JP2011055764A - イネ変異体、澱粉の製造方法、澱粉、及びイネ変異体の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】イネスターチシンターゼの変異した新規イネ変異体を提供する。
【解決手段】
イネスターチシンターゼＩＩＩａ型（ＳＳＩＩＩａ）と、イネスターチシンターゼＩＶｂ型（ＳＳＩＶｂ）の遺伝子座が劣性ホモであり、遺伝的に固定されているイネ変異体を得る。このイネ変異体は、ＳＳＩＩＩａ活性が野生型に比べて低下することを特徴とする。この上で、野生型や親系統と比べて、種子重量が８割以上維持され、農業形質が維持することを特徴とするイネ変異体を得る。また、このイネ変異体により生成される澱粉は、野生型イネやＳＳＩＩＩａの活性低下に起因する親系統イネを用いて製造される澱粉とは形状が異なる。
【選択図】図２

Description

本発明は、イネ変異体、澱粉の製造方法、澱粉、及びイネ変異体の製造方法に係り、特にイネスターチシンターゼに変異をもったイネ変異体、澱粉の製造方法、澱粉、及びイネ変異体の製造方法に関する。

澱粉は不溶性であり、植物に特有の貯蔵多糖である。また、地球上のほとんどの生物が炭水化物源として、澱粉を利用している。
澱粉は、グルコースのα１，４による直鎖およびα１，６グルコシド結合による枝分かれ構造を含むグルコースポリマーである。
また、澱粉は、主として直鎖からなるアミロースと枝分かれ構造をもつアミロペクチンの高分子の集合体である。

澱粉の生合成には、４種類の酵素が関与している。この酵素としては、基質供給酵素であるＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰａｓｅ）、α１，４グルコシド結合を伸長するスターチシンターゼ（ＳＳ）、α１，６グルコシド結合からなる枝分かれ構造を形成する枝作り酵素（ＢＥ）、アミロペクチンの特徴であるクラスター構造を維持するためにＢＥが付けた余分な枝をトリミングする枝切り酵素（ＤＢＥ）が知られている。
しかしながら、澱粉生合成に関与する酵素は他にもあると考えられている（非特許文献１）。

このように、植物の澱粉生合成には少なくとも４種類の酵素が関与している。
加えて、高等植物の場合、これらの酵素には多数のアイソザイム、すなわち同様の酵素反応を触媒するアミノ酸配列の異なる酵素群が関与していることがわかっている。たとえば、イネには、１０種類ものＳＳ、３種類ものＢＥ、４種類ものＤＢＥが存在する。
近年、これらのアイソザイムは、組織特異性や、微妙な基質特異性によって、役割分担をしていることが分かってきた。
アイソザイムの機能解明は、澱粉生合成メカニズムの解明には欠かせない。このために、従来から、各アイソザイムの変異体が開発されてきた。すなわち、特定のアイソザイムが欠失した変異体の表現型を調べることで、そのアイソザイムの働きや役割を知ることができる。

たとえば、イネにおいて既に単離され、分析されている変異体には、ＳＳＩ（非特許文献２、特許文献１）、ＳＳＩＩａ（非特許文献３、特許文献２）、ＳＳＩＩＩａ（非特許文献４、特許文献３）、ＧＢＳＳＩ（非特許文献５）、ＢＥＩ（非特許文献６）、ＢＥＩＩｂ（非特許文献７、特許文献２）、ＩＳＡ１（非特許文献８）、ＰＵＬ（非特許文献９、特許文献４）、ＰＨＯ（非特許文献１０）などがある。
これらの変異体は各アイソザイムの機能を明確にするだけでなく、それらが胚乳に蓄積する澱粉の構造が野生型とは異なる場合が多い。その構造の違いに伴い、独特の物性を示したり、澱粉粒の大きさ等が異なることがある。

特開２００３−７９２６０号公報 特開２００５−２６９９２８号公報 特開２００６−５１０２３号公報 特開２００７−２０４７５号公報

Ｙ． Ｎａｋａｍｕｒａ、Ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｂｅｔｔｅｒ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ： ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｔｉｓｓｕｅ．、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、日本、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２００２年、４３、、ｐ．７１８−７２５ Ｎ． Ｆｕｊｉｔａ他、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉ ｕｓｉｎｇ ｍｕｔａｎｔｓ ｉｎ ｒｉｃｅ．、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、アメリカ合衆国、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ， ２００６年、１４０、、ｐ．１０７０−１０８４ Ｙ． Ｎａｋａｍｕｒａ他、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ ＩＩａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｔａｒｃｈ ｑｕａｌｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｊａｐｏｎｉｃａ ａｎｄ ｉｎｄｉｃａ ｒｉｃｅ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ． 、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、、、２００５年、５８、、ｐ．２１３−２２７ Ｎ． Ｆｕｊｉｔａ他、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＳＩＩＩａ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｒｉｃｅ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）； ｔｈｅ ｆｕｃｎｔｉｏｎ ｏｆ ＳＳＩＩＩａ ａｎｄ ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｂｙ ＳＳＩＩＩａ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、アメリカ合衆国、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、２００７年４月、１４４、４、ｐ．２００９−２０２３ Ｙ． Ｓａｎｏ、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｗａｘｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ、、、１９８４年、６８、、ｐ．４６７−４７３ Ｈ． Ｓａｔｏｈ他、Ｓｔａｒｃｈ−ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ Ｉ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ａｆｆｅｃｔｓ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｉｎ ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、アメリカ合衆国、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、２００３年、１３３、、ｐ．１１１１−１１２１ Ａ． Ｎｉｓｈｉ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｍｙｌｏｓｅ−ｅｘｔｅｎｄｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、アメリカ合衆国、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、２００１年、１２７、、ｐ．４５９−４７２ Ｙ． Ｎａｋａｍｕｒａ他、Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｄｅｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ α−ｐｏｌｙｇｌｕｃａｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍｓ ｏｆ ｓｕｇａｒｙ−１ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｒｉｃｅ．、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、イギリス、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、１９９７年、１２、、ｐ．１４３−１５３ Ｎ． Ｆｕｊｉｔａ他、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＵＬ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｒｉｃｅ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．） ａｎｄ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＵＬ ｏｎ ｔｈｅ ｓｔａｒｃｈ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ．、イギリス、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２００９年３月、６０、３、ｐ．１００９−１０２３ Ｈ． Ｓａｔｏｈ他、Ｐｌａｓｔｉｄｉｃ α−ｇｌｕｃａｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙ ａｆｆｅｃｔｓ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｉｎ ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、アメリカ合衆国、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、２００３年、２０、、ｐ．１８３３−１８４９ Ｔ． Ｈｉｒｏｓｅ他、Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｉｎ ｒｉｃｅ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）．、Ｐｌａｎｔａ、、、２００４、２２０、、ｐ．９−１６ Ｔ． Ｏｈｄａｎ他、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｓｉｎｋ ａｎｄ ｓｏｕｒｃｅ ｏｒｇａｎｓ ｏｆ ｒｉｃｅ．、Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ．、イギリス、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２００５年１２月、５６、４２２、ｐ．３２２９−３２４４

しかしながら、従来の澱粉生合成に関与する酵素に変異を持つイネ変異体において、イネの多数あるＳＳアイソザイムの中で、ＳＳＩＶｂ遺伝子の胚乳における発現量は多くはなく、ＳＳＩＶｂの機能は不明であった。
このため、ＳＳＩＶｂが劣性のイネ変異体は、形状や性質が違う澱粉を製造するとは考えられなかった。

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の課題を解消することを課題とする。

本発明のイネ変異体は、イネスターチシンターゼＩＩＩａ型（ＳＳＩＩＩａ）及びイネスターチシンターゼＩＶｂ型（ＳＳＩＶｂ）の遺伝子座が劣性ホモであり、遺伝的に固定されていることを特徴とする。
本発明のイネ変異体は、更に、前記ＳＳＩＩＩａの活性が野生型に比べて低下したことを特徴とする。
本発明のイネ変異体は、野生型や親系統と比べて、種子重量が８割以上維持され、農業形質が維持されていることを特徴とする。
本発明の澱粉の製造方法は、前記イネ変異体を用いたことを特徴とする。
本発明の澱粉の製造方法は、前記イネ変異体の胚乳を用いたことを特徴とする。
本発明の澱粉は、前記澱粉の製造方法により製造されたことを特徴とする。
本発明の澱粉は、野生型イネや前記ＳＳＩＩＩａの活性低下に起因する親系統イネを用いて製造される澱粉とは形状が異なることを特徴とする。
本発明の澱粉は、前記野生型イネや前記親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、澱粉粒が球状であることを特徴とする。
本発明の澱粉は、前記野生型イネや前記親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、アミロペクチンのＤＰ≧３７、又はアミロペクチンのクラスターを連結するＢ２鎖より長い鎖が少ないことを特徴とする。
本発明の澱粉は、前記野生型イネや前記親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、糊化粘度特性が異なることを特徴とする。
本発明のイネ変異体の製造方法は、イネスターチシンターゼＩＩＩａ型（ＳＳＩＩＩａ）変異体とイネスターチシンターゼＩＶｂ型（ＳＳＩＶｂ）変異体との二重劣性ホモであることを特徴とする。
本発明のイネ変異体の製造方法は、前記イネスターチシンターゼＩＩＩａ型（ＳＳＩＩＩａ）変異体のイネ及び前記イネスターチシンターゼＩＶｂ型（ＳＳＩＶｂ）変異体のイネは、レトロトランスポゾンＴｏｓ１７の挿入によって得られることを特徴とする。
本発明のイネ変異体は、前記イネ変異体の製造方法により製造することを特徴とする。

本発明によれば、ＳＳＩＩＩａとＳＳＩＶｂの両方の遺伝子座が劣性ホモであることで、ＳＳＩＩＩａ単独の変異体、ＳＳＩＶｂ単独の変異体、野生型とは形状や性質が違う澱粉を製造できるイネ変異体を提供することができる。

本発明の実施の形態に係るイネスターチシンターゼアイソザイムの系統樹を示す図である。 本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂの二重変異体（＃２０１２、＃２０１３）及びΔＳＳＩＩＩａ又ΔＳＳＩＶｂであるそれらの親変異体（ｅ１、ｅ８、ｅ１４）とＷｉｌｄ ｔｙｐｅである野生型（日本晴）の完熟玄米および切片の形態を示す写真である。 本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂ（＃２０１２、＃２０１３）及びそれらの親変異体（ｅ１、ｅ８、ｅ１４）との完熟胚乳のアミロペクチンの鎖長分布について、それぞれから野生型（日本晴）のパターンを引いた差分（ΔＭｏｌｅ ％）を示すグラフである。 本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂ（＃２０１３）及びそれらの親変異体（ｅ１、ｅ１４）と野生型（日本晴）のゲル濾過パターンを示すグラフである。 本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂ（＃２０１２、＃２０１３）及びそれらの親変異体（ｅ１、ｅ８、ｅ１４）と野生型（日本晴）の澱粉粒を走査型電子顕微鏡で観察した写真である。 本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂ（＃２０１３）及びそれらの親変異体（ｅ１）と野生型（日本晴）の粒径を示すグラフである。 本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂ（＃２０１２、＃２０１３）及びそれらの親変異体（ｅ１、ｅ８、ｅ１４）と野生型（日本晴）の澱粉粒のＸ線回折パターンを示す図である。 本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂ（＃２０１３）及びそれらの親変異体（ｅ１、ｅ１４）と野生型（日本晴）の胚乳澱粉のラピッドビスコアナラーザーで測定した糊化粘度パターンを示すグラフである。Ｔｅｍｐは温度を示す。 本発明の実施の形態に係るイネＳＳＩＶｂ遺伝子の構造を示す概念図である。 本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂ（＃２０１３）のＰＣＲ選抜の写真である。 本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂ（＃２０１３）のＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色法の結果を示す図である。

＜実施の形態＞
まずは図１を参照して、イネのスターチシンターゼ（ＳＳ）のアイソザイムについて説明する。
図１は、各アイソザイムのアミノ酸配列を元に、近接結合法で系統樹を描いたものである。図１に記載の１０種類のアイソザイムは、ＳＳＩ、ＳＳＩＩ、ＳＳＩＩＩ、ＳＳＩＶ、ＧＢＳＳの５つのグループに分類できる。括弧内の番号は、各アイソザイム遺伝子のアクセッション番号を示す。
このように、ＳＳは、澱粉生合成関連酵素の中でも最も多くのアイソザイムをもち、未だ機能が不明なアイソザイムも数多く存在する。
１０種類あるイネのＳＳアイソザイムは、そのアミノ酸配列から５つのグループ（ＳＳＩ、ＳＳＩＩ、ＳＳＩＩＩ、ＳＳＩＶ、ＧＢＳＳ）に分けられ、ＳＳＩ以外のグループ内にさらに複数のアイソザイムが存在する。

本発明の発明者は、いまだに機能が不明なＳＳＩＶｂの機能を解明するために、ＳＳＩＶｂを欠損した二重変異体を作出することを考えた。
本発明の発明者は、まず、イネの内在性レトロトランスポゾンであるＴｏｓ１７が挿入されたミュータントパネルからＳＳＩＶｂ単一変異体を単離し、その性質を野生型と比較することで、ＳＳＩＶｂの機能を解明しようと試みた。
しかしながら、ＳＳＩＶｂ単一変異体は、アミロペクチン構造（図３参照）、種子形態、大きさ（図２参照）、澱粉粒の形態（図５参照）において、野生型（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）の日本晴とほとんど変わりがなかった。
本発明の発明者は、これは、野生型との表現型の変化が明確な他のＳＳアイソザイムの単一変異体と比べて、ＳＳＩＶｂ単一変異体は胚乳における発現が非常に少ないか、ＳＳＩＶｂのみが欠失しても他のＳＳアイソザイムが相補することでその機能がマスク（抑制）されていることが原因ではないかと考えた。
そこで、本発明の発明者は、比較的表現型の変化が大きいＳＳＩＩＩａ変異体を同時に欠損させることで、マスクされた変化が出現し親変異体よりも大きな変化が出ることを期待して、ＳＳＩＩＩａとＳＳＩＶｂの二重変異体を作出した。

その結果、本発明の発明者が作出したＳＳＩＩＩａとＳＳＩＶｂの二重変異体（ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂ）は、両親変異体及び野生型と比べて、以下の特徴があった。
まず、図２を参照して、ＳＳＩＩＩａとＳＳＩＶｂの二重変異体のクローンである＃２０１２、＃２０１３と、それらの親変異体（ΔＳＳＩＩＩａ、又はΔＳＳＩＶｂ）のクローンであるｅ１、ｅ８、ｅ１４と、野生型（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）である日本晴のクローンの完熟玄米および切片の形態について説明する。以下、同一の符号を付したクローンは、同一のものを示す。
まず、図２において、上述のように、ＳＳＩＶｂ単一変異体のクローンであるｅ８、ｅ１４の種子は、野生型の日本晴と同様に半透明で正常の形態を示した。
これに対して、ＳＳＩＩＩａ単一変異体のクローンであるｅ１の種子は、玄米の中央が白く濁る「心白」形態を示した。
更に、ＳＳＩＩＩａとＳＳＩＶｂの二重変異体のクローンである＃２０１２、＃２０１３の種子は、玄米全体が白く濁る「白濁」の形態を示した。このように、ＳＳＩＩＩａとＳＳＩＶｂの二重変異体の種子は、形態的に顕著な特徴を備えており、野生型と区別しやすいという効果が得られる。

また、このΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂの種子重量を測定したところ、野生型の８割以上であった。この測定結果を以下の表１に示す。

表１は、ＳＳＩＩＩａとＳＳＩＶｂの二重変異体のクローンである＃２０１２、＃２０１３、それらの親変異体のクローンであるｅ１、ｅ８、ｅ１４、野生型（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）の日本晴の玄米の粒型（ｍｍ）及び玄米重量（ｍｇ）について計測したデータを示す。粒型は、粒長（長さ）、粒幅（幅）、粒厚（厚さ）について計測した。
この表１に示すように、ＳＳＩＩＩａ単一変異体のクローンであるｅ１は、日本晴とほぼ同一の大きさであった。
また、ＳＳＩＶｂ単一変異体のクローンであるｅ８は、ｅ１と同様の大きさを示した。
これに対して、ＳＳＩＶｂ単一変異体のクローンであるｅ１４は日本晴と比べてやや小さかった。ｅ１４は、ＳＳＩＶｂ遺伝子にＴｏｓ１７は挿入されていないが、ｅ１４と同一のバックグランドを持つイネ（ｅ１４＋／＋）の重量も１５．９ｍｇと小さかった。このため、ｅ１４の小ささは、ＳＳＩＶｂ遺伝子以外の箇所に挿入されたＴｏｓ１７の影響であると考えられる。
＃２０１２の玄米重量は、野生型の８割以上の８６％とやや小さかった。粒長は野生型よりむしろ長く、粒厚がやや薄かった。
＃２０１３の玄米重量は、野生型の８割以上の８１％とやや小さかった。また、＃２０１２と同様に、粒長は野生型よりむしろ長く、粒厚がやや薄かった。

次に、図３を参照して、ＳＳＩＩＩａ変異体のアミロペクチンの鎖長分布について説明する。
図３は、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂ（＃２０１２、＃２０１３）、それらの親変異体（ｅ１、ｅ８、ｅ１４）、完熟胚乳のアミロペクチンの鎖長分布を示す。図３においては、それぞれから野生型（日本晴）のパターンを引いた差分をモル比（ΔＭｏｌｅ ％）にて示す。ＤＰ（ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）は、グルコースの重合度を示す値である。
まず、ＳＳＩＶｂ単一変異体のクローンであるｅ８、ｅ１４では、野生型（日本晴）と鎖長では大差がなかった。
これに対して、ＳＳＩＩＩａの単一変異体のクローンであるｅ１は、代表的な特徴として、鎖長ＤＰ≧３７の長鎖が野生型と比べて減少していた。
また、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂのクローン＃２０１２、＃２０１３共、アミロペクチンの鎖長分布は、ＳＳＩＩＩａ単一変異体のクローンｅ１よりもさらにＤＰ≧３７の長鎖が減少していた。加えて、＃２０１２および＃２０１３のパターンはｅ１のパターンに類似しているが、ＤＰ６〜１０およびＤＰ４０〜５５の減少が大きいのが特徴である。
このことから、ＳＳＩＶｂは、胚乳アミロペクチンの長鎖を伸長するＳＳＩＩＩａの機能と類似している可能性がある。

次に、図４を参照して、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂ（＃２０１３）、これらの親変異体（ｅ１、ｅ１４）、野生型（日本晴）の各クローンのデンプンを枝切りしたもののゲル濾過パターンについて説明する。
澱粉を枝切りしたもののゲル濾過パターンは、３つのピークにわかれ、最も速く検出されるピーク（Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｉ）が見かけのアミロース、２番目に検出されるピーク（Ｆｒａｃｔｉｏｎ ＩＩ）がクラスターを連結するＢ２鎖より長いアミロペクチンの長鎖、３番目に検出されるピーク（Ｆｒａｃｔｉｏｎ ＩＩＩ）がアミロペクチンのクラスター内の短鎖である。
これらを数値化したものを、以下の表２に示す。この表２では、各フラクションの割合と、アミロペクチンの長鎖に対する短鎖の割合（ＩＩＩ／ＩＩ）を示す。

非特許文献４を参照すると、ＳＳＩＩＩａ単一変異体は、枝切りしたデンプンのゲル濾過の結果，見かけのアミロース含量が日本晴に比べて約１．５倍高かった。今回の結果でも、日本晴の見かけのアミロース含量は２１．３％であるのに対し、ｅ１は２９．９％と約１．４倍の値を示した。
これに対して、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂのアミロース含量は３３．７％と、ＳＳＩＩＩａ変異体よりもさらに高かった。また、アミロペクチンの長鎖の減少がＳＳＩＩＩａ変異体よりも顕著であった。＃２０１３では、ＩＩＩ／ＩＩ値が６．７とｅ１の４．７に比べても非常に高くなっている。この結果は、鎖長分布でＤＰ≧３７の長鎖が減少していたことと一致する。
これにより、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂの澱粉は、結晶化が少なく独特の食感が得られ、酒造や菓子製造に用いて特徴的な製品を製造できると考えられる。

次に、図５、図６を参照して、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂの澱粉粒の形状と粒径について説明する。
野生型の澱粉粒は、約３〜５μｍの多角形であるが、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂの澱粉粒は、平均粒径が３．９５±６．９４μｍのほぼ完全な球形であった（図５、表３参照）。
また、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂの澱粉粒の大きさのばらつきは、日本晴やＳＳＩＩＩａ変異体より小さく、更に表面積も最も大きい値を示した（図５、表３参照）。
図５は、走査型電子顕微鏡で観察したΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂのクローン＃２０１２、＃２０１３、それらの親変異体のクローンｅ１、ｅ８、ｅ１４、及び野生型の日本晴の澱粉粒を示す図である。
図５を参照すると、野生型（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）である日本晴の澱粉粒は、約３〜５μｍの多角形であり、ＳＳＩＶｂ単一変異体のｅ８とｅ１４もこれに類似していた。これに対して、ＳＳＩＩＩａ単一変異体のｅ１の澱粉粒は、日本晴のそれよりやや小さく、丸みを帯びていた。さらに、ＳＳＩＩＩａとＳＳＩＶｂの二重変異体である＃２０１２と＃２０１３の澱粉粒は、ほぼ完全な球体であり、大きさは直径３〜５μｍであった。

ここで、図６を参照して、各クローンの粒径について説明する。
図６は、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂのクローンの＃２０１３、親変異体のクローンのｅ１、野生型の日本晴のデンプンの粒径分布を計測したグラフである。
このように、＃２０１３のピークが最も鋭いことから、粒径がより均質であることがわかった。

次に、図７を参照して、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂの胚乳澱粉の結晶性について説明する。図７は、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂのクローン＃２０１２、＃２０１３、親変異体のクローンｅ１、ｅ８、ｅ１４、及び野生型の日本晴の澱粉粒のＸ線回折パターンを示す。
この図７においては、グラフの縦軸の差の絶対値により、結晶性の高さを知ることができる。すなわち、溝が深い又は山が鋭いと結晶性が高い。
図７のグラフの縦軸の差の絶対値によると、親変異体のクローンｅ１が最も結晶性が低く、次いでΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂクローン＃２０１２、＃２０１３が低く、日本晴と親変異体のクローンｅ８とｅ１４が同じくらいあった。
すなわち、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂの胚乳澱粉のＸ線回折による結晶性は、野生型より低く、親変異体であるＳＳＩＩＩａ変異体より高かった。
また、いずれのクローンも、典型的なＡ形結晶を示した。

次に、図８を参照して、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂの糊化粘度について説明する。ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂの胚乳澱粉の熱糊化粘度パターンは、野生型やＳＳＩＩＩａ変異体とも異なっている。
ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂのクローンである＃２０１３は、親系統のクローンより糊化ピーク値が低く、粘度上昇温度が高い特徴があった。すなわち、粘度が上昇する温度がグラフ右にずれる、つまり高くなった。また、粘度ピーク値が野生型の半分程度と低かった。

より具体的には、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂの吸水率と加熱膨潤度は野生型やＳＳＩＩＩａ変異体のそれより低く、加熱溶解度は高かった。
この吸水率と加熱膨潤度について、以下の表４を参照して説明する。

表４は、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂのクローン＃２０１３、親変異体のクローンｅ１、及び野生型の日本晴の澱粉粒の吸水性、加熱溶解度、及び加熱膨潤度を示す。スラリー調製限界濃度は、高いほど吸水性が低くなる。
すなわち、＃２０１３は吸水性、加熱膨潤度が低く、加熱溶解度が高いという特徴があった。

以上のような本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂから、以下のような性質、効果を得ることができる。
まず、従来の澱粉生合成に関与する酵素に変異を持つイネ変異体において、イネの多数あるＳＳアイソザイムの中で、ＳＳＩＶｂの機能は不明であった。
これに対して、本発明の発明者らは、ＳＳＩＶｂが劣性のイネ変異体を作出したが、種子の形態、澱粉粒の形状や大きさが野生型と非常に類似していたため、ＳＳＩＶｂ変異体の解析によるＳＳＩＶｂの機能解明には到らなかった。
このため、本発明の発明者らは、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂの二重変異体を作成することでＳＳＩＶｂの機能を解明し、これにより産業上利用することを可能にした。

また、従来のイネのスターチシンターゼの変異体は、様々な性質を持つものがあるものの、澱粉自体の性質や形状は、それほど変化していなかった。
これに対して本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂの変異体からは、特に通常のイネの澱粉とは異なった性質と形状をもつ特性の澱粉を得られる。
これらの特性の中で、特にユニークであるのは、澱粉粒の形状である。
通常、イネの澱粉粒は、多角形を示し、他の植物の澱粉粒も、多くは楕円型あるいは平板型であり、完全な球形を示す澱粉粒は、非常に珍しい。
自然の澱粉において、球体に近い形状のものにキャッサバの澱粉粒があるが、粒径が約１０μｍと、本発明の実施の形態に係る澱粉粒より大きく、また、均質性で劣っている。
これに対して、直径が３〜５μｍの球形微粒子の天然素材は、本発明の実施の形態に係る澱粉の他にはない。
このサイズと形状により、本発明の実施の形態に係る澱粉は、肌のキメを整えるなどの化粧品素材、顔料、プリント基板回路用トナー、クロマトグラフィー用資材、製紙用など工業利用に応用可能である。
また、澱粉は熱を加えて可溶化して洗い流すことも可能であり、電子回路等にも利用できる可能性がある。
また、トナーには、通常５．５μｍの微粒子顔料が用いられるが、さらに細かい球形微粒子があれば、画質が向上する。加えて、トナーの定着時に、通常は１５０℃の熱をかけるが、さらに低い温度、例えば１００℃程度の定着が望まれている。これらの材料として、本発明の実施の形態に係る澱粉粒を用いることができる可能性がある。

また、本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂのイネ変異体から作成された澱粉は、糊化粘度パターンが通常のイネの澱粉とは異なっている。
これにより、通常とは食感が違う食品や加工品にΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂを用いることが考えられる。
また、本発明の実施の形態に係る澱粉は、吸水性や膨潤度が低いことから、石膏ボード等の建築資材の添加剤や、糊に使用しても良好な性能を得られると考えられる。

さらに、本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂのイネ変異体は、既に遺伝的に固定された系統であり、この種子を植えて自殖によって稔った種子は、全て同型質になる。
すなわち、イネは自殖性植物であり、稀に開花時期が一致し、接触する機会があれば他殖することもある。
しかしながら、万一、稀に他殖によって稔ったとしても、種子が白濁であるという特徴を示すため、誤って他殖したこともわかりやすく、形質を維持した種子を選抜することが容易である。
また、ＳＳのうち二つの酵素を欠失しているにもかかわらず、種子重量は８割以上を維持しており、稔性、生育も野生型と遜色ない。すなわち、農業的形質に低下がみられず、農業形質が維持されている。
さらに、遺伝子組換体ではないので、一般の水田に植えることが可能であり、大規模栽培も可能である。

以上のように、本発明の実施の形態に係るイネ変異体の製造方法においては、限りなく球形に近い澱粉粒をもつジャポニカ米品種のイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）変異体およびその製造方法、並びに該イネ変異体に由来する澱粉およびその製造方法を得ることができる。さらに、本発明は、該澱粉を利用する飲食品及び工業品に用いることができる。

以下で、図を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら制限されるものではない。

（ＳＳＩＶｂ変異体の単離）
上述したように、イネの１０個程度あるＳＳアイソザイムは、その発現パターンは精密に研究されているものの（非特許文献１１、１２参照）、変異体が既に単離され、その機能が解明されているのは、ＳＳＩ、ＳＳＩＩａ、ＳＳＩＩＩａ、ＧＢＳＳＩのわずか４種類である。
そこで、図９を参照すると、本発明の発明者らは、まず全く機能が不明であるＳＳＩＶｂの変異体を単離した。このため、既に配列がデータベースに登録済みのＳＳＩＶｂ遺伝子（ＡＹ１００４７１）のゲノミックＤＮＡ配列およびＴｏｓ１７のＤＮＡ配列を元に、プライマーを設計し、ミュータントパネルの配列を鋳型に２本のプライマー・ペアを用いてネステッドＰＣＲを行った。

図１０を参照すると、Ｔｏｓ１７のＤＮＡ配列を元に設計したプライマーＴ１Ｒ（配列表の配列番号１）、Ｔ２Ｒ（配列表の配列番号２）とＳＳＩＶｂ遺伝子のゲノミックＤＮＡ配列を元に設計したプライマーＳＳＩＶｂ−５Ｒ（配列表の配列番号８）、ＳＳＩＶｂ−６Ｒ（配列表の配列番号９）で選抜を行ったところ、ＳＳＩＶｂ遺伝子のエキソン８にＴｏｓ１７が挿入された変異体であるクローンのｅ８が単離された。図１０においては、アローヘッド（三角印）で示すバンドが、挿入を確認するためのＰＣＲ産物である。また、非挿入確認のＰＣＲにおいては、非挿入の長さのバンドが検出されないことで非挿入であることを確認できる。
また、Ｔｏｓ１７のＤＮＡ配列を元に設計したプライマーＴ１Ｒ（配列表の配列番号１）、Ｔ２Ｒ（配列表の配列番号２）とＳＳＩＶｂ遺伝子のゲノミックＤＮＡ配列を元に設計したプライマーＳＳＩＶｂ−２Ｒ（配列表の配列番号７）、ＳＳＩＶｂ−１０Ｒ（配列表の配列番号１０）で選抜を行ったところ、ＳＳＩＶｂ遺伝子のエキソン１４にＴｏｓ１７が挿入された変異体（ｅ１４）が、単離された。
ＳＳＩＶｂは、ＳＳＩやＳＳＩＩＩａの様に、種子が次第に発育・肥大した登熟状態の胚乳から抽出した可溶性画分をＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色で、明確にＳＳ活性バンドを検出することができなかった。このため、葉本体である葉身のＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ選抜のみを選抜に用いて材料を確保した。

図１０を参照して、Ｔｏｓ１７の挿入を確認する検出結果を示す。
すなわち、Ｔｏｓ１７挿入を確かめるＰＣＲでバンドが検出され、非挿入を確かめるＰＣＲでバンドが検出されなければ、劣性ホモであることが確認できる。

ｅ８のＴｏｓ１７挿入を確かめるためのプライマーとして、Ｔ１Ｒ（配列表の配列番号１）、Ｔ２Ｒ（配列表の配列番号２）とＳＳＩＶｂ−５Ｒ（配列表の配列番号８）、ＳＳＩＶｂ−６Ｒ（配列表の配列番号９）を用いた。
また、ｅ８のＴｏｓ１７非挿入を確かめるためのプライマーとして、ＳＳＩＶｂ−３Ｆ（配列表の配列番号３）、ＳＳＩＶｂ−４Ｆ（配列表の配列番号４）とＳＳＩＶｂ−５Ｒ（配列表の配列番号８）、ＳＳＩＶｂ−６Ｒ（配列表の配列番号９）を用いた。

ｅ１４のＴｏｓ１７挿入を確かめるためのプライマーとして、Ｔ１Ｒ（配列表の配列番号１）、Ｔ２Ｒ（配列表の配列番号２）とＳＳＩＶｂ−２Ｒ（配列表の配列番号７）、ＳＳＩＶｂ−１０Ｒ（配列表の配列番号１０）を用いた。
また、ｅ１４のＴｏｓ１７非挿入を確かめるためのプライマーとして、ＳＳＩＶｂ−７Ｆ（配列表の配列番号５）、ＳＳＩＶｂ−８Ｆ（配列表の配列番号６）とＳＳＩＶｂ−２Ｒ（配列表の配列番号７）、ＳＳＩＶｂ−１０Ｒ（配列表の配列番号１０）を用いた。

ｅ８は、いかなるイネの個体からもヘテロのバンドパターン、即ち、挿入および非挿入ＰＣＲのいずれでもバンドが検出されたため、選抜は困難であった。
一方、ｅ１４では、劣性ホモをうまく選抜することが可能であり、図１０のようなバンドパターンを示す個体を栽培することで、ＳＳＩＶｂ変異体を確立することができた。

（ＳＳＩＩＩａとＳＳＩＶｂが欠損した二重変異体の単離）
次に、ＳＳＩＶｂの澱粉生合成における機能を明確にする目的で、さまざまな性質を調べて野生型である日本晴と比較した。しかしながら、胚乳澱粉の性質においては、明確な違いは見られなかった（図２〜８を参照）。
このため、ＳＳＩＶｂ変異体とＳＳＩＩＩａ変異体を交配することで、二重変異体を作出し、その性質を調べた。

以下で、図１０と図１１を参照して二重変異体の交配について説明する。本発明の発明者らは、ＳＳＩＩＩａ変異体であるｅ１にＳＳＩＶｂ変異体であるｅ８またはｅ１４を交配し、交配当代のＦ１種子を次年度に播種し、Ｆ２種子を得た。この中には、両親変異体には無い白濁種子が約２０％含まれていた。次年度に白濁種子を播種し、その後、ＳＳＩＩＩａ遺伝子とＳＳＩＶｂ遺伝子が劣性ホモであるクローン＃２０１３を上述のＰＣＲ法で選抜した。＃２０１３のＦ３種子は、全て白濁種子が出現した。
一方、ＰＣＲ法ではＳＳＩＶｂ遺伝子の劣性ホモの確認が困難なｅ８を片親としたクローン＃２０１２では、Ｆ３種子は、正常、心白、白濁の形態の種子が混在していた。＃２０１２については、さらに次年度に白濁種子を播種したところ、そのイネに稔実した種子は全て白濁種子になった。これらの登熟種子から得た可溶性画分のＳＳＩＩＩａ活性をＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色法（Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を用いて検討したところ、＃２０１３においてＳＳＩＩＩａ活性の欠失が認められた。すなわち、図１１によると、＃２０１３の登熟種子の各クローンにおいて、欠失していないＳＳＩはＩ₂で染色されており活性があるものの、ＳＳＩＩＩａはＩ₂で染色されておらず活性がほぼないことが分かる。
具体的に、ＳＳＩＩＩａ活性の検出は、非特許文献２に記載の方法に従って、以下のように行った。

開花後１０〜１５日くらいの登熟種子１粒のもみ、胚、果皮を除去し、３倍体積の抽出バッファー［５０ｍＭのＩｍｉｄａｚｏｌ（ｐＨ７．４）、１２．５％のｇｌｙｃｅｒｏｌ、８ｍＭの塩化マグネシウム、５００ｍＭの２−メルカプトエタノール］を加え、マイクロチューブ内でプラスチック製ホモジナイザー（グライナー社製）を用いてホモジナイズし、１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心分離して得た上清にＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー［０．３ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、０．１％のブロモフェノールブルー、５０％のグリセロール］を１／２体積加えて電気泳動に用いた。
電気泳動にはグルコシルトランスフェラーゼ反応に必要なプライマーとしてカキグリコーゲンを６０℃で溶かし込んだ７．５％のアクリルアミドゲルを用いた。フロントが濃縮ゲルを通過するまで７．５ｍＡ、通過してから１５ｍＡの定常電流で４℃下で電気泳動し、フロントが出てから６０分で電流を止めた。
その後、基質であるＡＤＰグルコースを除いた反応液［クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、０．５ＭのＣｉｔｒａｔｅ−Ｎａ、１００ｍＭのＢｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のＧｌｙｃｅｒｏｌ、２ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのＡＤＰグルコース］で２回洗浄し（各１５分）、ＡＤＰＧを加えて２０時間、３０℃でシーソーで反応させた。反応後、ヨード・ヨードカリ液（１％のＫＩ／０．１％のＩ₂）で染色した。
以上のようにして、２種類のΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂの系統を確立できた。

（ラピッドビスコアナライザー（ＲＶＡ）による熱糊化粘度特性の測定）
精製した胚乳澱粉の水分含量を赤外線水分含量測定器（ザルトリウス・メカトロニクス・ジャパン株式会社製、ベーシック水分計ＭＡ１５０）で測定し、実質の乾燥重量が３．５ｇになるように計算し、ＲＶＡ用アルミカップに測りとった。これに合計２８．５ｇになるように蒸留水を加えた。
プラスチック製の羽を入れ、ＲＶＡ（フォスジャパン社製、ＲＶＡ４）で粘度を測定した。温度プログラムは、図８の温度Ｔｅｍｐのラインで示すＴｅｍｐｅｒｔｕｒｅ（℃）の通りである。具体的には非特許文献４に記載の方法に従って測定を行った。

（走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による澱粉粒の観察）
精製した胚乳澱粉を銀製両面テープを貼り付けた真鍮製ステージの上に貼り付け、金蒸着した。
ＳＥＭ（ＩＥＴ社製、Ｊｅｏｌ ５６００）で１０００倍および４０００倍に拡大して観察した。具体的には非特許文献４に記載の方法に従って観察を行った。

（Ｘ線回折装置による胚乳澱粉の結晶性）
精製した胚乳澱粉０．５ｇを蒸留水の入った密封容器の中で、２４時間１００％湿度にさらした。
その後、深さ０．５ｍｍのスリットに澱粉を貼り付けて、Ｘ線回折装置（理学ＲＩＮＴ２０００）で２θ＝４〜４０°の回折パターンを検出した。
具体的には、非特許文献４に記載の方法に従って同様に観察を行った。

（澱粉の精製法）
澱粉の精製は、冷アルカリ浸せき法（Ｙａｍａｍｏｔｏ他、Ｄｅｎｐｕｎ Ｋａｇａｋｕ ２８：２４１−２４４（１９８１））を用いた。１０ｇの玄米を８０％まで精米し、０．１％のＮａＯＨを２００ｍｌ加えて一晩４℃で放置した。
翌日、上清を捨て、乳鉢ですりつぶし、１５０μｍのメッシュに通して、３，０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。
沈殿に０．１％のＮａＯＨを６００ｍｌ加えて氷中で３時間振とうし、一晩４℃で放置した。翌日、上清を捨て、蒸留水でけん濁し、１Ｎの酢酸で中和した。さらに、蒸留水で５回洗浄し、乾燥させ、乳鉢で粉体にした。

（澱粉の枝切り及びゲル濾過）
精製した澱粉２２．５ｍｇに蒸留水０．２５ｍｌ加えて混合し、２ＮのＮａＯＨを０．２５ｍｌ加えて３７℃で２時間糊化させた。
これに蒸留水３．２６ｍｌを加え、５ＮのＨＣｌを９０μｌ加えて中和させた。次に、１００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）を５ｍｌ加え、Ｐ．ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８、林原生物化学研究所製）を１２．５μｌ（約８７５ｕｎｉｔ）加え、４０℃で２４時間揺らしながら反応させた。
そして、エタノールを５ｍｌ加え、ロータリーエバポレーターで乾固させた。これに蒸留水を０．４ｍｌ及び２ＮのＮａＯＨを０．４ｍｌ加えて、５℃で３０分間糊化させ、５μｍのフィルターで濾過した後、ろ液をゲル濾過カラムに投入（アプライ）した。

使用したカラムは、ＴＳＫｇｅｌ ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ５５Ｓ（３００ｘ２０ｍｍ）１本にＴＳＫｇｅｌ ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ５０Ｓ（３００ｘ２０ｍｍ）３本（両カラムともＴＯＳＯＨ社製）を直列に接続したものであり、溶離液は０．２％のＮａＣｌ／０．０５ＮのＮａＯＨを用いた。試験管１本あたり３ｍｌずつ分取し、６８本に分画し、各フラクションの澱粉ヨウ素複合体のλｍａｘを求めた。糖量は、カラムに接続したＲＩディテクター（ＴＯＳＯＨ ＲＩ８０２０）で検出した。

（鎖長分布解析）
図３を参照して、鎖長分布解析について説明する。
試料は、完熟種子１粒から外内穎及び胚を取り除き、ペンチで胚乳を粉砕した後、エッペンドルフチューブ内でプラスチック製ホモジナイザー（グライナー社製）を用いてさらに磨砕した粉末あるいは、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色に用いた上清を採取した後に残った沈殿を蒸留水とアセトンで洗浄したものを用いた。
各々に５ｍｌのメタノールを加え、１０分間煮沸した。次に、２、５００ｘｇで１０分間遠心分離し、上清を除去し、９０％のメタノールを５ｍｌ加え２度洗浄した。
さらに、沈殿に５Ｎの水酸化ナトリウムを１５μｌ加え、５分間煮沸して澱粉を糊化させた。
その糊化液を氷酢酸９．６μｌで中和した後、蒸留水を１０８９μｌ、０．６Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．４）を１００μｌ、２％のアジ化ナトリウムを１５μｌ、Ｐ．ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８、林原生物化学研究所）を２μｌ（約２１０ｕｎｉｔ）加え、スターラーバーで撹拌しながら３７℃で８時間以上反応した。
次に、イソアミラーゼを２μｌ追加して８時間以上反応した後、常温で１０，０００ｘｇで遠心分離し、上清を脱イオンカラム（ＡＧ５０１−Ｘ８（Ｄ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で濾過した。
次に、α−グルカン鎖の非還元末端を蛍光標識するため、Ｈｉｚｕｋｕｒｉら（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、９４、２０５−２１３（１９８１））の方法により試料中の糖含量を定量し５ｎｍｏｌ相当の還元末端をもつα−グルカン鎖を遠心濃縮機で乾燥させ、１−アミノピレン−３，６，８−三硫酸塩（ＡＰＴＳ）溶液［２．５％のＡＰＴＳ、１５％の酢酸］を２μｌ、シアン化ホウ素ナトリウム溶液［１Ｍのシアン化ホウ素ナトリウム、１００％のテトラヒドロフラン］を２μｌ添加し、５５℃で９０分間反応させた。
分析時には１２．５倍に蒸留水で希釈して用いた。鎖長分布解析は、キャピラリー電気泳動装置（Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒｓ）を用いて行った。
グルコース重合度（ＤＰ）３以上の各ピーク面積を数値化し、ＤＰ６０までのピーク面積の合計を１００％としたときの各ＤＰの割合（Ｍｏｌｅ ％）を算出した。さらに、各変異体イネから野生型イネのパターンを引いた差分（ΔＭｏｌｅ ％）のグラフを作成した。

（粒径分布）
（株）堀場製作所社製の超遠心式自動粒度分析測定装置（ＣＡＰＡ−７００）を用いて粒径分布の測定を行った。本機の初期吸光度が０．７〜０．９になる程度の濃度（約０．０７ ｇ／１００ ｍｌ）で澱粉を水に分散し、１０分間の超音波処理を施して測定試料を調製した。測定方法は遠心沈降測定（ＣＳ測定）を用いた。

（吸水性）
無水物換算で３０．００ｇの澱粉を、２００ｍｌ容積のトールビーカーに量り取り、マグネットスターラーで攪拌が可能となる時点まで蒸留水を僅かずつ添加した。
攪拌が可能となった時点の蒸留水添加量から、スラリー調製限界濃度を算出し、これを吸水性の指標とした。このスラリー調製限界濃度は以下の式（１）で求めた：

スラリー調整限界濃度（％） ＝ 澱粉無水物重量（３０ｇ）／（含水澱粉重量 ＋ 蒸留水添加量） × １００ …… 式（１）

（加熱膨潤度・加熱溶解度）
密栓式５０ｍｌ容積のファルコン（登録商標）チューブに、無水物換算１％（ｗ／ｗ）の澱粉懸濁液を３０．００ｇ調製し、沸騰浴中に３０分間保った。この際に、澱粉が沈殿しないように時々振盪した。次に、このチューブを冷水浴中に３０分間保ち放冷した。
その後、ベックマン（株）社製Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ＧＳ−６を用いて処理液を３０００ ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄液の一部をアルミ皿に広げて重量を測定した（Ａ）。
一方でゲル層の一部もアルミ皿に広げて重量を測定した（Ｂ）。
上澄液とゲル層を１０５℃で４時間以上保って乾固させた後、上澄液乾固後重量（Ｃ）及びゲル層乾固後重量（Ｄ）を測定した。
この上で、以下の式（２）で溶解度を、式（３）で膨潤度を求めた：

溶解度（％） ＝ １００００ × Ｃ ／ Ａ …… 式（２）
膨潤度（倍） ＝ Ｂ ／ Ｄ …… 式（３）

なお、上記実施の形態の構成及び動作は例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実行することができることは言うまでもない。

本発明は、イネスターチシンターゼＩＩＩａ型（ＳＳＩＩＩａ）活性と、イネスターチシンターゼＩＶｂ型（ＳＳＩＶｂ）の活性とが低下したイネ変異体を提供でき、このイネ変異体の澱粉は形状や物理的性質がこれまでの澱粉と異なっており、産業上利用可能である。

配列番号１：ＰＣＲプライマー（Ｔ１Ｒ）５'−ｃｇｇｔｇａａａａｇｇａｃａｇｔｇｇａｇ−３'
配列番号２：ＰＣＲプライマー（Ｔ２Ｒ）５'−ｇｇａｃａｔｇｇｇｃｃａａｃｔａｔａｃａｇ−３'
配列番号３：ＰＣＲプライマー（ＳＳＩＶｂ−３Ｆ）５'−ｃｃｃｇｇｔｔｇｔｇａｔｔａｃｔｇ−３'
配列番号４：ＰＣＲプライマー（ＳＳＩＶｂ−４Ｆ）５'−ｃｇｔｔｃｇｔｔｃｇｔｔｃｔｃａｇｔａｇ−３'
配列番号５：ＰＣＲプライマー（ＳＳＩＶｂ−７Ｆ）５'−ｔｇｔａａｇｃｇａａｇｔｃｔｇｔｔｇｇｃ−３'
配列番号６：ＰＣＲプライマー（ＳＳＩＶｂ−８Ｆ）５'−ｇａｃａａｇｃｔｃｔｔｃｔｇｇｔｇｃｔｃ−３'
配列番号７：ＰＣＲプライマー（ＳＳＩＶｂ−２Ｒ）５'−ａａｔｃｔｇｔｇｃｃｔｇｔｇｇｃａｔｃａ−３'
配列番号８：ＰＣＲプライマー（ＳＳＩＶｂ−５Ｒ）５'−ａｔｃａｇａｇａａｇｇｃａｃｔａｇａｃｇ−３'
配列番号９：ＰＣＲプライマー（ＳＳＩＶｂ−６Ｒ）５'−ｔａｇａｔｇｇｔｃｇｇｃａａｇａｃｇｃｔ−３'
配列番号１０：ＰＣＲプライマー（ＳＳＩＶｂ−１０Ｒ）５'−ｇｃｇｔｃａｇａｇａａａｇｇｃｔｃａｇｇ−３'

Claims (13)

1. イネスターチシンターゼＩＩＩａ型（ＳＳＩＩＩａ）及びイネスターチシンターゼＩＶｂ型（ＳＳＩＶｂ）の遺伝子座が劣性ホモであり、遺伝的に固定されている
   ことを特徴とするイネ変異体。
2. 更に、前記ＳＳＩＩＩａの活性が野生型に比べて低下した
   ことを特徴とする請求項１に記載のイネ変異体。
3. 野生型や親系統と比べて、種子重量が８割以上維持され、農業形質が維持されている
   ことを特徴とする請求項１又は２に記載のイネ変異体。
4. 請求項１乃至３のいずれか１項に記載のイネ変異体を用いた
   ことを特徴とする澱粉の製造方法。
5. 請求項１乃至３のいずれか１項に記載のイネ変異体の胚乳を用いた
   ことを特徴とする澱粉の製造方法。
6. 請求項４又は５に記載の澱粉の製造方法により製造された
   ことを特徴とする澱粉。
7. 野生型イネや前記ＳＳＩＩＩａの活性低下に起因する親系統イネを用いて製造される澱粉とは形状が異なる
   ことを特徴とする請求項６に記載の澱粉。
8. 前記野生型イネや前記親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、澱粉粒が球状である
   ことを特徴とする請求項６又は７に記載の澱粉。
9. 前記野生型イネや前記親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、アミロペクチンのＤＰ≧３７、又はアミロペクチンのクラスターを連結するＢ２鎖より長い鎖が少ない
   ことを特徴とする請求項６乃至８のいずれか１項に記載の澱粉。
10. 前記野生型イネや前記親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、糊化粘度特性が異なる
    ことを特徴とする請求項６乃至９のいずれか１項に記載の澱粉。
11. イネスターチシンターゼＩＩＩａ型（ＳＳＩＩＩａ）変異体と
    イネスターチシンターゼＩＶｂ型（ＳＳＩＶｂ）変異体との二重劣性ホモである
    ことを特徴とするイネ変異体の製造方法。
12. 前記イネスターチシンターゼＩＩＩａ型（ＳＳＩＩＩａ）変異体のイネ及び前記イネスターチシンターゼＩＶｂ型（ＳＳＩＶｂ）変異体のイネは、レトロトランスポゾンＴｏｓ１７の挿入によって得られる
    ことを特徴とする請求項１１に記載のイネ変異体の製造方法。
13. 請求項１１又は１２に記載のイネ変異体の製造方法により製造する
    ことを特徴とするイネ変異体。

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