KR20100075468A

KR20100075468A - 테로스틸벤 투여에 의해 산화적 스트레스를 개선하고 작업 기억을 향상시키는 방법

Info

Publication number: KR20100075468A
Application number: KR20107007002A
Authority: KR
Inventors: 제임스 에이. 조셉; 아그네스 엠. 리만도; 바바라 슈키트-헤일
Original assignee: 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카 애즈 레프리젠티드 바이 더 세크러테리 오브 애그리컬춰
Priority date: 2007-09-07
Filing date: 2008-09-04
Publication date: 2010-07-02
Also published as: CN103083288B; US20090069444A1; CN101820869B; WO2009032870A2; US9028887B2; CA2698661A1; US20120035272A1; JP5608082B2; HK1148932A1; HK1185257A1; US20140256827A1; AU2008296293A1; CA2698661C; US8809400B2; ES2526648T3; JP2010538077A; CN103083288A; CN101820869A; BRPI0816317A2; EP2200597A2

Abstract

본 발명은 실질적으로 순수한 테로스틸벤 화합물 및 생리학적으로 허용 가능한 담체를 치료적 유효량으로 함유하는 산화적 스트레스를 치료하는 약제학적 조성물을 기재한다. 테로스틸벤은 개체 체중의 킬로그램 당 약 2.5 mg 내지 약 10 mg 사이의 양으로 투여된다. 또한, 본 발명은 개체에 대한 작업 기억을 증가시키는, 실질적으로 순수한 테로스틸벤 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 것으로 이루어진 작업 기억을 증가시키는 방법을 기재하고 있고 치료적 유효량은 개체 체중의 킬로그램 당 약 10 mg의 테로스틸벤이다.

Description

테로스틸벤 투여에 의해 산화적 스트레스를 개선하고 작업 기억을 향상시키는 방법{METHOD TO AMELIORATE OXIDATIVE STRESS AND IMPROVE WORKING MEMORY VIA PTEROSTILBENE ADMINISTRATION}

본 발명은 신경원성 및 행동적 노화의 효과 및 신경퇴화성 질환 (neurodegenerative disease)들의 발생을 예방하고 방지하고 역전시키기 위해 개체에게 유효량으로 투여된 테로스틸벤 (pterostilbene)을 사용하는 방법에 관한 것이다. 상세하게는 레스베라트롤 유사체 테로스틸벤은 운동 결핍 (motor deficit) 및 개체의 작업 기억 (working memory)을 역전시키는 데 효과적이다.

과일과 채소로의 식사 보충 (diet supplementation)은 노화 개체와 관련된 결함 (defect)을 예방하고 역전시키는 효과를 나타낸다. 베리 과실 (berryfruit)로의 식사 보충제를 포함하는 영양적 섭생 (예로, 클랜베리 및 블루베리와 같은 백시니움 베리 (Vaccinium berries))은 노화와 관련된 운동 및 인지 변화 모두를 역전 및/또는 예방한다. 예를 들어, 블루베리 보충제는 APP/PS-1 돌연변이로 증가된 아밀로이드 β-펩타이드 생산을 나타내는 마우스에서 인지 행동적 결핍을 예방한다. (Joseph JA. et al., 2003. Nutr . Neurosci ., 6: 153-162). 블루베리의 유익한 효과는 산화적 스트레스 인자 (oxidative stressors)에 대한 직접적 및 간접적 작용을 포함한다. 따라서, 운동 및 인지 기능에서 산화적 매개 변화를 고치는 데 효과적인 베리 과실에서 화합물들을 확인하는 것이 필요하다.

트랜스-3,5,4'-트리하이드록시스틸벤 (이하, 레스베라트롤 (resveratrol)이라고 약칭함)은 그의 왕성한 항-산화 활성으로 인해 다수의 항-노화 성질을 가지는 것으로 확인되어왔다. 생체외 실험은 레스베라트롤이 효과적인 자유 라디칼 소거제 (free radical scavenger)이고 저밀도 지질 단백질 (low density lipoprotein)의 산화를 억제하는 것을 보여주었다 (Brito P. et al., 2002. Free Radic Res .36(6):621-631).

피노스틸벤 (pinosilbene), 데속시래폰티제닌 (desoxyrhapontigenin), 테로스틸벤 (pterostilbene), 레스베라트롤 트리메틸에테르 (resveratrol trimethylether), 및 피세아테놀 (piceatannol)과 같은 다른 스틸베노이드류는 핵 수용체, 퍼옥시좀 증식인자 활성화된 수용체 알파 이소형 (peroxisome proliferator-activated receptor alpha isoform)을 활성화시킴으로써 다양한 정도의 생물학적 활성 및 지질 수준을 낮추는 효율성을 나타낸다.

트랜스-3,5-디메톡시-4‘-하이드록시스틸벤 (이하, 테로스틸벤이라고 약칭함), 레스베라트롤의 천연 메틸에테르 유사체는 레스베라트롤과 유사한 항산화 활성을 가지는 것으로 보고되었다 (Rimando et al., 2002. J. Agric . Food Chem . 50:3453-3457; Stivala et al., 2001. J. Biol . Chem. 276(25):22586-22594.). 테로스틸벤은 목질 식물 (Maurya et al., 1977. J. Nat . Prod . 47:179-181; Amone et al., 1977. J. Chem . Soc . Perkins Trans . 19:2116-2118) 뿐만 아니라 포도와 같은 몇몇 작은 과실 (Adrian et al., 2000. J. Argic . Food Chem . 48:6103-6105) 및 백시니움의 베리( Vaccinium ashei Reade 및 Vaccinium stamineum L.)(Rimando et al., 2004. J. Argic . Food Chem . 52:4713-4719)에 존재한다. 또한, 다수의 식물성 약물은 아노제이수스 아쿠미나타 (Anogeissus acuminata), 드라카에나 코킨키 넨시스 (Dracaena cochinchinensis), 드라카에나 로우레이리 (Dracaena loureiri), 구이부르티아 테스만니 (Guibourtia tessmannii), 테로카르푸스 마크로카르푸스 (Pterocarpus macrocarpus), 테로카르푸스 마르수피움 (Pterocarpus marsupium), 테로카르푸스 산탈리누스 (Pterocarpus santalinus), 백시니움 아쉐이 (Vaccinium ashei), 백시니움 코림보섬 (Vaccinium corymbosum), 백시니움 델리시오섬 (Vaccinium deliciosum), 백시니움 멤브라나시움 (Vaccinium membranaceum), 백시 니움 오바툼 (Vaccinium ovatum), 백시니움 오발리포이륨 (Vaccinium ovalifoilum), 백시니움 파르비플로륨 (Vaccinium parviflorum), 백시니움 스태미 니움 (Vaccinium stamineum), 백시니움 울리기노숨 (Vaccinium uliginosum), 및 바 티스 비니프리아 (Vitis vinifrea)와 같은 테노스틸벤을 포함한다. 테노스틸벤은 또한 프로폴리스와 같은 비-식물성 출처에서도 발견된다.

테로스틸벤의 수준은 백시니움 베리의 종 (species) 간에 다양해질 수 있다. Rimando et al., 2004. J. Argic. Food Chem . 52:4713-4719에 보고된 바와 같이, 백시니움 베리의 경작물 (cultivars)을 통한 테로스틸벤의 농도는 99 ng/gm 내지 520 ng/gm 건조 시료를 나타내는 것으로 보고되었다. 또한, Rimando et al., Acta Hort. ( ISHS ). 680:137-143에 보고된 바와 같이, 백시니움의 9개 경작물 종으로부터 나온 동결 건조된 베리는 베리 그램 당 0.12 μg 내지 2.74 μg의 테로스틸벤을 보여준다. 유사하게, 블루베리 종도 테로스틸벤 농도의 양이 다양하다. 99 ng 내지 475 ng 범위 테로스틸벤이 동결 건조된 블루베리 일 그램으로부터 나올 수 있다고 보고되어 왔다.

연구들은 두뇌 노화 및 행동의 유해한 효과와 항산화제의 효과를 연관시켜 왔다. 과일과 채소에서 일반적으로는 식물 일차 대사에 관여하지 않는 "이차 화합물 (secondary chemicals)"의 형태로 발견되는 항산화제/항-염증성 폴리페놀류의 조합은 이들 유해한 효과를 방지하는 효능을 나타내었다. 따라서, 과일과 식물, 상세하게는 노화와 인지 결함에 대항하여 보호할 수 있는 화합물을 좀 더 동정하는 것이 필요하다.

테로스틸벤 화합물은 사이클로옥시게나제-1 (cyclooxygenase-1)의 적당한 저해 및 사이클로옥시게나제-2의 약한 저해를 나타내어 항-염증성 활성을 제시하였다. (Rimando, et al., 2002. J. Agric . Food Chem . 50: 3453-3457.) 또한, 테로스틸벤은 퍼옥시좀 증식인자-활성화된 알파 이소형 (PPARα), 지질 및 포도당 수준을 낮추는 데 관여하는 것으로 제안된 수용체를 활성화시키는 것으로 확인되었다. 테로스틸벤의 PPARα 작동제 효과의 상세한 내용은 Rimando et al., 2005. J. Agric . Food Chem . 53:3403-3407 및 미국 특허공개 제 US2006/005723A1호에 기재되어 있고, 둘 다 본 명세서에서 참고문헌에 의해 통합되어 있다.

테로스틸벤은 결장 암화 (carcinogenesis)를 억제하는 것으로 확인되었다. 구체적으로, 테로스틸벤은 이유기의 수컷 F344 래트에서 아조옥시메탄-유도성 (azoxymethane-induced) 결장의 이상 음와 세포 (aberrant crypt foci) 성장을 억제하였다. 또한, 테로스틸벤은 HT-29 인간 샘암종 세포주에서 유도성 니트릭 옥사이드 합성효소 (iNOS)의 발현을 저해한다. (Suh et al., 2007. Clin Cancer Res . 13(1) 350-355.)

노화 (senescent) 개체에서 인지 변화를 개선하려는 시도에서는, 노화 개체에게 테로스틸벤의 보충하는 것이 보충되지 않는 개체에 비해 인지 및 운동 결핍을 역전시킬 수 있는지 여부를 결정하는 것이 선행기술에 필요하다.

무스카린 콜린성 수용체 (muscarinic cholinergic receptor)는 중앙 및 말초 신경계, 위장계, 심장, 내분비샘, 폐 및 기타 조직에서 신경전달물질 아세틸콜린의 작용을 매개한다. 5개의 서로 다른 무스카린 수용체 아형은 m1 - m5로서 확인되었다. m1 아형은 대뇌 피질에서 발견되는 우세한 아형이고 인지 기능의 통제에 관여하는 것으로 여겨진다.

알츠하이머병과 같은 인지 장애와 관련된 질병은 뇌에 아세틸콜린의 소실이 동반된다. 이것은 기본 전뇌에 콜린성 뉴런의 퇴화 결과로 여겨지고, 고차원 인지 과정에 관여하는 관련된 피질 (association cortex) 및 해마 (hippocampus)의 영역을 약화시킨다.

따라서, 뇌에서 아세틸콜린 신호전달 효과를 증가시키는 화합물을 확인하는 것이 필요하다. 구체적으로, 중앙 및 말초 신경계에서 다양한 수용체 아형에 활성을 가지는 무스카린 작동체 (muscarinic agonist)로서의 화합물을 확인하는 것이 필요하다.

본 발명의 목적은 신경원성 행동적 노화의 효과를 치료하고 신경퇴화성 질병의 발생을 예방하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 하기 화학식의 실질적으로 순수한 화합물:

및 생리학적으로 허용 가능한 담체를 치료적 유효량으로 함유하는 산화적 스트레스를 치료하는 약제학적 조성물을 기재한다. 본 발명의 구체예에서, 테로스틸벤은 개체 체중의 킬로그램 당 약 2.5 mg 내지 약 10 mg 사이의 양으로 투여된다. 본 발명의 다른 구체예에서, 테로스틸벤의 치료적 유효량은 백시니움 베리 (Vaccinium berries) 식사를 통해 투여된다. 또 다른 구체예에서, 상기 백시니움 베리는 블루베리이다.

본 발명은 개체에 대한 산화적 스트레스를 감소시키는, 하기 화학식의 실질적으로 순수한 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 것으로 이루어진 산화적 스트레스를 치료하는 방법을 기재한다:

본 발명의 구체예에서, 테로스틸벤은 개체 체중의 킬로그램 당 약 2.5 mg 내지 약 10 mg의 양으로 투여된다. 다른 구체예에서, 상기 화합물은 개체의 아세틸콜린 수용체 활성을 증가시킨다. 그러나 또 다른 구체예에서, 투여되는 화합물의 양은 상기 개체가 산화적 스트레스 인자 (oxidative stressor)에 노출될 때 도파민 방출의 저해에 대항하여 보호한다. 또 다른 구체예에서, 테로스틸벤은 백시니움 베리 식사를 통해 투여된다. 또 다른 구체예에서, 상기 백시니움 베리는 블루베리이다. 또 다른 구체예에서, 테로스틸벤은 아형 m-1과 같은 무스카린 수용체 아형의 칼슘 완충 능력을 증가시킨다. 또한 본 발명은 개체에 대한 작업 기억을 증가시키는, 실질적으로 순수한 테로스틸벤 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 것으로 이루어진 개체의 작업 기억을 증가시키는 방법을 기재한다. 한 구체예에서, 상기 테로스틸벤의 치료적 유효량은 개체 체중의 킬로그램 당 약 10 mg의 화합물이다.

노화 개체들은 다수의 테로스틸벤 용량이 그들의 식사에 보충되어 투여되었다. 테로스틸벤-보충된 개체는 테로스틸벤 보충이 없는 경우에 비해 향상된 정신운동 및 인지 성적을 나타냈다. 다른 구체예에서, 개체는 테로스틸벤의 저용량 (low dose)으로 개체 중량 킬로그램 당 2.5 mg 테로스틸벤이 투여되었다. 또 다른 구체예에서, 개체는 테로스틸벤의 고용량 (high dose)으로 개체 중량 킬로그램 당 10 mg 테로스틸벤이 투여되었고 작업 기억을 평가하는 테스트에서 가장 많이 향상된 인지 성적을 나타내었다. 또 다른 구체예에서, 테로스틸벤의 전-처리는 M1-형질전환된 COS-7 세포주에서 오소트레모린-유도성 탈분극화 (oxotremorine-induced depolarization)에 이어서 칼슘 소거 (calcium clearance)에 미치는 도파민 처리의 음성 효과를 길항하였다. 본 발명의 또 다른 구체예에서는, 산화적 스트레스 민감성 무스카린 아세틸콜린 수용체로 형질전환된 상기 세포주는 회복 기간 (recovery time) 동안 도파민-유도성 감소에 대항하여 보호하도록 하여 테로스틸벤의 치료량을 투여하였다. 또한, 개체 식사에 투여된 테로스틸벤은 사후 검시 줄무늬 슬라이스의 개체 무스카린 수용체의 민감성을 증가시킨다. 여기서 도파민 방출은 산화적 스트레스 인자에 노출될 때 감소되지 않는다.

정의

본 명세서 및 청구항에서 사용되는 바, 단수형 “하나 (a)", "하나 (an)" 및 "그 (the)"는 내용 상 이와 다르게 분명히 기술되지 않는다면 복수 참고를 포함한다. 예를 들어, "하나의 세포 (a cell)"는 그들의 혼합물을 포함하여 복수의 세포를 포함한다.

용어 스틸벤은 트랜스-1,2-디테닐에틸렌 (trans-1,2-diphenylethylene)의 일반 화학식을 가지고 분자 구조식 C₆H₅CH=CHC₆H₅을 가지는 화합물의 화학적 부류 (chemical class)를 기술하는 데 사용된다. 스틸벤은 측쇄 가지로 2개 페닐 그룹을 가지는 1,2-디페닐에틸렌의 일반 구조를 가진다. 스틸벤 화학적 부류로부터 화합물 유도체 하나는 레스베라트롤이고, 이는 트랜스-3,5,4‘-트리하이드록시스텔벤 (trans-3,5,4'-trihydroxystilbene)이며 도 1에 나타나 있다. 스틸벤 화학적 부류로부터 또 다른 화학적 유도체는 테로스틸벤이고, 이는 트랜스-3,5-디메톡시-4’-하이드록시스틸벤 (trans-3,5-dimethoxy-4'-hydroxystilbene)로서 기술될 수 있으며 도 1에 나타나 있다. 스틸벤의 기타 예는 피노스틸벤 (트랜스-3,4‘-디하이드록시-5-메톡시스틸벤), 데속시래폰티제닌 (트랜스-3,5-디하이드록시-4’-메톡시스틸벤), 테로스틸벤 글루코사이드, 레스베라트롤 트리메틸에테르 (트랜스-3,5,4‘-트리메틸에테르스틸벤), 및 피세아태놀 (트랜스-3,4,3’,4‘-테트라하이드록시스틸벤)을 포함한다.

용어 산화적 스트레스 인자 (oxidative stressor)는 질병을 유발하는 몸체에서 다양한 물질과 반응하는 반응성 산소 종을 지칭한다. 일반적으로, 하이드록실 라디칼은 다수의 유기 물질들과 무차별적으로 반응한다. 산화시키는 스트레스 인자의 예는 과산화수소 및 오존이다.

용어 “작업 기억 (working memory)"은 본 명세서에서 사용되는 바, 정보가 확립된 장기 (삽화적인) 기억 (long-term memory)의 복구를 지원하는 과정을 포함하는 장기-기억으로 전환되기 전에 단기-기억 (short-term memory)에 들어오는 정보를 보유하기 위해 필요한 과정을 포함하는 저장과 복구를 위한 신속한 기억 방법을 지칭한다. 이 용어는 또한 단기-기억, 일차 기억 (primary memory), 일시적 기억 (immediate memory), 작동 기억 (operant memory), 및 예비적인 기억을 포함한다.

치료적 유효량 (therapeutically effective amount)은 개체에 투여될 때 이러한 조정된 상태의 치료에 영향을 주기 충분한 화합물의 양으로서 정의된다. “치료적 유효량"은 화합물, 및 치료되는 조건, 개체의 연령 및 상대적인 건강, 투여 경로 및 형태, 당업자의 판단 그리고 기타 요인들에 따라 다양해질 수 있다.

각 행동적 척도로는, 세 개 그룹을 비교하는 개체들-간 분산 분석 (ANOVA) 모델이 p < 0.05 수준에서 통계학적 유의성을 테스트하기 위해 시스탯 (Systat)(SPSS, INc., 시카고, IL)을 이용하여 수행되었다. 일수 또는 시험이, 적절한 경우, 개체-내 분산으로서 모델에 포함되었다. 포스트-혹 (post-hoc) 비교가 식사 그룹 중에 차이를 결정하기 위해 피셔의 LSD 포스트-혹 분석을 이용하여 수행되었다.

다수의 스틸벤 유사체가 M1-형질전환된 세포주에서 칼슘 회복 분석에 사용되었으며 이어서 도파민이 투여가 이루어졌다. 이들 스틸벤 유사체는 도 1에 나타나 있다. 레스베라트롤은 시그마-알드리치사 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)로부터 구입하는 한편, 피세아태놀은 캘바이오켐-노바바이오켐사 (Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, CA)로부터 구입하였다.

테로스틸벤 (트랜스-3,5-디메톡시-4‘-하이드록시스틸벤)이 아세트 안하이드라이드 및 트리메틸아민에서 3,5-디메톡시벤즈알데하이드 및 4-하이드록시페닐아세트산을 응축시킴에 의해 합성되었다 (Pettit et al., 1988, J. Nat . Prod . 51:517-527로부터 변형됨). 반응 혼합물을 질소 환경 하에서 가열 (150℃)하고 계속적으로 저어주었다. 20시간 후에, 반응은 정지되었고, 상온으로 식혀서, 농축된 염산 (5 mL)을 첨가하였다. 형성된 침전물은 50 mL 클로로포름에 녹이고 10% 액체 소듐 하이드로옥사이드를 사용하여 추출하였다. 액체 추출물은 농축된 염산을 사용하여 pH 1로 산성화하고, 적어도 6시간 동안 저어주었으며 그 결과 중간 산물, α-[(3,5-디메톡시페닐)메틸렌]-4-하이드록시-(αZ)-벤젠아세트산이 침전되었다. 이 중간 산물은 10 mL 퀴놀린에서 1.0g 구리를 사용하여 가열되었다 (200℃, 6시간, 질소 하). 반응 혼합물을 상온으로 식히고 필터 여과하였다. 5N 염산 (25 mL)을 첨가하여 여과하고 1시간 동안 저어주며 클로로포름으로 추출하였다. 순수하지 않은 테로스틸벤을 포함하는 클로로포름 추출물은 실리카겔 칼럼, 및 에틸 아세테이트:헥산 용매 시스템 (15:85로부터 100% 에틸 아세테이트까지의 선상 구배)을 사용하는 호라이즌 HPFC 시스템 (Biotage, Inc., Charlottesville, VA) 상의 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 순수한 테로스틸벤을 포함하는 분획은 조합되어 진공 하에서 농축되었다. 테로스틸벤은 헥산에서 재결정화되어 그의 구조가 그의 분광학적 테이타로부터 검증되었다 (UV, 질량 분광측정법 (mass spectrometry), 및 핵자기 공명 스펙트로스코피).

테로스틸벤 글루코사이드는 1 mL 에탄올에 40mg의 아세토브로모-α,D-글루코스 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 및 칼륨 하이드옥사이드 (5 mg)를 혼합한 테로스틸벤 (20 mg)에 의해 합성되었고, 상온에서 이틀 동안 저어주었다. 테로스틸벤 글루코사이드는 전개 용매로서 메탄올 : 클로로포름 (20 : 80)을 사용하는 예비적 층 크로마토그래피 (preparative layer chromatography)에 의해 정제되었다. 테로스틸벤 글루코사이드의 구조는 질량 분광측정법 및 ¹H-핵자기 공명 스펙트로스코피에 의해 결정되었다.

레스베라트롤의 용액 (3.0 ml 메탄올에 150 mg)은 다이아메탄을 한 방울씩 처리하였으며, 메틸화 반응을 얇은 층 크로마토그래피 (thin layer chromatography)에 의해 감시하였다. 데속시래폰티제닌, 피노스틸벤 및 레스베라트롤 트리메틸에테르는 전개 용매로서 헥산 : 에틸 아세테이트 (8 : 2)를 사용하는 예비적 층 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 데속시래폰티제닌, 피노스틸벤 및 레스베라트롤에 대한 보유 인자 (retention factor) 값 (R_f)은 각각 0.2, 0.25, 및 0.8이었다. 이들 화합물의 구조는 질량 분광측정법 및 핵자기 공명 스펙트로스코피에 의해 검증되었다.

개체 및 식사 제조

42마리의 19월령 수컷 피셔 344 래트가 NIA 군 (colony)(Harlan Sprague Dawley, 인디애나폴리스, IN)으로부터 획득되었다. 래트는 스테인레스 스틸망에 매달린 케이지에 개별적으로 가두고 음식과 ad libitum 물을 공급하였으며, 12-시간 명/암 주기에서 유지시켰다. 래트는 새로운 환경에 적응하도록 일주일이 주어졌으며 이후에 체중을 맞춘 다음 전체 (n=14/그룹)에 12-13주 동안 세 가지 식사 중 하나를 무작위로 배치하였다: 대조군, 저용량 테로스틸벤 (0.004%, 2.5 mg/kg 체중과 동등함), 고용량 테로스틸벤 (0.016%, 10 mg/kg 체중과 동등함). 모든 동물은 질병의 임상적 증상에 대해 매일 관찰되었다.

테로스틸벤 식사는 결정화 테로스틸벤을 대조군 식사, 저용량의 경우 40 mg/kg 식사, 0.004% w/w, 고용량의 경우 160 mg/kg 식사, 0.016% w/w을 식사에 첨가하여 하란 테크라드 (Harlan Teklad, Medison, WI)에서 제조되었다. 식사 조성에 대해서는 표 1을 참고한다. 대조군 식사에서의 옥수수의 양은 테로스틸벤이 첨가된 부피를 보상하도록 조절되었다. 래트는 운동 테스트 전 8주 동안 그리고 21개월에 인지 테스트 전 9주 동안 대조군 또는 테로스틸벤 식사로 유지되었다.

기본 혼합	g/ kg
밀. 고형, 연마됨	362.75
옥수수, 노란색, 연마됨	193.80
밀, 중급	102.00
귀리, 연마됨	102.00
생선 사료, 멘하덴, 60%	91.80
콩 사료, 48%	51.00
알팔파 사료, 탈수화됨, 17%	20.40
옥수수 글루텐 사료, 60%	20.40
디칼슘 포스페이트, 18.5%, FG	15.30
콩 오일	15.30
맥주 효모, 건조됨, FG	10.20
소금, 요오드화 NaCl	5.10
칼슘 카보네이트, 38%, FG	4.85
비타민 혼합, NIH-31 (TD 87391)	3.57
미네랄 혼합, NIH-31 (TD 76121)	1.53

대조군 식사 -98% 기본 혼합 + 2% 옥수수

저용량 테로스틸벤 식사 - 98% 기본 혼합 + 1.996% 옥수수 (1.96 g/kg) + 0.004% (0.040 g/kg) 결정화 테로스틸벤

고용량 테로스틸벤 식사 - 98% 기본 혼합 + 1.984% 옥수수 (1.84 g/kg) + 0.016% (0.160 g/kg) 결정화 테로스틸벤

본 발명은 상기 및 다른 목적 및 장점들과 함께 도면으로 묘사된 본 발명의 구체예의 하기 상세한 기술로부터 가장 잘 이해될 수 있다. 여기서:
도 1은 다양한 스틸벤 유도체들의 화학 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 M1-형질전환된 COS-7 세포 대조군 세포, 및 블루베리, 레스베라트롤, 피노스틸벤, 데속시래폰티제닌, 테로스틸벤, 테로스틸벤 글루코사이드, 레스베라트롤 트리메틸에테르, 또는 피세아태놀로 전-처리가 되고, 이어서 0 도파민 (- 도파민) 또는 1 mM 도파민 (+ 도파민) 처리가 된 세포에서 평균 Ca² ⁺ 회복 그래프이다. 별표는 각 처리의 경우 비-도파민-처리된 및 도파민-처리된 세포 간의 회복 상의 차이를 나타낸 것이다 (* = p < 0.001);
도 3은 테로스틸벤의 낮은 보충 (0.004% w/w), 테로스틸벤의 높은 보충 (0.016% w/w), 또는 식사에 테로스틸벤 없음 (대조군)을 투여한 개체들의 초 단위의 플랫폼 대기시간 측정의 그래프이다. 별표는 각 식사 그룹의 경우 시험 1 및 시험 2 간의 차이를 나타낸 것이다 (* = p < 0.05);
도 4는 테로스틸벤의 낮은 보충 (0.004% w/w), 테로스틸벤의 높은 보충 (0.016% w/w), 또는 식사에 테로스틸벤 없음 (대조군)을 투여한 개체들의 미터 단위의 플랫폼 거리 측정의 그래프이다. 별표는 각 식사 그룹의 경우 시험 1 및 시험 2 간의 차이를 나타낸 것이다 (* = p < 0.05);
도 5는 기초 수준 (-H₂O₂) 하에서 및 산화적 스트레스 처리의 조건 (+H₂O₂, 50μM) 하에서 대조군, 저용량 테로스틸벤 (0.004%), 및 고용량 테로스틸벤 (0.016%) 식사로 유지된 개체들로부터 준비된 줄무늬 (striatal) 슬라이스 (pmol/mg 단백질에서 변화)로부터 도파민 방출의 오소트레모린 증진 그래프이다. 별표는 각 식사 그룹의 경우 비-H₂O₂-처리된 및 H₂O₂-처리된 줄무늬 슬라이스 간의 도파민 방출에서의 차이를 나타낸 것이다 (* = p < 0.01).
도 6A는 개체의 해마에서 테로스틸벤 양 (ng)을 모리스 워터 메이즈에서 수행되는 플랫폼을 찾는 대기시간 (초)의 함수로 나타낸 그래프이다. 테로스틸벤은 개체의 해마에서 측정되었고 3일 및 4일로부터의 시험 2의 개체 성적과 상호 관련이 있었다. 도 6B는 개체의 해마에서 테로스틸벤 양 (ng)을 모리스 워터 메이즈에서 수행되는 플랫폼에 도달하는 데 개체가 통과하는 거리 (미터)의 함수로 나타낸 그래프이다. 테로스틸벤은 3일 및 4일로부터의 시험 2의 개체의 해마에서 측정되었다.

하기 제한되지 않는 실시예들은 본 발명의 다양한 구체예들을 보다 설명하기 위하여 제공된다.

실시예 1: 산화적 스트레스에 대한 세포 처리

아프리카 녹색 원숭이의 신장으로부터 유래한 세포주인 COS-7 세포를 10% 우태아 혈청 (FBS)를 보충하고 100 U/ml 페니실린 및 100 ug/ml 스트렙토마이신 설페이트를 포함하는 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium, D-MEM)에서 배양하였다. 형질전환 전 24시간에, 세포를 트립신을 사용하여 수확하고 계수하여 5 x 10⁶ 세포/플레이트 농도로 mm² 조직 배양 플레이트 상에 도말하였다. 세포를 DEAE-덱스트란 방법에 의해 래트 무스카린 수용체 아형 1 DNA로 일시적 형질전환시켰다. 형질전환 후, 세포를 80μM 클로로퀸 (chloroquine)을 포함하는 성장 배지에서 2.5시간 배양하여 상기 DNA의 분해를 최소화하였다. 형질전환된 세포를 그 다음 성장 배지에서 48시간 동안 유지시키고, 칼슘 이미징 (calcium imaging)을 위해 35 mm 플레이트에서 커버슬립 위에 도말하며 밤새 배양하였다.

세포 처리

블루베리 (BB) 추출물 (2mg/ml), 스틸벤 [레스베라트롤 (50μg/ml), 피노스틸벤 (50μg/ml), 데속시래폰디제닌 (25μg/ml), 테로스틸벤 (10μg/ml), 테로스틸벤 글루코사이드 (10μg/ml), 레스베라트롤 트리메틸에테르 (10μg/ml), 피세아태놀 (10μg/ml)] 및 도파민 (1mM) 처리는 앞서 Joseph J. et al., 2004. J. Alz. Dis. 6:403-411에 기술되어 있고 본 명세서에서 참고문헌에 의해 통합된 바와 같이 수행되었다. 상기 BB 추출물과 스틸벤은 성장 배지에 녹이고 상기 처리된 성장 배지를 사용하여 세포를 37℃에서 45분 동안 연속 배양하고 이어서 4시간 동안 도파민을 투여하였다. 이러한 배양에 이어서 세포를 테스트 전에 추출물-없는 성장 배지를 사용하여 세 번 세척하였다.

칼슘 이미징은 니콘 에클립스 TE200U 현미경 단상 위에 놓여진 온도 조절기를 가진 메디칼 시스템사(Medical Systems Corp.)의 오픈 살포 마이크로-배양기 (37℃)를 사용하여 수행되었고 형광 광원을 사용하여 발광되었다. 형질전환된 세포를 로딩 배지 (99% DMEM 1% FBS)에서 퓨라-2/아세톡시메틸 에스테르 (fura-2/acetoxymethyl ester)(2μM)를 사용하여 40분 동안 5% CO의 37℃에 로딩하였다.

그 다음 칼슘 유동의 실시간 분석을 750μM 오소트레모린-유도성 (oxotremorine-induced) 탈분극화 이전 및 이후 (37^oC) 심플 PCI 소프트웨어 (Compix, Inc. Mars, PA)를 사용하여 수행하였다. 그 다음 반응 및 회복이 각 시료에서 결정되었다. 반응은 세포가 오소트레모린에 대한 [Ca²⁺]_i 에서 기본선 대비 30%< 증가를 보이는지 여부를 조사하여 결정되었다. 이 반응 크기를 보이는 세포들만 심화 분석이 이루어졌다. 회복은 반응한 세포에서 탈분극화에 이어서 Ca² ⁺ 수준이 20% 증가로 회복되는 시간을 측정하여 결정되었다. 결과는 분산 및 Mann-Whitney U 테스트의 Kruskal-Wallis one-way 분석에 의해 분석되었다.

도파민의 투여는 M1-형질전환된 세포에서 [80% 기본선]으로부터 회복을 유의하게 감소시킨다 (대조군 대비 도파민-처리된 세포, p < 0.001) (도 2). 테로스틸벤, 테로스틸벤 글루코사이드, 레스베라트롤 트리메틸에테르 및 피세아태놀은 회복 (p > 0.05)에서 도파민-유도성 감소에 대항하여 보호한 반면, 레스베라트롤, 피노스틸벤 및 데속시래폰티제닌은 보호를 나타내지 않았다 (p < 0.001) (도 2).

실시예 2: 모리스 워터 메이즈 ( Morris Water Maze )

모리스 워터 메이즈 (MWM)는 개체의 공간적 학습 및 기억을 테스트하는 방법이다. 상기 MWM은 리차드 모리스에 의해 개발되었고, 개체가 먼 큐사인에 근거하여 원형 워터 풀 (반경 134cm x 높이 50cm, 23℃에 유지됨)의 표면 아래 (2cm)에 위치하는 감추어진 플랫폼 (반경 10 cm)을 설치하고 이전의 시도로부터 그 위치를 기억하도록 요구하는 나이 및 식사 민감성 학습 패러다임이다. 정확한 방향성 (navigation)에는 플랫폼 상의 물로부터 탈출하는 보상이 주어지고, 이를 위해 개체는 포스터, 실험기기 (experimenters), 컴퓨터, 사육 상자 (cage racks)와 같은 먼 큐 사인을 사용하여 효과적으로 설치한다. 상기 MWM의 작업 기억 버전 (Brandeis et al., 1989. Int J Neurosci. 48:29-69 Morris R., 1984. J Neurosci Methods.11: 47-60.)은 4일 연속 매일 처리하고 7주 동안 아침 및 점심 세션으로 각 세션마다 2번씩 10분 간격으로 두고 수행되었다. 래트는 무작위 방식으로 각 그룹으로부터 한 개체를 연속하여 테스트하는 조건으로 시험되었다. 각 시험을 시작하는 시점에서, 개체를 4개 무작위 시작점 중 하나에서 물 속에 가만히 담구었다. 각 개체에는 플랫폼 위로 탈출하도록 120초가 허용되었다; 개체가 이 시간 이내에 탈출하지 못하면, 플랫폼으로 인도되었다. 일단 개체가 플랫폼에 도달하면, 15초 동안 그 곳에 나두었다 (시험 1; 기준 (reference) 기억 또는 획득 시험). 개체는 시험 중 (10분) 홈 사육 상자로 돌아왔다. 시험 2 (작업 기억 또는 복구 시험)은 시험 1과 동일한 플랫폼 위치와 시작점을 사용하였다. 성적들은 비디오 촬영되고 이미지 추적 소프트웨어 (HVS Image, UK)를 사용하여 분석되었으며, 이는 대기시간 (초) (플랫폼을 찾는 시간), 경로 길이 (cm), 및 수영 속도 (cm/초; 대기시간/경로 길이)의 측정이 가능하다. 사용된 미로 및 패러다임의 상세한 설명은 Shukitt-Hale et al., 1998, Experimental Gerontology, 33:615-624 에 기재되어 있고 본 명세서에서 참고문헌에 의해 통합된다.

래트 개체는 상기 상세히 설명된 테로스틸벤 식사가 투여되었고 대조군 식사를 준 그룹에 비해 향상된 공간적 기억 성적을 나타내었다 (도 3 및 4). 식사 그룹 간에 시험 1 또는 시험 2의 경우 플랫폼을 찾는 데 대기시간 또는 거리에 차이가 없었다. 그러나, 별도의 t-테스트가 향상된 작업 기억의 표지로서, 서로 다른 식사 그룹이 시험 1부터 시험 2까지 그들의 성적을 유의하게 향상시키는지 여부를 결정하기 위해 3일 및 4일 동안 (학습 보다 기억에 더 의존하는 시간) 각 그룹에 대해 두 개 시험 대기시간 또는 거리 간에서 수행되었다. 고용량 테로스틸벤 그룹은 시험 1 및 시험 2 간 플랫폼을 찾는 대기시간에 유의한 (p < 0.05) 차이를 보여주었다. 예로, 시험 2 대기시간은 시험 1보다 유의하게 짧았고 이들 래트는 심지어 10분 보유 간격을 가지고 한 번 시도 학습 (one-trial learning)을 전시하는 것을 보여주었다 (도 3). 이러한 한 번 시도 학습은 대조군에서 관찰되지 않은 반면, 저용량 테로스틸벤 그룹은 시험 1로부터 시험 2까지 개선되는 경향이 있었다 (p = 0.09). 또한, 저용량 및 고용량 테로스틸벤 그룹은 둘 다 시험 1 및 시험 2 간 플랫폼을 찾는 거리에서 유의한 (p < 0.05) 차이를 보여주었다. 예로, 시험 2 거리는 시험 1 보다 유의하게 짧았다 (도 4). 대조군 그룹은 시험 1부터 시험 2까지 이러한 향상을 보여주지 못했다. 따라서, 테로스틸벤은 인지 성적, 특히 작업 기억에 미치는 노화의 해로운 효과를 용량-의존적 방식으로 역전시켰다.

개체 해마 조직에서 테로스틸벤

해마 뇌 조직이 모리스 워타 메이즈 테스트 이후 2-3 주에 안락사된 개체로부터 추출되었다. 조식 시료는 -80℃에 저장하고 추출 전 얼음으로 해동시켰다. 조직은 500μL의 인산 완충용액 (pH 7.4)에서 균질화시킨 다음 원심분리하였다 (7000 g, 4℃, 15분). 상청액은 수확되었으며 균질화 과정이 반복되었다. 조합된 상청액을 에틸 아세테이트 (500μL x 2)를 사용하여 추출하였다. 에틸 아세테이트 추출물은 질소 증기 하에서 건조되었다.

건조된 추출물은 30μL의 N,O-비스[트리메틸실릴]트리플루오르아세트아마이드 : 디메틸포름아미이드 (BSTFA:DMF, 1:1; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL)으로 처리하고 70℃에서 40분 동안 가열하였다. 유도체화 시료는 기체 크로마토그래피-질량 분광측정법 (GC-MS)에 의해 테로스틸벤의 분석하는 데 사용되었다. GC-MS는 J&W DB-5 모세 컬럼 (0.25 mm 내부 반경, 0.25 μm 필름 두께, 30 m 길이; Agilent Technologies, Foster City, CA)을 이용하는 제올 기기 (JEOL GCMate II) (JEOL USA Inc., Peabody, MA) 상에서 수행되었다. 상기 GC는 하기 온도 프로그램 하에서 진행되었다: 초기 190℃, 20℃/분 속도로 239℃까지 증가시키고 이 온도에서 3분 동안 유지하며, 0.2℃/분 속도로 242℃까지 증가시킨 다음 최종적으로 25℃/분 속도로 300℃까지 증가시키고 이 온도에서 1.5분 동안 유지시켰다. 운반 기체 (carrier gas)는 1 mL/분 유속에서 초고순도 헬륨이었다. 주입구, GC-MS 간격 및 이온화 체임버는 각각 250, 230 및 230℃였다. 주입 부피는 1 μL이고, 연속 (splitless) 주입이었다. 질량 스펙트럼은 양성, 원자 충격 (70eV), 저-해상도 방식에서 획득되었다. 테로스틸벤은 재구성된 (reconstructed) 이온 크로마토그램으로부터 결정되었고 m/z 328, 313, 297 및 147을 사용하여 정량 분석되었다. 정량 분석은 테로스틸벤의 표준 시료의 측정 곡선 (보유 시간, 12.5분)으로부터 수행되었다. GC-MS 분석은 중복 시료에서 시행되었다. 해마 테로스틸벤은 고용량 테로스틸벤 그룹에서만 검출되었고, 1.352 ± 0.465 ng/조직 시료이었다.

고용량 테로스틸벤 래트의 MWM 행동 및 뇌에서의 테로스틸벤 수준 간 관련성이 있는지 여부를 조사하기 위하여, 해마 테로스틸벤 수준을 시험 1 및 시험 2의 대기시간 및 거리 성적으로 도 6A 및 6B에 상술된 바와 같이 상호 연관시켰다. 해마는 공간 학습 및 기억에서의 그의 역할, 특히 시험 2 작업 기억으로 잘 알려져 있고 해마 테로스틸벤 수준 및 3일 및 4일에 대기시간 (r = -0.764, p = 0.010) 및 거리 (r = -0.734, p = 0.016)에 대한 시험 2 성적 간의 상호 연관성은 유의하게 음성인 것으로 밝혀졌다; 예로, 테로스틸벤 수준이 증가할수록 플랫폼을 찾는 대기시간 및 거리는 감소하였다.

실시예 3: 도파민 방출

과융합된 줄무늬 슬라이스로부터 나온 K⁺-유발 도파민 방출 (K⁺-ERDA)의 무스카린 증진은 수용체 민감성 및 줄무늬 기능의 표지자이고, Joseph et al., 1988. Brain Res., 454:140-8; Joseph et al., 1988. Brain Res ., 454:149-55; Joseph J., et al., 1990. Brain Res ., 537:40-48; Joseph et al., 1996. Free Radic . Biol. Med ., 20: 821-30 에 기술되어 있으며 본 명세서에서 참고문헌에 의해 통합되어 있는 바와 같이 노화 및 산화적 스트레스에 민감하다. 또한, 도파민 방출의 무스카린 증진은 Joseph et al., 1998. J. Neurosci ., 18: 8047-8055; Joseph et al., 1999. J. Neurosci ., 19: 8114-8121; Youdim et al., 2000. Nutr Neurosci ., 3: 383-97; Shukitt-Hale et al., 2005. Age ., 27: 49-57; Shukitt-Hale et al., 2006. Nutrition, 22: 295-302에 기재되어 있고 본 명세서에 참고문헌에 의해 통합되어 있는 바와 같이 식사 보충에 민감하다. 대조군 및 보충된 그룹으로부터 획득된 줄무늬 조직의 보호 능력은 줄무늬 K⁺-ERDA의 오소트레모린에서의 차이를 조사하여 평가되었다. 도파민 방출은 행동적 테스트에 이어서 고용량, 저용량 및 대조군 식사를 먹인 개체의 뇌로부터 나온 새로이 절단되고 크로스 컷 된 (300μm, McIlwain 조직 집게) 줄무늬 슬라이스 상에 2-3주 시행되었다. 상기 슬라이스는 95% O₂/5% CO₂ 로 30분 동안 거품을 낸 변형된 크렙스-링거 기본 방출 배지 (BRM)을 포함하고 21mM NaHCO₃, 3.4mM glucose, 1.3mM NaH₂PO₄, 1mM EGTA, 0.93mM MgCl₂, 127mM NaCl 및 2.5mM KCl (낮은 농도 KCl) (pH 7.4)를 포함하는 작은 유리 바이알에 넣어두었다. 조직의 절반은 산화적 스트레스 조건 하에서 식사의 효과를 평가하기 위해 50μM H₂O₂로 처리되었다. 이러한 평형기 이후에, 배지는 (mM로) KCl 30 (높은 농도 KCl), CaCl₂.2H₂O 1.26 (EGTA 대신), NaCl 57, 및 0 또는 500μM 오소트레모린을 포함하는 배지로 교환해준 다음 K⁺-ERDA의 증진이 평가되었다. 도파민 방출은 전기화학적 검출과 결합된 HPLC 에 의해 정량되었으며 로우리 방법에 의해 결정된 바와 같이 pmoles/mg 단백질로 표현되었다.

도파민 방출 (오소트레모린-증진된 줄무늬 K⁺-ERDA)은 식사 및 H₂O₂ 처리 [F(5,58) = 2.34, p < 0.05]에 따라 그룹들 간에 유의하게 차이가 있었다 (도 5). 기본 조건 하에서, 식사 그룹들 간에 차이는 없었다 (p > 0.05). 그러나, 도파민 방출은 비-H₂O₂-처리된 대조군 식사 그룹에 비해 H₂O₂-처리된 대조군 식사 그룹에서 유의하게 감소되었고 (p < 0.05), 한편 저용량 또는 고용량 테로스틸벤의 치료량을 투여한 개체에서 H₂O₂-처리 이후에 차이가 관찰되지 않았다.

본 발명은 기재된 구체예의 상세한 내용에 대한 참고문헌과 함께 기술되고 있지만, 이들 상세한 내용은 첨부된 청구항에 정의된 바와 같이 본 발명의 범위를 한정하려는 것이 아니다. 배타적인 재산권 또는 특권이 주장되는 본 발명의 구체예는 하기와 같이 정의된다.

Claims

실질적으로 순수한 테로스틸벤 (pterostilbene) 화합물 및 생리학적으로 허용가능한 담체를 치료적 유효량으로 함유하는 산화적 스트레스를 치료하는 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 화합물은 개체 체중의 킬로그램 당 약 2.5 mg 내지 약 10 mg의 화합물 로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 테로스틸벤의 치료적 유효량은 백시니움 베리 (Vaccinium berries) 식사를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3항에 있어서,
상기 백시니움 베리는 블루베리인 것을 특징으로 하는 조성물.
개체에 대한 산화적 스트레스를 감소시키는, 실질적으로 순수한 테로스틸벤 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 것으로 이루어진 산화적 스트레스를 치료하는 방법.
제 5항에 있어서,
상기 치료적 유효량은 개체 체중의 킬로그램 당 약 2.5 mg 내지 약 10 mg의 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서,
상기 화합물은 개체의 아세틸콜린 수용체 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서,
상기 개체가 산화적 스트레스 인자에 노출될 때 도파민 방출을 감소시키지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서,
테로스틸벤은 백시니움 베리 식사를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항에 있어서,
상기 백시니움 베리는 블루베리인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서,
테로스틸벤은 무스카린 수용체 아형 (muscarinic receptor subtypes)의 칼슘 완충 능력을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11항에 있어서,
상기 무스카린 아형은 M1인 것을 특징으로 하는 방법.
개체에 대한 작업 기억을 증가시키는, 실질적으로 순수한 테로스틸벤 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 것으로 이루어진 개체의 작업 기억을 증가시키는 방법.
제 13항에 있어서,
상기 테로스틸벤의 치료적 유효량은 개체 체중의 킬로그램 당 약 10 mg의 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
제 13항에 있어서,
테로스틸벤은 약제학적 담체와 함께 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 13항에 있어서,
테로스틸벤은 영양제학적 담체와 함께 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서,
테로스틸벤은 식물학적 식물로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 방법.