JP2011017965A

JP2011017965A - 顕微鏡装置、および顕微鏡装置の制御方法

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Publication number: JP2011017965A
Application number: JP2009163579A
Authority: JP
Inventors: Tadashi Uchida; 忠打田
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2009-07-10
Filing date: 2009-07-10
Publication date: 2011-01-27

Abstract

【課題】標本内部に刺激光を照射して、標本の界面付近の反応を観察する。
【解決手段】顕微鏡装置１１では、コンフォーカル光学系１９を介して標本１２の各深さごとに照射されるレーザ光による標本１２の各深さごとの蛍光断面画像を取得し、全反射照明光学系１７を介して標本１２の境界面で全反射するように照射されるレーザ光による標本１２の境界面の蛍光画像を取得し、蛍光断面画像に基づいて指定される所定箇所にコンフォーカル光学系１９を介して刺激光を照射し、刺激光が照射された後に、全反射照明光学系１７を介して標本１２の境界面で全反射するように照射されるレーザ光による標本１２の境界面の蛍光画像を取得する。本発明は、例えば、全反射照明光学系およびコンフォーカル光学系を有する顕微鏡装置に適用できる。
【選択図】図１

Description

本発明は、顕微鏡装置、および顕微鏡装置の制御方法に関し、特に、標本内部を刺激したことによる標本界面付近での反応を観察することができるようにした顕微鏡装置、および顕微鏡装置の制御方法に関する。

従来、共焦点レーザ走査顕微鏡や全反射顕微鏡などでは、蛍光染色された生物などの標本にレーザ光を照射し、そのレーザ光により励起された蛍光に基づいて標本を観察する蛍光観察が行われている。

例えば、共焦点レーザ走査顕微鏡では、対物レンズの回折限界付近に絞られたレーザ光スポットを標本に走査しながら照射し、レーザ光の照射された部分で発生した蛍光が、光学的共役位置に置かれた微小開口を通して検出され、標本の観察が行われる。

また、全反射顕微鏡では、カバーガラスに密着した標本にカバーガラス側から照明光を照射し、カバーガラスと標本との境界面で入射光が全反射する臨界角以上で入射された照明光の全反射領域でエバネッセント波を発生させ、標本の境界面近傍のエバネッセント波により励起された標本の境界面近傍蛍光により、標本の観察が行われる。このような境界面付近の観察では、観察像のコントラストが改善されるので、微弱光による現象を捉えることができる。

さらに、特許文献１および２には、１台の顕微鏡装置を、共焦点レーザ走査顕微鏡および全反射顕微鏡として使用する技術が開示されている。

特開２００３−２７０５３８号公報特開２００４−８５８１１号公報

ところで、近年、標本内部を刺激したことによる標本界面付近での反応を観察したいという要求がある。しかしながら、従来の顕微鏡装置では、観察面と同一の深さ方向に刺激光を照射して標本内部を刺激することはできるが、標本内部の特定した深さに刺激光を照射し、その後の標本の界面付近における反応を観察することは困難であった。

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、標本内部を刺激したことによる標本界面付近での反応を観察することができるようにするものである。

本発明の顕微鏡装置は、カバーガラスに密着した状態の標本に、前記標本と前記カバーガラスとの境界面で全反射するようにレーザ光を照射する全反射照明光学系と、前記標本の内部にレーザ光を集光するとともに走査するコンフォーカル光学系と、前記コンフォーカル光学系を介して、前記標本の内部を刺激する刺激光を発する刺激光光源とを備え、前記コンフォーカル光学系を介して前記標本の各深さごとに照射されるレーザ光による前記標本の各深さごとの蛍光断面画像を取得し、前記全反射照明光学系を介して前記標本の前記境界面で全反射するように照射されるレーザ光による前記標本の境界面の蛍光画像を取得し、前記蛍光断面画像に基づいて指定される所定箇所に前記コンフォーカル光学系を介して前記刺激光を照射し、前記刺激光が照射された後に、前記全反射照明光学系を介して前記標本の前記境界面で全反射するように照射されるレーザ光による前記標本の境界面の蛍光画像を取得する制御を行う制御部を有することを特徴とする。

本発明の顕微鏡装置の制御方法は、カバーガラスに密着した状態の標本に、前記標本と前記カバーガラスとの境界面で全反射するようにレーザ光を照射する全反射照明光学系と、前記標本の内部にレーザ光を集光するとともに走査するコンフォーカル光学系と、前記コンフォーカル光学系を介して、前記標本の内部を刺激する刺激光を発する刺激光光源とを備える顕微鏡装置の制御方法であって、前記コンフォーカル光学系を介して前記標本の各深さごとに照射されるレーザ光による前記標本の各深さごとの蛍光断面画像を取得し、前記全反射照明光学系を介して前記標本の前記境界面で全反射するように照射されるレーザ光による前記標本の境界面での蛍光画像を取得し、前記蛍光断面画像に基づいて指定される所定箇所に前記コンフォーカル光学系を介して前記刺激光を照射し、前記刺激光が照射された後に、前記全反射照明光学系を介して前記標本の前記境界面で全反射するように照射されるレーザ光による前記標本の境界面での蛍光画像を取得するステップを含むことを特徴とする。

本発明の顕微鏡装置、および顕微鏡装置の制御方法においては、コンフォーカル光学系を介して標本の各深さごとに照射されるレーザ光による標本の各深さごとの蛍光断面画像が取得され、全反射照明光学系を介して標本の境界面で全反射するように照射されるレーザ光による標本の境界面の蛍光画像が取得され、蛍光断面画像に基づいて指定される所定箇所にコンフォーカル光学系を介して刺激光が照射される。そして、刺激光が照射された後に、全反射照明光学系を介して標本の境界面で全反射するように照射されるレーザ光による標本の境界面での蛍光画像が取得される。

本発明の顕微鏡装置、および顕微鏡装置の制御方法によれば、標本内部を刺激したことによる標本界面付近での反応を観察することができる。

本発明を適用した顕微鏡装置の第１の実施の形態の構成例を示す図である。顕微鏡装置により標本を観察する処理を説明するフローチャートである。本発明を適用した顕微鏡装置の第２の実施の形態の構成例を示す図である。

以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。

図１は、本発明を適用した顕微鏡装置の第１の実施の形態の構成例を示す図である。

図１の顕微鏡装置１１では、主に蛍光染色された生物などの標本１２に対する観察が行われ、標本１２は、カバーガラス１３に密着した状態でシャーレ１４に収容されている。

例えば、顕微鏡装置１１では、レーザユニット１５−１から光ファイバ１６−１を介して全反射照明光学系１７に導入されたレーザ光が、全反射照明光学系１７を介して、カバーガラス１３と標本１２との境界面で全反射するように照射される。そして、その全反射領域で発生するエバネッセント波により、カバーガラス１３との境界面付近の標本１２が励起されて蛍光が発生し、その蛍光による画像が撮像装置１８により撮像される。

また、顕微鏡装置１１では、レーザユニット１５−２から光ファイバ１６−２を介してコンフォーカル光学系１９に導入されたレーザ光が、コンフォーカル光学系１９を介して、標本１２に照射され、標本１２の所定の深さでレーザ光のスポットがＸＹ平面で走査される。そして、標本１２内のスポットで発生した蛍光が、光学的に共役な位置に配置されているピンホール２０を通過してPMT（Photo Multiplier Tube）２１により検出されて、標本１２のＸＹ平面における画像が構築される。

さらに、顕微鏡装置１１では、コンフォーカル光学系１９を介して標本１２の内部を刺激するレーザ光（刺激光）が照射された後、全反射照明光学系１７を介して標本１２に照射されるレーザ光により、標本１２の内部を刺激したことによる標本１２の境界面付近の反応が観察される。

このように、顕微鏡装置１１では、全反射照明光学系１７を介して照射されるレーザ光による観察と、コンフォーカル光学系１９を介して照射されるレーザ光による観察とを行うことができ、それぞれのレーザ光の光路が、光路合成部２２において合成される。つまり、顕微鏡装置１１は、全反射照明光学系１７とコンフォーカル光学系１９とが同一の階層に配置されるように構成されている。

顕微鏡装置１１の対物レンズ２７は、標本１２を収容するシャーレ１４の下方に配置されており、例えば、ピエゾ素子などの高速な駆動手段を有する対物レンズ駆動部２８により、対物レンズ２７の光軸Ｌ１に沿って移動可能とされている。なお、以下、適宜、対物レンズ２７の光軸Ｌ１の方向をＺ方向と称し、Ｚ方向に直交する平面をＸＹ平面と称する。

また、標本１２の反対側となる対物レンズ２７の光軸Ｌ１上には、対物レンズ２７側から順に、ハーフミラー２９、集光レンズ３０、およびミラー３１が配置されており、ミラー３１により反射された光軸Ｌ２上には、フィルタ３２と、撮像装置１８の受光面３３とが配置されている。

即ち、全反射照明光学系１７を介して標本１２に照射されるレーザ光によって、カバーガラス１３との境界面近傍の標本１２から発せられる蛍光は、対物レンズ２７およびハーフミラー２９を介して、集光レンズ３０により集光されてミラー３１により反射された後、フィルタ３２によりフィルタリングされて撮像装置１８の受光面３３に結像する。

また、ハーフミラー２９により分岐される光路の光軸Ｌ３上には、ハーフミラー２９側から順に、リレーレンズ３４および３５、ハーフミラー３６、視野絞り３７、並びに、集光レンズ３８および３９が配置されており、その先に、光ファイバ１６−１の端部が配置されている。

即ち、光ファイバ１６−１から射出されたレーザ光は、集光レンズ３８および３９により集光され、その焦点位置に配置されている視野絞り３７により絞られた後、ハーフミラー３６を透過し、リレーレンズ３４および３５によりリレーされてハーフミラー２９に入射する。そして、ハーフミラー２９により反射されたレーザ光は、対物レンズ２７により標本１２の境界面で全反射するように照射される。

また、ハーフミラー３６により分岐された光路の光軸Ｌ４上には、ハーフミラー３６側から順に、集光レンズ４０および４１、ＸＹスキャナ４２、ダイクロイックミラー４３、集光レンズ４４、ピンホール２０、フィルタ４５、並びに、PMT２１が配置されている。また、ダイクロイックミラー４３により分岐された光路の光軸Ｌ５上には、ダイクロイックミラー４６、およびコリメータレンズ４７が配置されており、その先に、光ファイバ１６−２の端部が配置されている。

即ち、光ファイバ１６−２から射出されたレーザ光は、コリメータレンズ４７により平行な光束とされ、ダイクロイックミラー４６を透過して、ダイクロイックミラー４３により反射された後、ＸＹスキャナ４２に入射する。そして、ＸＹスキャナ４２により、標本１２のＸＹ平面で走査するようにスキャンされたレーザ光は、集光レンズ４０および４１を介してハーフミラー３６で反射され、リレーレンズ３４および３５によりリレーされた後、ハーフミラー２９により反射されて、対物レンズ２７により標本１２の内部でスポットを形成するように照射される。

そして、そのスポットで発生した蛍光は、励起用のレーザ光と逆の光路を通過して、ＸＹスキャナ４２によりデスキャンされた後、ダイクロイックミラー４３を透過して、集光レンズ４４により集光される。そして、その蛍光は、集光レンズ４４の焦点距離に配置されているピンホール２０によりセクショニングされ、フィルタ４５によりフィルタリングされた後、PMT２１に入射する。

このように、顕微鏡装置１１では、リレーレンズ３４および３５、ハーフミラー３６、視野絞り３７、並びに、集光レンズ３８および３９により、全反射照明光学系１７が構成されている。また、顕微鏡装置１１では、リレーレンズ３４および３５、ハーフミラー３６、集光レンズ４０および４１、ＸＹスキャナ４２、ダイクロイックミラー４３、集光レンズ４４、ピンホール２０、フィルタ４５、PMT２１、ダイクロイックミラー４６、並びに、コリメータレンズ４７により、コンフォーカル光学系１９が構成されている。

また、ダイクロイックミラー４６により分岐された光路の光軸Ｌ６上には、シャッタ４８、AOTF（Aoucst Optic Tunable Filter）４９、極短パルスレーザ５０が配置されている。

レーザユニット１５−１および１５−２は、波長が405nmであるレーザ光の光源であるレーザ光源５１−１および５１−２と、波長が488nmであるレーザ光の光源であるレーザ光源５２−１および５２−２とをそれぞれ有している。

レーザユニット１５−１において、レーザ光源５１−１から射出されるレーザ光は、シャッタ５３−１、ダイクロイックミラー５４−１、AOTF５５−１、シャッタ５６−１、および集光レンズ５７−１を介して、光ファイバ１６−１に入射する。また、レーザ光源５２−１から射出されるレーザ光は、シャッタ５８−１を介してミラー５９−１およびダイクロイックミラー５４−１により反射されて、AOTF５５−１、シャッタ５６−１、および集光レンズ５７−１を介して、光ファイバ１６−１に入射する。

レーザユニット１５−２は、レーザユニット１５−１と同様に構成されている。また、レーザユニット１５−２のレーザ光源５１−２から射出される波長405nmのレーザ光は、標本１２の内部を刺激するための刺激光として使用され、レーザ光源５２−２から射出される波長488nmのレーザ光は、標本１２から発せられる蛍光による断面画像を取得するための励起光として使用される。

また、顕微鏡装置１１は、その各部を制御する制御部６０を備えている。例えば、制御部６０は、対物レンズ駆動部２８を制御して、対物レンズ２７をＺ方向に駆動させたり、ＸＹスキャナ４２を制御して、レーザユニット１５−２から発せられるレーザ光（刺激光）を標本１２の内部における所定のＸＹ平面内の任意の箇所に照射させたりする。

次に、図２のフローチャートを参照して、顕微鏡装置１１による標本１２の観察する処理について説明する。

ステップＳ１１において、顕微鏡装置１１は、コンフォーカル光学系１９を介して標本１２に照射されるレーザ光（励起光）を使用し、標本１２の各深さでの断面画像を取得する。

即ち、制御部６０は、レーザユニット１５−１のシャッタ５３−１および５８−１、並びに、レーザユニット１５−２のシャッタ５３−２を閉鎖するとともに、レーザユニット１５−２のシャッタ５８−２を開放させて、レーザ光源５２−２から発せられる波長488nmのレーザ光を標本１２に照射させ、そのレーザ光スポットにより発生する蛍光を、ピンホール２０を介してPMT２１により検出させ、PMT２１からの出力に基づいて断面画像を構築する。そして、ＸＹスキャナ４２によるレーザ光スポットのスキャンによって１枚の断面画像が取得されるたびに、例えば、0.1μｍずつレーザ光スポットが標本１２の内側に移動されるように、対物レンズ駆動部２８を制御して対物レンズ２７を移動させる。

そして、例えば、標本１２全体の断面画像が取得されると、ユーザは、それらの断面画像に基づいて、刺激したい箇所の座標（Ｚ座標およびＸＹ座標）を、図示しない入力装置により指定し、制御部６０は、その座標を記憶する。

ステップＳ１２において、顕微鏡装置１１は、全反射照明光学系１７を介して標本１２に照射されるレーザ光を使用し、標本１２の境界面近傍での画像を取得する。

即ち、制御部６０は、レーザユニット１５−１のシャッタ５３−１、並びに、レーザユニット１５−２のシャッタ５３−２および５８−２を閉鎖するとともに、レーザユニット１５−１のシャッタ５８−１を開放させて、レーザ光源５２−１から発せられる波長488nmのレーザ光を標本１２に照射させる。そして、そのレーザ光がカバーガラス１３と標本１２との境界面で全反射することにより発生するエバネッセント波によって発生する蛍光による画像を撮像装置１８で撮像させる。また、制御部６０は、このときの対物レンズ２７のＺ方向の位置を記憶する。

ステップＳ１３において、顕微鏡装置１１は、標本１２の内部を刺激する。

即ち、制御部６０は、ステップＳ１１において指定されたＺ座標にレーザ光が照射されるように、対物レンズ駆動部２８を制御して対物レンズ２７を移動させるとともに、ステップＳ１１において指定されたＸＹ座標にレーザ光が照射されるように、ＸＹスキャナ４２を制御する。そして、制御部６０は、レーザユニット１５−１のシャッタ５３−１および５８−１、並びに、レーザユニット１５−２のシャッタ５８−２を閉鎖するとともに、レーザユニット１５−２のシャッタ５３−２を開放させて、レーザ光源５１−２から発せられる波長405nmのレーザ光を標本１２に照射させる。

ステップＳ１４において、顕微鏡装置１１は、レーザ光により内部が刺激された標本１２の境界面近傍での画像を取得する。

即ち、制御部６０は、対物レンズ駆動部２８を制御して、ステップＳ１２の処理で記憶したＺ方向の位置に対物レンズ２７を移動させ、ステップＳ１２での処理と同様に、レーザ光源５２−１から発せられる波長488nmのレーザ光を標本１２に照射させる。そして、そのレーザ光がカバーガラス１３と標本１２との境界面で全反射することにより発生するエバネッセント波によって発生する蛍光による画像を撮像装置１８で撮像させる。

ステップＳ１５において、顕微鏡装置１１は、レーザ光により内部が刺激された標本１２の各深さでの断面画像を、ステップＳ１１での処理と同様に取得し、処理は終了する。

以上のように、顕微鏡装置１１では、レーザユニット１５−１のシャッタ５３−１および５８−１、並びに、レーザユニット１５−２のシャッタ５３−２およびシャッタ５８−２と対物レンズ駆動部２８とが連動して制御されるので、標本１２の各深さでの断面画像を取得する処理、標本１２の内部を刺激する処理、および、標本１２の境界面近傍での画像を取得する処理を行うことができる。特に、対物レンズ駆動部２８により対物レンズ２７を高速で移動させることができるので、標本１２の内部を刺激した直後の標本１２の境界面近傍での反応を観察することができる。

また、顕微鏡装置１１では、ステップＳ１１において、コンフォーカル光学系１９で標本１２の各深さでの断面画像を取得するので、それらの断面画像に基づいて、標本１２の内部の刺激する箇所を指定することができる。制御部６０は、指定された箇所を記憶し、対物レンズ駆動部２８およびＸＹスキャナ４２を制御して、その箇所を刺激することができる。そして、標本１２の内部が刺激されたことによる、標本１２の境界面での反応と、標本１２の内部での反応とをそれぞれ観察することができる。

なお、顕微鏡装置１１では、刺激光により標本１２の内部を刺激した後、全反射照明光学系１７を介して照射されるレーザ光による標本１２の境界面近傍での画像を取得する処理と、コンフォーカル光学系１９を介して照射されるレーザ光（励起光）による標本１２の刺激箇所より深い断面での画像を取得する処理とを、交互に繰り返して行うことができる。これにより、標本１２の表面および内部における反応を連続的に観察することができる。

また、例えば、標本１２の内部の刺激する箇所を複数指定し、適宜、標本１２の内部の刺激する箇所を変更しながら、標本１２の境界面での反応を観察してもよい。

なお、レーザユニット１５−１および１５−２から射出されるレーザ光のＯＮ／ＯＦＦの切り替えを、AOTF５５−１および５５−２を利用して行うことができる。また、AOTF５５−１および５５−２により、標本１２に照射されるレーザ光の光量を調整することができる。

また、対物レンズ２７をＺ方向に動かす替わりに、シャーレ１４が載置されるステージ（図示せず）をＺ方向に動かすように構成してもよい。

さらに、ステップＳ１３の標本１２の内部刺激を、レーザ光源５１−２から発せられる波長405nmのレーザ光に代えて、極短パルスレーザ５０から発せられる約810 nmのレーザ光を照射することによっても実現できる。２光子励起現象が起こるのはレーザ光の集光位置付近のみなので、極めて局所的な刺激が可能となる。

なお、顕微鏡装置１１は、全反射照明光学系１７とコンフォーカル光学系１９とが同一の階層に配置されるように構成されているが、全反射照明光学系１７とコンフォーカル光学系１９とが異なる階層に配置されるように構成してもよい。即ち、顕微鏡装置１１では、光路合成部２２のハーフミラー３６により、全反射照明光学系１７の光路とコンフォーカル光学系１９の光路とが合成されるが、例えば、光路合成部２２を使用せずに、全反射照明光学系１７の光路とコンフォーカル光学系１９の光路とが合成されないように顕微鏡装置１１を構成することができる。

次に、図３は、本発明を適用した顕微鏡装置の第２の実施の形態の構成例を示す図である。なお、図３の顕微鏡装置１００において、図１の顕微鏡装置１１と同一の構成要素には、同一の符号が付されており、適宜、その説明を省略する。

図３の顕微鏡装置１００は、全反射照明光学系１７とコンフォーカル光学系１９とが階層状に配置されるように構成されている。

即ち、顕微鏡装置１００は、図１の顕微鏡装置１１のミラー３１に替えてハーフミラー１０１が用いられており、ハーフミラー１０１の先にコンフォーカル光学系１９が設けられている。そして、コンフォーカル光学系１９からのレーザ光は、ハーフミラー１０１を透過して、光軸Ｌ１に沿って標本１２に照射される。

このように構成されている顕微鏡装置１００においても、顕微鏡装置１１と同様に、標本１２の各深さでの断面画像を取得する処理、標本１２の内部を刺激する処理、および、標本１２の境界面近傍での画像を取得する処理を行うことができる。

なお、上述のフローチャートを参照して説明した各処理は、必ずしもフローチャートとして記載された順序に沿って時系列に処理する必要はなく、並列的あるいは個別に実行される処理（例えば、並列処理あるいはオブジェクトによる処理）も含むものである。

なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。

１１顕微鏡装置，１２標本，１３カバーガラス，１４シャーレ，１５−１および１５−２レーザユニット，１６−１および１６−２光ファイバ，１７全反射照明光学系，１８撮像装置，１９コンフォーカル光学系，２０ピンホール，２１ PMT，２２光路合成部，２７対物レンズ，２８対物レンズ駆動部，２９ハーフミラー，３０集光レンズ，３１ミラー，３２フィルタ３２，３３受光面，３４および３５リレーレンズ，３６ハーフミラー，３７視野絞り，３８および３９集光レンズ，４０および４１集光レンズ，４２ＸＹスキャナ，４３ダイクロイックミラー，４４集光レンズ，４５フィルタ，４６ダイクロイックミラー，４７コリメータレンズ，４８シャッタ，４９ AOTF，５０極短パルスレーザ，５１−１および５１−２レーザ光源，５２−１および５２−２レーザ光源，５３−１および５３−２シャッタ，５４−１および５４−２ダイクロイックミラー，５５−１および５５−２ AOTF，５６−１および５６−２シャッタ，５７−１および５７−２集光レンズ，５８−１および５８−２シャッタ，５９−１および５９−２ダイクロイックミラー，６０制御部

Claims

カバーガラスに密着した状態の標本に、前記標本と前記カバーガラスとの境界面で全反射するようにレーザ光を照射する全反射照明光学系と、
前記標本の内部にレーザ光を集光するとともに走査するコンフォーカル光学系と、
前記コンフォーカル光学系を介して、前記標本の内部を刺激する刺激光を発する刺激光光源と
を備え、
前記コンフォーカル光学系を介して前記標本の各深さごとに照射されるレーザ光による前記標本の各深さごとの蛍光断面画像を取得し、
前記全反射照明光学系を介して前記標本の前記境界面で全反射するように照射されるレーザ光による前記標本の境界面の蛍光画像を取得し、
前記蛍光断面画像に基づいて指定される所定箇所に前記コンフォーカル光学系を介して前記刺激光を照射し、
前記刺激光が照射された後に、前記全反射照明光学系を介して前記標本の前記境界面で全反射するように照射されるレーザ光による前記標本の境界面の蛍光画像を取得する
制御を行う制御部を有する
ことを特徴とする顕微鏡装置。
前記刺激光が照射された後に、前記コンフォーカル光学系を介して前記標本の各深さごとに照射されるレーザ光による前記標本の各深さごとの蛍光断面画像を取得する
ことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
前記刺激光が照射された後に、前記全反射照明光学系を介して前記標本の前記境界面で全反射するように照射されるレーザ光による前記標本の境界面の蛍光画像を取得する処理と、前記コンフォーカル光学系を介して前記標本の各深さごとに照射されるレーザ光による前記標本の所定の深さの蛍光断面画像を取得する処理とを繰り返して行う
ことを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡装置。
顕微鏡装置の制御方法において、
前記顕微鏡装置は、
カバーガラスに密着した状態の標本に、前記標本と前記カバーガラスとの境界面で全反射するようにレーザ光を照射する全反射照明光学系と、
前記標本の内部にレーザ光を集光するとともに走査するコンフォーカル光学系と、
前記コンフォーカル光学系を介して、前記標本の内部を刺激する刺激光を発する刺激光光源と
を備え、
前記コンフォーカル光学系を介して前記標本の各深さごとに照射されるレーザ光による前記標本の各深さごとの蛍光断面画像を取得し、
前記全反射照明光学系を介して前記標本の前記境界面で全反射するように照射されるレーザ光による前記標本の境界面の蛍光画像を取得し、
前記蛍光断面画像に基づいて指定される所定箇所に前記コンフォーカル光学系を介して前記刺激光を照射し、
前記刺激光が照射された後に、前記全反射照明光学系を介して前記標本の前記境界面で全反射するように照射されるレーザ光による前記標本の境界面の蛍光画像を取得する
ステップを含むことを特徴とする顕微鏡装置の制御方法。