JP2011055768A - 造血幹細胞の培養方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】造血幹細胞の培養方法は、造血幹細胞をSFRP-2タンパク質存在下で培養する工程を含む。そのために、培地にSFRP-2タンパク質を添加してもよく、造血幹細胞にSFRP-2タンパク質発現ベクターを導入してもよい。上記いずれかの培養方法において、SFRP-2タンパク質の培地中の濃度が、0.1μg/mL以上10μg/mL以下であってもよい。得られた細胞を造血幹細胞移植に用いる。
【選択図】図3
Description
まず、本発明の培養方法に用いる造血幹細胞を準備する。
造血幹細胞が由来する動物種は特に限定されないが、脊椎動物が好ましく、哺乳動物がより好ましく、ヒトが最も好ましい。造血幹細胞を取得する組織は、造血幹細胞が存在する組織であれば特に限定されないが、造血組織であることが好ましく、ヒト成体の場合、骨髄、臍帯血、または末梢血であることが好ましい。それらの組織が細胞塊の時は、プロテアーゼやコラゼナーゼ等で処理することによって解離し、個々に分離した細胞を、そのまま培養に用いても良い。また、血液のように細胞が分離している組織であれば、細胞の分離処理無しにそのまま培養に用いても良い。または、分離した細胞から造血幹細胞を単離して、造血幹細胞だけを用いても良い。
このようにして増殖させた造血幹細胞の移植方法も、当業者に公知の方法を用いればよい。移植した造血幹細胞が生着すると次第に造血機能が回復するが、ここで、造血幹細胞の造血能と長期骨髄再建能を向上させておけば、機能回復能がより増強する。本発明によって、SFRP-2タンパク質存在下で培養した造血幹細胞を移植に用いた場合、以下の実施例に示すように、SFRP-2タンパク質非存在下で培養した造血幹細胞に比べ、造血幹細胞の造血能と長期骨髄再建能が向上する。従って、SFRP-2タンパク質またはSFRP-2タンパク質を発現する発現ベクターは、造血幹細胞の機能向上剤として有用である。また、誰でも容易に本発明の方法を実施できるように、SFRP-2タンパク質またはSFRP-2タンパク質を発現する発現ベクターを、造血幹細胞の培養キットとしてもよい。このキットには、これら以外に、培地や造血幹細胞などが含まれていてもよい。
CD34-KSL細胞は、以下のようにして単離した(Ema H et al., Nat. Protoc. 2006; vol.1, p.2979-2987)。まず、8週齢〜12週齢のC57BL/6(日本クレア社)から骨髄細胞を単離し、さらにLymphoprep(Nycomed社)を用いて、単球を単離した。次に、その細胞群から、Lineage Cell Depletion Kit(Miltenyi Biotec)を用いて、lineage陽性細胞を除去した。残った細胞に対し、FITC結合抗CD34抗体、PE結合抗Sca-1抗体、APC結合抗c-Kit抗体、及びLineage Cell Depletion Kit添付のbiotin結合抗lineage抗体カクテルを結合させ、つづいてストレプトアビジン−PE−Cy7を結合させた。そして、FACS CaliburまたはFACS Ariaを用いて、細胞群を解析し、CD34-KSL細胞を単離した。
SFRP-1に用いたプライマー
Forward 5’-ggatccatgggcgtcgggcgcagcgc-3’ (配列番号1)
Reverse 5’-gaattctcacttaaaaacagactgga-3’ (配列番号2)
SFRP-2に用いたプライマー
Forward 5’-ggatccatgccgcggggccctgcctc-3’ (配列番号3)
Reverse 5’-gaattcctagcattgcagcttgcgga-3’ (配列番号4)
B6-Ly5.1マウス(三協ラボサービス社)から実施例1と同様に単離した20個のCD34-KSL細胞を2週間培養した細胞をドナー細胞とした。一方、950radの致死的な放射線量をB6-Ly5.2マウスに投与し、B6-Ly5.2マウス骨髄から単離した単球2x105個と共に、ドナー細胞を移植した。4週後、8週後、12週後、23週後に(図では、それぞれ4W、8W、12W、23Wと示す。)、末梢血におけるドナー細胞由来の細胞の割合を計測した。なお、ドナー細胞由来の細胞はLy5.1陽性であり、FACSによりLy5.1陽性細胞の比率を計測することによって、ドナー細胞由来の細胞の割合を測定した。
Claims (8)
- 造血幹細胞の培養方法であって、
前記造血幹細胞をSFRP-2タンパク質存在下で培養する工程を含む方法。 - 前記造血幹細胞の培地にSFRP-2タンパク質を添加する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記造血幹細胞にSFRP-2タンパク質発現ベクターを導入する工程を含む方法。
- 前記SFRP-2タンパク質の培地中の濃度が、0.1μg/mL以上10μg/mL以下であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 骨髄細胞または血液細胞から、CD34陰性、Sca-1陽性、c-Kit陽性、lineage抗原陰性の造血幹細胞を単離する工程を含む、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記lineage抗原が、CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly-6G/C), 7-4, Ter-119の抗原セットであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- SFRP-2タンパク質、またはSFRP-2タンパク質を発現する発現ベクターを含有する、造血幹細胞の機能向上剤。
- SFRP-2タンパク質、またはSFRP-2タンパク質を発現する発現ベクターを含有する、造血幹細胞の培養キット。
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