JP2011055827A5

JP2011055827A5 -

Info

Publication number: JP2011055827A5
Application number: JP2010144008A
Authority: JP
Filing date: 2010-06-24
Publication date: 2013-07-25
Anticipated expiration: 2030-06-24

Description

本発明の好ましい態様
本発明は好ましくは以下の態様を含む。
［態様１］
配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、
以下のグループ：
１）配列番号２の３６番目のセリン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；
２）配列番号２の８０番目のトリプトファン残基の親水性アミノ酸残基への置換；
３）配列番号２の１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；
４）配列番号２の４６番目のプロリン残基のスレオニン、セリン若しくはチロシン残基への置換、及び、７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；
５）配列番号２の４６番目のプロリン残基のスレオニン、セリン若しくはチロシン残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換：並びに
６）配列番号２の４６番目のプロリン残基のスレオニン、セリン若しくはチロシン残基への置換、７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
から選択される置換を有することを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様２］
１−ａ）配列番号２の３６番目のセリン残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２Ｓ３６Ａ）；
２−ａ）配列番号２の８０番目のトリプトファン残基がリジンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２Ｗ８０Ｋ）；
３−ａ）配列番号２の１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２Ｄ１１６Ａ）；
４−ａ）配列番号２の４６番目のプロリン残基がスレオニンに置換されており、そして、７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ）；
５−ａ）配列番号２の４６番目のプロリン残基がスレオニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２Ｐ４６Ｔ−Ｄ１１６Ａ）；並びに
６−ａ）配列番号２の４６番目のプロリン残基がスレオニンに置換されており、７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ―Ｄ１１６Ａ）
からなるグループから選択される、態様１に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様３］
以下の性質：
ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である；
ｉｉ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の四量体構造を維持している；
ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する；及び
ｉｖ）大腸菌の可溶性画分において高い発現を示す
の１ないし全部を満たす、態様１又は２に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様４］
配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、
６）配列番号２の７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換を有することを特徴とする改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様５］
６−ａ）配列番号２の７８番目のスレオニン残基がアラニン残基へ置換されている、態様４に記載の改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２Ｔ７８Ａ）。
［態様６］
以下の性質：
ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である；
ｉｉ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の四量体構造を維持している；
ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する；及び
ｖ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、高い耐熱性を有する
の１ないし全部を満たす、態様４又は５に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様７］
配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、
以下のグループ：
７）配列番号２の３６番目のセリン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；並びに
８）配列番号２の３６番目のセリン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
から選択される置換を有することを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様８］
７−ａ）配列番号２の３６番目のセリン残基がアラニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２Ｓ３６Ａ―Ｄ１１６Ａ）；並びに
８−ａ）配列番号２の３６番目のセリン残基がアラニンに置換されており、７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２Ｓ３６Ａ−Ｔ７８Ａ―Ｄ１１６Ａ）
からなるグループから選択される、態様７に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様９］
以下の性質：
ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である；
ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する；及び
ｖｉ）弱酸性条件下でビオチンと結合し、そして、中性条件下でビオチンと結合しない
の１ないし全部を満たす、態様７又は８に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様１０］
配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、
９）配列番号２の７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
を有することを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様１１］
９−ａ）配列番号２の７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、態様１０に記載の改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２Ｔ７８Ａ―Ｄ１１６Ａ）。
［態様１２］
以下の性質：
ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である；
ｉｉ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の四量体構造を維持している；
ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する；
ｉｖ）大腸菌の可溶性画分において高い発現を示す；及び
ｖｉｉ）イミノビオチンで精製できない
の１ないし全部を満たす、態様１０又は１１のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様１３］
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、低いビオチン結合性を示す、態様１ないし１２のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様１４］
以下のａ）−ｐ）
ａ）配列番号２の１４番目のアスパラギン残基は改変されていない、あるいはグルタミン又はアスパラギン酸に置換されている；
ｂ）配列番号２の１８番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
ｃ）配列番号２の３４番目のチロシン残基は改変されていない、あるいはセリン又はスレオニンに置換されている；
ｄ）配列番号２の３６番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
ｅ）配列番号２の４０番目のアスパラギン酸残基は改変されていない、あるいはアスパラギン以外の残基に置換されている；
ｆ）配列番号２の６９番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｇ）配列番号２の７６番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
ｈ）配列番号２の７８番目のスレオニン残基は改変されていない、あるいはセリン又はチロシンに置換されている；
ｉ）配列番号２の８０番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｊ）配列番号２の９６番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｋ）配列番号２の１０８番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｌ）配列番号２の１１６番目のアスパラギン酸残基は改変されていない、あるいはグルタミン酸又はアスパラギンに置換されている
ｍ）配列番号２の４６番目のプロリン残基は改変されていない；
ｎ）配列番号２の６６番目のアラニン残基は改変されていない；
ｏ）配列番号２の９７番目のロイシン残基は改変されていないか、イソロイシンに改変されている；及び
ｐ）配列番号２の１１３番目のバリン残基は改変されていない
の１ないし全ての条件を満たす、ただし、このうち、１）ないし９）で特定したアミノ酸残基は、１）ないし９）の各々で特定したように置換されている、
態様１ないし１３のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様１５］
配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１ないし１４のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様１６］
態様１ないし１５のいずれか１項に記載のタンパク質を固定化した担体。
［態様１７］
態様１ないし１５のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
［態様１８］
態様１７に記載の核酸を含むベクター。
［態様１９］
態様７の改変型ビオチン結合タンパク質を含む、生物学的試料中の物質を検出する系における非特異結合抑制剤。

本明細書において「プロテアーゼに対し耐性を有する」とは、プロテアーゼ処理によってタンパク質が酵素分解されない、又は実質的に分解されないことを意味する。プロテアーゼ処理は、例えば、３０℃で１５分間、プロテイナーゼＫによる処理を施す。「酵素分解されない」とは、野生型のＴＭ２と同様に、酵素処理後にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行っても当該タンパク質の四量体、二量体および／または単量体のバンドが明瞭に検出できることを意味する。すなわち、プロテアーゼに対し耐性を持たないタンパク質は、プロテアーゼ処理により小分子にまで分解されてしまい、プロテアーゼ処理後のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、四量体、二量体、および単量体のバンドは検出できないが、プロテアーゼに対し耐性を有するタンパク質の場合はプロテアーゼ処理によっても完全に分解されてしまうことなく、四量体構造を維持する。そしてＳＤＳ-ＰＡＧＥにおいて、四量体および／または四量体が解離した二量体や単量体のバンドとして検出される。

唯一、ストレプトアビジンの４９番目のＮ（アスパラギン）は、ＴＭ２においては４０番目のＤ（アスパラギン酸）になっており、例外であった。なお４０番目のアスパラギン酸に関しては、これをストレプトアビジンと同様にアスパラギンに改変したＴＭ２Ｄ４０ＮＴＭ２において、ビオチン結合能が高くなるという知見を本発明者らは得ている。よって４０番目のアスパラギン酸をアスパラギンに置換した改変体はビオチン結合能が強すぎるので、上記のＴＭ２Ｄ４０ＮＴＭ２を本発明に使用することは好ましくない。

一方、同じくＦＴにＴＭ２Ｓ３６Ａのバンドが見られないことから判るように、ＴＭ２Ｓ３６Ａは同様にビオチン−アガロースに効率よく吸着されるものの、過剰のビオチンを添加することで溶出され、ＥｌｕにＴＭ２Ｓ３６Ａのバンドが検出される。このビオチン結合の可逆性はＴＭ２に変異を組み込むことによって、ビオチンとのアフィニティが低下したことによりもたらされたものであると考えられた。他のＬＡＴＭ２、すなわち、ＴＭ２Ｗ１０８Ｋ、ＴＭ２Ｗ１０８Ｅ、ＴＭ２Ｔ７８Ａ（図１Ｂ）、ＴＭ２Ｄ１１６Ａ（図１Ｃ）、ＴＭ２Ｐ４６Ｔ−Ｄ１１６Ａ（図２Ａ）、ＴＭ２Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ（図２Ｂ）、ＴＭ２Ｔ７８Ａ−Ｄ１１６Ａ（図２Ｃ）、ＴＭ２Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ（図２Ｄ）についても、同様の実験結果が得られた。

Claims

配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、
以下のグループ：
１）配列番号２の３６番目のセリン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；
２）配列番号２の８０番目のトリプトファン残基の親水性アミノ酸残基への置換；
３）配列番号２の１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；
４）配列番号２の４６番目のプロリン残基のスレオニン、セリン若しくはチロシン残基への置換、及び、７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；
５）配列番号２の４６番目のプロリン残基のスレオニン、セリン若しくはチロシン残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換：並びに
６）配列番号２の４６番目のプロリン残基のスレオニン、セリン若しくはチロシン残基への置換、７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
から選択される置換を有することを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質。
１−ａ）配列番号２の３６番目のセリン残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２Ｓ３６Ａ）；
２−ａ）配列番号２の８０番目のトリプトファン残基がリジンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２Ｗ８０Ｋ）；
３−ａ）配列番号２の１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２Ｄ１１６Ａ）；
４−ａ）配列番号２の４６番目のプロリン残基がスレオニンに置換されており、そして、７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ）；
５−ａ）配列番号２の４６番目のプロリン残基がスレオニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２Ｐ４６Ｔ−Ｄ１１６Ａ）；並びに
６−ａ）配列番号２の４６番目のプロリン残基がスレオニンに置換されており、７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２Ｐ４６Ｔ−Ｔ７８Ａ―Ｄ１１６Ａ）
からなるグループから選択される、請求項１に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
以下の性質：
ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である；
ｉｉ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の四量体構造を維持している；
ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する；及び
ｉｖ）大腸菌の可溶性画分において高い発現を示す
の１ないし全部を満たす、請求項１又は２に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、
６）配列番号２の７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
を有することを特徴とする改変型ビオチン結合タンパク質。
６−ａ）配列番号２の７８番目のスレオニン残基がアラニン残基へ置換されている、請求項４に記載の改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２Ｔ７８Ａ）。
以下の性質：
ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である；
ｉｉ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の四量体構造を維持している；
ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する；及び
ｖ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、高い耐熱性を有する
の１ないし全部を満たす、請求項４又は５に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、
以下のグループ：
７）配列番号２の３６番目のセリン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；並びに
８）配列番号２の３６番目のセリン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
から選択される置換を有することを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質。
７−ａ）配列番号２の３６番目のセリン残基がアラニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２Ｓ３６Ａ―Ｄ１１６Ａ）；並びに
８−ａ）配列番号２の３６番目のセリン残基がアラニンに置換されており、７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２Ｓ３６Ａ−Ｔ７８Ａ―Ｄ１１６Ａ）
からなるグループから選択される、請求項７に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
以下の性質：
ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である；
ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する；及び
ｖｉ）弱酸性条件下でビオチンと結合し、そして、中性条件下でビオチンと結合しない
の１ないし全部を満たす、請求項７又は８に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、
９）配列番号２の７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
を有することを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質。
９−ａ）配列番号２の７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、請求項１０に記載の改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２Ｔ７８Ａ―Ｄ１１６Ａ）。
以下の性質：
ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である；
ｉｉ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の四量体構造を維持している；
ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する；
ｉｖ）大腸菌の可溶性画分において高い発現を示す；及び
ｖｉｉ）イミノビオチンで精製できない
の１ないし全部を満たす、請求項１０又は１１のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、低いビオチン結合性を示す、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
以下のａ）−ｐ）
ａ）配列番号２の１４番目のアスパラギン残基は改変されていない、あるいはグルタミン又はアスパラギン酸に置換されている；
ｂ）配列番号２の１８番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
ｃ）配列番号２の３４番目のチロシン残基は改変されていない、あるいはセリン又はスレオニンに置換されている；
ｄ）配列番号２の３６番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
ｅ）配列番号２の４０番目のアスパラギン酸残基は改変されていない、あるいはアスパラギン以外の残基に置換されている；
ｆ）配列番号２の６９番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｇ）配列番号２の７６番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
ｈ）配列番号２の７８番目のスレオニン残基は改変されていない、あるいはセリン又はチロシンに置換されている；
ｉ）配列番号２の８０番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｊ）配列番号２の９６番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｋ）配列番号２の１０８番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｌ）配列番号２の１１６番目のアスパラギン酸残基は改変されていない、あるいはグルタミン酸又はアスパラギンに置換されている
ｍ）配列番号２の４６番目のプロリン残基は改変されていない；
ｎ）配列番号２の６６番目のアラニン残基は改変されていない；
ｏ）配列番号２の９７番目のロイシン残基は改変されていないか、イソロイシンに改変されている；及び
ｐ）配列番号２の１１３番目のバリン残基は改変されていない
の１ないし全ての条件を満たす、ただし、このうち、１）ないし９）で特定したアミノ酸残基は、１）ないし９）の各々で特定したように置換されている、
請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
請求項１ないし１５のいずれか１項に記載のタンパク質を固定化した担体。
請求項１ないし１５のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
請求項１７に記載の核酸を含むベクター。
請求項７の改変型ビオチン結合タンパク質を含む、生物学的試料中の物質を検出する系における非特異結合抑制剤。