メチルシンナメート；化合物（１ｄ）の調製
ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−ｅｎｅ−１３，１９−ｄｉｏｌ（３０ｍｇ）をトルエン（１．２ｍＬ）に溶解し、２−メチルケイ皮酸（３５ｍｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（４−ＤＭＡＰ；２３ｍｇ）、及びｄｉ−２−ｐｙｒｉｄｙｌ ｔｈｉｏｎｏｃａｒｂｏｎａｔｅ（ＤＰＴＣ；４６ｍｇ）を加え室温で２４時間攪拌した。水で希釈後、ジエチルエーテルで抽出した。ジエチルエーテル層は水洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、溶媒を除去した。反応生成物はシリカゲル薄層クロマトグラフィー（展開液：ヘキサン−酢酸エチル＝７：３）にて精製し、化合物（１ｄ）（２８ｍｇ）を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 1.02 (s; 3H), 1.08 (s; 3H), 2.43 (s; 3H), 4.04 (d, J = 11.0Hz; 1H), 4.35 (d, J = 11.0Hz; 1H), 4.82 (brs; 1H), 4.98 (brs; 1H), 6.35 (d, J = 16.0Hz; 1H), 7.19 (d, J = 7.3Hz; 1H), 7.20 (t, J = 7.3Hz; 1H), 7.27 (dt, J = 1.4, 7.3Hz; 1H), 7.56 (d, J = 7.8Hz; 1H), 7.97 (d, J = 16.0Hz; 1H); HR-ESI-MS (positive ion mode) : m/z 471.2867 (C30H40O3Na計算値:471.2875).
実施例５
ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−ｅｎｅ−１３，１９−ｄｉｏｌ １９−Ｏ−β−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ ａｃｒｙｌａｔｅ（エント−カウル−１６−エン−１３，１９−ジオール １９−Ｏ−トリフルオロメチルアクリレート；化合物（１ｅ）の調製
ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−ｅｎｅ−１３，１９−ｄｉｏｌ（３０ｍｇ）をトルエン（１．２ｍＬ）に溶解し、β−トリフルオロメチルアクリル酸（４４ｍｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（４−ＤＭＡＰ；２３ｍｇ）、及びｄｉ−２−ｐｙｒｉｄｙｌ ｔｈｉｏｎｏｃａｒｂｏｎａｔｅ（ＤＰＴＣ；４６ｍｇ）を加え室温で２４時間攪拌した。水で希釈後、ジエチルエーテルで抽出した。ジエチルエーテル層は水洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、溶媒を除去した。反応生成物はシリカゲル薄層クロマトグラフィー（展開液：ヘキサン−酢酸エチル＝７：３）にて精製し、化合物（１ｅ）（１６ｍｇ）を得た。
ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−ｅｎｅ−１３，１９−ｄｉｏｌ １９−Ｏ−β−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ ａｃｒｙｌａｔｅ（エント−カウル−１６−エン−１３，１９−ジオール １９−Ｏ−トリフルオロメチルアクリレート；化合物（１ｅ）の調製
ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−ｅｎｅ−１３，１９−ｄｉｏｌ（３０ｍｇ）をトルエン（１．２ｍＬ）に溶解し、β−トリフルオロメチルアクリル酸（４４ｍｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（４−ＤＭＡＰ；２３ｍｇ）、及びｄｉ−２−ｐｙｒｉｄｙｌ ｔｈｉｏｎｏｃａｒｂｏｎａｔｅ（ＤＰＴＣ；４６ｍｇ）を加え室温で２４時間攪拌した。水で希釈後、ジエチルエーテルで抽出した。ジエチルエーテル層は水洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、溶媒を除去した。反応生成物はシリカゲル薄層クロマトグラフィー（展開液：ヘキサン−酢酸エチル＝７：３）にて精製し、化合物（１ｅ）（１６ｍｇ）を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 0.98 (s; 3H), 1.04 (s; 3H), 4.01 (d, J = 11.0Hz; 1H), 4.39 (d, J = 11.0Hz; 1H), 4.82 (brs; 1H), 4.98 (brs; 1H), 6.49 (dd, J = 2.1, 15.8Hz; 1H), 6.75 (dq, J = 6.6, 15.8Hz; 1H); HR-APCI-MS (positive ion mode): m/z 409.2346 (C24H32O3F3計算値:409.2354).
実施例６（腫瘍細胞傷害試験及びその傷害機構の解析）
１．細胞傷害活性試験
３種類の腫瘍細胞を用いて細胞傷害活性を評価した：ヒト乳癌由来細胞株ＳＫＢＲ３、ヒト肺癌由来細胞株Ａ５４９及びヒト胃癌由来細細胞株ＡＺ５２１を用いた。
各細胞を９６ｗｅｌｌマイクロプレートに播種し、２４時間培養した。本発明化合物を添加し、４８時間作用後、０．５％ＭＴＴ溶液を加え、３時間培養した。その後、０．０４Ｎ ＨＣｌ／ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌを加えＴｏｐ：５７０ｎｍ、Ｂｏｔｔｏｍ：６３０ｎｍにて吸光度を測定し、コントロールとの比較により細胞生存率を算出した。ＥＣ50はコントロールと比較して細胞を５０％死滅させる効果濃度のことであり、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｖｅｒ．４．０）を用いて求めた。
１．細胞傷害活性試験
３種類の腫瘍細胞を用いて細胞傷害活性を評価した：ヒト乳癌由来細胞株ＳＫＢＲ３、ヒト肺癌由来細胞株Ａ５４９及びヒト胃癌由来細細胞株ＡＺ５２１を用いた。
各細胞を９６ｗｅｌｌマイクロプレートに播種し、２４時間培養した。本発明化合物を添加し、４８時間作用後、０．５％ＭＴＴ溶液を加え、３時間培養した。その後、０．０４Ｎ ＨＣｌ／ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌを加えＴｏｐ：５７０ｎｍ、Ｂｏｔｔｏｍ：６３０ｎｍにて吸光度を測定し、コントロールとの比較により細胞生存率を算出した。ＥＣ50はコントロールと比較して細胞を５０％死滅させる効果濃度のことであり、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｖｅｒ．４．０）を用いて求めた。
細胞傷害活性試験に供したＳＫＢＲ３、Ａ５４９及びＡＺ５２１の細胞数は何れも３×１０3ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌである。
２．フローサイトメトリー（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）二重染色法）
本試験はＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ ｋｉｔ［Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ，ＢＭＳ３０６ＦＩ］を用いて行った。Ａ５４９を６ｗｅｌｌプレートに播種し（１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、２４時間培養した。本発明化合物（４０μＭ又は３０μＭ）を作用させた後、細胞を回収し、遠心分離（１０００×ｇ，５ｍｉｎ）を行った。遠心分離後、上清を除去し、Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ １９５μＬ及びＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ５μＬを加えピペッティングを行い、１５分間暗所で染色した。その後、遠心分離（１０００×ｇ，５ｍｉｎ）を行い、上清を除去し、Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ４９０μＬ及びＰＩ １０μＬを加えピペッティングし、フローサイトメーターにて解析を行った。
本試験はＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ ｋｉｔ［Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ，ＢＭＳ３０６ＦＩ］を用いて行った。Ａ５４９を６ｗｅｌｌプレートに播種し（１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、２４時間培養した。本発明化合物（４０μＭ又は３０μＭ）を作用させた後、細胞を回収し、遠心分離（１０００×ｇ，５ｍｉｎ）を行った。遠心分離後、上清を除去し、Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ １９５μＬ及びＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ５μＬを加えピペッティングを行い、１５分間暗所で染色した。その後、遠心分離（１０００×ｇ，５ｍｉｎ）を行い、上清を除去し、Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ４９０μＬ及びＰＩ １０μＬを加えピペッティングし、フローサイトメーターにて解析を行った。
３．結果
３−１．細胞傷害活性試験
本発明化合物の細胞傷害活性の結果を表１に示した。胃癌細胞（ＡＺ５２１）、肺癌細胞（Ａ５４９）及び乳癌細胞（ＳＫＢＲ３）に対して、参照化合物であるシスプラチンをはるかに上回る細胞傷害活性を示した。
３−１．細胞傷害活性試験
本発明化合物の細胞傷害活性の結果を表１に示した。胃癌細胞（ＡＺ５２１）、肺癌細胞（Ａ５４９）及び乳癌細胞（ＳＫＢＲ３）に対して、参照化合物であるシスプラチンをはるかに上回る細胞傷害活性を示した。
３−２．フローサイトメトリー（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）二重染色法）
本発明化合物の細胞傷害性がアポトーシスによることを確認するために本発明化合物２０μＭ〜４０μＭ（化合物（１ａ）は４０μＭ、化合物（１ｂ）〜（１ｄ）は３０μＭ、化合物（１ｅ）は２０μＭ）を作用させた肺癌細胞Ａ５４９についてＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＰＩ二重染色を行い、フローサイトメトリーを行った（図１〜５）。時間依存的にＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ 陽性／ＰＩ陰性細胞群の増加が確認され（８ｈｒ、２４ｈｒ）、本発明化合物がアポトーシスを誘導することを確認した。
本発明化合物の細胞傷害性がアポトーシスによることを確認するために本発明化合物２０μＭ〜４０μＭ（化合物（１ａ）は４０μＭ、化合物（１ｂ）〜（１ｄ）は３０μＭ、化合物（１ｅ）は２０μＭ）を作用させた肺癌細胞Ａ５４９についてＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＰＩ二重染色を行い、フローサイトメトリーを行った（図１〜５）。時間依存的にＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ 陽性／ＰＩ陰性細胞群の増加が確認され（８ｈｒ、２４ｈｒ）、本発明化合物がアポトーシスを誘導することを確認した。
３−３．Ｈｏｅｃｈｓｔ染色
２０μＭ〜３０μＭの化合物（１ａ）〜（１ｅ）を２４時間作用させた肺癌細胞Ａ５４９についてＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２染色を行った。その結果、図６及び７に示すように、化合物（１ａ）〜（１ｅ）のいずれの化合物処理によっても細胞核の凝集・断片化が観察されたことから、本発明化合物がアポトーシスを誘導することが判明した。
２０μＭ〜３０μＭの化合物（１ａ）〜（１ｅ）を２４時間作用させた肺癌細胞Ａ５４９についてＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２染色を行った。その結果、図６及び７に示すように、化合物（１ａ）〜（１ｅ）のいずれの化合物処理によっても細胞核の凝集・断片化が観察されたことから、本発明化合物がアポトーシスを誘導することが判明した。
また、化合物（１ｂ）を作用させたＡ５４９細胞におけるカスパーゼ遺伝子解析をしたところ、いずれのカスパーゼも活性化されていることから、本発明化合物によるアポトーシス誘導は、カスパーゼ３、８、９を介したシグナル伝達によるものと考えられた。
本発明化合物がヒト胃癌由来細胞株ＡＺ５２１、ヒト肺癌由来細胞株Ａ５４９及びヒト乳癌細胞株ＳＫＢＲ３に対して参照化合物のシスプラチンと比較してはるかに強い細胞傷害活性を有することが明らかになった。また、本発明化合物はＡ５４９細胞に対しアポトーシス誘導により細胞傷害活性を示すことが確認された。
Claims (5)
- 一般式（１）
で表されるステビオール誘導体。 - 請求項１記載の化合物を有効成分とする医薬。
- 悪性腫瘍治療薬である請求項２記載の医薬。
- 胃癌、肺癌又は乳癌の治療薬である請求項２又は３記載の医薬。
- 請求項１記載の化合物を有効成分とするアポトーシス誘導薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010179201A JP2011074065A (ja) | 2009-09-04 | 2010-08-10 | 悪性腫瘍治療薬 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009204884 | 2009-09-04 | ||
| JP2010179201A JP2011074065A (ja) | 2009-09-04 | 2010-08-10 | 悪性腫瘍治療薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2011074065A true JP2011074065A (ja) | 2011-04-14 |
Family
ID=44018418
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010179201A Pending JP2011074065A (ja) | 2009-09-04 | 2010-08-10 | 悪性腫瘍治療薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2011074065A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103087030A (zh) * | 2011-11-02 | 2013-05-08 | 中国药科大学 | 新颖exo-亚甲基内酯型四环二萜类化合物制备方法、生物活性及应用 |
-
2010
- 2010-08-10 JP JP2010179201A patent/JP2011074065A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103087030A (zh) * | 2011-11-02 | 2013-05-08 | 中国药科大学 | 新颖exo-亚甲基内酯型四环二萜类化合物制备方法、生物活性及应用 |
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