JP2010538077A - プテロスチルベン投与を介して酸化的ストレスを改善し、かつ作業記憶を向上させる方法 - Google Patents

Abstract

治療有効量のプテロスチルベンの実質的に純粋な化合物および生理学的に許容可能な担体を含む酸化的ストレスを処置するための医薬品組成物を開示する。プテロスチルベンは、被検体の体重の１キログラムあたり、約２．５ｍｇから約１０ｍｇの量で投与される。また、被検体の作業記憶を増加させる方法であって、治療有効量のプテロスチルベンの実質的に純粋な化合物を投与する工程を含み、被検体の作業記憶が増加することを開示し、上記治療有効量は、被検体の体重の１キログラムあたり、約１０ｍｇのプテロスチルベンである。
【選択図】なし

Description

本発明は、神経および行動の老化の作用ならびに神経変性疾患の発達を予防、阻止、および回復させるために有効量で被検体に投与されるプテロスチルベンの使用方法に関する。より詳細には、レスベラトロルアナログプテロスチルベンは、被検体の運動欠陥および作業記憶を回復させることに効果的である。

果実および野菜での食事による補給は老化する被検体に伴う欠陥を阻止および回復させる影響を与える。液果類（例えば、クランベリーおよびブルーベリー等のスノキ属（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）ベリー類）を用いた食事による補給を含む栄養養生法は老化に伴う運動および認知の変化の両方を回復および／または予防する。例えば、ブルーベリーの補給は、ＡＰＰ／ＰＳ−１変異を用いたアミロイドβ−ペプチド生成を増加させたマウスにおける認知行動欠陥を阻止する（非特許文献１）。液果類の有用な効果は、酸化的ストレッサーに対する直接および間接の作用を含む。従って、運動および認知機能における酸化により媒介された変化を変えることにおいて効果的である、液果類内の化合物を同定する必要性が存在する。

トランス−３，５，４’−トリヒドロキシスチルベン（以降、レスベラトロルと呼ぶ）は、その強い抗酸化活性のために、複数の老化防止特性を有すると確認されている。体外での実験では、レスベラトロルは、効果的な遊離基捕捉剤であり、低密度のリポタンパク質の酸化を抑制することが証明されている（非特許文献２）。他のスチルベノイド（例えば、ピノスチルベン、デスオキシラポンチゲニン、プテロスチルベン、レスベラトロルトリメチルエーテル、およびピセタノール）は、核内受容体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体αアイソフォームを活性化することによって、脂質レベルを低下させるための生物学的活性および効果のさまざまな度合いを有する。

トランス−３，５−ジメトキシ−４’−ヒドロキシスチルベン（以降、プテロスチルベンと呼ぶ）、レスベラトロルの天然のメチルエーテルアナログは、レスベラトロルのものと類似する抗酸化活性を有することが証明されている（非特許文献３、非特許文献４）。プテロスチルベンは、ブドウ等の一部の小さな果実（非特許文献５）およびスノキ属のベリー（ラビットアイブルーベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ａｓｈｅｉ Ｒｅａｄｅ）およびコバイケイソウ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｓｔａｍｉｎｅｕｍ Ｌ．））（非特許文献６）、ならびに木本（非特許文献７、非特許文献８）に存在する。さらに、アノゲイスス アクミナタ（Ａｎｏｇｅｉｓｓｕｓ ａｃｕｍｉｎａｔａ）、ドラセナ シタン（Ｄｒａｃａｅｎａ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ドラセナ パラオ（Ｄｒａｃａｅｎａ ｌｏｕｒｅｉｒｉ）、グイボルティア テスマニイ（Ｇｕｉｂｏｕｒｔｉａ ｔｅｓｓｍａｎｎｉｉ）、ビルマカリン（Ｐｔｅｒｏｃａｒｐｕｓ ｍａｃｒｏｃａｒｐｕｓ）、プテロカルプス マルスピウム（Ｐｔｅｒｏｃａｒｐｕｓ ｍａｒｓｕｐｉｕｍ）、プテロカルプス サンタリヌス（Ｐｔｅｒｏｃａｒｐｕｓ ｓａｎｔａｌｉｎｕｓ）、ラビットアイブルーベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ａｓｈｅｉ）、ハイブッシュ ブルーベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｃｏｒｙｍｂｏｓｕｍ）、スノキ属デリシオサム（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｄｅｌｉｃｉｏｓｕｍ）、シンリーフ ハックルベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｍ）、カリフォルニア ハックルベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｏｖａｔｕｍ）、クロウスゴ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｏｖａｌｉｆｏｉｌｕｍ）、スノキ属パルビフローラム（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ）、スノキ属スタミネウム（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｓｔａｍｉｎｅｕｍ）、クロマメノキ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍ）、およびヴィティス ヴィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｒｅａ）を含む複数の植物が、プテロスチルベンを含む。プテロスチルベンはまた、プロポリス等の非植物源において見出される。

プテロスチルベンのレベルは、スノキ属ベリー類の種によって異なり得る。非特許文献６の報告によれば、スノキ属ベリー類の品種によるプテロスチルベン濃度は、乾燥試料の９９ｎｇ／ｇｍから５２０ｎｇ／ｇｍを有することが報告されている。さらに、非特許文献９によって報告されているように、スノキ属の９品種の種からの凍結乾燥されたベリーが、ベリー１グラム当り０．１２μｇから２．７４μｇのプテロスチルベンを示した。同様に、ブルーベリー種により、プテロスチルベン濃度の量は様々である。９９ｎｇから４７５ｎｇの範囲のプテロスチルベンが凍結乾燥したブルーベリー１グラムから誘導され得ることが報告されている。

複数の研究により、抗酸化効果と脳の老化および行動の有害な作用とが関連付けられている。果実および野菜に、植物の一次代謝に通常含まれていない「二次的な化学物質（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）」の形態で見出される抗酸化性／抗炎症性ポリフェノールの組み合わせは、これらの有害な作用を抑えるのに有効であることを示している。従って、果実および植物、特に、老化および認知障害を防ぐことができる化合物をさらに同定する必要性が存在する。

プテロスチルベンの化合物は、抗炎症活性を示唆するシクロオキシゲナーゼ−１の適度な抑制およびシクロオキシゲナーゼ−２の弱い抑制を示した（非特許文献３）。さらに、プテロスチルベンは、脂質およびグルコースレベルを低下することを媒介すると提唱されているペルオキシソーム増殖因子活性化αアイソフォーム、（ＰＰＡＲα）受容体を活性化すると確認されている。プテロスチルベンのＰＰＡＲαアゴニスト作用の詳細は、非特許文献１０および特許文献１に開示され、それらの両方は参照することにより本明細書に援用される。

プテロスチルベンは結腸癌発症を抑制することが確認されている。特に、プテロスチルベンは、離乳雄性Ｆ３４４ラットにおけるアゾキシメタン誘発性の結腸異常腺窩巣の増殖を抑制する。さらに、プテロスチルベンは、ＨＴ−２９ヒト腺癌細胞株における誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の発現を抑制する（非特許文献１１）。

老化現象を示す被検体における認知変化を改善しようとするために、当該技術分野において、老化現象を示す被検体へのプテロスチルベンの補給が、補給しない被検体と比較して認知障害および運動障害を回復させるかどうかを決定する必要が存在する。

ムスカリン性コリン受容体は、末梢神経系および中枢神経系、胃腸系、心臓、内分泌腺、肺、ならびに他の組織における神経伝達物質アセチルコリンの作用を媒介する。５つの異なるムスカリン性受容体のサブタイプは、ｍ１〜ｍ５と同定されている。ｍ１のサブタイプは大脳皮質において見出される主なサブタイプであり、認知機能の制御に関連すると考えられている。

アルツハイマー病等の認知機能障害に伴う状態は、脳におけるアセチルコリンの損失に付随して生じる。これは、連合皮質および海馬の領域を刺激し、より高度な認知プロセスに関連する前脳基底部におけるコリン作動性ニューロンの変性の結果と考えられている。

従って、脳内におけるアセチルコリンシグナル伝達作用を増加させる化合物を同定する必要が存在する。特に、中枢神経系および末梢神経系における様々な受容体のサブタイプにおいて機能するムスカリン作動薬としての化合物を同定する必要性が存在する。

米国特許出願第２００６／００５７２３Ａ１号明細書

Ｊｏｓｅｐｈ ＪＡら、２００３年、Ｎｕｔｒ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、６：１５３−１６２ Ｂｒｉｔｏ Ｐ．ら、２００２年、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｒｅｓ．３６（６）：６２１−６３１ Ｒｉｍａｎｄｏら、２００２年、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．５０：３４５３−３４５７ Ｓｔｉｖａｌａら、２００１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２５）：２２５８６−２２５９４ Ａｄｒｉａｎら、２０００年、Ｊ．Ａｒｇｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．４８：６１０３−６１０５ Ｒｉｍａｎｄｏら、２００４年、Ｊ．Ａｒｇｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．５２：４７１３−４７１９ Ｍａｕｒｙａら、１９７７年、Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．４７：１７９−１８１ Ａｍｏｎｅら、１９７７年、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎｓ Ｔｒａｎｓ．１９：２１１６−２１１８ Ｒｉｍａｎｄｏら、Ａｃｔａ Ｈｏｒｔ．（ＩＳＨＳ）．６８０：１３７−１４３ Ｒｉｍａｎｄｏら、２００５年、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．５３：３４０３−３４０７ Ｓｕｈら、２００７年、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３（１）３５０−３５５

本発明の目的は、神経および行動の老化の作用を処置する組成物を提供し、酸化的ストレスによって生じる神経変性疾患の進行を抑制することである。

治療有効量の、以下の式：

の実質的に純粋な化合物および生理学的に許容可能な担体を含む酸化的ストレスを処置するための医薬品組成物を開示する。本発明の一実施形態において、プテロスチルベンは、被検体の体重の１キログラムあたり、約２．５ｍｇないし約１０ｍｇの量で投与される。本発明の別の実施形態において、上記治療有効量のプテロスチルベンは、スノキ属ベリー類の食事を介して投与される。別の実施形態において、スノキ属ベリー類はブルーベリーである。

酸化的ストレスを処置するための方法であって、治療有効量の、以下の式：

の実質的に純粋な化合物を投与する工程を含み、上記被検体への酸化的ストレスが低減されることを開示する。本発明の一実施形態において、上記プテロスチルベンは、被検体の体重の１キログラムあたり、約２．５ｍｇないし約１０ｍｇを含む量で投与される。別の実施形態において、上記化合物は被検体のアセチルコリン受容体活性を増加させる。さらに別の実施形態において、上記投与された化合物の量は、上記被検体に酸化的ストレッサーを受けさせた場合に、ドーパミン放出の抑制を阻止する。別の実施形態において、プテロスチルベンはスノキ属ベリー類の食事を介して投与される。別の実施形態において、上記スノキ属ベリー類はブルーベリーである。別の実施形態において、プテロスチルベンは、ムスカリン性受容体サブタイプ（例えばサブタイプはｍ−１である）のカルシウムを緩衝する能力を増加させる。また、被検体の作業記憶を増加させる方法であって、治療有効量の実質的に純粋なプテロスチルベンを投与する工程を含み、被検体の上記作業記憶が増加することを開示する。一実施形態において、上記治療有効量のプテロスチルベンは、被検体の体重の１キログラムあたり、約１０ｍｇの化合物である。

本発明は、上述の目的および他の目的ならびに利点と共に、図面に示される本発明の実施形態の以下の詳細な記載から最も良く理解され得る。

図１は、様々なスチルベン誘導体の化学構造を示す。 図２は、０ドーパミン（−ドーパミン）または１ｍＭドーパミン（＋ドーパミン）処理を施された後、Ｍ１トランスフェクトＣＯＳ−７細胞のコントロール細胞、ならびに、ブルーベリー、レスベラトロル、ピノスチルベン、デスオキシラポンチゲニン、プテロスチルベン、プテロスチルベングルコシド、レスベラトロルトリメチルエーテル、またはピセタノールで前処理された細胞における平均Ｃａ^２＋回復のグラフである。アスタリスクは、各処理に対するドーパミン処理していない細胞とドーパミン処理した細胞との間の回復における差異を示す（^＊＝ｐ＜０．００１）。 図３は、低量のプテロスチルベンの補給物（０．００４％ｗ／ｗ）を投与した、高量のプテロスチルベンの補給物（０．０１６％ｗ／ｗ）を投与した、または被検体の食事の中にプテロスチルベンを投与しない（コントロール）被検体の、秒単位におけるプラットフォームまでの潜伏の測定のグラフである。アスタリスクは各食事群に対する試行１と試行２の能力との間の差異を示す（^＊＝ｐ＜０．０５）。 図４は、低量のプテロスチルベンの補給物（０．００４％ｗ／ｗ）を投与した、高量のプテロスチルベンの補給物（０．０１６％ｗ／ｗ）を投与した、または被検体の食事の中にプテロスチルベンを投与しない（コントロール）被検体の、メートル単位におけるプラットフォームまでの距離の測定のグラフである。アスタリスクは各食事群に対する試行１と試行２の能力との間の差異を示す（^＊＝ｐ＜０．０５）。 図５は、基礎レベル（−Ｈ_２Ｏ_２）下および酸化的ストレス（＋Ｈ_２Ｏ_２、５０μＭ）処理の条件下での、コントロール、低用量のプテロスチルベン（０．００４％）および高用量のプテロスチルベン（０．０１６％）の食事に維持された被検体から調製された線条体片（ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質における変化）からのドーパミン放出のオキソトレモリン増加のグラフである。アスタリスクは各食事群に対するＨ_２Ｏ_２処理しない線条体片とＨ_２Ｏ_２処理した線条体片との間のドーパミン放出における差異を示す（^＊＝ｐ＜０．０１）。 図６Ａは、モリス水迷路中で行われたプラットフォームを見つける際の潜伏（秒）の関数としての、被検体の海馬中のプテロスチルベンの量（ｎｇ）を表すグラフである。プテロスチルベンは、被検体の海馬中で測定され、３日目および４日目からの試行２の被検体の能力と関連付けられた。 図６Ｂは、モリス水迷路中で行われたプラットフォームに達する際の被検体が移動した距離（メートル）の関数としての、被検体の海馬中のプテロスチルベンの量（ｎｇ）を表すグラフである。プテロスチルベンは、３日目および４日目からの試行２の被検体の海馬中で測定された。

老化現象を示す被検体に、複数回のプテロスチルベンの用量をそれらの食事を補給して投与した。プテロスチルベンを補給された被検体はプテロスチルベンの補給の無い被検体と比較して、改善された精神運動および認知能力を示した。別の実施形態において、被検体に、被検体の体重の１キログラム当り２．５ｍｇの低用量のプテロスチルベンを投与した。別の実施形態において、被検体に、被検体の体重の１キログラム当り１０ｍｇの高用量のプテロスチルベンを投与し、作業記憶を評価する試験において最も改善された認知能力を示した。別の実施形態において、Ｍ１−トランスフェクトＣＯＳ−７細胞株におけるオキソトレモリン誘導性の脱分極の後、プテロスチルベンの前処理は、カルシウムクリアランスに対するドーパミン処理の負の効果に拮抗した。本発明のさらに別の実施形態において、治療有効量のプテロスチルベンを投与し、ここで、酸化的ストレス感受性のムスカリン性アセチルコリン受容体をトランスフェクトされた上記の細胞株は、回復時におけるドーパミン誘発の低下を保護した。さらに、被検体の食事に投与されたプテロスチルベンは死後の線条体片の被検体のムスカリン性受容体の感受性を増加させ、酸化的ストレッサーを受けさせた場合に、ドーパミン放出は減少しない。

（定義）
本明細書および特許請求の範囲において用いられるように、単数形の表現は、その文脈が明らかに他の意を指示しないのであれば、複数の参照を含む。例えば、用語「１つの細胞（ａ ｃｅｌｌ）」は複数の細胞を含み、それらの混合物を含む。

用語スチルベンは、トランス−１，２−ジフェニルエチレンの一般式を有し、Ｃ_６Ｈ_５ＣＨ＝ＣＨＣ_６Ｈ_５の分子式を有する化合物の化学的分類を記載するために用いられる。スチルベンは、２つのフェニル基の分枝を側鎖として有する１，２−ジフェニルエチレンの一般構造を有する。スチルベンの化学的分類からの１つの化学的誘導体はレスベラトロルであり、これはトランス−３，５，４’−トリヒドロキシスチルベンであり、図１に示されている。スチルベンの化学的分類からの別の化学的誘導体はプテロスチルベンであり、これはトランス−３，５−ジメトキシ−４’−ヒドロキシスチルベンとして記載可能であり、図１に示されている。スチルベンの他の例としては、ピノスチルベン（トランス−３，４’−ジヒドロキシ−５−メトキシスチルベン）、デスオキシラポンチゲニン（トランス−３，５−ジヒドロキシ−４’−メトキシスチルベン）、プテロスチルベングルコシド、レスベラトロルトリメチルエーテル（トランス−３，５，４’−トリメチルエーテルスチルベン）、およびピセタノール（トランス−３，４，３’，５’−テトラヒドロキシスチルベン）が挙げられる。

用語酸化的ストレッサーは、疾患を生じている身体中の様々な物質に反応する活性酸素種のことをいう。一般的には、ヒドロキシルラジカルは、複数の有機基質と差別無く反応する。酸化的ストレッサーの例は、過酸化水素およびオゾンである。

本明細書において用いられるように、用語「作業記憶」は、記憶および回復のための速い記憶過程のことをいい、それが長期記憶に変換される前の短期記憶における、入ってくる情報を保持することを必要とする過程を含み、確立された長期的（エピソード）記憶の回復を支持する過程を含む。この用語はまた、短期記憶、一次記憶、即時記憶、オペラント記憶（ｏｐｅｒａｎｔ ｍｅｍｏｒｙ）、および臨時記憶（ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ ｍｅｍｏｒｙ）のことをいう。

治療有効量は、被検体に投与する場合、条件付けられた状態のそのような処置を達成するのに十分な化合物の量として定義される。「治療有効量」は、化合物、処置される状態、被検体の年齢およびそれに伴う健康状態、投与の経路および形態、当業者の判断、ならびに他の要因によって様々であってよい。

各々の行動測定に対しては、３つの群を比較する被検体間の分散分析（ＡＮＯＶＡ）モデルを、ｐ＜０．０５レベルにて、統計的有意性を試験するために、Ｓｙｓｔａｔ（ＳＰＳＳ，Ｉｎｃ． シカゴ、イリノイ州）を用いて行った。日にちまたは試行は、適切なときに、被検体内変数としてモデル内に含まれた。食事群間の差異を決定するために、事後比較（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）をＦｉｓｈｅｒのＬＳＤ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ分析を用いて行った。

複数のスチルベンアナログを、ドーパミンを投与した後、Ｍ１−トランスフェクトした細胞株中でのカルシウム回復アッセイに利用し、これらのスチルベンアナログを図１に示した。レスベラトロルはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）から購入し、ピセタノールはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．（サンディエゴ、カリフォルニア州）から購入した。

プテロスチルベン（トランス−３，５−ジメトキシ−４’−ヒドロキシスチルベン）を、無水酢酸およびトリエチルアミン中の３，５−ジメトキシベンズアルデヒドおよび４−ヒドロキシフェニル酢酸の濃縮によって合成した（Ｐｅｔｔｉｔら、１９８８年、Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．５１：５１７−５２７から改変した）。その反応混合物を、窒素雰囲気下で加熱（１５０℃）し、継続的に攪拌した。２０時間後、反応物を停止させ、室温まで冷却し、濃塩酸（５ｍＬ）を加えた。形成された沈殿物を５０ｍＬのクロロホルムに溶解させ、１０％の水酸化ナトリウム水溶液で抽出した。水性抽出物を、濃塩酸でｐＨ１まで酸性化し、少なくとも６時間攪拌し、その結果、中間生成物としての沈殿物、α−［（３，５−ジメトキシフェニル）メチレン］−４−ヒドロキシ−（αＺ）−ベンゼン酢酸を得た。この中間生成物を、１０ｍＬのキノリン中に、１．０ｇの銅を用いて加熱した（窒素下で２００℃、６時間）。その反応混合物を室温まで冷却して濾過した。５Ｎの塩酸（２５ｍＬ）を加えて濾過し、１時間攪拌し、クロロホルムで抽出した。不純なプテロスチルベンを含有するクロロホルム抽出物を、シリカゲルカラムおよび溶媒系の酢酸エチル：ヘキサン（１５：８５から１００％の酢酸エチルの線形勾配）を用いて、Ｈｏｒｉｚｏｎ ＨＰＦＣ系（Ｂｉｏｔａｇｅ，Ｉｎｃ．シャーロッツビル、バージニア州）でのフラッシュ・クロマトグラフィーによって精製した。純粋なプテロスチルベンを含有する画分を混合し、真空下で濃縮した。プテロスチルベンをヘキサン中で再結晶化し、その構造物を分光データ（ＵＶ、質量分析、および核磁気共鳴分光法）から確認した。

１ｍＬのエタノール中の４０ｍｇのアセトブロモ−α、Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃ、セントルイス、ミズーリ州）、および水酸化カリウム（５ｍｇ）と、プテロスチルベン（２０ｍｇ）とを混合することにより、プテロスチルベングルコシドを合成し、室温で２日間攪拌した。プテロスチルベングルコシドを展開溶媒としてのメタノール：クロロホルム（２０：８０）を用いて、分取層クロマトグラフィーによって精製した。プテロスチルベングルコシドの構造を、質量分析、および^１Ｈ−核磁気共鳴分光法によって決定した。

レスベラトロルの溶液（３．０ｍｌのメタノール中１５０ｍｇ）を、ジアゾメタン（液滴）で処理し、そのメチル化反応物を薄膜クロマトグラフィーによってモニターした。デスオキシラポンチゲニン、ピノスチルベン、およびレスベラトロルトリメチルエーテルを、展開溶媒としてのヘキサン：酢酸エチル（８：２）を用いて、分取層クロマトグラフィーによって精製した。デスオキシラポンチゲニン、ピノスチルベン、およびレスベラトロルに対する保持因子値（Ｒ_ｆ）を各々、０．２、０．２４、および０．８とした。これらの化合物の構造を、質量分析、および核磁気共鳴分光法によって確認した。

（被検体および食事の調製）
４２匹の１９ヶ月齢の雄性Ｆｉｓｃｈｅｒ３４４ラットをＮＩＡ ｃｏｌｏｎｙ（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、インディアナポリス、インディアナ州）から得た。ラットを、ステンレス製の網の吊り下げたケージにおいて個々に飼育し、自由に食事および水を提供し、１２時間の明暗サイクルを維持した。ラットに１週間を与えて新たな環境に適合させ、その後、ラットの体重を合わせ、次いで、コントロール、低用量のプテロスチルベン（０．００４％、体重１キログラム当り２．５ｍｇに等しい）、または高用量のプテロスチルベン（０．０１６％、体重１キログラム当り１０ｍｇに等しい）の３つの食事のうちの１つをランダムに、合計１２〜１３週間（ｎ＝１４／群）、与えた。全ての動物を、疾患の臨床的兆候について毎日観察した。

プテロスチルベンの食事を、低用量には１キログラムの食事当り４０ｍｇ、０．００４％ｗ／ｗ、高用量には１キログラムの食事当り１６０ｍｇ、０．０１６％ｗ／ｗの結晶プテロスチルベンをコントロール食事に加えることによって、Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ（マディソン、ウィスコンシン州）で調製した。食事の組成については表１を参照。コントロール食事中のコーンの量を調節し、追加量のプテロスチルベンを補った。ラットを、２１ヶ月齢にて、運動試験前の８週間、および認知試験前の９週間の間、コントロール食事またはプテロスチルベン食事のいずれかで維持した。

以下の非限定的な実施例を、本発明の種々の実施形態をさらに例示するために提供する。

（実施例１：酸化的ストレスに対する細胞処理）
アフリカミドリザルの腎臓由来の細胞株である、ＣＯＳ−７細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補い、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシンを含有するダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）中で増殖させた。トランスフェクトする２４時間前に、細胞をトリプシンで回収し、計測し、５×１０^６細胞／プレートにて１００ｍｍ^２の組織培養プレートに播いた。細胞を、ＤＥＡＥデキストラン法によりラットムスカリン性受容体サブタイプ１ ＤＮＡで一時的にトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を、ＤＮＡの分解を最小化するために８０μＭのクロロキンを含有する増殖培地中で２．５時間、インキュベートした。次いで、トランスフェクトした細胞を、４８時間、増殖培地中に維持し、トリプシンで回収し、カルシウムイメージングのために３５ｍｍプレート中のカバーガラスに播き、一晩、インキュベートした。

（細胞処理）
ブルーベリー（ＢＢ）抽出物（２ｍｇ／ｍｌ）、スチルベン［レスベラトロル（５０μｇ／ｍｌ）、ピノスチルベン（５０μｇ／ｍｌ）、デスオキシラポンチゲニン（２５μｇ／ｍｌ）、プテロスチルベン（１０μｇ／ｍｌ）、プテロスチルベングルコシド（１０μｇ／ｍｌ）、レスベラトロルトリメチルエーテル（１０μｇ／ｍｌ）、ピセタノール（１０μｇ／ｍｌ）］およびドーパミン（１ｍＭ）処理を、Ｊｏｓｅｐｈ Ｊ．ら、２００４．Ｊ．Ａｌｚ．Ｄｉｓ．６：４０３−４１１（本明細書に参照により援用される）に以前に記載されるように実施した。ＢＢ抽出物およびスチルベンを増殖培地に溶解し、その後、細胞を、処理した増殖培地を用いて３７℃で４５分間インキュベートし、続いて、４時間、ドーパミン投与した。これらのインキュベーションの後、細胞を、試験前に抽出物を含まない増殖培地で３回洗浄した。

カルシウムイメージングを、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２００Ｕ顕微鏡のステージに取り付けられた、温度制御を備えるＭｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏｒｐ．のオープンパーフュージョンマイクロインキュベーター（ｏｐｅｎ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｍｉｃｒｏ−ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）（３７℃）を用いて実施し、蛍光光源で照射した。トランスフェクトした細胞に、５％のＣＯとともに３７℃で４０分間、負荷培地（９９％のＤＭＥＭ １％のＦＢＳ）中でＦｕｒａ−２／アセトキシメチルエステル（２μＭ）を導入した。

次いで、７５０μＭのオキソトレモリンで誘導した脱分極の前後のカルシウム流出のリアルタイム分析を、Ｓｉｍｐｌｅ ＰＣＩソフトウェア（Ｃｏｍｐｉｘ，Ｉｎｃ．Ｍａｒｓ，ＰＡ）を用いて実施した。次いで、反応および回復を各試料について測定した。反応は、細胞が、ベースライン上で３０％を超えるオキソトレモリンに対して［Ｃａ^２＋］_ｉの増加を示すか否かを調べることにより測定した。この大きさの反応を示したそれらの細胞のみを、さらなる分析のために考慮した。回復は、反応した細胞の脱分極後、２０％の増加に戻るまでＣａ^２＋レベルについて時間（３００秒以内）をアッセイすることにより測定した。データは、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ一元配置分散分析およびＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定により分析した。

ドーパミンの投与は、Ｍ１−トランスフェクト細胞において［８０％のベースライン］からの回復を著しく減少させる（コントロール対ドーパミン処理した細胞、ｐ＜０．００１）（図２）。ドーパミン誘発に対して保護されたプテロスチルベン、プテロスチルベングルコシド、レスベラトロルトリメチルエーテル、およびピセタノールは、回復を減少させたが（ｐ＞０．０５）、一方、レスベラトロル、ピノスチルベンおよびデスオキシラポンチゲニンは、保護を与えなかった（ｐ＜０．００１）（図２）。

（実施例２：モリス水迷路）
モリス水迷路（ＭＷＭ）は、被験体の空間学習および記憶を試験するための方法である。Ｒｉｃｈａｒｄ Ｍｏｒｒｉｓによって開発されたＭＷＭは、被検体が、遠位の手がかりに基づいて、円形の水のプール（直径１３４ｃｍ×高さ５０ｃｍ、２３℃に維持）の水面下（２ｃｍ）に置かれた隠されたプラットフォーム（直径１０ｃｍ）を見つけて、以前の試行からその位置を記憶することを必要とする年齢および食事感受性の学習パラダイムである。正確な進路決定により、水からプラットフォーム上への避難が得られる。このために、被検体は、効果的に見つけるために、ポスター、実験者、コンピューター、ケージラック、などの遠位の手がかりを使用する。ＭＷＭの作業記憶バージョン（Ｂｒａｎｄｅｉｓら，１９８９．Ｉｎｔ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４８：２９−６９；Ｍｏｒｒｉｓ Ｒ．，１９８４．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１１：４７−６０．）を、午前および午後の時間、各時間２回の試行で（２回の試行の間、１０分の試行間隔をあけて）、第９週目の処置の間、４日連続で毎日実施した。ラットは、各群から１匹の被検体を連続して試験するように制限してランダムに試験した。各試行の開始時に、被検体を、４つのランダムにした開始位置のうちの１つで水中に穏やかに浸した。各被検体に、プラットフォーム上に避難させるのに１２０秒を与えた；被検体がこの時間内に避難できない場合、プラットフォームに導いた。被検体がプラットフォームに到達すると、そこに１５秒間維持した（試行１；参照記憶または獲得試行）。試行の間（１０分）、被検体をそのホームケージに戻した。試行２（作業記憶または回復試行）は、試行１と同じプラットフォームの位置および開始位置を使用した。行動を録画し、潜伏（秒）（プラットフォームを見つけるまでの時間）、路程（ｃｍ）、および水泳速度（ｃｍ／秒；潜伏／路程）の測定を可能にする画像追跡ソフトウェア（ＨＶＳ Ｉｍａｇｅ，ＵＫ）で分析した。使用した迷路およびパラダイムの詳細な説明は、Ｓｈｕｋｉｔｔ−Ｈａｌｅら、１９９８．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ，３３：６１５−６２４（本明細書に参照として援用される）に開示されている。

上記に詳述したプテロスチルベン食事を投与したラットの被検体は、コントロール食事を与えた群と比較して向上した空間記憶能力を示した（図３および図４）。食事群の間で、試行１または試行２に関してプラットフォームを見つけるための潜伏または距離の差はなかった。しかしながら、異なる食事群が、向上した作業記憶の指標である、試行１から試行２までのそれらの能力を有意に向上させるか否かを判定するために、個別ｔ検定を、３日および４日（学習よりも記憶を頼りにする日数）の間、各群について２回の試行の潜伏または距離の間で実施した。高用量のプテロスチルベン群は、試行１と試行２との間でプラットフォームを見つけるための潜伏において有意（ｐ＜０．０５）差を示した。すなわち、試行２の潜伏は、試行１よりも有意に減少し、これは、それらのラットが、１０分の保持間隔でさえも、１回の試行の学習を実証したことを示す（図３）。この１回の試行の学習は、コントロール群において見出されなかったが、低用量のプテロスチルベン群は、試行１から試行２までに向上させる傾向があった（ｐ＝０．０９）。さらに、低用量および高用量のプテロスチルベン群の両方は、試行１と試行２との間でプラットフォームを見つけるための距離において有意（ｐ＜０．０５）差を示した。すなわち、試行２の距離は、試行１よりも有意に減少した（図４）。コントロール群は、試行１から試行２までにこの向上を示さなかった（ｐ＞０．０５）。従って、プテロスチルベンは、用量依存的に認知能力、特に作業記憶に対する老化の有害な作用を逆転させた。

（被検体の海馬組織におけるプテロスチルベン）
海馬大脳組織を、モリス水迷路試験の２〜３週間後に安楽死させた被検体から抽出した。その組織試料を−８０℃で保存し、抽出前に氷中で解凍した。組織を、５００μＬのリン酸バッファー（ｐＨ７．４）で均質化し、次いで遠心分離（７０００ｇ、４℃、１５分）した。その上清を回収し、均質化を繰り返した。合わせた上清を、酢酸エチルで抽出した（５００μＬ×２）。その酢酸エチル抽出物を、窒素のストリーム下で乾燥させた。

その乾燥させた抽出物を、３０μＬのＮ，Ｏ−ビス［トリメチルシリル］トリフルオロアセトアミド：ジメチルホルムアミド（ＢＳＴＦＡ：ＤＭＦ，１：１；Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で処理し、４０分間７０℃で加熱した。誘導体化した試料を、ガスクロマトグラフィー質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）によりプテロスチルベンの分析のために使用した。ＧＣ−ＭＳを、Ｊ＆Ｗ ＤＢ−５キャピラリーカラム（０．２５ｍｍ内径、０．２５μｍフィルム厚さ、３０ｍ長さ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてＪＥＯＬ ＧＣＭａｔｅ ＩＩ機器（ＪＥＯＬ ＵＳＡ Ｉｎｃ．，Ｐｅａｂｏｄｙ，ＭＡ）で実施した。ＧＣは、以下の温度プログラム下で実行した：初期１９０℃、２０℃／分の速度で２３９℃まで増加、この温度で３分間保持、０．２℃／分の速度で２４２℃まで増加、次いで最終的に２５℃／分の速度で３００℃まで増加、この温度で１．５分間保持。キャリアガスは、１ｍＬ／分の流速にて、超高純度のヘリウムであった。注入ポート、ＧＣ−ＭＳインターフェースおよび電離箱は、それぞれ、２５０℃、２３０℃および２３０℃であった。注入体積は１μＬのスプリットレス注入であった。質量スペクトルを、陽電極、電子衝撃（７０ｅＶ）、低分解能モードにおいて獲得した。プテロスチルベンを測定し、ｍ／ｚ３２８，３１３，２９７および１４７を用いて、再構成したイオンクロマトグラフから定量化した。定量化は、プテロスチルベンの基準試料の較正曲線から実施した（保持時間、１２．５分）。ＧＣ−ＭＳ分析を２連で実施した。海馬のプテロスチルベンは、高用量のプテロスチルベン群においてのみ検出可能であり、１．３５２±０．４６５ｎｇ／組織試料であった。

高用量のプテロスチルベンのラットのＭＷＭ行動と、脳におけるプテロスチルベンレベルとの関係があるか否かを調べるために、海馬のプテロスチルベンレベルを、図６Ａおよび図６Ｂに示すように、試行１と試行２の潜伏および距離の能力とで関連付けた。海馬は、空間学習および記憶、特に試行２の作業記憶におけるその役割を知られており、海馬のプテロスチルベンレベルと、潜伏（ｒ＝−０．７６４、ｐ＝０．０１０）および距離（ｒ＝−０．７３４、ｐ＝０．０１６）についての３日および４日の試行２の能力との間に有意な逆相関が見られた；すなわち、プテロスチルベンレベルが増加するにつれて、プラットフォームを見つけるための潜伏および距離は減少した。

（実施例３：ドーパミン放出）
Ｊｏｓｅｐｈら，１９８８．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，４５４：１４０−８；Ｊｏｓｅｐｈら，１９８８．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，４５４：１４９−５５；Ｊｏｓｅｐｈ Ｊ．ら，１９９０．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，５３７：４０−４８；Ｊｏｓｅｐｈら，１９９６．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，２０：８２１−３０（本明細書に参照として援用される）に開示されているように、表面灌流した線条体片からのＫ^＋誘発ドーパミン放出（Ｋ^＋−ＥＲＤＡ）のムスカリンの増加は、受容体感受性および線条体機能の指標であり、老化および酸化的ストレスに感受性がある。さらに、Ｊｏｓｅｐｈら，１９９８．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：８０４７−８０５５；Ｊｏｓｅｐｈら，１９９９．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９：８１１４−８１２１；Ｙｏｕｄｉｍら，２０００．Ｎｕｔｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，３：３８３−９７；Ｓｈｕｋｉｔｔ−Ｈａｌｅら，２００５．Ａｇｅ．，２７：４９−５７；Ｓｈｕｋｉｔｔ−Ｈａｌｅら，２００６．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２２：２９５−３０２（本明細書に参照として援用される）に開示されているように、ドーパミン放出のムスカリンの増加は、食事補給に感受性がある。コントロール群および補給した群から得た線条体組織の保護能力を、線条体Ｋ^＋−ＥＲＤＡのオキソトレモリン増加の差を調べることによりアッセイした。ドーパミン放出を、高用量、低用量およびコントロール食事を与えた被検体の脳から新たに解剖して、クロスカット（３００μｍ、ＭｃＩｌｗａｉｎ組織チョッパー）した線条体片で、行動試験の２〜３週後に実施した。その片を、９５％Ｏ_２／５％ＣＯ_２とともに３０分間泡立て、２１ｍＭのＮａＨＣＯ_３、３．４ｍＭのグルコース、１．３ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．９３ｍＭのＭｇＣｌ_２、１２７ｍＭのＮａＣｌおよび２．５ｍＭのＫＣｌ（低ＫＣｌ）（ｐＨ７．４）を含む改変Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ基礎放出培地（ＢＲＭ）を含有する小さなガラスバイアルに入れた。組織の半分を、酸化的ストレスの条件下で食事の効果を評価するために５０μＭのＨ_２Ｏ_２で処理した。その片を灌流チャンバに入れ、３７℃に維持し、３０分間、ＢＲＭで灌流した。この平衡期間の後、培地を、（ｍＭで）ＫＣｌ３０（高ＫＣｌ）、ＣａＣｌ_２．２Ｈ_２Ｏ１．２６（ＥＧＴＡの代わり）、ＮａＣｌ５７、および０または５００μＭのオキソトレモリンを含むものに移し、次いでＫ^＋−ＥＲＤＡの増加を評価した。ドーパミン放出を、電気化学的検出に接続したＨＰＬＣにより定量し、Ｌｏｗｒｙ法によって測定されるようにｐｍｏｌｅｓ／ｍｇタンパク質として表した。

ドーパミン放出（オキソトレモリンが増加した線条体Ｋ^＋−ＥＲＤＡ）は、食事およびＨ_２Ｏ_２処理［Ｆ（５，５８）＝２．３４，ｐ＜０．０５］に依存して、群の間で有意に異なった（図５）。基礎条件下で、食事群の間に差はなかった（ｐ＞０．０５）。しかしながら、ドーパミン放出は、Ｈ_２Ｏ_２処理していないコントロール食事群と比較して、Ｈ_２Ｏ_２処理したコントロール食事群において有意に減少した（ｐ＜０．０５）が、低用量または高用量のプテロスチルベンのいずれかの治療有効量を投与した被検体においてＨ_２Ｏ_２処理後に差は見られなかった。

本発明は、例示した実施形態の詳細に関連して記載したが、それらの詳細は、添付の特許請求の範囲に規定される本発明の範囲を限定することを意図しない。特許請求される独占的権利または特権のある本発明の実施形態は、添付の特許請求の範囲に規定されるとおりである。

Claims (17)

1. 治療有効量のプテロスチルベンの実質的に純粋な化合物と、生理学的に許容可能な担体とを含む、酸化的ストレスを処置するための医薬品組成物。
2. 被検体の体重の１キログラムあたり、約２．５ｍｇないし約１０ｍｇの化合物が投与される、請求項１に記載の組成物。
3. 前記治療有効量のプテロスチルベンは、スノキ属ベリー類の食事を介して投与される、請求項１に記載の組成物。
4. 前記スノキ属ベリー類はブルーベリーである、請求項３に記載の組成物。
5. 酸化的ストレスを処置するための方法であって、治療有効量のプテロスチルベンの実質的に純粋な化合物を投与する工程を含み、被検体への酸化的ストレスが低減される、方法。
6. 前記治療有効量は、被検体の体重の１キログラムあたり、約２．５ｍｇないし約１０ｍｇの前記化合物である、請求項５に記載の方法。
7. 前記化合物は被検体のアセチルコリン受容体活性を増加させる、請求項５に記載の方法。
8. 前記被検体に酸化的ストレッサーを受けさせた場合に、ドーパミン放出が減少しない、請求項５に記載の方法。
9. プテロスチルベンはスノキ属ベリー類の食事を介して投与される、請求項５に記載の方法。
10. 前記スノキ属ベリー類はブルーベリーである、請求項９に記載の方法。
11. プテロスチルベンは、ムスカリン性受容体サブタイプのカルシウムを緩衝する能力を増加させる、請求項５に記載の方法。
12. 前記ムスカリン性サブタイプはＭ１である、請求項１１に記載の方法。
13. 被検体の作業記憶を増加させる方法であって、治療有効量のプテロスチルベンの実質的に純粋な化合物を投与する工程を含み、被検体の作業記憶が増加する、方法。
14. 前記治療有効量のプテロスチルベンは、被検体の体重の１キログラムあたり、約１０ｍｇである、請求項１３に記載の方法。
15. プテロスチルベンは医薬担体とともに投与される、請求項１３に記載の方法。
16. プテロスチルベンは栄養補助の担体とともに投与される、請求項１３に記載の方法。
17. プテロスチルベンは植物由来である、請求項５に記載の方法。

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