JP2010537670A - 新生家畜においてt細胞免疫調節を調整するためのモリンダ・シトリフォリア系製剤 - Google Patents
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Abstract
新生動物においてCD8+T細胞を活性化するための、液体形態および固体形態のモリンダ・シトリフォリア強化動物用食品製品が提供される。いずれもモリンダ・シトリフォリア果実ピューレおよびその他のモリンダ・シトリフォリア植物生成物を含む。
Description
本発明の分野は、様々な動物に投与可能なノニ(モリンダ・シトリフォリア)強化製品に関し、さらに具体的には動物のCD8+T細胞の活性化を増強させる製品に関する。
多種多様な異なる動物用食品製剤が市販されている。過去において、これらの製剤の栄養素または成分は一般に、要望や必要に応じて動物に対する特別な利点を提供するように設計されてはいなかった。動物用食品は新生家畜の死亡率を減少させるように特別に設計することができる。例えば、様々な家畜の新生児免疫系が生まれつき発育未熟であることは、罹患率および死亡率増加になる素因である。現在、この罹患率および死亡率を減少させる主要な管理戦略は、特に酪農子牛においては、高品質初乳を摂取させて免疫グロブリンの適正受身伝達(APT)を確保することである。APTは酪農子牛飼育者の目標であるが、規模のより大きい商業的な子牛飼育農場と比較して、より小さな閉鎖群集団の酪農場の方がより簡単に達成することができる。
免疫グロブリンに加えて、高品質初乳は新生児の先天および適応免疫を調節するのに中心的な働きをするサイトカイン、成長因子、ホルモンおよび母体からの白血球を完全に含む。ウシの初乳はIFN−γ,IL−1β,IL−1ra,IL−4,IL−6,IL−18,およびTNF−αなどの幾種かのサイトカインを含むことが知られている。その多くは出産直後に最高濃度で見出すことができ、出産5日後までに乳中の濃度が急速に減少する。経口投与された白血球とサイトカインは素早く吸収されて新生子牛の循環系に入ることは、様々な研究で示されている。
ウシヘルペスウイルス−1(BHV−1)、ウシウイルス性下痢症ウイルス(BVDV)およびウシ呼吸器多核体ウイルス(BRSV)などの感染症に対する防御における適応免疫には、CD4+Tヘルパー細胞、細胞傷害性CD8+T細胞CTL、およびγδTCR+サブセットを含む機能的T細胞の全レパートリーが必要である。
Tヘルパー細胞はCD4+を発現し、Tヘルパー1(Th1)とTヘルパー2(Th2)細胞という2つの主要な集団からなる。これらのT細胞サブセットは、IL−2およびIFN−γのようなサイトカインの分泌を通じてマクロファージ活性化のような多数の免疫細胞の活性化を調整することによって、全般的な適応免疫反応を調整する点で重要な役割を果たす。エフェクターCD4+T細胞はB細胞の応答を助け、APCの活性化やIL−2、IL−4、およびIL−5などのサイトカインの分泌を通じてCD8+T細胞の発生を強化する。新生子牛免疫が侵入病原体に直面してTh2反応を選好することも確定している。Th1応答に対するこの偏向は、炎症誘発性サイトカインが産生される間、母体と胎仔の間での同種免疫反応の可能性を減少させ、子宮内外両方で感染に対する防御を助ける。しかしながら、このTh2偏向細胞応答はワクチン応答を弱め、新生仔を微生物感染に対する感受性がより高い状態のままにしてしまう。長期間繰り返しての抗原暴露、Th2細胞の極性化の減少および/またはTh1細胞の極性化の増加は、免疫成熟プロセスを促進するので、アレルギーとアトピーを減少させる可能性がある。妊娠中に有害となり得るTh1免疫応答は、CD8+CTLの産生に繋がるので、分娩後には重要性が高まる。これらの細胞は、感染した細胞を溶解する能力を持つ免疫システムにおいて決定的な役割を果たす。
γδT−細胞は、回腸粘膜におけるリンパ球のうちで最小のフラクションであり、若い子牛におけるPBMCのうちで最大のフラクションを形成する。それらの細胞は幅広い範囲の機能を持つが、それらの免疫監視および病原体認識における役割はまだ不明なところが多い。γδT細胞の機能には免疫調節と炎症反応の他にサイトカイン産生と細胞傷害活性が含まれるという証拠がある。脾臓に見いだされるウシγδT細胞は血中に存在するものよりも転写活性が高いが、循環するTリンパ球の中でもほんの小さなフラクションに過ぎない。
新生子の損失を防ぐ第二の主要な管理戦略は、治療的使用および/または予防的戦略として代用乳または注射によって抗生物質を投与することである。この戦略は子牛の罹患率や死亡率の減少に繋がるけれども、この管理技術は抗生物質耐性病原菌の発生を早める可能性があることや、非有機産物を消費者に提供することになるということについて、大いに調査されている。事実、2003年、欧州連合は成長促進目的で家畜に対して抗生物質および同類の薬を使用することを既に禁止している。これらの制限は人間に使用する抗生物質の有効性を維持するためである。世界保健機関もまた、生産動物への成長促進抗生物質使用の中止を勧告しており、米国も近い将来に同様の制限を採用するだろうと予想する人もいる。
消費者の圧力の結果として、子牛の健康を増進し罹患率および死亡率を低下させる、安全で自然で持続可能な免疫調節剤が求められてきた。APT成功の可能性を増加させて免疫機能を改善させながら抗生物質への産業依存を減らすことができる栄養補助製品が求められている。ペプチド、リポ多糖、糖タンパク質、脂質由来物、タンパク質、および微生物から単離した物質を含む広範囲の免疫調節物質が同定され、臨床場面において試験されてきたが、その成功率は様々である。
植物源からの免疫調節物質は、その免疫増強効果、比較的低い毒性、および生物学的利用可能性のために大きな評価を受けてきた。ある種の免疫調節物質である多価不飽和脂肪酸は、動物食のエネルギー濃度を高めるのに用いられ、免疫調節を提供してきた。最適量のビタミンAとEは、成牛並みの免疫応答を促すことが証明されている。マンナンオリゴ糖を雌親から補給された子牛は、比較対照の子牛よりも高い血清ロタウイルス中和価と血清タンパク質濃度を有する傾向があった。
モリンダ・シトリフォリア(ノニ)の実は幅広い抗菌性、抗炎症性、免疫刺激性、および抗腫瘍効果があると言われる周知の天然ハーブ製品である。モリンダ・シトリフォリアの実の果汁は多糖が豊富な物質であるノニ沈殿剤(ppt)に媒介される免疫刺激効果を有すると考えられる。
前述した数々の医学的問題に対する一般的な薬物療法の殆どは、深刻な副作用を引き起こす可能性があるので、動物の苦痛を軽減するだけではなくヒトの健康の質を改善するためにも、これらの病気や症候群をより少ない禁忌で治療して抗生物質耐性の発生を減らすであろう組成物含有天然産品および栄養補給食品が強く望まれる。
本発明は、動物の健康を増進して罹患率および死亡率を低下させる、様々なモリンダ・シトリフォリア強化免疫調節物質を動物に投与する様々な配合物と方法とに関する。従って、本発明の好ましい態様は、動物に投与可能なモリンダ・シトリフォリア強化製品を提供する。
本発明の幾つかの態様は、次の様な加工済みモリンダ・シトリフォリア成分を1つ以上含む。モリンダ・シトリフォリア葉の抽出物、葉の熱水抽出物、加工済みモリンダ・シトリフォリア葉のエタノール抽出物、加工済みモリンダ・シトリフォリア葉の蒸気蒸留抽出物、モリンダ・シトリフォリア果汁、モリンダ・シトリフォリア抽出物、モリンダ・シトリフォリア食物繊維、モリンダ・シトリフォリアピューレ汁、モリンダ・シトリフォリアのピューレ、モリンダ・シトリフォリア濃縮果汁、モリンダ・シトリフォリア濃縮ピューレ汁、凍結濃縮したモリンダ・シトリフォリア果汁、および蒸発濃縮したモリンダ・シトリフォリア果汁、生のモリンダ・シトリフォリア全果実、乾燥したモリンダ・シトリフォリア全果実、粉末あるいは溶媒抽出した形態のモリンダ・シトリフォリア種子、酵素処理をしたモリンダ・シトリフォリア種子、またはその他の処理をしたモリンダ・シトリフォリア種子(即ち、焙煎、漂白、電子レンジ処理、加熱処理、水または様々な塩や化合物の水溶液への浸漬など)、花や花弁が付着したモリンダ・シトリフォリア全果実、葉抽出物、葉汁、及び脱脂済み且つ未処理の種子抽出物。
本発明の好ましい態様は、モリンダ・シトリフォリアピューレと他の種子抽出物、脂肪酸、およびミネラルなどの添加物を含有する食品製品を動物に与える送達システム、方法、および装置を提供する。これらの送達システムの例としては、ペレット、押出塊、押出薄片、沈降塊、水系をまたはリックタンク系を経由した液体形態での送達、半固体およびゼラチン形態、低水分ゲル、低水分ゲルペレット、クランブル、マッシュ、疎性の餌、甘い餌、および液体ドレンチ法がある。本発明は、これらの様々な形態のモリンダ・シトリフォリア強化製品を、一般的に動物に与える餌にその製品を一体化させるか、または餌の上層とするかによって投与することを意図する。他の投与方法としては、産後間もない新生子牛へ投与される初乳がある。
本発明は栄養物添加ありと添加無しで様々な形態のモリンダ・シトリフォリアを投与することを意図する。動物に投与することができる製品の非限定的な例として、グリコサミノグリカンを添加したモリンダ・シトリフォリア、ヒアルロン酸を添加したモリンダ・シトリフォリア、グルコサミン塩酸塩を添加したモリンダ・シトリフォリア、グルコサミン硫酸塩を添加したモリンダ・シトリフォリア、およびコンドロイチン硫酸塩を添加したモリンダ・シトリフォリアが挙げられる。その他の動物に投与することができるモリンダ・シトリフォリアを含有する製剤の非限定的な例としては、必須アミノ酸を添加したモリンダ・シトリフォリア、必須脂肪酸を添加したモリンダ・シトリフォリア、長鎖脂肪酸を添加したモリンダ・シトリフォリア、オメガ3脂肪酸を添加したモリンダ・シトリフォリア、オメガ6脂肪酸を添加したモリンダ・シトリフォリア、マクロミネラルを添加したモリンダ・シトリフォリア、ミクロミネラルを添加したモリンダ・シトリフォリア、ペプチド鎖を添加したモリンダ・シトリフォリア、分岐鎖アミノ酸を添加したモリンダ・シトリフォリア、全ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、焙煎済み全ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、焙煎脱脂済み全ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、脱脂した焙煎済み粗挽きノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、焙煎済み粗挽きノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、焙煎済み粉末ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、脱脂した焙煎済み粉末ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、脱脂した焙煎済み薄片ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、焙煎済み薄片ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、脱脂した焙煎済み押出ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、および焙煎済み押出ノニ種子と種子抽出物を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレが挙げられる。
本発明は様々な家畜の免疫系の発達を強化するために、栄養物添加ありと添加無しで様々な形態のモリンダ・シトリフォリアを投与することを意図する。免疫系の発育未熟は、家畜を高罹患率と高死亡率にしがちである。母体からの免疫グロブリン、白血球、およびサイトカインを含む初乳の摂取は、その動物の健康と生存を保証する、動物の最良の防御である。本発明の好ましい態様は、殺菌、リンパ球増殖、CD4+、CD8+およびγδT細胞におけるCD25発現を達成するためにノニピューレを投与することを含む、新生子牛の給餌によって免疫系に好影響を与えるように構成される。
植物モリンダ・シトリフォリア L.の概要説明
インディアンマルベリー(Indian Mulberry)またはモリンダ・シトリフォリア(和名ヤエヤマアオキ)植物は、学名モリンダ・シトリフォリア L.(“モリンダ・シトリフォリア”)として知られる灌木または低木である。この植物は、東南アジア原産で、古くからインドから東ポリネシアまでの広い地域に広まった。この植物は野生では不規則に生育するが、農園や小規模な個人栽培地で栽培されてきた。完熟すると、その実は腐ったチーズのような強い臭気を持つ。この実は幾つかの国で食物として食べられてきたが、モリンダ・シトリフォリア植物の最も一般的な用途は赤色や黄色の染料原料として伝統的に用いられてきた。
インディアンマルベリー(Indian Mulberry)またはモリンダ・シトリフォリア(和名ヤエヤマアオキ)植物は、学名モリンダ・シトリフォリア L.(“モリンダ・シトリフォリア”)として知られる灌木または低木である。この植物は、東南アジア原産で、古くからインドから東ポリネシアまでの広い地域に広まった。この植物は野生では不規則に生育するが、農園や小規模な個人栽培地で栽培されてきた。完熟すると、その実は腐ったチーズのような強い臭気を持つ。この実は幾つかの国で食物として食べられてきたが、モリンダ・シトリフォリア植物の最も一般的な用途は赤色や黄色の染料原料として伝統的に用いられてきた。
1.モリンダ・シトリフォリア葉の処理
モリンダ・シトリフォリア植物の葉は、本発明の組成物中に存在しうるモリンダ・シトリフォリア植物の可能な成分の1つである。例えば、本明細書において更に説明されるように、ある組成物は葉抽出物および/または葉汁を含む。ある組成物は、モリンダ・シトリフォリア植物から得られた葉抽出物と果汁の両方からなるリーフセラムを含む。本発明のある組成物は、栄養補助製品に組み込まれるものとしてリーフセラムおよび/または様々な葉抽出物を含む(本明細書における「栄養補助」とは、ヒトや他の動物などの生体の健康を改善するように構成された如何なる薬または製品を言う)。
モリンダ・シトリフォリア植物の葉は、本発明の組成物中に存在しうるモリンダ・シトリフォリア植物の可能な成分の1つである。例えば、本明細書において更に説明されるように、ある組成物は葉抽出物および/または葉汁を含む。ある組成物は、モリンダ・シトリフォリア植物から得られた葉抽出物と果汁の両方からなるリーフセラムを含む。本発明のある組成物は、栄養補助製品に組み込まれるものとしてリーフセラムおよび/または様々な葉抽出物を含む(本明細書における「栄養補助」とは、ヒトや他の動物などの生体の健康を改善するように構成された如何なる薬または製品を言う)。
本発明のある態様では、モリンダ・シトリフォリア葉抽出物は以下の処理を用いて得られる。最初に、モリンダ・シトリフォリア L.植物の比較的乾燥した葉を集め、小片に切断し、圧縮装置−好ましくは油圧プレス−の中に入れて葉の小片を押しつぶす。ある態様では、押しつぶされた葉の小片は、次に、当業者で公知の方法を用いてエタノール、メタノール、酢酸エチルなどのアルコールやその他のアルコール系誘導体で浸出させる。次に、ある態様では、押しつぶされた葉の小片から前記アルコールとアルコール可溶な全ての成分を抽出した後、熱により煮詰めて全ての液体を除去して葉抽出物を残す。この結果生じた乾燥葉抽出物を本明細書では「一次葉抽出物」と呼ぶ。
本発明のある態様では、一次葉抽出物を低温殺菌して少なくとも部分的にこの抽出物を滅菌し、好ましくない生命体を死滅させる。一次葉抽出物を、好ましくは70から80℃の範囲の温度で、抽出物の主要な化学変換無しに好ましくない生命体を死滅させるのに十分な時間低温殺菌する。低温殺菌は様々な放射線技術や方法によって行うことができる。
本発明のある態様では、低温殺菌した一次葉抽出物を遠心デカンターの中に入れ、遠心によりクロロフィルを含む他の物質から残存する葉汁を除去または分離する。遠心サイクルが完了すると、葉抽出物は比較的精製された状態になる。次にこの精製葉抽出物を上記と同様に再び低温殺菌して、精製一次葉抽出物を得る。
好ましくは、一次葉抽出物を、低温殺菌および/または精製するかどうかに関わらず、さらに無水ヘキサンフラクションと水メタノールフラクションの2つの別個のフラクションに分ける。これは、好ましくは二酸化シリコンとCH2Cl2−MeOH成分を含むガスクロマトグラフによって当業者に周知の方法で達成される。本発明のある態様では、メタノールフラクションをさらに分画して二次メタノールフラクションを得る。ある態様では、ヘキサンフラクションをさらに分画して二次ヘキサンフラクションを得る。
一次葉抽出物、ヘキサンフラクション、メタノールフラクション、または二次ヘキサンまたはメタノールフラクションなどを含む葉抽出物のうちの1つ以上は、モリンダ・シトリフォリア植物の果実の果汁と混合してリーフセラムを得てもよい(果汁を得る処理は後述する)。ある態様では前記リーフセラムは出荷に備えて包装、凍結される。別の態様では、さらにここで説明したような栄養補助製品の中に組み込まれる。
2.モリンダ・シトリフォリア果実の処理
本発明のある態様では、モリンダ・シトリフォリア植物の果汁を含む組成物を含む。ある態様では、加工したモリンダ・シトリフォリアの果汁は、成熟したモリンダ・シトリフォリア果実の果汁と果肉から種と皮を分離し、この果汁から果肉を濾過し、果汁を包装することによって用意できる。あるいは、果汁を包装せずに、果汁を直ちに他の製品の一成分として入れたり凍らせたり低温殺菌したりすることもできる。本発明のある態様では、果汁と果肉をピューレ状にし、他の成分と混ぜるための均質な混合物とすることも可能である。他の処理としては、果実と果汁の凍結乾燥がある。果実と果汁は、最終果汁製品を製造するときに水で元に戻すことができる。さらに他の処理として、素練り前に果実と果汁を空気乾燥してもよい。
本発明のある態様では、モリンダ・シトリフォリア植物の果汁を含む組成物を含む。ある態様では、加工したモリンダ・シトリフォリアの果汁は、成熟したモリンダ・シトリフォリア果実の果汁と果肉から種と皮を分離し、この果汁から果肉を濾過し、果汁を包装することによって用意できる。あるいは、果汁を包装せずに、果汁を直ちに他の製品の一成分として入れたり凍らせたり低温殺菌したりすることもできる。本発明のある態様では、果汁と果肉をピューレ状にし、他の成分と混ぜるための均質な混合物とすることも可能である。他の処理としては、果実と果汁の凍結乾燥がある。果実と果汁は、最終果汁製品を製造するときに水で元に戻すことができる。さらに他の処理として、素練り前に果実と果汁を空気乾燥してもよい。
モリンダ・シトリフォリア果実の果汁を製造するのに現時点で好ましい処理では、果実は手で採るか、機械設備で採る。果実は、直径が少なくとも1インチ(2〜3cm)から12インチ(24〜36cm)までの大きさになれば収穫できる。果実は好ましくは、暗緑色から黄緑色を経て白色までの範囲の色およびその間の色の諧調を有する。収穫後に如何なる処理を行う前にも果実は十分に清浄にする。
果実は0〜14日間かけて成熟あるいは熟成させることができるが、好ましくは2〜3日間である。果実は、地面に接触しないように設備上に置いて成熟あるいは熟成させる。果実は、熟成中は布やネット材料で覆うことが好ましいが、覆わずに熟成させることもできる。さらなる処理の用意ができた状態の果実の色は、薄緑色、薄黄色、白または半透明色などの淡色である。腐敗が無いか、緑色が濃くて固過ぎないか果実を検査する。腐敗したり固くて緑色をした果実を合格した果実から分別する。
成熟、熟成した果実は、更なる処理や輸送のために、好ましくはプラスチックで内張した容器内に置く。熟成した果実の容器は0〜30日間保持可能であるが、好ましくは果実容器は処理前の7〜14日間保持する。容器は、更なる処理の前に、随意に冷蔵状態で保管してもよい。果実を保存容器から取り出し、手動または機械式の分離器で処理する。種と皮を果汁と果肉から分離する。
果汁と果肉は、貯蔵と輸送のために容器に詰めることができる。あるいは、果汁と果肉を直ちに処理して最終果汁製品としてもよい。容器は、冷蔵、冷凍、または室温状態で貯蔵することができる。モリンダ・シトリフォリアの果汁と果肉は、好ましくは均一混合物に混合し、その後、香味料、甘味料、栄養成分、植物性薬品および着色料など、その他の材料と混合してもよい。最終果汁製品は、好ましくは最低83℃から最高100℃までの温度で加熱し低温殺菌する。製造される他の製品は、濃縮または希釈状態のモリンダ・シトリフォリアピューレとピューレ汁である。ピューレは基本的に種子から分離した果肉であり、本書で述べる果汁とは別物である。
この製品をプラスチック、ガラス、または処理温度に耐え得る他の好適な素材からなる最終容器に充填、密閉してもよい。容器を充填温度で維持してもよいし、直ぐに冷却して輸送コンテナの中に置いてもよい。輸送コンテナは好ましくは、最終容器に入った製品の温度を維持あるいは制御する材質と方法で包装される。
果汁と果肉は、濾過装置によって果汁から果肉を分離することによって更に処理されてもよい。濾過装置は、好ましくは、遠心デカンター、1ミクロンから2000ミクロン、より好ましくは500ミクロン未満のサイズのスクリーンフィルター、フィルタープレス、逆浸透濾過装置、その他の標準的な市販濾過装置からなるが、これらには限定されない。動作フィルター圧力は好ましくは0.1psigから1000psigまでの範囲である。流量は好ましくは0.1g.p.m.から1000g.p.m.、より好ましくは5〜50g.p.m.の範囲である。湿った果肉を洗浄し、少なくとも1回最多10回濾過して全ての果汁を果肉から取り除く。得られた果肉抽出物は、一般的に10〜40重量パーセントの繊維を含む。得られた果肉抽出物は、好ましくは最低でも83℃の温度で低温殺菌し、さらなる処理のためにドラム缶に詰めるか、または高繊維製品とする。
3.モリンダ・シトリフォリア種子の処理
本発明のモリンダ・シトリフォリア組成物の幾つかは、モリンダ・シトリフォリア植物の種子を含む。本発明のある態様では、モリンダ・シトリフォリア種子の処理は、実験室用ミルで粉砕して種子粉末とすることによって行われる。ある態様では、この種子粉末は未処理のままとする。ある態様では、この種子粉末は、さらにヘキサンに浸漬、撹拌することによって脱脂する。この工程は好ましくは1時間室温で行う(薬剤:ヘキサン比率は1:10)。ある態様では、その後残渣を減圧濾過し、再度脱脂し(好ましくは30分間前記と同条件下で)、再度減圧濾過する。残留ヘキサンを除去するため、この粉末を換気フードに一晩保持してもよい。
本発明のモリンダ・シトリフォリア組成物の幾つかは、モリンダ・シトリフォリア植物の種子を含む。本発明のある態様では、モリンダ・シトリフォリア種子の処理は、実験室用ミルで粉砕して種子粉末とすることによって行われる。ある態様では、この種子粉末は未処理のままとする。ある態様では、この種子粉末は、さらにヘキサンに浸漬、撹拌することによって脱脂する。この工程は好ましくは1時間室温で行う(薬剤:ヘキサン比率は1:10)。ある態様では、その後残渣を減圧濾過し、再度脱脂し(好ましくは30分間前記と同条件下で)、再度減圧濾過する。残留ヘキサンを除去するため、この粉末を換気フードに一晩保持してもよい。
さらにまた、本発明のある態様では、脱脂および/または未処理粉末を、好ましくは50%エタノール(m/m)で24時間室温で薬剤と溶媒の比が1:2の条件で抽出する。
4.モリンダ・シトリフォリア油の処理
本発明のある態様は、モリンダ・シトリフォリア植物から抽出した油を含んでもよい。この油を抽出処理する方法は、1999年8月27日出願の米国特許出願第09/384,785号に記載され、米国特許第6,214,351号として2001年4月10日に発行されており、これは本明細書に参照として組み込まれる。モリンダ・シトリフォリア油は、一般的にパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノレン酸、およびその他微量に存在する脂肪酸など、トリグリセリドの形で幾つかの異なる脂肪酸の混合物を含む。さらに、この油は好ましくは油の劣化を防ぐ抗酸化剤を含む。通常の食品用抗酸化剤を使用するのが好ましい。
本発明のある態様は、モリンダ・シトリフォリア植物から抽出した油を含んでもよい。この油を抽出処理する方法は、1999年8月27日出願の米国特許出願第09/384,785号に記載され、米国特許第6,214,351号として2001年4月10日に発行されており、これは本明細書に参照として組み込まれる。モリンダ・シトリフォリア油は、一般的にパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノレン酸、およびその他微量に存在する脂肪酸など、トリグリセリドの形で幾つかの異なる脂肪酸の混合物を含む。さらに、この油は好ましくは油の劣化を防ぐ抗酸化剤を含む。通常の食品用抗酸化剤を使用するのが好ましい。
5.組成物とその用途
動物用食品は、異なる動物の特有の要求を具体的標的としてその要求を満足させる能力に関してますます進歩してきた。幾つかの動物用食品の調製が米国特許出願第6,737,089号に開示されており、その全部が本明細書に組み込まれる。
動物用食品は、異なる動物の特有の要求を具体的標的としてその要求を満足させる能力に関してますます進歩してきた。幾つかの動物用食品の調製が米国特許出願第6,737,089号に開示されており、その全部が本明細書に組み込まれる。
本発明は、様々な生理的状態を改善する動物向けの様々なモリンダ・シトリフォリア強化製品を投与するための組成物および方法を特徴とする。例えば、本発明の製品は免疫を強化するのに利用することができる。本発明の態様はまた、動物の体にモリンダ・シトリフォリア組成物を内部でおよび/または外部から導入するための方法を含む。モリンダ・シトリフォリア組成物のある態様は、様々な異なる成分からなり、各態様は本明細書で教示説明するような加工済みモリンダ・シトリフォリア成分を1つ以上の形態で含む。
本発明のある態様は次のような加工済みモリンダ・シトリフォリア成分を1つ以上含む。モリンダ・シトリフォリアの葉の抽出物、葉の熱水抽出物、加工済みモリンダ・シトリフォリア葉のエタノール抽出物、加工済みモリンダ・シトリフォリア葉の蒸気蒸留抽出物、モリンダ・シトリフォリア果汁、モリンダ・シトリフォリア抽出物、モリンダ・シトリフォリア食物繊維、モリンダ・シトリフォリアピューレ汁、モリンダ・シトリフォリアピューレ、モリンダ・シトリフォリア濃縮果汁、モリンダ・シトリフォリア濃縮ピューレ汁、凍結濃縮したモリンダ・シトリフォリア果汁、および蒸発濃縮したモリンダ・シトリフォリア果汁、生のモリンダ・シトリフォリア全果実、乾燥したモリンダ・シトリフォリア全果実、粉末あるいは溶媒抽出した形態のモリンダ・シトリフォリア種子、酵素処理をしたモリンダ・シトリフォリア種子、またはその他の処理をしたモリンダ・シトリフォリア種子(即ち、焙煎、漂白、電子レンジ処理、加熱処理、水または様々な塩や化合物の水溶液への浸漬など)、花や花弁が付着したモリンダ・シトリフォリア全果実、葉抽出物、葉汁、及び脱脂済み且つ未処理の種子抽出物。本発明の組成物は様々な他の成分を含んでもよい。他の成分の例としては、限定されないが、人工香料、他の天然果汁または濃縮天然ブドウ果汁や濃縮天然ブルーベリー果汁などの濃縮果汁、担体成分、および本明細書で更に後述する他の物が挙げられる。
モリンダ・シトリフォリア葉からの葉抽出物を含む組成物はいずれも、次の物を1つ以上含有してもよい。一次葉抽出物、ヘキサンフラクション、メタノールフラクション、二次ヘキサンおよびメタノールフラクション、リーフセラム、または栄養補助用製品。
本発明のある態様では、モリンダ・シトリフォリア組成物の有効成分と化合物は、当業者で周知の様々な手順や処理を用いて抽出することができる。例えば、有効成分は、当業者で公知の方法を用いて、メタノール、エタノール、および酢酸エチルなどのアルコールまたはアルコール系溶液、および、他のアルコール系誘導体を用いて単離、抽出してもよい。これらの有効成分または化合物は、単離し、さらに互いからその構成成分に分画または分離してもよい。好ましくは、これらの化合物は、分離または分画して、病気の防止、健康の増進あるいは他の同様な機能の実行を助けるかもしれない如何なる有効成分も同定し単離する。さらに、これらの化合物は、直前に述べた健康によい機能を提供するかもしれない如何なる重要で依存的な相互作用を同定し、分離して、その構成部分に分画または分離してもよい。
本発明は様々な形態のモリンダ・シトリフォリアを添加栄養物と共に投与することを意図する。動物に投与することができる製品の非限定的な例として、グルコサミノグリカンを添加したモリンダ・シトリフォリア、ヒアルロン酸を添加したモリンダ・シトリフォリア、グルコサミン塩酸塩を添加したモリンダ・シトリフォリア、グルコサミン硫酸塩を添加したモリンダ・シトリフォリア、およびコンドロイチン硫酸塩を添加したモリンダ・シトリフォリアが挙げられる。動物に投与することができるモリンダ・シトリフォリアを含有する製剤のほかの非限定的な例としては、必須アミノ酸を添加したモリンダ・シトリフォリア、必須脂肪酸を添加したモリンダ・シトリフォリア、長鎖脂肪酸を添加したモリンダ・シトリフォリア、オメガ3脂肪酸を添加したモリンダ・シトリフォリア、オメガ6脂肪酸を添加したモリンダ・シトリフォリア、マクロミネラルを添加したモリンダ・シトリフォリア、ミクロミネラルを添加したモリンダ・シトリフォリア、ペプチド鎖を添加したモリンダ・シトリフォリア、分岐鎖アミノ酸を添加したモリンダ・シトリフォリア、全ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、焙煎済み全ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、焙煎脱脂済み全ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、脱脂した焙煎済み粗挽きノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、焙煎済み粗挽きノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、焙煎済み粉末ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、脱脂した焙煎済み粉末ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、脱脂した焙煎済み薄片ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、焙煎済み薄片ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、脱脂した焙煎済み押出ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、および焙煎済み押出ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレが挙げられる。
本発明は様々な形態のモリンダ・シトリフォリア強化製品を投与することを意図する。それらの形態の非限定的な例としては、ペレット、押出塊、押出薄片、沈降塊、水系を経由した液体、リックタンク系を経由した液体、半固体、ゲル、低水分ゲル、低水分ゲルペレットなどが挙げられる。
モリンダ・シトリフォリア強化製品の送達方法は大変に重要であると思われる。送達方法の非限定的な方法としては、餌の最上層をモリンダ・シトリフォリア製品にしたり、生後間もない新生子牛に与える初乳にモリンダ・シトリフォリア製品を添加することを含む新生子牛用に用いられる給餌にモリンダ・シトリフォリア製品を添加したり、酪農業において乳腺炎の改善のためにモリンダ・シトリフォリア強化製品に浸漬したりすることが挙げられる。
どのようなモリンダ・シトリフォリア製品の投与形態を採用すべきかという判断には幾つか考慮が含まれてもよい。非限定的な考慮の例としては、牛/動物がこの製品を食べるかどうかという美味しさ、適切な用量はどれぐらいかという推奨摂取量、酪農業において牛乳の味を腐らすかという牛乳風味、その効果を著しく損なうことなく便利に餌に添加できるかという餌への組み込み、および、各動物が確実に適正用量を取れるように餌に均一かつ安定的に混合することができるかという混合の均一性が挙げられる。
好ましい態様では、モリンダ・シトリフォリア強化製品は動物の消費する食物と十分に混合される。非限定的な例として、モリンダ・シトリフォリア強化製品を穀物、干し草、ミルクまたはミルク代用品と混合することを提案する。別の非限定的な例として、モリンダ・シトリフォリアを液体投薬器具(例えば、中にある液体が水である)で混合することを提案する。
モリンダ・シトリフォリアのいずれの成分や組成物も、さらに栄養補助製品に組み込まれてもよい(再度、「栄養補助」とは本明細書においてヒトおよび/または動物などの生体の健康を改善するように構成された如何なる製品をもさす)。栄養補助製品の例としては、経静脈製剤、局所経皮製剤、救急製品、抗菌製剤、免疫系増強製剤、抗炎症製剤、点眼剤、抗真菌製剤、および様々な栄養補助剤と本明細書でさらに述べられる他の製品などが挙げられるが、これらには限定されない。
本発明の組成物は、経口組成物、局所経皮液剤、経静脈液剤、およびその他の製品や組成物を含む様々な態様のいずれにも配合可能である。
経口組成物は例えば、錠剤、巨丸薬、糖錠、水性または油性懸濁液、分散性粉末または顆粒、乳濁液、シロップ、またはエリキシル剤などの形態を取ってもよい。経口使用の組成物は、当業者で公知の如何なる方法によって調製しても良く、このような組成物は甘味剤、香料、着色料、及び保存料など、1つ以上の薬剤を含有してもよい。また、これらには、ビタミンやミネラルなど、1つ以上の添加成分が含まれてもよい。錠剤は、錠剤の製造に適した非毒性で薬理学的に許容される賦形剤との混合物中に1つ以上のモリンダ・シトリフォリア成分を含有するように製造してもよい。これらの賦形剤の例としては、不活性希釈剤、造粒剤および崩壊剤、結合剤、および潤滑剤などが挙げられる。錠剤は被覆されなくてもよいし、あるいは、消化管での崩壊や吸収を遅らせて長期間に渡る持続作用を提供するように公知の技術によって被覆されてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンなどの時間遅延材料を用いることができる。
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物にモリンダ・シトリフォリア成分を含むように製造することができる。このような賦形剤の例としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギニン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカント・ゴムおよびアカシア・ゴムなどの懸濁化剤、レシチンのような天然に存在するリン脂質、またはステアリン酸ポリオキシキシレンなどの脂肪酸とアルキレンオキシドとの縮合物、またはヘプタデカエチレンオキシセタノールなどの長鎖脂肪族アルコールとエチレンオキシドとの縮合物、あるいはモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトールなどのヘキシトールと脂肪酸由来の部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物、またはモノオレイン酸ポリエチレンソルビタンなどの無水ヘキシトールと脂肪酸由来の部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物、などの拡散剤または湿潤剤が挙げられるが、これらには限定されない。
一般的な甘味剤としては、トウモロコシ、テンサイ、サトウキビ、ジャガイモ、タピオカなどから取れる天然糖、または化学的あるいは酵素的に結晶塊、粉末、および/またはシロップに変換できるその他のデンプン含有資源が挙げられるが、これらには限定されない。甘味料には、また、人工的または高強度の甘味料を包含することができ、それの一部には、アスパルテーム、スクラロース、ステビア、サッカリンなどが含まれる。甘味料の濃度はモリンダ・シトリフォリア組成物の0〜50重量パーセントの間で良く、さらに好ましくは約1〜5重量パーセントである。
一般的な香料としては、美味しさに寄与する人工および/または天然の香料成分が挙げられるが、これらには限定されない。香料の濃度は、例えばモリンダ・シトリフォリア組成物の0〜15重量パーセントの範囲でよい。着色料としては、モリンダ・シトリフォリア組成物の0〜10重量パーセントの範囲の濃度を持つ食品用の人工または天然着色料が挙げられる。
一般的な栄養成分としては、モリンダ・シトリフォリア組成物の0〜10重量パーセントの濃度のビタミン、ミネラル、微量元素、ハーブ、植物抽出物、生理活性化学物質、および化合物が挙げられる。ビタミンの例としては、ビタミンA、B1からB12、C、D、E、葉酸、パントテン酸、ビオチンなどが挙げられるが、これらには限定されない。ミネラルと微量元素の例としては、カルシウム、クロム、銅、コバルト、ホウ素、マグネシウム、鉄、セレン、マンガン、モリブデン、カリウム、ヨウ素、亜鉛、リンなどが挙げられるが、これらには限定されない。ハーブと植物抽出物としては、アルファルファ草、蜂花粉、クロレラ粉末、ドンクアイ粉末、エキナセア根、イチョウ粉末抽出物、ハーブのトクサ、ヤエヤマアオキ、茸のシイタケ、海藻のスピルリナ、ブドウ種子抽出物などが挙げられるが、これらには限定されない。一般的な生理活性化学物質としては、カフェイン、エフェドリン、L−カルニチン、クレアチン、リコピンなどが挙げられるが、これらには限定されない。
局所経皮製剤に利用される成分としては、哺乳類の体内に内在しても安全であり、それぞれ1つ以上の担体剤を含むゲル、ローション、クリーム、軟膏などの様々な形態で存在可能であれば如何なる成分も含むことができる。体系的(例えば静脈内)に投与される組成物に組み込まれる成分や担体剤は、当業者で公知のいずれのものからなってもよい。
1つの典型的な態様においては、本発明のモリンダ・シトリフォリア組成物は、約0.01〜100重量パーセント、好ましくは0.01〜95重量パーセントの量で存在する1つ以上の加工済みモリンダ・シトリフォリア成分を含む。ある製剤の態様は、その全体が本明細書に組み込まれる2001年4月10日発行の米国特許第6,214,351号に含まれる。しかしながら、これらの組成物は単に典型例を示すことを意図するものであり、通常の当業者ならば、加工済みモリンダ・シトリフォリア製品を含む他の製剤や組成物を理解することができる。
別の典型的な態様においては、その内部組成は、約0.1〜80重量パーセントの量で存在する加工済みモリンダ・シトリフォリア果汁またはピューレ汁と、約0.1〜20重量パーセントの量で存在する加工済みモリンダ・シトリフォリア油と、約20〜90重量パーセントの量で存在する担体媒体を含む。モリンダ・シトリフォリアピューレ汁または果汁は、同様な濃度で存在する加工済みモリンダ・シトリフォリアの食物繊維製品と共に配合してもよい。
果汁と果肉は様々な方法を用いて乾燥させることができる。果汁と果肉の混合物を乾燥前に低温殺菌または酵素処理することができる。32.9℃〜57.2℃の間の温度で製品を加熱して酵素処理を開始する。次に、1種類の酵素あるいは酵素の組み合わせのいずれかにより処理する。これらの酵素としては、アミラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ブロメリンなどが挙げられるが、これらには限定されない。果汁と果肉を、高繊維製品に関してこれまでに述べたものなど、他の成分と共に乾燥することもできる。乾燥した果汁と果肉の一般的な栄養的側面は、水分が1〜20パーセント、タンパク質が0.1〜15パーセント、繊維が0.1から20パーセント、およびビタミンとミネラルの含量である。
濾過した果汁と湿った果肉を洗浄した水は、好ましくは一緒に混合する。濾過した果汁は、好ましくは減圧蒸発して、40〜70ブリックスに、また水分を0.1〜80パーセント、より好ましくは25〜75パーセントにする。得られたモリンダ・シトリフォリア濃縮果汁は低温殺菌してもしなくてもよい。糖の含有量または水の活性が微生物の成育を防ぐのに十分に低い状態であれば、果汁を低温殺菌しなくてもよい。貯蔵、輸送および/または更なる処理のために包装する。
動物用食品は、異なる動物の特有の要求を具体的標的としてその要求を満足させる能力に関してますます進歩してきた。幾つかの動物用食品の調製が米国特許出願第6,737,089号に開示されており、その全部が本明細書に組み込まれる。
6.送達の形態と方式
本発明は、様々な形態のモリンダ・シトリフォリア強化製品を投与することを意図する。これらの形態の非限定的な例としては、ペレット、押出塊、押出薄片、沈降塊、水系を経由した液体、リックタンク系を経由した液体、半固体、ゲル、低水分ゲル、低水分ゲルペレットなどが挙げられる。
本発明は、様々な形態のモリンダ・シトリフォリア強化製品を投与することを意図する。これらの形態の非限定的な例としては、ペレット、押出塊、押出薄片、沈降塊、水系を経由した液体、リックタンク系を経由した液体、半固体、ゲル、低水分ゲル、低水分ゲルペレットなどが挙げられる。
送達の方法
送達方法の非限定的な例としては、餌の最上層をモリンダ・シトリフォリア製品にしたり、その動物種に通常与える乾燥餌にモリンダ・シトリフォリア製品を液体状で添加したり、あるいはモリンダ・シトリフォリア製品を乾燥させて粉末、顆粒、あるいはペレットの形状で添加したりすることが挙げられる。液体モリンダ・シトリフォリア製品は、他の液状餌と適切な比率で混合されるだけでよい。沈降性ペレットは魚や他の水棲生物に用いられる。各動物が適正な用量を摂取して確実に均一な利益を得られるように、液体状態か乾燥状態かに関わらずモリンダ・シトリフォリア添加剤を餌に均一かつ安定的に混合する。
送達方法の非限定的な例としては、餌の最上層をモリンダ・シトリフォリア製品にしたり、その動物種に通常与える乾燥餌にモリンダ・シトリフォリア製品を液体状で添加したり、あるいはモリンダ・シトリフォリア製品を乾燥させて粉末、顆粒、あるいはペレットの形状で添加したりすることが挙げられる。液体モリンダ・シトリフォリア製品は、他の液状餌と適切な比率で混合されるだけでよい。沈降性ペレットは魚や他の水棲生物に用いられる。各動物が適正な用量を摂取して確実に均一な利益を得られるように、液体状態か乾燥状態かに関わらずモリンダ・シトリフォリア添加剤を餌に均一かつ安定的に混合する。
モリンダ・シトリフォリア強化食品を投与する1つの方法は、大量液体用量投与または「飲薬」(“drenching”)法によるものであり、この方法は、各牛、馬、羊および/または他の動物に1クォートまたは1リッター程度のモリンダ・シトリフォリア強化製品を食道まで一気に与えるものである。
投与の形態
本発明は様々な形態のモリンダ・シトリフォリア強化製品を投与することを意図する。これらの非限定的な形態としては、ペレット、押出塊、押出薄片、沈降塊、水系を経由した液体、リックタンク系を経由した液体、半固体、ゲル、低水分量ゲル、および低水分量ゲルペレットなどが挙げられる。
本発明は様々な形態のモリンダ・シトリフォリア強化製品を投与することを意図する。これらの非限定的な形態としては、ペレット、押出塊、押出薄片、沈降塊、水系を経由した液体、リックタンク系を経由した液体、半固体、ゲル、低水分量ゲル、および低水分量ゲルペレットなどが挙げられる。
モリンダ・シトリフォリア強化製品を送達する方法は非常に重要となるかも知れない。送達方法の非限定的な例としては、餌の最上層をモリンダ・シトリフォリア製品にしたり、生後間もない新生子牛に与える初乳にモリンダ・シトリフォリア製品を添加することを含む新生子牛用に用いられる給餌にモリンダ・シトリフォリア製品を添加したりすることが挙げられる。
抗生物質使用場所で様々なモリンダ・シトリフォリア強化製品を投与することによって抗生物質使用の低減を達成することができる。
7.実施例
下記の実施例は、本発明に基づき作られた、または作られる可能性がある、様々な実施例を説明するためにほんの一例として与えられる。下記の実施例は、本明細書に記載される技術に従って調製されうる本発明の多くのタイプの態様の全てを包含、総合、あるいは網羅するものではないということは理解されるべきである。
下記の実施例は、本発明に基づき作られた、または作られる可能性がある、様々な実施例を説明するためにほんの一例として与えられる。下記の実施例は、本明細書に記載される技術に従って調製されうる本発明の多くのタイプの態様の全てを包含、総合、あるいは網羅するものではないということは理解されるべきである。
実施例1:子牛への試用
免疫系の発達未熟は新生子牛を高罹患率と高死亡率にしがちである。母体の免疫グロブリン、白血球、およびサイトカインを含む初乳の摂取は、その子牛の健康と生存を保証する、子牛の最良の防御である。この調査の目的は、殺菌、リンパ球増殖、CD4+、CD8+およびγδT細胞におけるCD25発現を測定することによって、ノニピューレを新生子牛に食べさせることによる免疫調節効果を評価することであった。18頭のホルスタイン種の新生雄子牛を地元酪農場から2頭一組で入手した。全ての子牛に生後12時間までに貯蔵初乳4.0Lを与え、生後24時間の時点で適切な受動伝達(APT)を有している事を確認した。この子牛達を2つのグループに分けた。グループ1は対照群子牛とする一方、グループ2には1日に2回代用乳中にノニピューレ30ml(1oz)を入れて与えた。0日目の試料を生後36〜48時間の間、そして最初にピューレを与える前に取得した。血液試料を各子牛から0、3、7、および14日目に集めた。殺菌試験を行い、大腸菌(Esherichia coli)および表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)の殺菌率を推定した。リンパ球の増殖を測定するために、マイトジェン誘導リンパ球幼若化試験(LBT)を行った。CD4+、CD8+およびγδT細胞のマイトジェンにより誘導される活性化も、これらの細胞表面にあるIL−2受容体とCD25発現量の増加を2色フローサイトメトリーにより評価した。コンカナバリンA(ConA)とフィトヘマグルチニン(PHA)を包括的マイトジェンとして使用した。結果は、ノニピューレを摂取させた子牛は実験開始後3日または分娩後約5日でCD8+T細胞上のCD25発現率が著しく増加したことを示した。CD4+T細胞上のCD25発現率も、ノニピューレを摂取させた子牛で、統計的に有意ではなかったものの、3日後で高くなった。両方の知見はConA刺激に対する反応であった。LBTは2つのグループの間でどちらのマイトジェンに対する反応でも顕著な違いは示さなかった。
免疫系の発達未熟は新生子牛を高罹患率と高死亡率にしがちである。母体の免疫グロブリン、白血球、およびサイトカインを含む初乳の摂取は、その子牛の健康と生存を保証する、子牛の最良の防御である。この調査の目的は、殺菌、リンパ球増殖、CD4+、CD8+およびγδT細胞におけるCD25発現を測定することによって、ノニピューレを新生子牛に食べさせることによる免疫調節効果を評価することであった。18頭のホルスタイン種の新生雄子牛を地元酪農場から2頭一組で入手した。全ての子牛に生後12時間までに貯蔵初乳4.0Lを与え、生後24時間の時点で適切な受動伝達(APT)を有している事を確認した。この子牛達を2つのグループに分けた。グループ1は対照群子牛とする一方、グループ2には1日に2回代用乳中にノニピューレ30ml(1oz)を入れて与えた。0日目の試料を生後36〜48時間の間、そして最初にピューレを与える前に取得した。血液試料を各子牛から0、3、7、および14日目に集めた。殺菌試験を行い、大腸菌(Esherichia coli)および表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)の殺菌率を推定した。リンパ球の増殖を測定するために、マイトジェン誘導リンパ球幼若化試験(LBT)を行った。CD4+、CD8+およびγδT細胞のマイトジェンにより誘導される活性化も、これらの細胞表面にあるIL−2受容体とCD25発現量の増加を2色フローサイトメトリーにより評価した。コンカナバリンA(ConA)とフィトヘマグルチニン(PHA)を包括的マイトジェンとして使用した。結果は、ノニピューレを摂取させた子牛は実験開始後3日または分娩後約5日でCD8+T細胞上のCD25発現率が著しく増加したことを示した。CD4+T細胞上のCD25発現率も、ノニピューレを摂取させた子牛で、統計的に有意ではなかったものの、3日後で高くなった。両方の知見はConA刺激に対する反応であった。LBTは2つのグループの間でどちらのマイトジェンに対する反応でも顕著な違いは示さなかった。
材料と方法
酸性クエン酸デキシトロース−A(ACD−A)をクエン酸ナトリウム(無水)2.2g、クエン酸(1水和物)0.8g、デキシトロース2.5g、水100ml適量で調製した。pH7.2の細胞溶解液をNa2HPO41.5g(10.6mM)とNaH2PO40.32g(2.7mM)を水1L適量に溶かして調製した。pH7.2の修復用溶液をNa2HPO41.5g(10.6mM)、NaH2PO40.32g(2.7mM)、およびNaCl27g(462.0mM)を同様に水1L適量に溶かして調製した。
酸性クエン酸デキシトロース−A(ACD−A)をクエン酸ナトリウム(無水)2.2g、クエン酸(1水和物)0.8g、デキシトロース2.5g、水100ml適量で調製した。pH7.2の細胞溶解液をNa2HPO41.5g(10.6mM)とNaH2PO40.32g(2.7mM)を水1L適量に溶かして調製した。pH7.2の修復用溶液をNa2HPO41.5g(10.6mM)、NaH2PO40.32g(2.7mM)、およびNaCl27g(462.0mM)を同様に水1L適量に溶かして調製した。
このプロジェクト用の動物は6つの地方酪農場から入手した。生後12時間までに4.0Lの貯蔵初乳を摂取させた18頭のホルスタイン種の新生雄子牛は、生後12時間以内に獣医学技術病院(Veterinary Medical Teaching Hospital)に2頭一組で到着し、そこでそれぞれ囲いの中で収容された。子牛は各組毎に、病院職員によりトレーラーから無作為に降ろされて、各処理グループに割り当てられ、子牛用トレーラーから取り出された順に収容された。それ以上の無作為化はしなかった。
到着後すぐに、各動物は健康診断を受け、続いて体温、咳誘発の容易性、便性状、および目や耳の異常の存在や重症性などを毎日調べた。子牛健康スコアとして記録された子牛の健康評価(表1)は、処置グループを知らされていない獣医により監督された。3日間継続して5点以上の総合健康スコアを受けた子牛はいずれも調査から外されて適切な処置を施した。APT(IgG>1000mg/dl)は全ての子牛に対して生後24時間でIgG Midland Quick Test Kit(登録商標)を用いて確かめられた。
各子牛組は、ノニピューレを給餌した1頭と対照群の1頭から構成される。子牛達は、製造会社のラベルに従って水を加えて戻した非投薬代用乳(CALF GLO(登録商標)、Vita Plus社、マディソン、ウィスコンシン州)を最初の7日間は毎日2回2Lを、8〜14日目までは毎日2回2.5Lを哺乳瓶で給餌した。ノニピューレを給餌した子牛は代用乳の中にノニピューレを30ml入れて毎日2回与えた。子牛達には1日に子牛用スターター125gと真水4Lを摂取可能にした。8組の子牛の内、0日目には3組のみが2頭間で異なる健康スコアを有していたが、その内2組のスコアが対照子牛よりも1単位高く、1組がノニを摂取した子牛よりも1単位高かった。健康を理由に調査から外された子牛はいなかった。
0、3、7、および14日目の各子牛の頸静脈から真空採血管(Becton Dickinson社、フランクリンレークス、ニュージャージー州)にACD−A抗凝固処理済血液25mlを集めた。この調査の0日目に当たる最初のノニピューレ給餌前の生後36〜48時間の間の各子牛から試料を得た。
この血液をフローサイトメトリーとLBT試験のために1:1でPBSで希釈した。25℃にて920×gで30分間遠心した後に軟膜を採取し、血漿で希釈して、1.083Ficoll−Histopaque(Sigma社、セントルイス、ミズーリ州)に上層して25℃にて1380×gで30分間遠心した。PBMCの相間層を採取して残りの赤血球細胞を溶解液に1分間晒し、修復用溶液で中和した。このPBMCをPBSで1回、RPMI1640で1回の計2回、280×gで10分間洗浄し、続いてFCSを20%濃度で含むRPMI1640(Mediatech社、ハーンドン、バージニア州)中で再懸濁した。細胞の生存率(>95%)を確認するために細胞をトリパンブルーで染色し、FCSを20%濃度で含むRPMI1640で5×106細胞/mlに調整した。
フローサイトメトリー解析のために、PBMC(5×106細胞/ml)50μlをCostar平底細胞培養処理96ウェルプレート(Corning社、コーニング、ニューヨーク州)上で培養した。刺激無しの対照ウェルにはRPMI1640+20%FCSを100μl入れた。刺激有りの試料ウェルにはConA(最終濃度6.7μg/ml)(シグマ社、セントルイス、ミズーリ州)を100μlまたはRPMI1640で1:200に希釈したM型PHA(Gibco,Invitrogen社、カールスバード,カリフォルニア州)を100μl入れた。プレートを5%CO2で37℃にて72時間培養した。
培養後、細胞を12×75mmのポリスチレン丸底試験管(Becton Dickinson社,フランクリンレークス、ニュージャージー州)に移し、PBSで25℃にて520×gで7分間洗浄した。細胞を再懸濁し2色フローサイトメトリー用に一次抗体(15μg/ml;VMRD社,プルマン,ワシントン州)で染色した(表2)。
ConA刺激染色の組み合わせはCD4とCD25、CD8とCD25、TcR1−N6(γδTリンパ球亜集団)とCD25,CD25のみ、CD4とCD2,CD3のみ、およびTcR1−N6のみである。PHA刺激および無刺激対照の組み合せは、CD4とCD25、CD8とCD25、およびTcR1−N6とCD25である。無刺激対照試料のみの細胞についても試験した。
染色した細胞を4℃にて20分間培養し、PBSで3度、25℃にて520×gで7分間遠心洗浄した。細胞を再び再懸濁して二次抗体(Jackson ImmunoResearch社、ウェストグローブ、ペンシルバニア州)で染色した(表3)。4℃で20分間培養後、細胞を前述のように3回洗浄してパラホルムアルデヒドを1%量含むPBS500μlで再懸濁した。続いてBecton Dickinson社のFACScanフローサイトメータで2色解析を行い、その結果をFlowJo(Ver.8.1.1;Tree Star社,1997−2006)で解析した。リンパ球の個数を表現型および形態による特性評価とCD3+発現で正の選択をして同定した。
LBTのために、FCSを20%濃度および抗生物質/抗真菌剤(シグマ社、セントルイス、ミズーリ州)を1倍濃度で含むRPMI1640溶液にPBMCを加えたもの(5×106細胞/ml)を50μlずつ96ウェルプレートに3つずつ分注した。刺激無しの対照ウェルにはRPMI1640を100μl入れた。刺激有りの試料のウェルにはConA(最終濃度6.7μg/ml)を100μl、またはRPMI1640で1:200に希釈したM型PHAを100μl入れた。プレートを5%CO2下で37℃にて48時間培養し、その後RPMI1640に[3H]チミジンを10μCi/mlに希釈した溶液を各ウェルに100μl添加することによって細胞をパルス標識した。さらに5%CO2下で37℃にて12〜18時間培養した後、プレートを少なくとも30分間、−20℃の環境下に置いた。細胞をPackard Filtermate 196(PerkinElmer社、シェルトン、コネチカット州)を用いて採取し、放射能をPackard Topcount Microplate Scintillation Counter(PerkinElmer社、シェルトン、コネチカット州)を用いて測定した。
LBTのデータをSASでPROC UNIVARIATEを用いて解析した。バックグラウンドを除くために、刺激無しの対照の値をマイトジェンで刺激した方の値から差し引いた。各子牛の組の増殖の差(ノニピューレ給餌子牛−対照子牛)をConAとPHAの両方について、各々4時点(0、3、7、および14日目)で計算した。この差の標準分位点プロットは、それらが正規分布ではないことを示したので、ウィルコクソンの符号順位検定を群間の中央値差を比較するのに用いた。実験上誤差確率は各マイトジェン処理群内でp値をボンフェノーリ補正することで5%レベルに調整した。
フローサイトメトリーのために、ConAとPHA、CD25単独、CD4とCD25、CD8とCD25、およびTcR1−N6とCD25の各染色組に対して別々に解析を行った。マイトジェンで刺激した値から、刺激をせず無処置の値、またはバックグラウンドを差し引くことで各値をそのベースラインに対して標準化した。各子牛の組、1方はノニを与え他方には与えなかった各組で、標準化した値同士の差を取った。このノニおよび対照子牛の間の差を、各時間においてノニの効果があったかどうか、および/またはこの調査の期間(0、3、7、および14日目)中にノニの効果に傾向があったかどうかを判定するために、一次自己回帰相関構造を用いた反復測定分散分析における応答として用いた。ノニ群と対照群の間の平均差に対するP値をボンフェノーリの方法を用いて修正した。各時点における平均差の間の多重比較はテューキーの方法を用いて修正した。残差分析は標準化と定数分散の分散分析の仮定に違反が無いことを示した。有意性はp<0.05と立証された。
結果と考察
フローサイトメトリーの結果は、調査開始3日目または分娩後およそ5日目のノニ給餌子牛達がConAに反応してCD8+T細胞上のCD25発現率が顕著に増加していることを示した(p=0.036)(表5;図1)。統計的に有意では無かったが(p=0.11)、同時点における同一マイトジェンによるノニ給餌子牛達に関するCD4+T細胞上のCD25の発現も顕著に増加した。T細胞サブセット内でのPHAに対する反応に関して有意差は無く、LBTからのノニ給餌子牛と対照子牛の結果の間に有意差が全く無かった。
フローサイトメトリーの結果は、調査開始3日目または分娩後およそ5日目のノニ給餌子牛達がConAに反応してCD8+T細胞上のCD25発現率が顕著に増加していることを示した(p=0.036)(表5;図1)。統計的に有意では無かったが(p=0.11)、同時点における同一マイトジェンによるノニ給餌子牛達に関するCD4+T細胞上のCD25の発現も顕著に増加した。T細胞サブセット内でのPHAに対する反応に関して有意差は無く、LBTからのノニ給餌子牛と対照子牛の結果の間に有意差が全く無かった。
初乳は、自然免疫反応と適応免疫反応に影響を与える成分を含む。初乳中の免疫グロブリン、白血球、およびサイトカインは子牛に吸収されて免疫調節によってその新生仔を保護する重要な役割を果たす。
本調査で、我々は植物化学系の免疫調整物質であるモリンダ・シトリフォリア(ノニ)ピューレを代用乳と組み合わせて摂取させることで産まれてから最初の2週間で新生子牛のT細胞機能に影響を与えることができるかどうかについて調べた。新生子牛の免疫におけるノニピューレの効果を評価するため、T細胞活性(CD25発現)を2色フローサイトメトリーで測定した。包括的(T細胞)マイトジェンに応答した細胞増殖はLBTによっても測定した。
結果は、ノニを与えられた免疫グロビン産生能のある子牛は、調査開始後3日または分娩後およそ5日目にConAに応答してCD8+T細胞の活性化に著しい増加があることを示した。同一日に同一マイトジェンによって刺激されたノニ処理動物のCD4+T細胞の活性化の上昇もあった。
本発明は、CD8+T細胞の活性化とCD25発現の顕著な増加は摂取した初乳に見つけ出されるTNF−α,IL−1βおよびIFN−γへのノニの刺激効果によるものだと考える。完全に初乳細胞を欠いた代用乳にノニピューレを入れて投与したのであるから、ノニは子牛が以前に吸収した母体の白血球への効果を有したと本発明は考える。ノニ−pptは最初にマクロファージを刺激して幾つかのサイトカインを産生させる。これらのサイトカインには、NK細胞とナイーブT細胞を誘導してTh1細胞に分化させるIL−12が含まれる。これらの細胞は、より多くのTh細胞、CD8+CTL,NK細胞、およびINF−γとIL−5の産生を活性化するIFN−γとIL−2を産生する。よって、NK細胞の活性を強化することにより、ノニ−pptは新生免疫の強力な刺激薬となる。成牛に比べて新生子牛の末梢血に著しく豊富なワークショップクラスタ1+γδT細胞は、IL−12とIL−18に刺激されて大量のIFN−γを分泌する。さらに、ウシ型結核菌(Myco bacterium bovis)であるカルメット・ゲラン桿菌に感染した樹状細胞はCD3−CD8+NK様およびCD3+CD8+T細胞の増殖を促進した。NK様細胞はIFN−γ産生細胞の主要集団であり、Th1に偏る免疫反応に関与する可能性がある。本調査のこれらの発見と結果は、Th1細胞を媒介としCTLと関連した免疫応答はIFN−γへの直接または間接的なノニピューレによる刺激によるものであることを示す。
CD4+T細胞は、CD8+T細胞と比べると、体外および体内での細胞分裂の速度が遅い。さらに、CD8+T細胞と相互作用するMHCクラスI分子はほぼ普遍的に発現する一方、CD4+T細胞と相互作用するMHCクラスII分子はより限定的な細胞群に対して発現する。この差はCD8+T細胞に対して抗原に遭遇する機会をより多く提供できるので、CD4+T細胞以前にその活性化閾値に達する。この活性化閾値の差は活性化したCD4+T細胞における統計的有意性の欠如に寄与した可能性がある。T細胞応答の最初の段階である展開期には、LBTによって検出される子牛群間に有意な差は無かった。実験により、ヤマゴボウ(pokeweed)マイトジェンによって刺激されたウシ単核白血球の増殖が細胞の植え付けから6日〜14日後に比較的一定となり、12日後に最大量となる一方、刺激無しの対照細胞では時間経過と共に減少して植え付け後12日で最低レベル(<20%)になることが示された。本調査において、細胞の植え付け後およそ4日目に細胞数を数えたが、顕著な効果を見るには充分な培養時間ではなかった可能性がある。この実験では経時変化は調べなかったので、増殖における可能性のある傾向についての情報は得ていない。初乳給餌された子牛達は初乳を与えなかった子牛達よりも増殖数がかなり高い。本調査における子牛は全て充分量の初乳を摂取したので、LBTの結果はこの効果により変化した可能性があり、対照子牛群とノニ給餌子牛群の間になぜ有意差が観察されなかったのかという理由を説明している。さらに、試料のリンパ球の構成については分析されていないので、1つの細胞サブセットが別のものと異なる影響を受けたかどうか判定するのは難しい。恐らく1つの細胞サブセットの増殖の欠如が別の細胞サブセットにおける応答増加を中和した可能性がある。各細胞サブセットの蛍光抗体標識、PKHまたはCFSE染料を用いた細胞染色、およびフローサイトメトリーによる増殖解析など、さらに適切な試験が必要であったろう。
まとめると、我々はノニを摂取した免疫グロビン産生能のある子牛達は、生後2日目にノニ給餌を開始した場合、ConAに応答して調査開始3日目または分娩後およそ5日目にCD8+T細胞の活性化の顕著な増加があることを示した。我々はさらに、ノニで処置した動物が3日目にConAにより刺激されてCD4+T細胞の活性化が増加する傾向があることを示した。
Claims (18)
- 動物に投与してCD8+T細胞の活性化を増加させるための乾燥食品製品であって、
低温殺菌したモリンダ・シトリフォリア果実ピューレと、
必須アミノ酸を添加したモリンダ・シトリフォリア、必須脂肪酸を添加したモリンダ・シトリフォリア、長鎖脂肪酸を添加したモリンダ・シトリフォリア、オメガ3脂肪酸を添加したモリンダ・シトリフォリア、オメガ6脂肪酸を添加したモリンダ・シトリフォリア、マクロミネラルを添加したモリンダ・シトリフォリア、ミクロミネラルを添加したモリンダ・シトリフォリア、ペプチド鎖を添加したモリンダ・シトリフォリア、分岐鎖アミノ酸を添加したモリンダ・シトリフォリア、全ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、焙煎済み全ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、焙煎脱脂済み全ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、脱脂した焙煎済み粗挽きノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、焙煎済み粗挽きノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、焙煎済み粉末ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、脱脂した焙煎済み粉末ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、脱脂した焙煎済み薄片ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、焙煎済み薄片ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、脱脂した焙煎済み押出ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、焙煎済み押出ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、および焙煎済み押出ノニ種子からの抽出物を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレからなるリストの中から選択される添加物と
を含む乾燥食品製品。 - モリンダ・シトリフォリアの葉からの抽出物、葉の熱水抽出物、加工済みモリンダ・シトリフォリア葉のエタノール抽出物、加工済みモリンダ・シトリフォリア葉の蒸気蒸留抽出物、モリンダ・シトリフォリア果汁、モリンダ・シトリフォリア抽出物、モリンダ・シトリフォリア食物繊維、モリンダ・シトリフォリアピューレ汁、モリンダ・シトリフォリアピューレ、モリンダ・シトリフォリア濃縮果汁、モリンダ・シトリフォリア濃縮ピューレ汁、凍結濃縮したモリンダ・シトリフォリア果汁、および蒸発濃縮したモリンダ・シトリフォリア果汁、生のモリンダ・シトリフォリア全果実、乾燥したモリンダ・シトリフォリア全果実、溶媒抽出した形態のモリンダ・シトリフォリア種子、酵素処理したモリンダ・シトリフォリア種子、加工済みモリンダ・シトリフォリア種子、モリンダ・シトリフォリア全果実、葉抽出物、葉汁、脱脂済みモリンダ・シトリフォリアの種子抽出物、及び未処理モリンダ・シトリフォリアの種子抽出物からなるリストの中から選択される成分を更に含む、請求項1記載の製品。
- グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、グルコサミン塩酸塩、グルコサミン硫酸塩、コンドロイチン硫酸塩、必須アミノ酸、必須脂肪酸、長鎖脂肪酸、オメガ3脂肪酸、オメガ6脂肪酸、マクロミネラル、ミクロミネラル、ペプチド鎖、分岐鎖アミノ酸、全ノニ種子、焙煎済み全ノニ種子、焙煎脱脂済み全ノニ種子、脱脂した焙煎済み粗挽きノニ種子、焙煎済み粗挽きノニ種子、焙煎済み粉末ノニ種子、脱脂した焙煎済み粉末ノニ種子、脱脂した焙煎済み薄片ノニ種子、焙煎済み薄片ノニ種子、脱脂した焙煎済み押出ノニ種子、および焙煎済み押出ノニ種子からなるリストの中から選択される成分を更に含む、請求項1の製品。
- ケルセチン、ルチン、スコポレチン、オクタン酸、カリウム、ビタミンC、テルペノイド、アルカロイド、アントラキノン、ノルダムナカンタール、モリンドン、ルビアンジン、B−シトステロール、カロチン、ビタミンA、フラボン配糖体、リノール酸、アリザリン、アミノ酸、アキュビン、L−アスペルロシド、カプロン酸、カプリル酸、ウルソル酸、および推定プロゼロニンからなる群から選択される活性成分を更に含む、請求項1の製品。
- 前記ケルセチンは約0.1〜10重量パーセントの量で存在する、請求項4の製品。
- 前記ルチンは約0.1〜10重量パーセントの量で存在する、請求項4の製品。
- 動物に投与してCD8+T細胞の活性化を増加させるための液状製品であって、
低温殺菌したモリンダ・シトリフォリア果実ピューレと、
必須アミノ酸を添加したモリンダ・シトリフォリア、必須脂肪酸を添加したモリンダ・シトリフォリア、長鎖脂肪酸を添加したモリンダ・シトリフォリア、オメガ3脂肪酸を添加したモリンダ・シトリフォリア、オメガ6脂肪酸を添加したモリンダ・シトリフォリア、マクロミネラルを添加したモリンダ・シトリフォリア、ミクロミネラルを添加したモリンダ・シトリフォリア、ペプチド鎖を添加したモリンダ・シトリフォリア、分岐鎖アミノ酸を添加したモリンダ・シトリフォリア、全ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、焙煎済み全ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、焙煎脱脂済み全ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、脱脂した焙煎済み粗挽きノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、焙煎済み粗挽きノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、焙煎済み粉末ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、脱脂した焙煎済み粉末ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、脱脂した焙煎済み薄片ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、焙煎済み薄片ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、脱脂した焙煎済み押出ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレ、および焙煎済み押出ノニ種子を添加したモリンダ・シトリフォリアピューレからなるリストの中から選択される添加物
とを含む液状製品。 - モリンダ・シトリフォリアの葉からの抽出物、葉の熱水抽出物、加工済みモリンダ・シトリフォリア葉のエタノール抽出物、加工済みモリンダ・シトリフォリア葉の蒸気蒸留抽出物、モリンダ・シトリフォリア果汁、モリンダ・シトリフォリア抽出物、モリンダ・シトリフォリア食物繊維、モリンダ・シトリフォリアピューレ汁、モリンダ・シトリフォリアピューレ、モリンダ・シトリフォリア濃縮果汁、モリンダ・シトリフォリア濃縮ピューレ汁、凍結濃縮したモリンダ・シトリフォリア果汁、および蒸発濃縮したモリンダ・シトリフォリア果汁、生のモリンダ・シトリフォリア全果実、乾燥したモリンダ・シトリフォリア全果実、溶媒抽出した形態のモリンダ・シトリフォリア種子、酵素処理したモリンダ・シトリフォリア種子、加工済みモリンダ・シトリフォリア種子、モリンダ・シトリフォリア全果実、葉抽出物、葉汁、脱脂済みモリンダ・シトリフォリアの種子抽出物及び未処理モリンダ・シトリフォリアの種子抽出物からなるリストの中から選択される成分を更に含む、請求項7の製品。
- グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、グルコサミン塩酸塩、グルコサミン硫酸塩、コンドロイチン硫酸塩、必須アミノ酸、必須脂肪酸、長鎖脂肪酸、オメガ3脂肪酸、オメガ6脂肪酸、マクロミネラル、ミクロミネラル、ペプチド鎖、分岐鎖アミノ酸、全ノニ種子、焙煎済み全ノニ種子、焙煎脱脂済み全ノニ種子、脱脂した焙煎済み粗挽きノニ種子、焙煎済み粗挽きノニ種子、焙煎済み粉末ノニ種子、脱脂した焙煎済み粉末ノニ種子、脱脂した焙煎済み薄片ノニ種子、焙煎済み薄片ノニ種子、脱脂した焙煎済み押出ノニ種子、および焙煎済み押出ノニ種子からなるリストの中から選択される成分を更に含む、請求項7の製品。
- ケルセチン、ルチン、スコポレチン、オクタン酸、カリウム、ビタミンC、テルペノイド、アルカロイド、アントラキノン、ノルダムナカンタール、モリンドン、ルビアンジン、B−シトステロール、カロチン、ビタミンA、フラボン配糖体、リノール酸、アリザリン、アミノ酸、アキュビン、L−アスペルロシド、カプロン酸、カプリル酸、ウルソル酸、および推定プロゼロニンからなる群から選択される有効成分を更に含む、請求項7の製品。
- 前記ケルセチンは約0.1〜10重量パーセントの量で存在する、請求項10の製品。
- 前記ルチンは約0.1〜10重量パーセントの量で存在する、請求項10の製品。
- CD8+TにおけるCD25の発現を増加させるために動物に製品を給餌する方法であって、
加工済みモリンダ・シトリフォリア製品をアルコール系溶液に添加し、
前記溶液から前記加工済みモリンダ・シトリフォリア製品の有効成分を単離抽出し、
前記抽出した有効成分を他の餌成分と混合し、そして
前記動物に前記餌を投与する
の各工程を含む方法。 - 前記加工済みモリンダ・シトリフォリア製品は加工済みモリンダ・シトリフォリア果汁を含む、請求項13の方法。
- 前記加工済みモリンダ・シトリフォリア製品は加工済みモリンダ・シトリフォリアピューレを含む、請求項13の方法。
- 前記アルコール系溶液は、メタノール、エタノール、および他のアルコール系誘導体から本質的になる群から選択される、請求項13の方法。
- 前記有効成分がケルセチンである、請求項13の方法。
- 前記有効成分がルチンである、請求項13の方法。
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