JP2010534070A - ヒトヘモグロビンベータ遺伝子からのｄｎａ標的配列を切断するメガヌクレアーゼ変異型及びその使用 - Google Patents

ヒトヘモグロビンベータ遺伝子からのｄｎａ標的配列を切断するメガヌクレアーゼ変異型及びその使用 Download PDF

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Abstract

2つのI-CreI単量体の一方が、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位にそれぞれ位置するLAGLIDADGコアドメインの2つの機能的サブドメイン内に1つずつ存在する少なくとも2つの置換を有し、I-CreI変異型がヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列を切断できるI-CreI変異型。該変異型及びその派生生成物の、ヒトベータグロビン遺伝子での変異により引き起こされる病変状態(鎌状赤血球病、ベータ-サラセミア)の予防及び治療のための使用。
【選択図】なし

Description

本発明は、ヒトヘモグロビンベータ遺伝子からのDNA標的配列を切断するメガヌクレアーゼ変異型、該変異型をコードするベクター、該ベクターにより改変された細胞、動物又は植物、並びに該メガヌクレアーゼ変異型及びその派生生成物の、エクスビボゲノム療法(遺伝子細胞療法)、及びゲノム工学のための使用に関する。
ヘモグロビン(Hb)分子は、細胞呼吸において用いるために、肺から体の種々の部分に赤血球により酸素を運ぶ役割を有する。成熟ヘモグロビン(正常成体ヘモグロビン又はHb A)は、2つのタイプのタンパク質：2つのアルファ鎖及び2つのベータ鎖で構成される四量体タンパク質である。ヘモグロビンベータ鎖は、しばしば、ベータグロビン(β-グロビン)とよばれる。ヘモグロビンの各タンパク質サブユニットは、酸素との結合を担う、ヘムと呼ばれる鉄含有分子を有する。完全ヘモグロビンタンパク質は、よって、一度に4つの酸素分子を運ぶことができる。
ヘモグロビンベータ鎖をコードする遺伝子(HBB遺伝子又はベータグロビン(β-グロビン)遺伝子)は、第11染色体の短(p)腕上15.5位に(11p15.5)位置する。これは、ゲノムDNAの1606塩基対にわたって分布する3つのエキソンで構成される(アクセッション番号GenBank NC_000011.8又はNT_009237.17)。mRNA (626-bp; アクセッション番号GenBank NM_0518.4)は、HBBポリペプチド鎖の147アミノ酸配列に翻訳される[アクセッション番号GenBank NP_00509.1; Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM (TM). Johns Hopkins University, Baltimore, MD. MIM No.141900 (2001年11月6日)]。
HBB遺伝子において、数百の変更が同定されている。これらの変化のいくつかは、アルファベット文字でしばしば表され、名称によってもときに表されるヘモグロビンの異常型の生成をもたらす。これらの異常型ヘモグロビンは、鎌状赤血球貧血(HbSS)、ヘモグロビンSC (HbSC)及びヘモグロビンSE (HbSE)を含む鎌状赤血球病(鎌状赤血球症候群又は鎌状赤血球貧血症候群)を引き起こす(Park, K.W., Int. Anesthesiol. Clin., 2004, 42, 77〜93; Stuart, M.J.及びNagel R.L., Lancet, 2004, 364, 1343〜1360)。ベータサラセミアとよばれるほかの状態は、ヘモグロビンのベータグロビンサブユニットの生成をなくすか又は低減する多くの遺伝子変異により引き起こされる。ヘモグロビン鎌状-ベータサラセミア(HbSBetaThal)は、ヘモグロビンSを生じる変異とベータサラセミアを生じる変異とが一緒に生じる場合に引き起こされる。
鎌状赤血球病は、慢性溶血性貧血、感染への感受性の増加、臓器損傷、並びに急性及び慢性の両方の疼痛を引き起こす血管閉塞を特徴とする、遺伝性ヘモグロビン障害の一群である(Ashley-Kochら, American Journal of Epidemiology, 2000, 151, 839〜845; The metabolic & molecular bases of inherited disease, 第8版, Scriver, C.R., c2001: p4571〜4636, McGraw-Hill, New York)。異なる民族の70,000人の米国人が、鎌状赤血球病を有し、鎌状赤血球症候群は、アフリカ系アメリカ人の400人に1人に存在すると見積もられている。地中海盆地、中東及びインドからの集団も、この疾患の頻度が高い。
鎌状赤血球病をもたらす最も一般的なベータヘモグロビン変異型は、ベータグロビン鎖の6位のグルタミン酸のバリンでの置換(E6V)を含むヘモグロビンS、すなわちHbSである。
鎌状赤血球病の一般的な形態である鎌状赤血球貧血(HbSS)において、ヘモグロビンS、すなわちHbSは、ヘモグロビン中の両方のベータヘモグロビンサブユニットで置き換えられる(Ashley-Kochら, Am. J. Epidemiol. 2000, 151, 839〜845; Sickle cell disease, Sergeant G., Oxford University Press: Oxford, 1985)。変異は、異常HbSサブユニットが互いにくっついて、長く堅い分子を形成することを引き起こす。堅いHbS分子は、赤血球を鎌形状に曲げ、これは早期に死ぬ。よって、変異は、赤血球の不足を導く(貧血)。鎌形状細胞は、小さい血管を遮断して、疼痛及び臓器損傷も引き起こし得る。
鎌状赤血球病のほかのタイプにおいて、1つのベータヘモグロビンサブユニットだけがヘモグロビンSで置き換えられる。他のベータヘモグロビンサブユニットは、異なる異常変異型、例えばヘモグロビンC又はヘモグロビンEで置き換えられる。例えば、ヘモグロビンSC(HbSC)疾患において、ベータヘモグロビンサブユニットは、ヘモグロビンS及びヘモグロビンCで置き換えられる。この障害の重篤さは非常に多様であるが、鎌状赤血球貧血と同様に重篤であり得る。ヘモグロビンC (HbC)は、他の集団よりも西アフリカ系の人々により一般的であり、6位のグルタミン酸のリジンによる置換(E6K)に起因する。ヘモグロビンE (HbE)は、東南アジアの人々に主に見出されるヘモグロビンの変異型である。変異タンパク質は、26位のグルタミン酸のリジンによる置換(E26K)に起因する。
HBBにおける欠陥は、ベータ-サラセミアの原因である(Thein SL., Br. J. Haematol., 2004, 124, 264〜274)。これは、多くの場合、地中海及び東南アジアの集団において生じる。ベータサラセミアを引き起こす200を超えるHBB変異が同定されている。ほとんどの変異は、HBB遺伝子内の単一ヌクレオチドの変化を含むが、挿入又は欠失も報告されている。ベータ-サラセミアの顕著な特徴は、成体HbA分子でのグロビン鎖生成における不均衡である。ベータ鎖の不在は、ベータ(0)-サラセミアを引き起こし、検出可能なベータグロビンの量の低減は、ベータ(+)-サラセミアを引き起こす。ベータ-サラセミアの重篤な形態において、過剰のアルファグロビン鎖は、骨髄中の発達する赤血球前駆体中に蓄積される。それらの堆積は、赤血球アポトーシスの大きな増大を導き、これが次に、無効造血及び重篤な小赤血球性淡色性貧血を引き起こす。
鎌状赤血球患者にとって最も一般的な問題は、四肢、背中、胸部及び腹部での疼痛症状の発現である(Dwarakanath, G.K.及びWarfield C., Hosp. Pract., 1986, 64b; Fields H.L.及びLevine J.D., West. J. Med. 1984, 347, 141〜143; Vichinskiら, Am. J. Ped. Hematol. Oncol., 1982, 4, 328)。強い疼痛の正確な原因はわかっていない。これは、鎌状赤血球により引き起こされる血流の閉塞及び凝集に起因する炎症性応答により引き起こされるのかもしれない。疼痛症状発現は、鎮痛薬の使用により、通常、管理される。しかし、疼痛にもかかわらず、最も重篤な生命を脅かす併発症は、細菌感染及び脾臓血球貯留急性発症である。細菌感染は、子供が3歳未満の場合に特に、鎌状赤血球病の患者における死亡の主因の1つである(Barrett-Connor, E., Medicine, 1971, 50, 97〜112)。脾臓機能は鎌状赤血球貧血では減少するか又はないので、患者は、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)、ヘモフィラス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、サルモネラ(Salmonella)、髄膜炎菌(Meningococcus)などの被包生物の感染の高い危険性を有する[Powarsら., JAMA, 1981, 245, 1839〜1842]。つまり、若年の子供では、予防的なペニシリンがいつも用いられる(Gastonら, N. Engl. J. Med., 1986, 314, 1593〜99)。脾臓血球貯留急性発症は、最も重篤な合併症の1つであり、鎌状赤血球病の幼児における死亡の2番目の原因である。この事象は、通常、4ヶ月から3歳の間に生じる。血球貯留の症状発現中に、鎌状赤血球は脾臓に捕捉され、ヘモグロビンレベルの迅速な下落及び脾臓肥大及びその他の併発症を引き起こす。今日の唯一の治療は、積極的な輸血である。緊急の脾摘が、しばしば必要である(Vichinskyら, N Engl. J. Med., 1995, 222, 206〜213; Haberkernら, Blood, 1995, 86, 142a)。
ヒドロキシウレア(Hydrea)のような経口抗鎌状細胞生成性薬物の毎日の投与は、鎌状赤血球病において著しい利益をもたらしたことが文書化された最初の効果的な治療である(Steinberg MH., Scientific World Journal, 2002, 2, 1706〜1728; Mehanna A.S., Curr. Med. Chem., 2001, 8, 79〜88; Characheら, N. Engl. J. Med., 1995, 332, 1317〜1322)。しかし、ヒドロキシウレアの長期の利点と毒性は知られていない。よって、今日ではまだ、生命を脅かす併発症のための最も急性の治療は、輸血である。
第2のストラテジーは、骨髄移植であろう。これは、米国において27名の患者を、ヘモグロビンSSから正常のAA又はAS (関連する骨髄提供者の表現型に依存して)にうまく変換させるために用いられた。しかし、骨髄移植は、まだ、死亡(10%死亡率)及び骨髄移植による長期の併発症の危険性を正当化する、鎌状赤血球病に由来する充分な併発症を有し、同一HLA適合である同胞も有する患者に限定された実験的治療である(Waltersら, New Engl. J. Med., 1996, 355, 369〜376; Waltersら, Biol. Blood Marrow Transplant., 1996, 2, 100〜104)。
同種造血幹細胞(HSC)移植は治癒力があるが、この治療上のオプションは、患者の大多数には利用可能でない。自己HCS中の調節されたβ-グロビン遺伝子の移入は、よって、高度に魅力的な代替治療である(Tisdale J.及びSadelain, M., Semin. Hematol., 2001, 38, 382〜392)。
HBBは、遺伝子治療について優れた候補であるようである。遺伝子は非常に小さく、広く特徴決定されている。障害は劣性遺伝性であり、血球細胞に影響する。しかし、1980年の最初の試みが失敗した原因は、大部分が、非効率的な遺伝子移入と、導入されたβ-グロビン遺伝子の乏しい発現とによる。HBB遺伝子発現についてより多くの知見が得られているが、その後の遺伝子治療の試みはなされていない。これは、所望の細胞での必要とされる遺伝子発現の制御が非常に厳密であるという問題による。実際に、生成されるβ-グロビンタンパク質の量は、α-グロビンの量と等しくなければならない。なぜなら、β-グロビン鎖とα-グロビン鎖との不均衡は、α-サラセミア表現型をもたらすからである(Sadelain M.ら, Best. Pract. Res. Clin. Haematol., 2004, 17, 517〜534)。それにもかかわらず、エクスビボ遺伝子治療は、非常に魅力的であり、マウスのような小動物において少なくとも、大きな成功がなされている。種々のヒト化鎌状赤血球貧血(SCA)マウスモデルが、内因性α-及びβ-グロビン遺伝子のノックアウト、並びにヒトα-、βS-及びγ-グロビン遺伝子のノックインにより得られ(Pasztyら, Science 1997, 278, 876〜878; Ryanら, Science, 1997, 278, 873〜876; Changら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 14886〜14890)、鎌状赤血球マウスは、ヒト鎌状赤血球病で見出される主要な特徴を再現する。鎌状赤血球表現型は、レンチウイルス媒介ヒトβ-グロビン遺伝子の骨髄細胞への組み込みにより、逆にでき(Mayら, Blood, 2002, 99, 1902〜1908; Pawliukら, Science, 2001, 294, 2368〜2371)、このことは、実際のヒト遺伝子治療に向けた第一歩を提供する。
標的相同組換えは、現在のアプローチにより生じる問題点を回避する別の代替法である。現在の遺伝子治療ストラテジーは、補完アプローチに基づき、ここでは、無作為に挿入されたが機能的な遺伝子の過剰コピーが、変異された内因性コピーの機能を提供する。対照的に、相同組換えは、現場(insitu)での変異の正確な修正を可能にする(図1A)。相同組換え(HR)は、DNA二本鎖破断(break) (DSB)及びその他のDNA損傷の修復に関与する、非常に保存されたDNA維持経路である(Rothstein, Methods Enzymol., 1983, 101, 202〜211; Paquesら, Microbiol Mol Biol Rev, 1999, 63, 349〜404; Sungら, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2006, 7, 739〜750)が、減数分裂における対立遺伝子の減数分裂性再集合(Roeder, Genes Dev., 1997, 11, 2600〜2621)、酵母における交配型の相互交換(Haber, Annu. Rev. Genet., 1998, 32, 561〜599)、及びクラスIイントロン及びインテインの新規な対立遺伝子への「ホーミング」のような多くの生物学的現象の根底をなす。HRは、内因性配列間の遺伝子情報の交換を通常、促進するが、遺伝子ターゲティング実験において、これは、内因性染色体配列と外因性DNA構築物との交換を促進するために用いられる。基本的に、標的配列と相同性を有するDNAを、細胞の核に導入し、内因性相同組換え装置が、次の工程を提供する(図1A)。
相同遺伝子ターゲティングストラテジーは、内因性遺伝子をノックアウトする(Capecchi, M.R., Science, 1989, 244, 1288〜1292, Smithies, O., Nature Medicine, 2001, 7, 1083〜1086)か、又は染色体に外因性配列をノックインするために用いられている。これは、遺伝子修正、原則的に、単一遺伝子疾患に関連する変異の修正のためにも用いることができる。しかし、この使用は、プロセスの低い効率(トランスフェクションされた細胞の10-6〜10-9)のために、実際は困難である。最近、遺伝子ターゲティングアプローチを用いて、モデルSCAマウスからのES細胞においてヒトβ-S-グロビン遺伝子が修正された(Changら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2006, 103, 1036〜1040; Wuら, Blood, 2006, 108, 1183〜1188)。しかし、方法の効率が本質的に低いので、伝統的な選択スキームを用いなければならなかった。
過去10年間に、この効率を増大させるためにいくつかの方法が開発されている。例えば、キメラ形成法(de Semir, Nadalら 2003)及び小型フラグメント相同置換(Small Fragment Homologous Replacement) (Goncz, Colosimoら 2001; Bruscia, Sangiuoloら 2002; Sangiuolo, Brusciaら 2002; De Semir及びAran 2003)はともに、CFTR変異を修正することを試みるために用いられ、種々のレベルで成功している。
組換えの効率を増大するための別のストラテジーは、メガヌクレアーゼを用いて、標的遺伝子座にDNA二本鎖破断を送達することである。メガヌクレアーゼは、定義によると、大きい配列を認識する配列特異的エンドヌクレアーゼである(Thierry, A.およびB. Dujon, Nucleic Acids Res., 1992, 20, 5625〜5631)。これらは生細胞においてユニーク部位を切断でき、それにより遺伝子ターゲティングを、切断部位の近傍において1000倍以上に増大させる(Puchtaら, Nucleic Acids Res., 1993, 21, 5034〜5040 ; Rouetら, Mol. Cell. Biol., 1994, 14, 8096〜8106; Choulikaら, Mol. Cell. Biol., 1995, 15, 1968〜1973; Puchtaら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1996, 93, 5055〜5060; Sargentら, Mol. Cell. Biol., 1997, 17, 267〜277; Cohen-Tannoudjiら, Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 1444〜1448; Donoho,ら, Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 4070〜4078; Elliottら, Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 93〜101)。このようなメガヌクレアーゼを用いて、遺伝性単一遺伝子疾患の原因である変異を修正できた。
遺伝子欠陥を修正するための最も正確な様式は、遺伝子の非変異コピーを有する修復マトリクスを用いることであり、これは、変異の復帰をもたらす。しかし、遺伝子修正の効率は、変異とDSBとの間の距離が大きくなるほど減少し、200 bpの距離で5倍減少する。よって、所定のメガヌクレアーゼは、そのDNA標的の近傍にある変異だけを修正するために用いることができる。
「エキソンノックイン」とよばれる代替が、図1Bに示される。この場合、遺伝子の5'部分を切断するメガヌクレアーゼを用いて、有害変異の上流に機能的エキソン配列をノックインできる。この方法は、導入遺伝子をその通常の場所に配置するが、エキソン重複ももたらし、長い範囲に対するこの影響は評価されていないままである。さらに、天然のシス作用性要素が切断の下流のイントロン内に配置される場合、それらの近傍の環境は改変され、それらの正しい機能も探索される必要があるだろう。しかし、この方法は、非常に有利である。単一のメガヌクレアーゼを多くの異なる患者に用いることができるだろう。
しかし、「ホーミングエンドヌクレアーゼ」ともよばれる数百の天然メガヌクレアーゼが同定されているが(Chevalier, B.S.及びB.L. Stoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜3774)、切断可能な配列のレパートリーは、ゲノムの複雑さに取り組むためには非常に限定されており、選択した遺伝子中には、通常、切断可能部位がない。例えば、ヒトHBB遺伝子中には、既知の天然メガヌクレアーゼのための切断部位がない。理論的には、選択された特異性を有する人工の配列特異的エンドヌクレアーゼを作製することにより、この制限が緩和できる。よって、仕立てられた特異性を有するメガヌクレアーゼの作製は、精力的に検討されている。
最近、ジンクフィンガータンパク質(ZFP)と、クラスIIS制限エンドヌクレアーゼであるFokIの触媒ドメインとの融合体を用いて、機能的配列特異的エンドヌクレアーゼが作製された (Smithら, Nucleic Acids Res., 1999, 27, 674〜681; Bibikovaら, Mol. Cell. Biol., 2001, 21, 289〜297; Bibikovaら, Genetics, 2002, 161, 1169〜1175; Bibikovaら, Science, 2003, 300, 764; Porteus, M.H.及びD. Baltimore, Science, 2003, 300, 763〜; Alwinら, Mol. Ther., 2005, 12, 610〜617; Urnovら, Nature, 2005, 435, 646〜651; Porteus, M.H., Mol. Ther., 2006, 13, 438〜446)。このようなヌクレアーゼは、最近、リンパ系列からのヒト細胞におけるILR2G遺伝子を工学的に改変するために用いることができた(Urnovら, Nature, 2005, 435, 646〜651)。
Cys2-His2型のジンクフィンガータンパク質(ZFP)の結合特異性は、これらが単純(フィンガーあたり実質的に4残基により駆動される特異性)でモジュール性の(modular)システムを示すので、操作するのが容易である(Paboら, Annu. Rev. Biochem., 2001, 70, 313〜340; Jamiesonら, Nat. Rev. Drug Discov., 2003, 2, 361〜368)。Paboの実験室からの研究は、ほとんどのG/ANNG/ANNG/ANN配列に結合できる新規な人工ZFPの大きいレパートリーをもたらした(Rebar, E.J.及びC.O. Pabo, Science, 1994, 263, 671〜673; Kim, J.S.及びC.O. Pabo, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1998, 95, 2812〜2817)、Klug (Choo, Y.及びA. Klug, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 11163〜11167; Isalan M.及びA. Klug, Nat. Biotechnol., 2001, 19, 656〜660)及びBarbas (Choo, Y.及びA. Klug, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 11163〜11167; Isalan M.及びA. Klug, Nat. Biotechnol., 2001, 19, 656〜660)。
にもかかわらず、ZFPは、特に、治療用途のような非常に高レベルの特異性を必要とする用途について制限があるかもしれない。最近、融合体でのFokIヌクレアーゼ活性が、FokIのいくつかのDNA結合欠陥性変異体の存在下を含んで、1つの認識部位、又はDNAループにより種々の距離で分けられた2つの部位のいずれかと作用することが示された(Cattoら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, 1711〜1720)。よって、特異性は、哺乳動物細胞及びショウジョウバエ(Drosophila)における毒性により示されるように、非常に退化している(Bibikovaら, Genetics, 2002, 161, 1169〜1175; Bibikovaら, Science, 2003, 300, 764〜)。
野生では、メガヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼにより実質的に代表される。ホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)は、数百のタンパク質ファミリーを含む天然のメガヌクレアーゼの広範なファミリーである(Chevalier, B. S.及びB.L. Stoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜3774)。これらのタンパク質は、「ホーミング」とよばれるプロセスにより伝播される可動性遺伝要素によりコードされる。エンドヌクレアーゼは、可動性要素が存在しない同族の対立遺伝子を切断することにより、受容側遺伝子座に可動性DNAを重複させる相同組換え事象を刺激する。効率及び特異性の点でのそれらの例外的な切断特性に鑑みて、これらは、新規で特異性が高いエンドヌクレアーゼを導くために理想的な足場であり得る。
HEは、4つの主要なファミリーに属する。触媒中心に含まれる保存されたペプチドモチーフにちなんで命名されたLAGLIDADGファミリーは、最も普及しており、最もよく特徴付けられている群である。現在、7つの構造が入手可能である。このファミリーからのほとんどのタンパク質が単量体であり、2つのLAGLIDADGモチーフを示すが、いくつかは1つのモチーフのみを有するものの、二量体を形成してパリンドローム又は偽パリンドローム標的配列を切断する。
ファミリーのメンバーのうち、LAGLIDADGペプチドが唯一の保存領域であるが、これらのタンパク質は、非常によく似た構造を有する(図2A)。触媒コアは、I-CreI(Chevalierら, Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312〜316)及びI-MsoI (Chevalierら, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜269)のようなホモ二量体について完全な2回回転対称の、そしてI-SceI (Moureら, J. Mol. Biol., 2003, 334, 685〜69)、I-DmoI (Silvaら, J. Mol. Biol., 1999, 286, 1123〜1136)又はI-AniI (Bolducら, Genes Dev., 2003, 17, 2875〜2888)のような単量体について偽対称を有する2つのDNA結合ドメインで挟まれる。両方の単量体又は両方のドメイン(単量体タンパク質について)は、二価カチオンの周りに組織された触媒コアに貢献する。触媒コアのすぐ上に、2つのLAGLIDADGペプチドが、二量体形成界面において必須の役割も演じる。DNA結合は、DNA主溝の上に位置する2つの典型的なサドル形ββαββ折り畳みに依存する。他のドメインは、例えばPI-PfuI (Ichiyanagiら, J. Mol. Biol., 2000, 300, 889〜901)及びPI-SceI (Moureら, Nat. Struct. Biol., 2002, 9, 764〜770)のようなインテインにおいて見出すことができ、このタンパク質スプライシングドメインはDNA結合にも関与する。
I-DmoIドメインのN-末端をI-CreI単量体と融合させることによる機能的キメラメガヌクレアーゼの作製(Chevalierら, Mol. Cell., 2002, 10, 895〜905; Epinatら, Nucleic Acids Res, 2003, 31, 2952〜62; 国際PCT出願WO 03/078619及びWO 2004/031346)は、LAGLIDADGタンパク質の可塑性を証明する。
そのうえ、異なるグループが、I-CreI (Seligmanら, Genetics, 1997, 147, 1653〜1664; Sussmanら, J. Mol. Biol., 2004, 342, 31〜41; 国際PCT出願WO 2006/097784、及びWO 2006/097853; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458; Rosenら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, 4791〜4800; Smithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149)、I-SceI (Doyonら, J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 2477〜2484)、PI-SceI (Gimbleら, J. Mol. Biol., 2003, 334, 993〜1008)及びI-MsoI (Ashworthら, Nature, 2006, 441, 656〜659)の特異性を局所的に変更するために半合理的(semi-rational)アプローチを用いている。
さらに、局所的に特異性が変更された数百のI-CreI誘導体が、半合理的アプローチとハイスループットスクリーニングとを組み合わせることにより工学的に作製された：
- I-CreIの残基Q44、R68及びR70又はQ44、R68、D75及びI77を変異させ、DNA標的(5NNN DNA標的)の±3〜5位での特異性が変更された変異型のコレクションを、スクリーニングにより同定した(国際PCT出願WO 2006/097784及びWO 2006/097853; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458; Smithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149)。
- I-CreIの残基K28、N30及びQ38、N30、Y33及びQ38又はK28、Y33、Q38及びS40を変異させ、DNA標的(10NNN DNA標的)の±8〜10位での特異性が変更された変異型のコレクションを、スクリーニングにより同定した(Smithら, Nucleic Acids Res.,2006, 34, e149; 国際PCT出願WO 2007/060495及びWO 2007/049156)。
図2Bに示すように、2つの異なる変異型を組み合わせて、それぞれの変異型DNA標的配列の異なる半分の融合により得られるキメラ標的を切断できる機能的へテロ二量体エンドヌクレアーゼを組み立てた(Arnouldら, 上記; 国際PCT出願WO 2006/097854およびWO 2007/034262)。興味深いことに、新規なタンパク質は、正しい折り畳み及び安定性と、高い活性と、狭い特異性とを維持した。
さらに、I-CreIの残基28〜40及び44〜77は、ホーミングエンドヌクレアーゼハーフサイト(half-site)の別個の部分に結合できる、2つの分離可能な機能的サブドメインを形成することが示された(Smithら Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149; 国際PCT出願WO 2007/049095及びWO 2007/057781)。
図2Cに示すように、I-CreIの2つのサブドメインからの変異を同じ単量体内で組み合わせることにより、それぞれのサブドメインが結合する±3〜5位及び±8〜10位のヌクレオチドを含むパリンドロームの組み合わせたDNA標的配列を切断できる新規なキメラ分子(ホモ二量体)の設計が可能になった(Smithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149; 国際PCT出願WO 2007/060495及びWO 2007/049156)。
2つの前の工程の組み合わせにより、4つの異なるサブドメインを含む、より大きいコンビナトリアルアプローチが可能になる。異なるサブドメインは、図2Dに示すように、別々に改変でき、組み合わせて、選択された特異性を有する完全に再設計されたメガヌクレアーゼ変異型(ヘテロ二量体又は単鎖分子)を得ることができる。第1工程において、新規なメガヌクレアーゼの対を、切断したい標的に由来するパリンドローム標的を切断する新しい分子(「ハーフメガヌクレアーゼ」)に組み合わせる。次いで、このような「ハーフメガヌクレアーゼ」の組み合わせは、興味対象の標的を切断するヘテロ二量体種をもたらすことができる。4組の変異を、モデル標的配列又はヒトRAG1及びXPC遺伝子からの配列を切断するヘテロ二量体エンドヌクレアーゼに組み立てることが、Smithら(Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149)及びArnouldら(J. Mol. Biol., Epub 2007年5月10日)にそれぞれ記載されている。
これらの変異型は、真性の(genuine)染色体配列を切断するために用いることができ、遺伝子治療を含むいくつかの分野において、新しい展望のための道を切り開く。
しかし、塩基対±1及び±2はタンパク質といずれの接触も示さないが、これらの位置が、特に塩基対±1について、満足な情報が欠けているわけではなく(Chevalierら, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜269)、さらなる基質特異性の原因であり得ることが示されている(Argastら, J. Mol. Biol., 1998, 280, 345〜353; Juricaら, Mol. Cell., 1998, 2, 469〜476; Chevalier, B.S.及びB.L. Stoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜3774)。ランダム突然変異を誘発した切断可能なI-CreI標的のインビトロ選択(Argastら, 上記)は、タンパク質結合及び切断活性に対するこれらの4つの塩基対の重要性を明らかにした。活性部位で見出される規則正しい水分子のネットワークが、DNA標的の位置決めに重要であることが示唆されている(Chevalierら, Biochemistry, 2004, 43, 14015〜14026)。さらに、I-CreI結合の際にこの領域に出現する広範なコンホメーション変化は、4つの中央のヌクレオチドが、おそらく配列依存性のコンホメーション嗜好性により、基質特異性に貢献しうることを示唆する(Chevalierら, 2003, 上記)。
つまり、gtacである4つの中央ヌクレオチドを有するパリンドローム配列を切断するホモ二量体として10NNN及び5NNN DNA標的に対して同定される変異体が、4つの中央ヌクレオチド中に変化を含有する標的を切断する新しいエンドヌクレオチドの設計を可能にするかどうか、明らかでなかった。
本発明者らは、I-CreI変異型により切断できるヒトベータグロビン遺伝子中の一連のDNA標的を同定した(表I及び図16)。図2Dに示すコンビナトリアルアプローチを用いて、I-CreIタンパク質のDNA結合ドメインを全体的に再設計し、そのことにより、完全に工学的に改変された(engineered)特異性を有する新規なメガヌクレアーゼを工学的に作製し、I-CreI C1221 22 bpパリンドローム部位とは、4つの中央ヌクレオチドのうち3つ(-2位、+1位、+2位)を含む16ヌクレオチド(HBB5; 図4)と、4つの中央ヌクレオチドのうち2つ(+1位、+2位)を含む15ヌクレオチド(HBB8; 図5)がそれぞれ異なるヒトHBB遺伝子からの2つのDNA標的(HBB5及びHBB8)を切断した。
組み合わせた変異型は、それぞれヌクレオチド10NNN及び5NNNに指向して最初は同定され、標的の4つの中央ヌクレオチドの、工学的に作製されたメガヌクレアーゼの活性に対する強い影響が観察されたが、特異性における重大な変化を有する機能的メガヌクレアーゼが選択された。さらに、工学的に作製されたタンパク質の活性は、I-CreIタンパク質の活性と比較して、ランダム突然変異誘発及びスクリーニングにより著しく改良できた。
ヒトHBB遺伝子からのゲノムDNA標的を切断できるI-CreI変異型は、鎌状赤血球病及びベータサラセミアのゲノム療法、及びベータグロビン遺伝子座でのゲノム工学(動物モデル及び組換え細胞の作製)のために用いることができる。
例えば、HBBのコードエキソン1中に位置する(配列番号4の1138位〜1159位; 図3)、HBB6とよばれるDNA標的は、グルタミン酸コドンと重複し、このグルタミン酸コドンの変異は、鎌状赤血球貧血及びHbSCの原因であり、その変異がHbSEの原因であるグルタミン酸コドンと近い。野生型遺伝子とは1148位のAからTへの転換が異なる(これは、グルタミン酸コドン(GAG; 配列番号4の1147位〜1149位)をバリンコドン(GTG)に変更する)HbS対立遺伝子において、HBB6配列は、HBB8で置き換えられている。HBB5とよばれるDNA標的は、鎌状赤血球貧血(1147位〜1149位のGTGコドン; E6V変異)、HbSC (1147位〜1149位のAAGコドン; E6K変異)及びHbSE (1207位〜1209位のAAGコドン; E6K変異)の原因である変異グルタミン酸コドンに近い、HBB遺伝子のイントロン1の初めに位置する(配列番号4の1237位〜1258位;図3)。
HBB8又はHBB5を切断するメガヌクレアーゼを用いて、E6V変異を修正できるだろう。HBB5を切断するエンドヌクレアーゼがを用いて、ベータグロビン鎖の6位のその他の変異(HbC: E6K)も修正できるだろう。さらに、HBB5又はHBB6を切断するメガヌクレアーゼを用いて、切断部位の近傍のいずれのその他のアミノ酸変異(E26K)も修正できるだろう。遺伝子修正の効率は、DSBへの距離が増大すると減少するので(Elliottら, Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 93〜101)、このストラテジーは、切断部位の500 bp以内に位置する変異について最も有効であろう。或いは、同じメガヌクレアーゼを用いて、HBB遺伝子座にて機能的HBB遺伝子を回復するであろうエキソン配列をノックインできるだろう(図1B)。このストラテジーは、切断部位の下流のいずれの変異についても用いることができるだろう。
本発明は、2つのI-CreI単量体の少なくとも一方が、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位にそれぞれ位置するLAGLIDADGコアドメインの2つの機能的サブドメイン内に1つずつ存在する少なくとも2つの置換を有するI-CreI変異型に関し、これはヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列を切断できる。
本発明による変異型の切断活性は、国際PCT出願WO 2004/067736; Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜2962; Chamesら, Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178及びArnould et al., J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458に記載されるようないずれの公知のインビトロ又はインビボ切断アッセイにより測定できる。例えば、本発明の変異型の切断活性は、直列反復組換えアッセイ(direct repeat recombination assay)により、酵母又は哺乳動物細胞内で、レポーターベクターを用いて測定できる。レポーターベクターは、酵母又は哺乳動物発現ベクター中にクローニングされた介在配列内に、レポーター遺伝子の2つの切断された非機能的コピー(直列反復)と、ゲノムDNA標的配列とを含む。変異体の発現が、ゲノムDNA標的配列を切断できる機能的エンドヌクレアーゼをもたらす。この切断は、直列反復同士の相同組換えを誘発し、機能的レポーター遺伝子をもたらし、その発現を、適切なアッセイによりモニターできる。
メガヌクレアーゼ誘発組換えによる機能的遺伝子の回復のための2つの異なるストラテジーを説明する。 ホーミングエンドヌクレアーゼのモジュール性の構造と、再設計されたホーミングエンドヌクレアーゼを作製するためのコンビナトリアルアプローチを説明する。 ヒトHBB遺伝子のゲノム遺伝子座を示す。 HBB5標的配列及びその誘導体を示す。 HBB6/HBB8標的配列及びそれらの誘導体を示す。 コンビナトリアル変異体によるHBB5.3の切断を説明する。 コンビナトリアル変異体によるHBB 5.4の切断を説明する。 ヘテロ二量体コンビナトリアル変異体によるHBB5.2及びHBB5標的の切断を説明する。 HBB 5標的の切断を示す。 コンビナトリアル変異体によるHBB8.3の切断を説明する。 コンビナトリアル変異体によるHBB8.4の切断を説明する。 ヘテロ二量体コンビナトリアル変異体によるHBB8の切断を説明する。 pCLS0542ベクターマップを表す。 pCLS1055ベクターマップを表す。 pCLS1107ベクターマップを表す。 ヒトベータグロビン遺伝子で見出されるメガヌクレアーゼ標的配列、及び該DNA標的を切断できる対応するI-CreI変異型を表す。 HBB5.3又はHBB5.4標的を切断する最適化I-CreI変異体によるHBB5の切断を説明する。 I-CreI変異体の多部位特異的突然変異誘発の原理を説明する。 ランダム突然変異誘発により得られたHBB5.3又はHBB5.4標的を切断する最適化I-CreI変異体によるHBB5の切断を説明する。 多部位特異的突然変異誘発により得られたHBB5.3又はHBB5.4標的を切断する最適化I-CreI変異体によるHBB5の切断を説明する。 CHO哺乳動物細胞におけるHBB5 DNA標的の染色体外切断を説明する。 HBB8標的の切断を説明する。 HBB8.5及びHBB6.5標的の切断の特異性を説明する。 HBB8標的の切断を説明する。 HBB8.6及びHBB6.6由来標的の切断の特異性を説明する。 CHO哺乳動物細胞におけるHBB由来配列を標的にするメガヌクレアーゼの染色体外切断効率を説明する。 哺乳動物細胞におけるレポーター系を表す。 HBB8 DNA標的配列を切断するメガヌクレアーゼの染色体切断効率を説明する。 ヒトHBB遺伝子座の遺伝子ターゲティングのためのノックインベクターを表す。 pCLS1058ベクターマップを表す。 pCLS1069ベクターマップを表す。
定義
- HBB及びメガヌクレアーゼ変異型の両方の位置の認められた(admitted)数字は、最初のメチオニンの計数を省略する。このことは、通常用いられる数字の注釈と、本明細書に添付の配列表で見られる有効な位置との間で観察される不一致を説明する。より具体的には：
・HBB番号付けに関して、これは、OMIMTMデータベースで示される番号付けと一致する。よって、参照配列(GenBank NP_00509.1又は本明細書に添付の配列表の配列番号150)において、変異E6K及びE26Kは、それぞれ7位及び27位での変異に相当し、
・メガヌクレアーゼの番号付けに関して、これは、I-CreI pdbアクセッションコードIg9yと一致する。
- ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書において、1文字コードに従って表し、例えばQはGln又はグルタミン残基を意味し、RはArg又はアルギニン残基を意味し、DはAsp又はアスパラギン酸残基を意味する。
- ヌクレオチドは、次のように表す：1文字コードは、ヌクレオシドの塩基を表すために用いる：aはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重ヌクレオチドについて、rはg又はa (プリンヌクレオチド)を表し、kはg又はtを表し、sはg又はcを表し、wはa又はtを表し、mはa又はcを表し、yはt又はc (ピリミジンヌクレオチド)を表し、dはg、a又はtを表し、vはg、a又はcを表し、bはg、t又はcを表し、hはa、t又はcを表し、nはg、a、t又はcを表す。
- 「メガヌクレアーゼ」により、12〜45 bpの2本鎖DNA標的配列を有するエンドヌクレアーゼを意図する。該メガヌクレアーゼは、各ドメインが単量体上にある二量体酵素、又は単一ポリペプチド上に2つのドメインを含む単量体酵素のいずれかである。
- 「メガヌクレアーゼドメイン」により、メガヌクレアーゼのDNA標的の一方の半分と相互作用し、かつDNA標的の他方の半分と相互作用する同じメガヌクレアーゼの他方のドメインと会合して、該DNA標的を切断できる機能的メガヌクレアーゼを形成できる領域を意図する。
- 「メガヌクレアーゼ変異型」又は「変異型」により、野生型メガヌクレアーゼ(天然のメガヌクレアーゼ)のアミノ酸配列における少なくとも1つの残基の、別のアミノ酸での置き換えにより得られるメガヌクレアーゼを意図する。
- 「機能的変異型」により、DNA標的配列、好ましくは、親のメガヌクレアーゼにより切断されない新しい標的を切断できる変異型を意図する。例えば、このような変異型は、DNA標的配列に接触するか、又は直接若しくは間接的に該DNA標的と相互作用する位置にてアミノ酸変動を有する。
- 「I-CreI」により、配列表内の配列番号1及び配列番号178の配列にそれぞれ相当する配列SWISSPROT P05725又はpdbアクセッションコード1g9yの配列を有する野生型I-CreIを意図する。
- 「新規な特異性を有するI-CreI変異型」により、親のメガヌクレアーゼのものとは異なる切断標的のパターンを有する変異型を意図する。等価で、同様に用いられる用語「新規な特異性」「改変された特異性」「新規な切断特異性」「新規な基質特異性」は、DNA標的配列のヌクレオチドに対する変異型の特異性のことである。
- 「I-CreI部位」により、I-CreIにより切断される22〜24 bpの2本鎖DNA配列を意図する。I-CreI部位は、野生型(天然)非パリンドロームI-CreIホーミング部位と、C1221ともよばれる(図4)配列5'- t-12c-11a-10a-9a-8a-7c-6g-5t-4c-3g-2t-1a+1c+2g+3a+4c+5g+6t+7t+8t+9t+10g+11a+12 (配列番号2)のような派生パリンドローム配列を含む。
- 「ドメイン」又は「コアドメイン」により、約100アミノ酸残基の配列に相当する、LAGLIDADGファミリーのホーミングエンドヌクレアーゼの特徴的なα1β1β2α2β3β4α3折り畳みである「LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメイン」を意図する。該ドメインは、DNA標的の一方の半分と相互作用する逆平行ベータシートに折り畳まれた4つのベータ鎖(β1β2β3β4)を含む。このドメインは、DNA標的の他方の半分と相互作用する別のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインと会合して、該DNA標的を切断できる機能エンドヌクレアーゼを形成できる。例えば、二量体ホーミングエンドヌクレアーゼI-CreI (163アミノ酸)の場合、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインは、残基6〜94に相当する。
- 「サブドメイン」により、ホーミングエンドヌクレアーゼDNA標的ハーフサイトの別個の部分と相互作用するLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの領域を意図する。
- 「ベータヘアピン」により、ループ又はターンにより接続されたLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの逆平行ベータシートの2つの連続するベータ鎖(β1β2又はβ3β4)を意図する。
- 「単鎖メガヌクレアーゼ」「単鎖キメラメガヌクレアーゼ」「単鎖メガヌクレアーゼ誘導体」「単鎖キメラメガヌクレアーゼ誘導体」又は「単鎖誘導体」により、ペプチドスペーサーで連結された2つのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼドメイン又はコアドメインを含むメガヌクレアーゼを意図する。単鎖メガヌクレアーゼは、それぞれの親のメガヌクレアーゼ標的配列の1つの異なる半分を含むキメラDNA標的配列を切断できる。
- 「DNA標的」、「DNA標的配列」、「標的配列」、「標的部位」、「標的」、「部位」、「興味対象の部位」、「認識部位」、「認識配列」、「ホーミング認識部位」、「ホーミング部位」、「切断部位」により、I-CreIのようなLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、又は変異型、又はI-CreIに由来する単鎖キメラメガヌクレアーゼにより認識されかつ切断される20〜24 bpの2本鎖パリンドローム、部分的パリンドローム(偽パリンドローム)又は非パリンドロームのポリヌクレオチド配列を意図する。これらの用語は、そこでメガヌクレアーゼにより2本鎖破断(切断)が誘導される独特のDNAの場所、好ましくはゲノムの場所のことをいう。DNA標的は、C1221について上で示したように、2本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の5'から3'の配列により定義される。DNA標的の切断は、センス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれについて、+2位及び-2位のヌクレオチドで生じる。そうでないと記載しない限り、I-Cre Iメガヌクレアーゼ変異型によるDNA標的の切断が生じる位置は、DNA標的のセンス鎖上の切断部位に相当する。
- 「DNA標的ハーフサイト」、「ハーフ切断部位」又は「ハーフサイト」により、それぞれのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインが結合するDNA標的の部分を意図する。
- 「キメラDNA標的」又は「ハイブリッドDNA標的」により、2つの親のメガヌクレアーゼ標的配列の異なる半分の融合を意図する。さらに、該標的の少なくとも一方の半分は、少なくとも2つの別個のサブドメインが結合するヌクレオチドの組み合わせ(組み合わせたDNA標的)を含み得る。
- 「ベータグロビン遺伝子」又は「HBB遺伝子」により、第11染色体の短(p)腕上15.5位に(11p15.5)位置するヒトベータグロビン遺伝子を意図する。本発明は、正常(野生型HBB)及び変異HBB遺伝子(変異HBB; HBB対立遺伝子)、特に鎌状赤血球病(HbS対立遺伝子、βS-グロビン遺伝子又は鎌状グロビン遺伝子)及びベータ-サラセミアの原因である変異体を含む。HBB遺伝子(1606 bp)は、アクセッション番号GenBank NT_009237.17の配列の逆相補鎖(reverse complemented strand)上の4033937位〜4035542位に相当する。これは、3つのエキソンを含む(エキソン1: 1位〜142位;エキソン2: 273位〜495位;エキソン3: 1346位〜1606位)。51位(エキソン1)から1474位(エキソン3)までのORFは、2つの非翻訳領域で挟まれる。野生型HBB配列(配列番号3)は、アクセッション番号NT_009237.17の配列の逆相補鎖上の4032541位〜4036620位に相当する4080 bpフラグメント(配列番号4)に含まれる。HBB遺伝子配列は配列番号4の1079位〜2684位に、エキソン1は1079位〜1220位に、エキソン2は1351位〜1573位に、エキソン3は2424位〜2684位に、ORFは1129位〜2552位に相当する(図3)。HBB mRNAは、アクセッション番号GenBank NM_00518.4 (配列番号149)の配列に相当する。ベータグロビンタンパク質は、アクセッション番号GenBank NP_00509.1 (配列番号150)の配列に相当する。
- 「ベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列」「ゲノムDNA標的配列」、「ゲノムDNA切断部位」、「ゲノムDNA標的」又は「ゲノム標的」により、メガヌクレアーゼ変異型又は単鎖キメラメガヌクレアーゼ誘導体により認識され切断される哺乳類のベータグロビン遺伝子の20〜24 bp配列を意図する。
- 「ベクター」により、連結された別の核酸を輸送できる核酸分子を意図する。
- 「相同な」により、配列同士の間の相同組換えを導くのに充分な別の配列との同一性を有する、より具体的には少なくとも95%の同一性、好ましくは97%の同一性、より好ましくは99%を有する配列を意図する。
- 「同一性」は、2つの核酸分子又はポリペプチド間の配列同一性のことをいう。同一性は、比較の目的のために整列させ得るそれぞれの配列中の位置の比較により決定できる。比較される配列中の位置が同じ塩基により占められる場合、その分子同士は、その位置において同一である。核酸又はアミノ酸配列間の類似性又は同一性の程度は、核酸配列により共有される位置での同一又は一致するヌクレオチドの数の関数である。種々のアラインメントアルゴリズム及び／又はプログラムを用いて、2つの配列間の同一性を計算することができ、GCG配列解析パッケージ(University of Wisconsin, Madison, Wis.)の一部分として利用可能であり、例えばデフォルト設定で用い得るFASTA又はBLASTを含む。
- 「個体」は、哺乳動物、及びその他の脊椎動物(例えば鳥類、魚類及び爬虫類)を含む。用語「哺乳動物」及び「哺乳類」は、本明細書で用いる場合、その子に授乳し、生存する子を出産する(真獣類(eutharian)又は胎盤哺乳類(placental mammals))又は産卵する(後獣類(metatharian)又は無胎盤哺乳類(nonplacental mammals))単孔類、有袋類及び有胎盤類(placental)を含むいずれの脊椎動物のことをいう。哺乳動物の種の例は、ヒト、及びその他の霊長類(例えばサル、チンパンジー)、げっ歯類(例えばラット、マウス、モルモット)、並びにその他、例えばウシ、ブタ及びウマを含む。
- 「変異」により、ポリヌクレオチド(cDNA、遺伝子)又はポリペプチド配列内の1つ又は複数のヌクレオチド／アミノ酸の置換、欠失、挿入を意図する。上記の変異は、遺伝子のコード配列又はその調節配列に影響し得る。これは、ゲノム配列の構造又はコードされるmRNAの構造／安定性にも影響し得る。
本発明による変異型は、ホモ二量体又はヘテロ二量体であり得る。好ましくは、ヘテロ二量体の両方の単量体が、26位〜40位及び／又は44位〜77位で変異される。より好ましくは、両方の単量体が、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位の両方に異なる置換を有する。
上記の変異型の好ましい実施形態において、I-CreIの44位〜77位に位置するサブドメイン内の上記の置換は、44位、68位、70位、75位及び／又は77位にある。
上記の変異型の別の好ましい実施形態において、I-CreIの26位〜40位に位置するサブドメイン内の上記の置換は、26位、28位、30位、32位、33位、38位及び／又は40位にある。
上記の変異型の別の好ましい実施形態において、これは、DNA標的配列と接触するか又はDNA主鎖(backbone)若しくはヌクレオチド塩基と直接又は水分子を介して相互作用する他のアミノ酸残基の位置にて、1つ又は複数の変異を含む。これらの残基は、当該技術において公知である(Juricaら, Molecular Cell., 1998, 2, 469〜476; Chevalierら, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜269)。特に、付加的な置換は、例えば最終C-末端ループ中の(137位〜143位; Prietoら, Nucleic Acids Res., Epub 2007年4月22日)、リン酸主鎖と接触する位置にて導入され得る。好ましくは、上記の残基は、上記のDNA切断部位の結合及び切断に関与する。より好ましくは、上記の残基は、I-CreIの138位、139位、142位又は143位にある。それぞれの変異が138位と139位の残基の対及び142位と143位の残基の対から選択される残基の異なる対の中にあることを条件として、2つの残基を1つの変異型内で変異させ得る。導入される変異は、最終C-末端ループのアミノ酸の、I-CreI部位のリン酸主鎖との相互作用を改変する。好ましくは、138位又は139位の残基を疎水性アミノ酸により置換して、DNA切断部位のリン酸主鎖との水素結合の形成を回避する。例えば、138位の残基がアラニンにより置換されるか、又は139位の残基がメチオニンにより置換される。142位又は143位の残基を、有利には、小さいアミノ酸、例えばグリシンにより置換して、これらのアミノ酸残基の側鎖のサイズを低減させる。より好ましくは、最終C-末端ループ中の上記の置換は、I-CreI部位の±1〜2位、±6〜7位及び／又は±11〜12位のヌクレオチドに対する変異型の特異性を改変する。
上記の変異型の別の好ましい実施形態において、これは、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列に対する変異型の結合及び／又は切断特性を改良する1つ又は複数の付加的な変異を含む。
変異される付加的な残基は、I-CreI配列全体、特にI-CreIのC-末端半分(80位〜163位)にあり得る。両方のI-CreI単量体を変異させるのが有利である。それぞれの単量体中の変異は、同じ又は異なることができる。例えば、変異型は、以下の位置の1つ又は複数の付加的な置換を含む：4位、7位、12位、16位、19位、24位、34位、43位、49位、54位、58位、60位、64位、66位、79位、80位、81位、82位、85位、86位、87位、92位、93位、94位、96位、99位、100位、103位、105位、109位、111位、117位、120位、121位、125位、129位、131位、132位、139位、140位、147位、151位、152位、155位、159位、160位、161位、162位及び163位。上記の置換は、K4E、K7R、Y12H、F16L、G19S、G19A、I24V、K34R、F43L、T49A、F54L、L58Q、D60N、D60G、V64I、Y66H、S79G、E80G、E80K、I81T、K82R、K82E、H85R、N86S、F87L、Q92R、P93A、F94L、K96R、Q99R、K100R、N103S、V105A、V105I、I109V、Q111H、E117G、D120G、K121R、K121E、V125A、V129A、Q131R、I132V、K139R、T140A、T147A、V151M、L152Q、L155P、K159R、K159E、K160E、S161P、S162P及びP163Sからなる群より選択されるのが有利である。好ましくは、変異型は、G19S、F54L、E80K、F87L、V105A及びI132Vからなる群より選択される少なくとも1つの置換を含む。より好ましくは、変異型は、G19S置換及びE80K置換、又はF87L置換及びE80K置換を少なくとも含む。
上記の変異型のより好ましい実施形態によると、上記の付加的な変異は、機能的ホモ二量体の形成をさらに損なう。より好ましくは、上記の変異はG19S変異である。有利には、G19S変異を、ヘテロ二量体I-CreI変異型の2つの単量体のうちの一方に導入することにより、切断活性が増強され、切断特異性が増強されたメガヌクレアーゼを得る。さらに、切断特異性をさらに増強するために、他方の単量体は、機能的ホモ二量体の形成を損なうか又はヘテロ二量体の形成に好ましい、別個の変異を有し得る。
上記の変異型の別の好ましい実施形態において、上記の置換は、最初の(initial)アミノ酸の、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、Y、C、V、L及びWからなる群より選択されるアミノ酸での置き換えである。
本発明の変異型は、野生型I-CreI (配列番号1又は178)、又は配列番号178と少なくとも85%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性、より好ましくは少なくとも95%の同一性を有するI-CreI足場タンパク質、例えばI-CreI配列の2位のアラニンの挿入、置換D75N及びC-末端でのAADの挿入(164位〜166位)を有する配列番号5の足場(167アミノ酸)から導き得る。
さらに、本発明の変異型は、配列のNH2末端及び／又はCOOH末端に挿入された1つ又は複数の残基を含み得る。例えば、タグ(エピトープ又はポリヒスチジン配列)を、NH2末端及び／又はCOOH末端に導入する。このタグは、上記の変異型の検出及び／又は精製のために有用である。例えば、変異型は、そのC-末端に挿入されたAAD又はATD配列を有し得る。
変異型は、核局在化シグナル(NLS)も含み得る。上記のNLSは、該変異型を細胞の核内に輸送するために有用である。NLSは、変異型の最初のメチオニンの直後又はN-末端タグの直後に挿入できる。
本発明による変異型は、パリンドローム又は偽パリンドロームDNA標的配列を切断できるホモ二量体であり得る。
或いは、上記の変異型は、I-CreIの26位〜40位及び／又は44位〜77位に異なる置換を有する第1及び第2単量体の会合により得られるヘテロ二量体であって、ヒトベータグロビン遺伝子からの非パリンドロームDNA標的配列を切断できるヘテロ二量体である。
本発明によるヘテロ二量体変異型のそれぞれの単量体(第1単量体及び第2単量体)は、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位及び70位、75位及び77位の11残基と、上記のような変異された付加的な残基の文字コードで命名され得る。例えば、KTSHRS/KYSDT + 120G又は28K30T32S33H38R40S / 44K68Y70S75D77T + 120Gは、I-CreI K28, T30, S32 , H33 , R38, S40/ K44, Y68, S70, D75, T77及びG120のことである。
上記の変異型により切断されるDNA標的配列は、ヒトベータグロビン遺伝子のエキソン又はイントロン内にあってよい。
上記の変異型の別の好ましい実施形態において、上記のDNA標的配列は、配列番号6〜19の配列からなる群より選択される(図16及び表I)。
Figure 2010534070
より好ましくは、I-CreI変異型の単量体は、第1及び第2のI-CreI単量体についてそれぞれ、少なくとも以下の置換を有する：
* N30S、Y33G、Q44D、R68N、R70S及びD75N (第1単量体)と、Y33T、Q38A、R70S、D75Y及びI77R (第2単量体);この変異型は、ヒトHBB遺伝子5'フランキング配列内に位置するHBB標的配列番号6を切断する(図16及び表I)、
* N30D、Y33R、R70S及びD75N (第1単量体)と、S32G、Y33T、Q44A、R70G及びD75N (第2単量体);この変異型は、ヒトHBB遺伝子5'フランキング配列内に位置するHBB標的配列番号7を切断する(図16及び表I)、
* S32D、Q38C、R70S及びI77K (第1単量体)と、S32D、Q38C、R70S及びD75N (第2単量体);この変異型は、ヒトHBB遺伝子5'フランキング配列内に位置するHBB標的配列番号8を切断する(図16及び表I)、
* Y33T、Q44D、R68A、R70S、D75K及びI77R (第1単量体)と、Y33R、Q38T、R68H、R70H及びD75N (第2単量体);この変異型は、HBB6 (配列番号9)及びHBB8 (配列番号10)の両方の標的を切断する(図3及び16並びに表I)。HBB6及びHBB8標的は、エキソン1内に位置し、ヒトベータグロビン鎖の6位の正常(GAG; グルタミン酸、E6)及び変異(GTG;鎌状赤血球貧血を引き起こすグルタミン酸のバリンへの置換(E6V)をもたらすAからTへの転換)コドンとそれぞれオーバーラップする。
* 以下の変異型(図16並びに表XVI、XVIII、XX及びXXI)は、HBB8 (配列番号10)標的を切断し(図3及び16ならびに表I)、HBB6標的を切断しないか又はより低い効率で切断する。HBB8標的は、エキソン1内に位置し、鎌状赤血球貧血の原因であるヒトベータグロビン鎖の6位の変異コドンとオーバーラップする：
- 28位にK、30位にN、32位にS、E又はT、33位にT、C、S又はV、38位にS、Q、R、H、40位にS又はQ、44位にK、R、D、N又はH、68位にY、A又はE、70位にS、75位にD、K又はN、並びに77位にR又はQを有する第1単量体。好ましくは、28位、30位、32位、33位、38位及び40位の残基は、KNSTSS、KNSSSS、KNETQS、KNTCQS、KNSCQS、KNSTRQ、KNSVRQ、KNSVHQ、KNSCHS、KNSSRS、KNSTQS及びKNSVHSからなる群より選択され、44位、68位、70位、75位及び77位の残基は、KASDR、RYSNQ、HYSNR、NESNR及びDASKRからなる群より選択される。より好ましくは、第1単量体は、KNSTSS/RYSNQ、KNTCQS/RYSNQ、KNTCQS/HYSNR、KNSCHS/RYSNQ、KNSVHS/RYSNQ、KNSTRQ/NESNR、KNETQS/DASKR、KNTCQS/DASKR、KNSCHS/DASKR、KNSCQS/DASKR、KNSSSS/KASDR、KNSSRS/DASKR、KNSTRQ/DASKR、KNSVRQ/DASKR、KNSTQS/DASKR及びKNSVHQ/DASKRからなる群より選択される。第1単量体は、有利には、G19S、F54L、E80K、F87L、V105A及びI132Vからなる群より選択される少なくとも1つの第1付加的変異と、ついには、K7R、K121R及びQ131Rからなる群より選択される第2付加的変異を含む。このような変異型の例は、表XVI (配列番号104、105、111、113、114、118、121)、表XX (配列番号257〜276)、表XXI (配列番号286)及び図16 (配列番号126)に示す。
- 28位にK、30位にN、T又はQ、32位にT又はS、33位にG、H、T、C、Y又はR、38位にK、R、T又はQ、40位にS、44位にQ又はK、68位にA、S、H又はY、70位にS又はH、75位にN、並びに77位にR、Q、Y又はIを有する第2単量体。好ましくは、28位、30位、32位、33位、38位及び40位の残基は、KNSGKS、KTSHRS、KNSTRS、KNSRTS、KNSGRS、KNSCRS、KQTYRS及びKTSRQSからなる群より選択され、44位、68位、70位、75位及び77位の残基は、QASNR、KYSNY、KYSNQ、QYSNR、KYSNR、KYSNI、QHHNI及びKSSNYからなる群より選択される。より好ましくは、第2単量体は、KNSGKS/QASNR、KTSHRS/KYSNY、KNSTRS/KYSNY、KNSGRS/KYSNY、KNSCRS/KYSNQ、KNSGKS/KYSNY、KNSGKS/QYSNR、KNSGKS/KYSNR、KNSGKS/KYSNQ、KQTYRS/KYSNI、KQTYRS/KYSNY、KQTYRS/QASNR、KQTYRS/KYSNQ、KNSRTS/QHHNI及びKTSRQS/KSSNYからなる群より選択される。第2単量体は、有利には、G19S、F54L、E80K、F87L、V105A及びI132Vからなる群より選択される少なくとも1つの第1付加的変異と、ついには、K4E、Y12H、L58Q、D60N、V64I、H85R、P93A、E117G、V129A及びL152Qからなる群より選択される第2付加的変異を含む。このような変異型の例は、表XVI (配列番号82、84、85、88、94、103)、表XVIII (配列番号231〜255)、表XXI (配列番号287〜291)及び図16 (配列番号139に示す。
HBB8標的を切断し、かつHBB6標的を切断しないか又はより低い効率で切断するこのような変異型の例は、表XVI、XVIII、XX及びXXIに示す。例えば、表XVIに示す変異型は、以下の置換を有する：
- Y33T、Q38S、Q44R、R68Y、R70S、D75N及びI77Q (KNSTSS/RYSNQ)又はS32E、Y33T、Q44D、R68A、R70S、D75K及びI77R (KNETQS/DASKR; 第1単量体)、並びにY33C、Q38R、Q44K、R68Y、R70S、D75N及びI77Q (KNSCRS/KYSNQ; 第2単量体)、
- Y33C、Q38H、Q44R、R68Y、R70S、D75N及びI77Q (KNSCHS/RYSNQ)又はS32T、Y33C、Q44D、R68A、R70S、D75K及びI77R (KNTCQS/DASKR; 第1単量体)、並びにY33G、Q38K、R68A、R70S、D75N及びI77R (KNSGKS/QASNR); N30T、Y33H、Q38R、Q44K、R68Y、R70S、D75N及びI77Y (KTSHRS/KYSNY); Y33T、Q38R、Q44K、R68Y、R70S、D75N及びI77Y (KNSTRS/KYSNY); Y33G、Q38R、Q44K、R68Y、R70S、D75N及びI77Y (KNSGRS/KYSNY); Y33G、Q38K、Q44K、R68Y、R70S、D75N及びI77Y (KNSGKS/KYSNY)からなる群より選択される第2単量体、
- Y33T、Q38R、S40Q、Q44N、R68E、R70S、D75N及びI77R (KNSTRQ/NESNR)又はY33S、Q38S、Q44K、R68A、R70S及びI77R (KNSSSS/KASDR; 第1単量体)、並びにN30T、Y33H、Q38R、Q44K、R68Y、R70S、D75N及びI77Y (KTSHRS/KYSNY; 第2単量体)、
- S32T、Y33C、Q44R、R68Y、R70S、D75N及びI77Q (KNTCQS/RYSNQ; 第1単量体)、並びにY33G、Q38K、R68A、R70S、D75N及びI77R (KNSGKS/QASNR; 第2単量体)。
好ましい変異型は、表XXIに示すものである：
-KNSVHQ/DASKR+87L+131R (第1単量体)及びKNSGKS/KYSNY+19S+117G、KQTYRS/KYSNY+19S+64I、KNSGKS/KYSNY+19S+132V、KQTYRS/KYSNY+54L又はKQTYRS/KYSNQ+19S (第2単量体)、
- KNSTRQ/DASKR+19S (第1単量体)及びKQTYRS/KYSNY+105A+152Q、KQTYRS/KYSNY+54L、KQTYRS/QASNR+87L又はKQTYRS/KYSNI+19S (第2単量体)、
- KNSVRQ/DASKR+19S (第1単量体)及びKQTYRS/QASNR+87L+58Q、KQTYRS/KYSNY+105A+152Q、KNSGKS/KYSNY+132V、KQTYRS/KYSNY+54L又はKQTYRS/QASNR+87L (第2単量体),
- KNSVHQ/DASKR+87L (第1単量体)及びKNSGKS/KYSNY+132V、KNSGKS/KYSNY+19S+117G、KNSGKS/KYSNY+19S+132V、KQTYRS/KYSNY+54L又はKQTYRS/KYSNI+19S (第2単量体)。
* 以下の変異型(図16並びに表V、VII、IX、XI及びXII)は、3つの主な鎌状赤血球病：鎌状赤血球貧血(E6V)、HbSC (E6V及びE6K)及びHbSE (E6V及びE26K; 図16及び表I)の原因である変異コドンの近傍のイントロン1内に位置するHBB5標的(配列番号11)を切断する：
- 28位にK、30位にN、32位にT、S、P又はD、33位にY又はP、38位にQ、40位にS、44位にA、68位にR、70位にS、75位にE、及び77位にRを有する第1単量体。これらの変異型は、KNTYQS/ARSER、KNDYQS/ARSER、KNPYQS/ARSER、KNSPQS/ARSER及びKNSYQS/ARSERに相当する。第1単量体は、有利には、G19S、E80K、F87L、V105A及びI132Vからなる群より選択される少なくとも1つの第1付加的変異を含む。より好ましくは、第1単量体は、少なくともG19S置換及びE80K置換、又はF87L置換及びE80K置換と、ついには、I24V、F43L、K82R、H85R、K96R、K100R、V105I、I109V、K121E、V129A、K139R、L155P、K159R、K160E及びS161Pからなる群より選択される付加的変異を含む。このような変異型の例は、表V (配列番号79)、表IX (配列番号179〜186)、表XI (配列番号209〜220)、表XII (配列番号281)、図16 (配列番号127)、図19B及び20B (配列番号292〜297)に示す。
- 28位にK、30位にT、N、K又はS、32位にS又はP、33位にH、S又はR、38位にH、Q、K又はR、40位にS、44位にK又はR、68位にY、S又はE、70位にS、75位にS、D又はN、及び77位にT、R、I又はQを有する第2単量体。好ましくは、28位、30位、32位、33位、38位及び40位の残基は、KTSRHS、KTSHRS、KNSRRS、KNSSKS、KNSRRS、KSSHRS、KKSSQS及びKSPHRSからなる群より選択され、44位、68位、70位、75位及び77位の残基は、KSSNI、KYSDT、KYSDR、KYSNQ、RYSNQ及びKESNRからなる群より選択される。より好ましくは、第2単量体は、KTSRHS/KSSNI、KTSHRS/KYSDT、KNSRRS/KYSDT; KNSRRS/KYSDR、KNSRRS/KYSNQ、KNSRRS/RYSNQ、KSSHRS/KYSDT、KNSSKS/KYSNQ、KNSSKS/KYSDR、KNSRRS/KYSNQ、KSSHRS/KYSDQ、KSPHRS/KYSDT、KSSHRS/KYSNQ及びKKSSQS/KESNRからなる群より選択される。第2単量体は、有利には、G19S、E80K、F87L、V105A及びI132Vからなる群より選択される少なくとも1つの第1付加的変異と、ついには、K4E、K7R、F16L、K34R、T49A、D60G、Y66H、E80G、I81T、K82R、K82E、N86S、Q92R、F94L、Q99R、K100R、N103S、Q111H、D120G、V125A、K139R、T140A、T147A、V151M、K159E、K159R、K160E、S162P及びP163Sからなる群より選択される第2付加的変異を含む。このような変異型の例は、表V (配列番号45及び56)、表VII (配列番号164〜177)、表XI (配列番号197〜208)、表XII (配列番号277〜280)並びに図16 (配列番号140)、17A (配列番号298〜301)、19A (配列番号302〜304)及び20A (配列番号305、306)に示す。
HBB5標的を切断するこのような変異型の例は、図16、17、19、20並びに表V、VII、IX、XI及びXIIに示し、以下の配列で表される：Y33P、Q44A、R70S、D75E及びI77R (KNSPQS/ARSER; 第1単量体)と、N30K、Y33S、Q44K、R68E、R70S及びI77R (KKSSQS/KESNR; 第2単量体); S32T、Q44A、R70S、D75E、I77R、E80K及びK96R (KNTYQS/ARSER+80K+96R; 第1単量体)と、N30T、Y33H、Q338R、Q44K、R68Y、R70S及びI77T (KTSHRS/KYSDT)又はY33R、Q38R、Q44K、R68Y、R70S及びI77T (KNSRRS/KYSDT; 第2単量体)。
好ましい変異体は、表XIIに示すものである：KNTYQS/ARSER+19S+80K+85R+87L+96R+139R (第1単量体)と、KSPHRS/KYSDT+81T又はKTSHRS/KYSDT+66H+82R+86S+99R+132V+139R+140A (第2単量体)。
* Y33T、Q38A、Q44A及びR70H (第1単量体)と、Y33H、Q38S、Q44Y、R68D、R70S、D75R及びI77T (第2単量体);この変異型は、イントロン2に位置するHBB標的配列番号12を切断する(図16及び表I)、
* S32G、Y33T、Q44K、R68E、R70S、D75Y及びI77V (第1単量体)と、N30H、Y33H、Q44P、R70H及びD75N (第2単量体);この変異型は、イントロン2に位置するHBB標的配列番号13を切断する(図16及び表I)、
* N30D、S32T、R68Y、R70S及びD75Y (第1単量体)と、S32D、Q38C、R68Y、R70S、D75R及びI77Q (第2単量体);この変異型は、イントロン2に位置するHBB標的配列番号14を切断する(図16及び表I)、
* N30T、Y33G、R68H、R70H及びD75N (第1単量体)と、Y33R、Q38T、Q44A及びR70H (第2単量体);この変異型は、イントロン2に位置するHBB標的配列番号15を切断する(図16及び表I)、
* N30H、Y33S、R68Y、R70S及びD75Y (第1単量体)と、N30D、Y33R、R68H、R70H及びD75N (第2単量体);この変異型は、イントロン2に位置するHBB標的配列番号16を切断する(図16及び表I)、
* S32W、Y33T、Q44A及びR70H (第1単量体)と、S32T、Y33C、Q44A、R70G及びD75N (第2単量体);この変異型は、イントロン2に位置するHBB標的配列番号17を切断する(図16及び表I)、
* S32T、Q38W、Q44N、R68Y、R70S、D75R及びI77V (第1単量体)と、S32T、Y33T、Q44A、R70S、D75E及びI77R (第2単量体);この変異型は、イントロン2に位置するHBB標的配列番号18を切断する(図16及び表I)、並びに
* N30Q、Y33H、Q44A、R70S、D75E及びI77R (第1単量体)と、S32N、Y33G、Q38Y、R70S、D75R及びI77Q (第2単量体);この変異型は、エキソン3に位置するHBB標的配列番号19を切断する(図16及び表I)。
上記のように定義されるヘテロ二量体変異型は、上記のアミノ酸置換のみを有し得る。この場合、記載していない位置は変異されておらず、よって、野生型I-CreI (配列番号1又は178)又はI-CreI N75足場(配列番号5)の配列にそれぞれ相当する。表IのHBB DNA標的(配列番号6〜19のヌクレオチド配列)を切断するこのようなへテロ二量体I-CreI変異型の例は、以下の配列の対に相当する第1及び第2単量体からなる：それぞれ配列番号123〜135 (第1単量体)と配列番号136〜148 (第2単量体; 図16)。以下の配列の対に相当する第1及び第2単量体からなる変異型(表V、VII、IX、XI及びXII)は、HBB5標的を切断する：配列番号79 (第1単量体)と、配列番号45、56、164〜177、298〜301のいずれか(第2単量体); 配列番号179〜186 (第1単量体)と、配列番号57 (第2単量体); 配列番号179 (第1単量体)と、配列番号197〜208、302〜306のいずれか(第2単量体); 配列番号209〜220、292〜297 (第1単量体)と、配列番号164 (第2単量体); 配列番号213、214、281 (第1単量体)と、配列番号277、278、279又は280 (第2単量体)。さらに、以下の配列の対に相当する第1及び第2単量体からなる変異型(表XVI、XVIII、XX及びXXI)は、HBB8標的を切断する：配列番号104又は114 (第1単量体)と、配列番号82 (第2単量体); 配列番号105又は118 (第1単量体)と、配列番号84、85、88、94及び103のいずれか(第2単量体); 配列番号113又は111 (第1単量体)と、配列番号103 (第2単量体); 配列番号121 (第1単量体)と、配列番号85 (第2単量体); 配列番号118 (第1単量体)と、配列番号231〜255 (第2単量体); 配列番号257〜274 (第1単量体)と、配列番号103 (第2単量体); 配列番号286 (第1単量体)と、配列番号250、236、287、288及び289のいずれか(第2単量体); 配列番号269 (第1単量体)と、配列番号290、236、237又は248のいずれか(第2単量体); 配列番号273 (第1単量体)と、配列番号291、290、242、236及び237のいずれか(第2単量体); 配列番号261 (第1単量体)と、配列番号242、289、287、236及び248のいずれか(第2単量体)。
或いは、ヘテロ二量体変異型は、上記で定義されるアミノ酸置換を含むI-CreI配列からなることができる。後者の場合、記載していない位置は、さらなる変異、例えば上記で定義される1つ又は複数の付加的変異を含み得る。
本発明は、上記で定義される配列と少なくとも85%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性、より好ましくは少なくとも95% (96%、97%、98%、99 %)の同一性を有するI-CreI変異型であって、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的を切断できる変異型を含む。
ヘテロ二量体変異型は、有利には、2つのI-CreI単量体間に分子間相互作用をつくる第1及び第2単量体の残基に対応する興味対象の少なくとも1対の変異を有する偏性(obligate)ヘテロ二量体変異型であり、ここで、上記の対の第1変異は第1単量体中にあり、上記の対の第2変異は第2単量体中にあり、上記の変異の対は各単量体からの機能的ホモ二量体の形成を妨げ、ヒトベータグロビン遺伝子からのゲノムDNA標的を切断できる機能的ヘテロ二量体の形成を可能にする。
偏性ヘテロ二量体を形成するために、単量体は、第1及び第2単量体のそれぞれについて、以下の変異の対の少なくとも1つを有することが有利である：
a) 8位のグルタミン酸の塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンでの置換(第1単量体)、及び7位のリジンの酸性アミノ酸、好ましくはグルタミン酸での置換(第2単量体)；第1単量体は、7位及び96位のリジン残基の少なくとも1つのアルギニンによる置換をさらに含み得る、
b) 61位のグルタミン酸の塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンでの置換(第1単量体)、及び96位のリジンの酸性アミノ酸、好ましくはグルタミン酸での置換(第2単量体)；第1単量体は、7位及び96位のリジン残基の少なくとも1つのアルギニンによる置換をさらに含み得る、
c) 97位のロイシンの芳香族アミノ酸、好ましくはフェニルアラニンでの置換(第1単量体)、及び54位のフェニルアラニンの小さいアミノ酸、好ましくはグリシンでの置換(第2単量体)；第1単量体は、54位のフェニルアラニンのトリプトファンによる置換をさらに含むことができ、第2単量体は、58位のロイシン又は57位のリジンのメチオニンによる置換をさらに含み得る、
d) 137位のアスパラギン酸の塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンでの置換(第1単量体)、及び51位のアルギニンの酸性アミノ酸、好ましくはグルタミン酸での置換(第2単量体)。
例えば、第1単量体は変異D137Rを、第2単量体は変異R51Dを有し得る。偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼは、有利には、上記のa)、b)、c)又はd)で定義される変異の少なくとも2対を含む。変異の対のうちの1つは、有利にはc)又はd)で定義されるとおりである。好ましくは、一方の単量体は、7位及び96位のリジン残基の酸性アミノ酸(アスパラギン酸(D)又はグルタミン酸(E))、好ましくはアスパラギン酸(K7E及びK96E)による置換を含み、他方の単量体は、8位及び61位のグルタミン酸残基の塩基性アミノ酸(アルギニン(R)又はリジン(K)；例えばE8K及びE61R)による置換を含む。より好ましくは、偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼは、上記のa)、b)及びc)で定義される変異の3対を含む。偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼは、有利には、(i) E8R、E8K又はE8H、E61R、E61K又はE61H及びL97F、L97W又はL97Y; (ii) K7R、E8R、E61R、K96R及びL97F、或いは(iii) K7R、E8R、F54W、E61R、K96R及びL97Fと、(iv) K7E又はK7D、F54G又はF54A及びK96D又はK96E; (v) K7E、F54G、L58M及びK96E、或いは(vi) K7E、F54G、K57M及びK96Eの変異を少なくとも有する第2単量体(B)とからなる。例えば、第1単量体は、変異K7R、E8R又はE8K、E61R、K96R及びL97F、或いはK7R、E8R又はE8K、F54W、E61R、K96R及びL97Fを有し、第2単量体は、変異K7E、F54G、L58M及びK96E又はK7E、F54G、K57M及びK96Eを有し得る。偏性ヘテロ二量体は、上記で定義される少なくとも1つのNLS及び／又は1つのタグを有し得る。上記のNLS及び／又はタグは、第1及び／又は第2単量体にあり得る。
本発明の主題は、上記で定義されるI-CreI変異型に由来する単鎖キメラメガヌクレアーゼ(融合タンパク質)でもある。単鎖メガヌクレアーゼは、2つのI-CreI単量体、2つのI-CreIコアドメイン(I-CreIの6位〜94位)、又はこれら両方の組み合わせを含み得る。好ましくは、2つの単量体/コアドメイン又はこれら両方の組み合わせは、ペプチドリンカーにより連結される。
本発明の主題は、上記で定義される変異型又は単鎖キメラメガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドフラグメントでもある。上記のポリヌクレオチドは、ホモ二量体若しくはヘテロ二量体の変異型の1つの単量体、又は単鎖キメラメガヌクレアーゼの2つのドメイン/単量体をコードし得る。
本発明の主題は、本発明による変異型又は単鎖メガヌクレアーゼの発現のための組換えベクターでもある。組換えベクターは、上記で定義される変異型又は単鎖メガヌクレアーゼをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドフラグメントを含む。好ましい実施形態において、上記のベクターは、それぞれがヘテロ二量体変異型の単量体の一方をコードする2つの異なるポリヌクレオチドフラグメントを含む。
本発明において用い得るベクターは、限定されないが、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、或いは染色体、非染色体、半合成又は合成の核酸からなり得る線状若しくは環状のDNA又はRNA分子を含む。好ましいベクターは、自律複製できるもの(エピソームベクター)及び／又は連結された核酸の発現を可能にするもの(発現ベクター)である。多数の適切なベクターが当業者に知られ、商業的に入手可能である。
ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス(例えばアデノ随伴ウイルス)、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えばオルトミクソウイルス(例えばインフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例えば狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス)、パラミクソウイルス(例えば麻疹及びセンダイ)、プラス鎖RNAウイルス、例えばピコルナウイルス及びアルファウイルス、並びにアデノウイルス、ヘルペスウイルス(例えば単純ヘルペスウイルス1及び2型、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス)及びポックスウイルス(例えばワクシニア、鶏痘及びカナリア痘)を含む二本鎖DNAウイルスを含む。その他のウイルスは、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス及び肝炎ウイルスを含む。レトロウイルスの例は、トリ白血病肉腫、哺乳類C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプマウイルスを含む(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, 第3版, B. N. Fieldsら編, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996)。
好ましいベクターは、レンチウイルスベクター、特に自己不活化レンチウイルスベクター(self inactivacting lentiviral vectors)を含む。
ベクターは、選択マーカー、例えば真核細胞培養についてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ及びヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；エス・セレビシエ(S. cerevisiae)についてTRP1；大腸菌(E. coli)においてテトラサイクリン、リファンピシン又はアンピシリン耐性を含み得る。
好ましくは、上記のベクターは、本発明の変異型／単鎖メガヌクレアーゼをコードする配列が、適切な転写及び翻訳制御要素の制御下に位置して、該変異型の生成又は合成を許容する発現ベクターである。よって、上記のポリヌクレオチドは、発現カセットに含まれる。より具体的には、該ベクターは、複製起点、該コードポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーター、リボソーム結合部位、RNAスプライシング部位(ゲノムDNAを用いる場合)、ポリアデニル化部位、及び転写終結部位を含む。これは、エンハンサーも含み得る。プロモーターの選択は、ポリペプチドが発現される細胞に依存する。好ましくは、変異型がヘテロ二量体である場合、各単量体をコードする2つのポリヌクレオチドは、両方のポリヌクレオチドの発現を同時に駆動し得る1つのベクターに含まれる。適切なプロモーターは、組織特異的及び／又は誘導性プロモーターを含む。誘導性プロモーターの例は、重金属のレベルの増加により誘導される真核メタロチオネインプロモーター、イソプロピル-β-D-チオガラクト-ピラノシド(IPTG)に応答して誘導される原核lacZプロモーター、及び温度の増加により誘導される真核熱ショックプロモーターである。組織特異的プロモーターの例は、骨格筋クレアチンキナーゼ、前立腺特異的抗原(PSA)、α-アンチトリプシンプロテアーゼ、ヒトサーファクタント(SP)タンパク質A及びB、β-カゼイン及び酸性ホエータンパク質遺伝子である。
上記のベクターの別の有利な実施形態によると、これは、上記で定義されるゲノムDNA切断部位を取り囲む領域と相同性を有する配列を含むターゲティング構築物を含む。
例えば、変異型のゲノムDNA切断部位を取り囲む領域と相同性を有する配列は、配列番号4の508位〜707位、651位〜850位、701位〜900位、1048位〜1247位、1147位〜1346位、1524位〜1723位、1599位〜1798位、1808位〜2007位、2084位〜2283位、2094位〜2293位、2245位〜2444位、2323位〜2522位及び2523位〜2722位を含むヒトベータグロビン遺伝子のフラグメントである。
或いは、I-CreI変異型/単鎖メガヌクレアーゼをコードするベクターと、ターゲティング構築物を含むベクターとは、異なるベクターである。
より好ましくは、上記のターゲティングDNA構築物は：
a) 上記で定義されるゲノムDNA切断部位を取り囲む領域と相同性を有する配列と、
b) a)に記載の配列で挟まれた、導入される配列と
を含む。
好ましくは、少なくとも50 bp、好ましくは100 bpを超える、より好ましくは200 bpを超える相同配列が用いられる。よって、ターゲティングDNA構築物は、好ましくは200 pb〜6000 pb、より好ましくは1000 pb〜2000 pbである。実際に、共有されるDNA相同性は、破断の部位の上流及び下流に接する領域に位置し、導入されるDNA配列は、2つの腕の間に位置するべきである。導入される配列は、好ましくは、ゲノム療法のために、興味対象の遺伝子の変異を修復する配列である(遺伝子修正又は機能的遺伝子の回復)。或いは、これは、特定の配列を改変するため、興味対象の遺伝子を減弱若しくは活性化するため、興味対象の遺伝子若しくはその一部分を不活性化又は削除するため、興味対象の部位に変異を導入するため、或いは外因性遺伝子又はその一部分を導入するために用いられる配列を含む、ある特定の様式で染色体DNAを変更させるために用いられる任意のその他の配列であり得る。このような染色体DNAの変更は、ゲノム工学(動物モデル/ヒト組換え株化細胞)のために用いられる。ターゲティング構築物は、2つの相同腕の間にポジティブ選択マーカーと、ついには、第1の相同腕の上流又は第2の相同腕の下流にネガティブ選択マーカーとを含むのが有利である。マーカーは、標的部位にて相同組換えにより興味対象の配列が挿入された細胞の選択を可能にする。
例えば、図16は、HBB遺伝子からの標的、該標的を切断できる変異型、及びそれぞれの標的部位にて切断を修復するための最小マトリクスを示す。
HBB遺伝子を修正するために、遺伝子の切断は、変異の近傍、好ましくは変異から500 bp以内で生じる(図1A)。ターゲティング構築物は、切断を修復するための標的部位に接する少なくとも200 bpの相同配列(最小修復マトリクス)を有し、変異を修復するための変異の領域に相当する野生型ベータ-グロビンの部分をコードする配列を含むHBB遺伝子フラグメントを含む(図1A)。結果として、遺伝子修正のためのターゲティング構築物は、最小修復マトリクスを含むか、又は最小修復マトリクスからなる。これは、好ましくは200 pb〜6000 pb、より好ましくは1000 pb〜2000 pbである。好ましくは、変異型の切断部位が変異(例えばHBB8標的)と重複する場合、修復マトリクスは、HBB遺伝子に上記の切断を誘導するために用いられる変異型により切断されない改変切断部位と、ヒトベータグロビンタンパク質のオープンリーディングフレームを変更しない野生型ヒトベータグロビンをコードする配列を含む。
例えば、図3に示すように、鎌状赤血球病(それぞれHbSS、HbSC及びHbSE)で見出されるHBB遺伝子内のE6V、E6K又はE26K変異を修正するために、上記で定義されるHBB5 DNA標的を切断するヘテロ二量体変異型を、DNA二本鎖破断及び変異の両方の効率的な修復のために、配列番号4の少なくとも1147位〜1346位を含むターゲティング構築物とともに用いることができる。好ましくは、変異型は、表XIIに示すものである：KNTYQS/ARSER+19S+80K+85R+87L+96R+139R (第1単量体；例えば配列番号214)、及びKSPHRS/KYSDT+81T (例えば配列番号277)又はKTSHRS/KYSDT+66H+82R+86S+99R+132V+139R+140A (例えば配列番号279；第2単量体)。
さらに、図3に示すように、鎌状赤血球貧血(HbSS)で見出されるHBB遺伝子内のE6V変異を修正するために、上記で定義されるHBB8 DNA標的を切断するヘテロ二量体変異型を、DNA二本鎖破断及び変異の両方の効率的な修復のために、配列番号4の少なくとも1048位〜1247位を含むターゲティング構築物とともに用いることができる。好ましい変異型は、表XXIに示すものである：
-KNSVHQ/DASKR+87L+131R (例えば配列番号286；第1単量体)及びKNSGKS/KYSNY+19S+117G (例えば配列番号286)、KQTYRS/KYSNY+19S+64I (例えば配列番号288)、KNSGKS/KYSNY+19S+132V (例えば配列番号287)、KQTYRS/KYSNY+54L (例えば配列番号226)又はKQTYRS/KYSNQ+19S (例えば配列番号250、第2単量体)、
- KNSTRQ/DASKR+19S (例えば配列番号269) 第1単量体)及びKQTYRS/KYSNY+105A+152Q (例えば配列番号290), KQTYRS/KYSNY+54L (例えば配列番号236), KQTYRS/QASNR+87L (例えば配列番号237)又はKQTYRS/KYSNI+19S (例えば配列番号248；第2単量体)、
- KNSVRQ/DASKR+19S (例えば配列番号273) 第1単量体)及びKQTYRS/QASNR+87L+58Q (例えば配列番号291)、KQTYRS/KYSNY+105A+152Q (例えば配列番号290)、KNSGKS/KYSNY+132V (例えば配列番号242)、KQTYRS/KYSNY+54L (例えば配列番号236)又はKQTYRS/QASNR+87L (例えば配列番号248；第2単量体)、
- KNSVHQ/DASKR+87L (例えば配列番号261) 第1単量体)及びKNSGKS/KYSNY+132V (例えば配列番号242)、KNSGKS/KYSNY+19S+117G (例えば配列番号289)、KNSGKS/KYSNY+19S+132V (例えば配列番号287)、KQTYRS/KYSNY+54L (例えば配列番号236)又はKQTYRS/KYSNI+19S (例えば配列番号248；第2単量体)。
さらに、HbSEにおいて見出されるHBB遺伝子内のE26K変異を修正するために、HBB6 DNA標的を切断する以下の変異型を、DNA二本鎖破断及び変異の両方の効率的な修復のために、配列番号4の少なくとも1048位〜1247位を含むターゲティング構築物とともに用いることができる：
- 第1単量体：Y33T、Q44D、R68A、R70S、D75K及びI77R (例えば配列番号126)、及び第2単量体：Y33R、Q38T、R68H、R70H及びD75N (例えば配列番号139)。
或いは、機能的遺伝子を回復するために(図1B)、遺伝子の切断は、変異の上流で生じる。好ましくは、上記の変異は、遺伝子の配列内で最初のわかっている変異であり、そのことにより、遺伝子の全ての下流の変異が同時に修正される。よって、切断は、HBB遺伝子の上流、例えば配列番号4の597位(HBB標的配列番号6)、740位(HBB標的配列番号7)、又は790位(HBB標的配列番号8)で生じることが好ましい。図16に示すヘテロ二量体変異型を用いることができる：
* 597位：第1単量体：N30S, Y33G, Q44D, R68N, R70S及びD75N (例えば配列番号123)、及び第2単量体：Y33T, Q38A, R70S, D75Y及びI77R (例えば配列番号136)、
* 597位：第1単量体：N30D, Y33R, R70S及びD75N (例えば配列番号124)、及び第2単量体：S32G, Y33T, Q44A, R70G及びD75N (例えば配列番号137)、
* 790位：第1単量体：S32D, Q38C, R70S及びI77K (例えば配列番号125)、及び第2単量体: S32D, Q38C, R70S及びD75N (例えば配列番号138)。
ターゲティング構築物は、フレーム内で融合された(cDNAでのように)切断部位の下流にあって、3'における転写を停止するためのポリアデニル化部位を有するエキソンを含む。導入される配列(エキソンノックイン構築物)は、切断部位を取り囲むイントロン又はエキソンの配列で挟まれており、そのことにより、機能的タンパク質をコードできるmRNAへの工学的操作遺伝子(エキソンノックイン遺伝子)の転写を可能にする(図1B)。例えば、エキソンノックイン構築物は、上記で定義される最小修復マトリクスからの、切断部位の上流及び下流の配列により挟まれる。
ノックイン動物/細胞を作製するために、ターゲティングDNA構築物は、以下のものを含む：切断を修復するための標的部位に接する少なくとも200 bpの相同配列を有するHBB遺伝子フラグメントと、興味対象の外因性遺伝子の配列と、結局は、HPRT遺伝子のような選択マーカー。
配列の挿入のために、DNA相同性は、破断の部位のすぐ上流及び下流の領域に一般的に位置する(破断に隣接する配列；最小修復マトリクス)。しかし、挿入が、切断部位に接するORF配列の欠失を伴う場合、共有されるDNA相同性は、欠失の領域の上流及び下流の領域に位置する。
ヒトHBB遺伝子内の改変は、ヒトゲノム療法又はヒト組換え株化細胞の作製を目的として、ヒト細胞に導入される。しかし、これらは、遺伝性ヘモグロビン障害の動物モデルの作製、又はメガヌクレアーゼにより誘発される相同組換えによる変異の修正を研究するために、内因性HBB遺伝子が欠失され(ノックアウト)、正常又は変異ヒトHBB遺伝子がゲノム内のどこかの場所に導入された(トランスジェニック)か又は内因性HBB遺伝子座に特異的に導入された(ノックイン)ヒト化細胞にも導入され得る。遺伝性ヘモグロビン障害のマウスモデルは当該技術において公知であり、例えばSCAマウスを含む(Pasztyら, Science 1997, 278, 876〜878; Ryanら, Science, 1997, 278, 873〜876; Changら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 14886〜14890)。
本発明の主題は、上記で定義されるターゲティングDNA構築物でもある。
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも1つのメガヌクレアーゼ(変異型又は単鎖誘導キメラメガヌクレアーゼ)及び／又は上記で定義される、上記のメガヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの発現ベクターを含むことを特徴とする組成物でもある。
上記の組成物の好ましい実施形態において、これは、上記で定義されるターゲティングDNA構築物を含む。
好ましくは、上記のターゲティングDNA構築物は、組換えベクターに含まれるか、又は本発明によるメガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに含まれる。
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも1つのメガヌクレアーゼ及び／又は1つの発現ベクターの、必要とする個体における上記で定義されるベータグロビン遺伝子内の変異により引き起こされる病変状態を予防、改善又は治癒するための医薬品の製造のための使用でもある。
好ましくは、上記の病変状態は、鎌状赤血球病(鎌状赤血球貧血、ヘモグロビンSC、ヘモグロビンSE)及びベータ-サラセミアからなる群より選択される。
メガヌクレアーゼの使用は、(a) ドナー／個体の体組織に、該メガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識及び切断部位を含むベータグロビン遺伝子の興味対象部位にて、該切断部位と該メガヌクレアーゼとを接触させることにより二本鎖切断を誘導し、(b) 上記で定義されるように、(1) 切断部位を取り囲む領域と相同性を有するDNAと(2) ターゲティングDNAと染色体DNAの間の組換えによりベータグロビン遺伝子を修復するDNAとを含むターゲティングDNAを前記体組織に導入する工程を少なくとも含み得る。ターゲティングDNAは、興味対象部位へのターゲティングDNAの導入に適する条件下で体組織に導入される。ターゲティング構築物は、ヒトベータグロビン遺伝子を欠失させる配列と、ついには、興味対象の外因性遺伝子の配列を含み得る(遺伝子置き換え)。
本発明によると、上記の二本鎖切断は、疾患の個体からの体細胞(造血幹細胞)へメガヌクレアーゼを導入し、次いで、改変された細胞を疾患の個体に移植して戻すことによりエクスビボで誘発してよい。
本発明の主題は、必要とする個体において、ベータグロビン遺伝子内の変異により引き起こされる病変状態を予防、改善又は治癒するための方法でもあり、該方法は、前記個体に、任意の手段により上記で定義される組成物を投与する工程を少なくとも含む。
本発明の主題は、さらに、上記で定義されるメガヌクレアーゼ、好ましくは発現ベクターに含まれる1つ又は2つのポリヌクレオチドの、非治療目的でのヒトベータグロビン遺伝子のゲノム工学のための使用である。ヒトベータグロビン遺伝子は、ヒト内因性HBB遺伝子(ヒトHBB遺伝子遺伝子座；ヒト組換え細胞作製)、又は動物、例えばマウスに挿入された導入遺伝子(遺伝性ヘモグロビン障害の動物モデル)であり得る。
上記の使用の有利な実施形態によると、これは、ゲノムDNA標的配列を含むベータグロビン遺伝子の興味対象部位内に2本鎖破断を誘発することにより、DNA組換え事象、DNA欠失又は細胞死を誘発するためである。
本発明によると、上記の二本鎖破断は、ヒトベータグロビン遺伝子内の特定の配列を修復するため、ヒトベータグロビン遺伝子内の特定の配列を改変するため、変異された遺伝子の代わりに機能的ヒトベータグロビン遺伝子を回復するため、ヒトベータグロビン遺伝子を減弱若しくは活性化するため、ヒトベータグロビン遺伝子の興味対象部位に変異を導入するため、外因性遺伝子若しくはその一部分を導入するため、ヒトベータグロビン遺伝子若しくはその一部分を不活性化又は欠失させるため、染色体腕を転座させるため、或いはDNAを修復されないままにして分解させるためである。
上記の使用の別の有利な実施形態によると、上記の変異型、ポリヌクレオチド、ベクターは、上記で定義されるターゲティングDNA構築物と会合される(are associated with)。
本発明によるメガヌクレアーゼの使用の第1の実施形態において、これは、以下の工程を含む：1)二本鎖破断を、該メガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識及び切断部位を含むヒトベータグロビン遺伝子の興味対象部位にて、該切断部位を該メガヌクレアーゼと接触させることにより導入し；2)標的遺伝子座と相同性を有する配列で挟まれた、導入される配列を含むターゲティングDNA構築物を提供する。上記のメガヌクレアーゼは、細胞に直接、又は該メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、用いられる細胞におけるその発現に適切な発現ベクターにより提供され得る。このストラテジーは、DNA配列を標的部位に導入して、例えば、タンパク質生産、遺伝子機能研究、薬剤の開発(薬剤のスクリーニング)のために、又は遺伝性ヘモグロビン障害モデル(疾患、及びメガヌクレアーゼ誘発相同性組換えによる変異の修正の研究)として用いることができるノックイン若しくはトランスジェニック動物又は組換えヒト株化細胞を作製するために用いられる。
本発明によるメガヌクレアーゼの使用の第2の実施形態において、これは、以下の工程を少なくとも含む：1) 二本鎖破断を、該メガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識及び切断部位を含むヒトベータグロビン遺伝子の興味対象部位にて、該切断部位を該メガヌクレアーゼと接触させることにより導入し；2)該破断されたゲノム遺伝子座を、切断部位を取り囲む領域と相同性を有する染色体DNAとの相同組換えに適する条件下に維持する。
本発明によるメガヌクレアーゼの使用の第3の実施形態において、これは、以下の工程を少なくとも含む：二本鎖破断を、該メガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識及び切断部位を含むヒトベータグロビン遺伝子の興味対象部位にて、該切断部位を該メガヌクレアーゼと接触させることにより導入し；2)該破断されたゲノム遺伝子座を、非相同末端結合による二本鎖破断の修復のために適切な条件下に維持する。
本発明の主題は、正常／変異ヒトHBB遺伝子を含むヒト化マウスに由来する改変マウス(ノックインマウス)を作製する方法でもあり、該方法は少なくとも以下の工程を含む：
(a) 上記のヒト化マウスの多能性前駆細胞又は胚に、上記で定義されるメガヌクレアーゼを導入して、該メガヌクレアーゼのDNA認識及び切断部位を含むヒトHBB遺伝子の興味対象部位に二本鎖切断を誘発し、同時に又は連続的に、
(b) 工程(a)のマウス前駆細胞又は胚に、(1) 切断部位を取り囲む領域と相同性を有するDNAと、(2) ターゲティングDNAと染色体DNAとの組換えの際に興味対象部位を修復するDNAとを含むターゲティングDNAを導入することにより、相同組換えにより興味対象部位が修復されたゲノム改変マウス前駆細胞又は胚を作製し、
(c) 工程(b)のゲノム改変マウス前駆細胞又は胚を、キメラマウスに発達させ、
(d) 工程(c)のキメラマウスからトランスジェニックマウスを誘導する。
好ましくは、工程(c)は、工程(b)で作製されたゲノム改変前駆細胞を、キメラマウスを作製するように、胚盤胞へ導入することを含む。
本発明の主題は、少なくとも以下の：
(a) ヒト細胞に、上記で定義されるメガヌクレアーゼを導入して、該メガヌクレアーゼのDNA認識及び切断部位を含むヒトグロビン遺伝子の興味対象部位に二本鎖切断を誘発し、同時に又は連続的に、
(b) 工程(a)の細胞に、(1) 切断部位を取り囲む領域と相同性を有するDNAと、(2) ターゲティングDNAと染色体DNAとの組換えの際に興味対象部位を修復するDNAとを含むターゲティングDNAを導入して、相同組換えにより興味対象部位が修復された組換えヒト細胞を作製し、
(c) 任意の適切な手段により、工程(b)の組換えヒト細胞を単離する
工程を含む、組換えヒト細胞を作製する方法でもある。
ターゲティングDNAは、細胞内に、ターゲティングDNAを興味対象部位に導入するのに適する条件下で導入される。
好ましい実施形態において、上記のターゲティングDNA構築物は、ベクターに挿入される。
改変される細胞は、興味対象のいずれの細胞であってもよい。ノックイン／トランスジェニックマウスを作製するために、細胞は、当該技術において公知の胚由来幹(ES)細胞のような多能性前駆細胞である。組換えヒト株化細胞を作製するために、細胞は、PerC6 (Fallauxら, Hum. Gene Ther. 9, 1909〜1917, 1998)又はHEK293 (ATCC # CRL-1573)細胞であることが有利であり得る。上記のメガヌクレアーゼは、細胞に直接提供できるか、又は該メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、用いられる細胞内でのその発現に適する発現ベクターにより提供できる。
興味対象の異種タンパク質を発現するヒト組換え株化細胞／トランスジェニック動物を作製するために、ターゲティングDNAは、興味対象の生成物(タンパク質又はRNA)をコードする配列と、結局は、上記で定義される、切断部位の上流と下流の配列で挟まれたマーカー遺伝子とを含み、そのことにより、相同組換えにより、ヒトベータグロビン遺伝子内に興味対象の外因性配列が組み込まれたゲノム改変細胞(ヒト細胞)が作製される。
興味対象の配列は、ある興味対象のタンパク質／ペプチドをコードする任意の遺伝子であってよく、限定されないが、レポーター遺伝子、受容体、シグナル分子、転写因子、医薬活性タンパク質及びペプチド、疾患原因遺伝子産物及び毒素を含む。配列は、例えばsiRNAを含む興味対象のRNA分子をコードしてもよい。
外因性配列の発現は、内因性ヒトベータグロビンプロモーター又は異種プロモーター、好ましくは上記で定義される構成性若しくは誘導性の遍在性又は組織特異的プロモーターにより駆動され得る。さらに、興味対象の配列の発現は、条件的であり得る。発現は、部位特異的リコンビナーゼ(Cre、FLP・・・)により誘発され得る。
よって、興味対象の配列は、興味対象の遺伝子に機能的に連結された異種プロモーターと、限定されないが(選択)マーカー遺伝子、リコンビナーゼ認識部位、ポリアデニル化シグナル、スプライス受容配列、イントロン、タンパク質検出のためのタグ及びエンハンサーを含む1つ又は複数の機能的配列とを含み得る適切なカセット内に挿入される。
遺伝性ヘモグロビン障害の動物モデルを作製するために、ターゲティングDNAは、切断部位の上流及び下流の配列で挟まれた、正しい／変異ヒトHBB遺伝子配列を含み、そのことにより、HBB遺伝子内の変異が修正された動物、又は変異HBB遺伝子(例えば鎌状グロビン遺伝子)が挿入された動物が作製される。
メガヌクレアーゼは、ポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物のいずれかとして用い得る。これは、特定の種類の細胞に適切な当該技術において公知の任意の簡便な手段により、単独で、又は少なくとも適切なビヒクル若しくはキャリアのいずれか及び／又はターゲティングDNAとともに、マウス細胞に導入される。
本発明による使用の有利な実施形態によると、メガヌクレアーゼ(ポリペプチド)は、以下のものと会合される：
- リポソーム、ポリエチレンイミン(PEI)；このような場合、上記の会合物は投与され、よって、標的体細胞に導入される。
- 膜移送ペプチド(membrane translocating peptides) (Bonetta, The Scientist, 2002, 16, 38; Fordら, Gene Ther., 2001, 8, 1〜4 ; Wadia及びDowdy, Curr. Opin. Biotechnol., 2002, 13, 52〜56)；このような場合、変異型/単鎖メガヌクレアーゼの配列は、膜移送ペプチドの配列と融合される(融合タンパク質)。
本発明による使用の別の有利な実施形態によると、メガヌクレアーゼ(メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド)及び／又はターゲティングDNAは、ベクターに挿入される。ターゲティングDNA及び／又はメガヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターは、種々の方法により細胞に導入できる(例えば注入、直接摂取、発射衝撃、リポソーム、エレクトロポレーション)。メガヌクレアーゼは、発現ベクターを用いて、細胞内で安定的又は一過的に発現させ得る。真核細胞における発現の方法は、当該技術において公知である(Current Protocols in Human Genetics: 12章 「Vectors For Gene Therapy」及び13章「Delivery Systems for Gene Therapy」を参照)。所望により、組換えタンパク質中に、核局在化シグナルを組み込んで、核内でそれが発現されることを確実にすることが好ましい。
一旦細胞内に入ると、メガヌクレアーゼと存在するならばターゲティングDNA及び／又はメガヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターは、細胞質から核内の作用部位まで、細胞により移入又は移送される。
治療目的のために、メガヌクレアーゼと医薬的に許容される賦形剤とは、治療有効量で投与される。このような組み合わせは、投与された量が生理的に重要である場合に、「治療有効量」で投与されるという。作用剤は、その存在が、レシピエントの生理機能に検出可能な変化をもたらす場合に、生理的に重要である。この関係において、作用剤は、その存在が、標的疾患の1つ又は複数の症状の重篤度を低減させ、損傷又は異常のゲノム修正をもたらす場合に、生理的に重要である。
本発明による使用のある実施形態において、メガヌクレアーゼは、本質的に非免疫原性であり、すなわち、ほとんど又は全く有害免疫応答を生じない。この種の有害免疫反応を緩和又は排除するための種々の方法を、本発明に従って用いることができる。好ましい実施形態において、メガヌクレアーゼは、N-ホルミルメチオニンを実質的に含まない。望ましくない免疫反応を回避するその他の様式は、メガヌクレアーゼをポリエチレングリコール(「PEG」)又はポリプロピレングリコール(「PPG」) (好ましくは500〜20,000ダルトンの平均分子量(MW)のもの)とコンジュゲートさせることである。Davisら(US 4,179,337)により記載されるPEG又はPPGとのコンジュゲート形成は、抗ウイルス活性を有する、非免疫原性で、生理活性で水溶性のエンドヌクレアーゼコンジュゲートを提供できる。ポリエチレン--ポリプロピレングリコール共重合体を用いる同様の方法が、Saiferらにより記載される(US 5,006,333)。
本発明は、上記で定義されるポリヌクレオチド又はベクター、好ましくは発現ベクターで改変された原核又は真核宿主細胞にも関する。
本発明は、細胞の全て又は一部分が上記で定義されるポリヌクレオチド又はベクターで改変されたことを特徴とする非ヒトトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物にも関する。
本明細書で用いる場合、細胞とは、原核細胞、例えば細菌細胞、又は真核細胞、例えば動物、植物若しくは酵母細胞のことである。
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも1つのメガヌクレアーゼ変異型の、別のメガヌクレアーゼを作製するための足場としての使用でもある。例えば、新規な第3世代のメガヌクレアーゼを作製する目的で、3回目の突然変異誘発及び選択／スクリーニングを上記の変異型に対して行うことができる。
本発明によるメガヌクレアーゼの異なる使用及び上記のメガヌクレアーゼを用いる方法は、I-CreI変異型、該変異型に由来する単鎖キメラメガヌクレアーゼ、上記で定義される、該変異型若しくは単鎖キメラメガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ベクター、細胞、トランスジェニック植物又は非ヒトトランスジェニック哺乳動物の使用を含む。
本発明によるI-CreI変異型は、少なくとも以下の工程を含む、ヒトベータグロビン遺伝子からのゲノムDNA標的配列を切断できるI-CreI変異型を工学的に作製するための方法により得ることができる：
(a) I-CreIの26位〜40位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第1機能的サブドメイン内に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第1シリーズを構築し、
(b) I-CreIの44位〜77位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第2機能的サブドメイン内に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第2シリーズを構築し、
(c) 工程(a)の第1シリーズから、(i) I-CreI部位の-10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(d) 工程(b)の第2シリーズから、(i) I-CreI部位の-5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(e) 工程(a)の第1シリーズから、(i) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(f) 工程(b)の第2シリーズから、(i) I-CreI部位の+3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(g) 工程(c)及び工程(d)からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を、単一の変異型に組み合わせて、(i) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(iv) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモ二量体I-CreI変異型を得て、及び／又は
(h) 工程(e)及び工程(f)からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を、単一の変異型に組み合わせて、(i) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(iv) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモ二量体I-CreI変異型を得て、
(i) 工程(g)及び(h)で得られた変異型を組み合わせて、ヘテロ二量体を形成し、
(j) ヒトベータグロビン遺伝子からの上記のゲノムDNA標的を切断できる工程(i)からのヘテロ二量体を選択及び／又はスクリーニングする。
上記の工程(c)、(d)、(e)又は(f)の1つは省略できる。例えば、工程(c)を省略する場合、工程(d)は、-10位〜-8位及び-5位〜-3位の両方のヌクレオチドトリプレットが上記のゲノム標的の-10位〜-8位及び-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットでそれぞれ置き換えられ、+3位〜+5位及び+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の-5位〜-3位及び-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列でそれぞれ置き換えられた変異I-CreI部位を用いて行われる。
工程(a)、(b)、(g)、(h)及び(i)は、上記で定義される、DNA標的配列と接触するか又は該DNA標的と直接若しくは間接的に相互作用する他の位置、変異体の結合及び／又は切断特性を改良する位置、或いは機能的ホモ二量体の形成を妨げるか若しくは損なうか、又はヘテロ二量体の形成に好ましい位置での、付加的な変異の導入をさらに含み得る。
当業者に公知の標準的な突然変異誘発法、例えばPCRを用いることにより、変異型又は変異型のプールに対して部位特異的突然変異誘発及び／又はランダム突然変異誘発により付加的な変異を導入してよい。部位特異的突然変異誘発は、上記で定義されるような変異部位を含むオーバーラップフラグメントを、公知のオーバーラップPCR法に従って増幅することにより有利に行うことができる。さらに、図18に示すような多部位特異的突然変異誘発を、変異型又は変異型のプールに対して行うことが有利であろう。
特に、ランダム突然変異誘発は、変異型全体又は変異型の一部分、特に変異型のC-末端半分(80位〜163位)に導入して、興味対象の遺伝子からのDNA標的に対する変異体の結合及び／又は切断特性を改良できる。変異体の結合及び／又は切断特性を改良する位置、例えば19位、54位、80位、87位、105位及び／又は132位での部位特異的突然変異誘発を、ランダム突然変異誘発と組み合わせることもできる。突然変異誘発は、当該技術において公知であり商業的に入手可能な標準的な突然変異誘発方法に従って、ランダム／部位特異的突然経に誘発ライブラリーを変異型のプールに対して作製することにより行うことができる。
好ましくは、突然変異誘発は、工程(i)で形成されるか又は工程(j)で得られるヘテロ二量体の一方の単量体に対して、有利には、単量体のプールに対して、好ましくは工程(i)又は(j)のへテロ二量体の両方の単量体に対して行われる。
好ましくは、Arnouldら, J. Mol. Biol., Epub 2007年5月10日の図4に記載される方法に従って、少なくとも2回の選択／スクリーニングを行う。1回目において、ヘテロ二量体の一方の単量体(図4の単量体Y)に突然変異を誘発し、他方の単量体(図4の単量体X)と同時発現させてヘテロ二量体を形成し、改良単量体Y+を、興味対象遺伝子からの標的に対して選択する。2回目において、他方の単量体(単量体X)に突然変異を誘発し、改良単量体Y+と同時発現させてヘテロ二量体を形成し、興味対象遺伝子からの標的に対して選択して、改良された活性を有するメガヌクレアーゼ(X+ Y+)を得る。突然変異誘発は、上記で定義される、単量体又は単量体のプールに対するランダム突然変異誘発又は部位特異的突然変異誘発であり得る。両方の型の突然変異誘発は、組み合わせることが有利である。1つ又は両方の単量体に対してさらなる回の選択／スクリーニングを行って、変異型の切断活性を改良できる。
本発明による方法により得ることができる改良されたメガヌクレアーゼの切断活性は、元のメガヌクレアーゼのものとの比較により、レポーターベクターを用いて、酵母又は哺乳動物細胞での直列反復組換えアッセイにより測定できる。レポーターベクターは、酵母又は哺乳動物発現ベクター中にクローニングされた介在配列内に、レポーター遺伝子の2つの切断された非機能的コピー(直列反復)と、ゲノムDNA標的配列とを含む。メガヌクレアーゼの発現が、ゲノムDNA標的配列の切断をもたらす。この切断は、直列反復同士の相同組換えを誘発し、機能的レポーター遺伝子(例えばLacZ)をもたらし、この発現は、適切なアッセイによりモニターできる。元のメガヌクレアーゼと比較して、より強いシグナルが、改良されたメガヌクレアーゼを用いて観察される。或いは、そのゲノムDNA標的に対する改良されたメガヌクレアーゼの活性は、同じゲノム遺伝子座にて、哺乳動物細胞での染色体アッセイ(Arnouldら, J. Mol. Biol., 2007, 371, 49〜65)を用いて、I-CreI部位に対するI-CreIのものと比較できる。
工程(g)及び(h)における変異の(分子内)組み合わせは、公知のオーバーラップPCR法に従って、2つのサブドメインのそれぞれを含むオーバーラップフラグメントを増幅することにより行ってよい。
工程(i)における変異型の(分子間)組み合わせは、工程(g)からの1つの変異型を、工程(h)からの1つの変異型と同時発現させて、ヘテロ二量体の形成を可能にすることにより行われる。例えば、宿主細胞を、該変異型をコードする1つ又は2つの組換え発現ベクターで改変できる。次いで、国際PCT出願WO 2006/097854及びArnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458に以前に記載されたようにして、細胞を、変異型の発現を可能にする条件下で培養することにより、宿主細胞内でヘテロ二量体が形成される。
工程(c)、(d)、(e)、(f)及び／又は(j)における選択及び／又はスクリーニングは、国際PCT出願WO 2004/067736、Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458, Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜2962及びChamesら, Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178に記載されるような、インビトロ又はインビボでの切断アッセイを用いて行うことができる。
上記の方法の別の有利な実施形態によると、工程(c)、(d)、(e)、(f)及び／又は(j)は、インビボで、変異型により作製された変異DNA標的配列内の2本鎖破断が、ポジティブ選択マーカー若しくはレポーター遺伝子の活性化、又はネガティブ選択マーカー若しくはレポーター遺伝子の不活性化を、該DNA 2本鎖破断の組換え媒介修復により導く条件下で行われる。
本発明の主題は、本発明に従う、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的を切断できる変異型を工学的に作製するために有用なI-CreIの26位〜40位及び／又は44位〜77位に変異を有するI-CreI変異型でもある。特に、本発明は、表II、III、VI、VIII、X、XIII、XIV、XVII及びXIXの変異型を含む、上記で定義されるI-CreI変異型を工学的に作製するための方法の工程(c)〜(f)で定義されるI-CreI変異型を包含する。本発明は、配列番号38〜76、80〜122、163、223〜230の配列の変異型(表II、III、VI、XIII、XIV及びXVIIの組み合わせた変異型)を含む、上記で定義されるI-CreI変異型を工学的に作製するための方法の工程(g)及び(h)で定義されるI-CreI変異型も包含する。
興味対象の遺伝子からのDNA標的を切断できる単鎖キメラメガヌクレアーゼは、当該技術において公知の方法により、本発明による変異型から導かれる(Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜62; Chevalierら, Mol. Cell., 2002, 10, 895〜905; Steuerら, Chembiochem., 2004, 5, 206〜13; 国際PCT出願WO 03/078619及びWO 2004/031346)。このような方法はいずれも、本発明で定義される変異型に由来する単鎖キメラメガヌクレアーゼを構築するために用いることができる。
本発明で定義される変異型をコードするポリヌクレオチド配列は、当業者に知られる任意の方法により調製できる。例えば、これらは、cDNA鋳型から、特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応により増幅される。好ましくは、上記のcDNAのコドンは、所望の発現系における上記のタンパク質の発現に好ましいように選択される。
上記のポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、公知の組換えDNA及び遺伝子工学の技術により得て、宿主細胞に導入できる。
本発明で定義されるI-CreI変異型又は単鎖誘導体は、上記で定義されるポリペプチドを発現させることにより生成される。好ましくは、該ポリペプチドは、ポリペプチドの発現又は同時発現に適する条件下で、1つの発現ベクター又は2つの発現ベクター(変異型のみの場合)により改変された宿主細胞又はトランスジェニック動物／植物で、発現又は同時発現(変異型のみの場合)され、変異型又は単鎖誘導体は、宿主細胞培養又はトランスジェニック動物／植物から回収される。
本発明の実行は、そうでないと記載しない限り、当該技術の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA及び免疫学の通常の技術を用いる。このような技術は、文献に充分に説明されている。例えばCurrent Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, (Sambrookら, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編, 1984); Mullisら、米国特許第4,683,195号; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries及びS. J. Higgins編 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames及びS. J. Higgins編 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson及びM. Simon編, Academic Press, Inc., New York)のシリーズ, 特に第154巻及び第155巻(Wuら編)並びに第185巻「Gene Expression Technology」(D. Goeddel編); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller及びM. P. Calos編, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer及びWalker編, Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, 第I〜IV巻(D. M. Weir及びC. C. Blackwell編, 1986); 並びにManipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)を参照されたい。
上記の特徴に加えて、本発明は、I-CreIメガヌクレアーゼ変異型及び本発明によるそれらの使用、本発明に記載される、異なる配列をまとめた表XXIIに言及する実施例、並びに添付の図面に言及する以下の記載から明らかになるその他の特徴をさらに含む。添付の図面において：
- 図1は、メガヌクレアーゼ誘発組換えによる機能的遺伝子の回復のための2つの異なるストラテジーを説明する。A. 遺伝子修正。変異はHBB遺伝子内で生じる。メガヌクレアーゼによる切断及び修復マトリクスを用いる組換えの際に、有害変異が修正される。B. エキソン配列ノックイン。変異はHBB遺伝子内で生じる。変異mRNA転写産物は、遺伝子の下に強調する。修復マトリクスにおいて、切断部位の上流に位置するエキソンは、フレーム内で(cDNAでのように) 3'の転写を停止するポリアデニル化部位と融合される。イントロン及びエキソン配列は、相同領域として用いることができる。エキソン配列ノックインは、機能的HBB遺伝子をコードできるmRNAに転写される工学的操作遺伝子をもたらす。
- 図2は、ホーミングエンドヌクレアーゼのモジュール性の構造と、再設計されたホーミングエンドヌクレアーゼを作製するためのコンビナトリアルアプローチを説明する。A. そのDNA標的と結合したI-CreIホーミングエンドヌクレアーゼの3次元構造。触媒コアは、DNA主溝の上にサドル形の相互作用界面を形成する2つのαββαββα折り畳みで囲まれる。B. 非パリンドロームのキメラ標的を切断するヘテロ二量体又は単鎖融合分子を得るための(右下)I-CreI標的配列に由来する異なる結合配列(右上及び左下)。C. より小さい独立サブユニット、すなわち単一単量体又はαββαββα折り畳み内のサブユニット(右上及び左下)の同定により、同じ単量体内の変異の組み合わせにより、新規なキメラ分子の設計(右下)が可能になる。このような分子は、パリンドロームキメラ標的(右上)を切断する。D. 2つの前の工程の組み合わせにより、4つの異なるサブドメインを含む、より大きいコンビナトリアルアプローチが可能になる。局所的に特性が改変されたI-CreI誘導体の大きいコレクションが作製される。第1工程において、新規なメガヌクレアーゼの対を、切断したい標的に由来するパリンドローム標的を切断する新しいホモ二量体タンパク質に組み合わせる(同じ単量体内の変異の組み合わせにより；「ハーフメガヌクレアーゼ」) 。次いで、このような「ハーフメガヌクレアーゼ」の組み合わせは、興味対象の標的を切断するヘテロ二量体種をもたらし得る(カスタムメガヌクレアーゼ)。つまり、それぞれのサブドメインについての少数の新しく切断するものを同定することにより、特異性が完全に再設計された非常に多数の新規なエンドヌクレアーゼの設計が可能になる。
- 図3は、ヒトHBB遺伝子のゲノム遺伝子座を示す。ヒトHBB遺伝子(アクセッション番号NT_009237.17; 1606 bp; 配列番号3)は、4080 bpフラグメント(配列番号4)に含まれる。エキソン配列は、それらの連結部とともに灰色の箱で示す。HBB5、HBB6及びHBB8標的は、それらの配列及び位置とともに示す。HBB8標的は、鎌状赤血球貧血に導く天然HBB6配列の変異バージョンである。グルタミン酸残基をバリンに変更する変異(AからTへの転換)を示す。
- 図4は、HBB5標的配列及びその誘導体を示す。全ての標的は、I-CreIにより切断されるパリンドローム配列であるC1221標的と整列させる。10GGT_P、10AAG_P、5CCT_P及び5AGG_Pは、I-CreI変異体により切断されることが見出された近縁の誘導体である。これらは、C1221とは箱で囲んだモチーフが異なる。C1221、10GGT_P、10AAG_P、5CCT_P及び5AGG_Pは、24 bp配列として最初は記載したが、構造データは、22 bpだけがタンパク質／DNA相互作用に関係することを示唆する。しかし、±12位を、括弧内に示す。HBB5は、ヒトHBB遺伝子内に、1237位〜1258位に位置するDNA配列である(図3)。HBB 5.3は、HBB5の右部分に由来するパリンドローム配列であり、HBB5.4は、HBB 5の左部分に由来するパリンドローム配列である。図に示すように、10GGT_P、10AAG_P、5CCT_P及び5AGG_Pからの箱で囲んだモチーフは、標的のHBB5シリーズで見出される。
- 図5は、HBB6/HBB8標的配列及びそれらの誘導体を示す。全ての標的は、I-CreIにより切断されるパリンドローム配列であるC1221標的と整列させる。10AGA_P、10TGA_P、5TCT_P及び5CCT_Pは、I-CreI変異体により切断されることが見出された近縁の誘導体である。これらは、C1221とは箱で囲んだモチーフが異なる。C1221、10AGA_P、10TGA_P、5TCT_P及び5CCT_Pは、24 bp配列として最初は記載したが、構造データは、22 bpだけがタンパク質／DNA相互作用に関係することを示唆する。しかし、±12位を、括弧内に示す。HBB6は、ヒトHBB遺伝子内に、1138位〜1159位に位置する天然標的である(図3)。これもまたヒトHBB遺伝子内に、1138位〜1159位に位置するHBB8は、鎌状赤血球貧血の原因であるAからTへの転換を、1148位に含む(図3)。HBB 8.2標的において、標的の中ほどの配列が、C1221で見出される塩基で置き換えられる。HBB8.3は、HBB8の右部分に由来するパリンドローム配列であり、HBB8.4は、HBB8の左部分に由来するパリンドローム配列である。HBB 8.5及びHBB8.6は、HBB 8のそれぞれ左部分及び右部分に由来し、中ほどにCCAC配列を有するパリンドローム配列である。HBB 6.5及びHBB6.6は、HBB 6のそれぞれ左部分及び右部分に由来し、中ほどにCCTC配列を有するパリンドローム配列である。図に示すように、10AGA_P、10TGA_P、5TCT_P及び5CCT_Pからの箱で囲んだモチーフは、標的のHBB6/HBB8シリーズで見出される。
- 図6は、コンビナトリアル変異体によるHBB5.3の切断を説明する。この図は、HBB5.3標的を用いるI-CreIコンビナトリアル変異体の1次スクリーニングの例を示す。上のフィルタにおいて、C8、F10、H5及びH6の位置の陽性変異体(箱で囲む)の配列は、それぞれKDSRQS/DASKR、KNSHQS/KYSDT、KKSAQS/KYSDT及びKKSAQS/RYSNQである(表IIと同じ命名法)。下のフィルタにおいて、C6、C8及びE1の位置の陽性変異体(箱で囲む)の配列は、それぞれKNSSKS/KYSDT、KNSRRS/KSSNV及びKKSTQS/RYSNQである。H10、H11、H12は、異なる強度の陽性対照である。
- 図7は、コンビナトリアル変異体によるHBB 5.4の切断を説明する。この図は、HBB5.4標的を用いるI-CreIコンビナトリアル変異体の1次スクリーニングの例を示す。上のフィルタにおいて、A9、D4及びH3の位置の陽性変異体(箱で囲む)の配列は、それぞれKGSYQS/RYSET、KNSYQS/ARSER及びKNQYQS/ARSERである(表IIIと同じ命名法)。下のフィルタにおいて、B6及びB12の位置の陽性変異体(箱で囲む)の配列は、それぞれKQSRQS/ARSER及びKGSYQS/ARSERである。H10、H11、H12は、異なる強度の陽性対照である。
- 図8は、ヘテロ二量体コンビナトリアル変異体によるHBB5.2及びHBB5標的の切断を説明する。A. HBB5.2標的を用いるI-CreI変異体の80の組み合わせの2次スクリーニング。B. HBB 5標的を用いるI-CreI変異体の同じ組み合わせの2次スクリーニング。HBB 5.2標的(パネルA)又はHBB 5標的(パネルB)に対してスクリーニングしたクローンを、垂直方向の箱で示す。
- 図9は、HBB 5標的の切断を示す。HBB5.4を切断する一連のI-CreI N75変異体を最適化し、HBB5.3を切断する2つの変異体と同時発現させた。切断は、HBB5標的を用いて試験する。HBB5の切断が増大した変異体を丸で囲む。示される2つのフィルタにおいて、B2は次のいずれかのヘテロ二量体に相当する：
- 28K30N32T33Y38Q40S44A68R70S75E77R80K96R (KNTYQS/ARSER/80K96R) + KTSHRS/KYSDT (パネルA)、又は
- 28K30N32T33Y38Q40S44A68R70S75E77R80K96R (KNTYQS/ARSER/80K96R) + KNSRRS/KYSDT (パネルB)。H10、H11、H12は、異なる強度の陽性対照である。
- 図10は、コンビナトリアル変異体によるHBB8.3の切断を説明する。この図は、HBB 8.3標的を用いるI-CreIコンビナトリアル変異体の１次スクリーニングの例を示す。上のフィルタにおいて、D3、D4、E5、E7、E10、G3及びG11の位置の陽性変異体(箱で囲む)の配列は、それぞれKTSHRS/KYSNI、KNSSKS/KYSNY、KNSRRS/KYSNY、KNSTRS/KYSNV、KNSGKS/QASNR、KTSHRS/KYSNY、KDSRQS/KYSNYである(表VIと同じ命名法)。下のフィルタにおいて、C9、F6、G3及びH4の位置の陽性変異体(箱で囲む)の配列は、それぞれKNSGKS/KYSNI、KDSRQS/QSSNR、KSSGQS/KYSNY、KNSGRS/KYSNVである(表VIと同じ命名法)。H10、H11、H12は、異なる強度の陽性対照である。
- 図11は、コンビナトリアル変異体によるHBB8.4の切断を説明する。この図は、HBB 8.4標的を用いるI-CreIコンビナトリアル変異体の１次スクリーニングの例を示す。上のフィルタにおいて、A10、A12、B5、B8、C11、E1及びG8の位置の陽性変異体(箱で囲む)の配列は、それぞれKNSSRH/RRSND、KTSGQS/DASKR、KNTCQS/KYSDT、KNETQS/RYSNQ、KNSCTS/KTSDR、KNETQS/DASKR及びKNETQS/DASKRである(表VIIと同じ命名法)。２番目のフィルタにおいて、A4、B2及びG12の位置の陽性変異体(箱で囲む)の配列は、それぞれKNTCQS/KTSDR、KNTTQS/KTSDR及びKNSTQT/RYSNQである(表VIIと同じ命名法)。H10、H11、H12は、異なる強度の陽性対照である。
- 図12は、ヘテロ二量体コンビナトリアル変異体によるHBB8の切断を説明する。A. HBB8.2標的を用いるI-CreI変異体の組み合わせの2次スクリーニング。B. HBB8標的を用いるI-CreI変異体の同じ組み合わせの2次スクリーニング。HBB8.2標的(パネルA)又はHBB8標的(パネルB)に対するスクリーニングで得られた陽性クローンを、丸で示す。
- 図13は、pCLS0542ベクターマップを表す。
- 図14は、pCLS1055ベクターマップを表す。
- 図15は、pCLS1107ベクターマップを表す。
- 図16は、ヒトベータグロビン遺伝子で見出されるメガヌクレアーゼ標的配列、及び該DNA標的を切断できる対応するI-CreI変異型を表す。標的配列に最も近いエキソンと、エキソン接合部を示し(1列及び2列)、DNA標的の配列(3列)を、配列番号4を参照にしてその最初のヌクレオチドとともに表す(4列)。標的部位での切断を修復するための最小修復マトリクスを、その最初のヌクレオチド(始点、7列)及び最後のヌクレオチド(終点、8列)で示す。それぞれのI-CreI変異型の配列は、記載される位置での変異残基により定義する。例えば、図16の最初のヘテロ二量体変異型は、30位、33位、44位、68位、70位及び75位にそれぞれS、G、D、N、S及びNを有する第1単量体と、33位、38位、70位、75位及び77位にそれぞれT、A、S、Y、Rを有する第2単量体とからなる。位置は、I-CreI配列SWISSPROT P05725 (配列番号1)を参照にして示す。I-CreIは、30位、33位、38位、44位、68位、70位、75位及び77位にそれぞれN、Y、Q、Q、R、R、D及びIを有する。
- 図17は、HBB5.3又はHBB5.4標的を切断する最適化I-CreI変異体によるHBB5の切断を説明する。A. HBB5.3配列を切断し、部位特異的突然変異誘発により得られた置換G19Sを有するI_CreI洗練(refined)変異体のHBB5標的に対するヘテロ二量体1次スクリーニングの例。フィルタにおいて、B11、C3、E3、G6、G11、G12、H6及びH9の位置の陽性変異体の配列は、それぞれKTSHRS / KYSDT + 19S、KNSRRS / KYSDT + 19S、KNSRRS / KYSNQ + 19S + 82E、KNSRRS / RYSNQ + 19S、KNSSKS / KYSNQ + 19S、KTSHRS / KYSDT + 19S、KNSSKS / KYSNQ + 19S + 92R、KNSSKS / KYSDR + G19Sである(表Vと同じ命名法)。H10、H11、H12は、異なる強度の陽性対照である。B. HBB5.4標的を切断し、部位特異的突然変異誘発により得られた置換G19Sを有するI_CreI洗練変異体のHBB5標的に対するヘテロ二量体1次スクリーニングの例。フィルタにおいて、陽性変異体の配列は、位置B8についてKNDYQS / ARSER +19S +80K +96R、位置E1についてKNPYQS / ARSER + 19S、位置E11、F6、F11についてKNTYQS / ARSER +19S + 80K、及び位置B10、C2、D5、D7、F7についてKNTYQS / ARSER +19S + 80K + 96Rである(表Vと同じ命名法)。H10、H11、H12は、異なる強度の陽性対照である。
- 図18は、I-CreI変異体の多部位特異的突然変異誘発の原理を説明する。別々のオーバーラップPCR反応の6群を、まず行って、変異G19S、F54L、E80K、V105A、I132Vの挿入に関わる位置の間の配列を含有するI-CreI N75コード配列の内部フラグメントを増幅した。フラグメントの6つのプールを、次いで、精製し、PCRにより組み立てて、異なる変異が組み合わさったI-CreIコード配列を得た。
- 図19は、ランダム突然変異誘発により得られたHBB5.3又はHBB5.4標的を切断する最適化I-CreI変異体によるHBB5の切断を説明する。A. HBB5.3配列を切断するI_CreI洗練変異体のHBB5標的に対するヘテロ二量体スクリーニングの例。フィルタにおいて、HBB5標的の切断の効率が増大した陽性変異体を、丸及び四角で示す。B5、E6及びE10の位置の陽性変異体(四角)の配列は、それぞれKNSRRS / KYSDR+19S+87L+103S +147A、KNSRRS / KYSDR+16L+ 19S +87L +159R、KNSRRS / KYSNQ+ 19S+82E +105A + 162Pである(表Vと同じ命名法)。H10、H11、H12は、異なる強度の陽性対照である。B. HBB5.4配列を切断するI_CreI洗練変異体のHBB5標的に対するヘテロ二量体スクリーニングの例。フィルタにおいて、HBB5標的の切断の効率が増大した陽性変異体を、丸及び四角で示す。E1、F3、G7及びH1の位置の陽性変異体(四角)の配列は、それぞれKNTYQS / ARSER + 19S+ 80K, KNTYQS / ARSER+19S+34R+80K+87L+96R、KNTYQS / ARSER+24V+ 43L+80K+82R +87L+155P、KNTYQS / ARSER+19S+34R+80K+87L+96Rである(表Vと同じ命名法)。H10、H11、H12は、異なる強度の陽性対照である。
- 図20は、多部位特異的突然変異誘発により得られたHBB5.3又はHBB5.4標的を切断する最適化I-CreI変異体によるHBB5の切断を説明する。HBB5.3配列を切断するI_CreI洗練変異体のHBB5標的に対するヘテロ二量体スクリーニングの例。フィルタにおいて、HBB5標的の切断の効率が増大した陽性変異体を、丸及び四角で示す。A1、A8、D3及びH7の位置の陽性変異体(四角)の配列は、それぞれKNSRRS / KYSNQ +19S+80K +132V、KNSRRS / KYSDR+ 19S +105A+132V+159E+160E、KSSHRS / KYSDQ +105A+132V、KSSHRS / KYSNQ +19S+80K (表Vと同じ命名法)。H10、H11、H12は、異なる強度の陽性対照である。B. HBB5.4配列を切断するI_CreI洗練変異体のHBB5標的に対するヘテロ二量体スクリーニングの例。フィルタにおいて、HBB5標的の切断の効率が増大した陽性変異体を、丸及び四角で示す。C2、C11、D3及びE2の位置の陽性変異体(四角)の例は、それぞれKNSYQS / ARSER +24V+43L+80K+96R、KNTYQS / ARSER + 19S+80K+96R+132V、KNTYQS / ARSER +80K + 96R +132V、KNDYQS/ ARSER +19S+80K+96R +132Vである(表Vと同じ命名法)。H10、H11、H12は、異なる強度の陽性対照である。
- 図21は、CHO哺乳動物細胞におけるHBB5 DNA標的の染色体外切断を説明する。12のヘテロ二量体組み合わせを、それらの切断効率について試験した。試験した最適化変異体の配列を、表XIIに記載する。陰性対照pCLS 1069は、空の発現ベクターである。
- 図22は、HBB8標的の切断を説明する。F54L、F87L、V105A、I132V変異(パネルA)又はG19S及びE80K変異(パネルB)を有し、HBB8.3を切断する一連のI-CreI N75最適化部位特異的変異体を、HBB8.4を切断する1つの変異体と同時発現させる。切断を、HBB8標的を用いて試験する。H10、H11、H12は、異なる強度の陽性対照である。
- 図23は、HBB8.5及びHBB6.5標的の切断の特異性を説明する。F54L、F87L、V105A、I132V変異を有し、HBB8.3を切断する一連のI-CreI N75最適化部位特異的変異体を、ホモ二量体スクリーニングにおいて、HBB8.5標的(パネルA)又はHBB6.5標的(パネルB)の切断の効率について試験した。H10、H11、H12は、異なる強度の陽性対照である。
- 図24は、HBB8標的の切断を説明する。F54L、E80K、F87L、V105A、I132V変異(パネルA)又はG19S変異(パネルB)を有し、HBB8.4を切断する一連のI-CreI N75最適化部位特異的変異体を、HBB8.3を切断する1つの変異体と同時発現させる。切断を、HBB8標的を用いて試験する。H10、H11、H12は、異なる強度の陽性対照である。
- 図25は、HBB8.6及びHBB6.6由来標的の切断の特異性を説明する。F54L、E80K、F87L、V105A、I132V変異を有し、HBB8.4を切断する一連のI-CreI N75最適化部位特異的変異体を、ホモ二量体スクリーニングにおいて、HBB8.6標的(パネルA)又はHBB6.6標的(パネルB)の切断の効率について試験した。H10、H11、H12は、異なる強度の陽性対照である。
- 図26は、CHO哺乳動物細胞におけるHBB由来配列を標的にするメガヌクレアーゼの染色体外切断効率を説明する。19のヘテロ二量体組み合わせを、標的HBB8及びHBB6の切断の効率について比較した。試験した最適化変異体の配列は、表XXIに記載する。陰性対照pCLS 1069は、空の発現ベクターである。
- 図27は、哺乳動物細胞におけるレポーター系を表す。開始コドンの132bp下流にI-SceI切断部位が割り込んだピューロマイシン耐性遺伝子は、EFIαプロモーターの制御下にある(1)。導入遺伝子は、単一コピーでCHO-K1細胞において安定的に発現する。同じ染色体の関係においてメガヌクレアーゼ標的部位を導入するために、修復マトリクスは、i) プロモーターレスハイグロマイシン耐性遺伝子、ii) 完全lacZ発現カセット、及びiii) 相同配列の2つの腕(1.1 kb及び2.3 kb)で構成される。lacZ遺伝子に割り込む認識部位のみが異なるいくつかの修復マトリクスが構築されている(2)。よって、非常に類似の株化細胞が、A1株化細胞、I-SceI株化細胞及びI-CreI株化細胞として生成されている。lacZ修復マトリクス(2kb長)を、認識部位を切断するメガヌクレアーゼを発現するベクターと同時トランスフェクションさせたときに、機能的lacZ遺伝子が回復される(3)。メガヌクレアーゼ誘発組換えのレベルは、トランスフェクション後の青色のコロニー又は増殖巣(foci)の数から推断できる。
- 図28は、HBB8 DNA標的配列を切断するメガヌクレアーゼの染色体切断効率を説明する。LacZ遺伝子の修正の頻度は、HBB8又はHBB6染色体レポーター系を含有するCHOに、修復マトリクスと、最適化HBB8へテロ二量体H3/A4をコードする種々の量のメガヌクレアーゼ発現ベクターとをトランスフェクションした後に検出される(変異体の配列については表XXIを参照されたい)。
- 図29は、ヒトHBB遺伝子座の遺伝子ターゲティングのためのノックインベクターを表す。ヒトゲノムHBB遺伝子座の構造を示す。遺伝子ターゲティングに有用なベクターを記載する。LH及びRHは、相同性の左の腕及び右の腕に相当する。ハイグロマイシン及びガンシクロビルに対するクローンの選択マーカーを示す。マトリクスのHBB6部位の配列の改変を示す。
- 図30は、pCLS1058ベクターマップを表す。
- 図31は、pCLS1069ベクターマップを表す。
これらの実施例は、本発明の主題の説明のためにのみ与えられ、限定を構成するものでないことが明確に理解されるべきである。
実施例1：HBB5.3を切断するメガヌクレアーゼの作製
この実施例は、I-CreI変異体が、パリンドローム形のHBB5標的配列の右部分に由来するHBB5.3 DNA標的配列を切断できることを示す(図4)。この実施例に記載する標的配列は、22 bpのパリンドローム配列である。よって、これらを、最初の11ヌクレオチドと、それに続く接尾辞_Pによってのみ記載する。例えば、標的HBB 5.3は、tggtctcctgt_P (配列番号25)とも記載される。HBB5.3は、5CCT_Pと、±1位、±2位、±3位、±4位、±5位にて類似し、10GGT_Pと、±1位、±2位、±8位、±9位及び±10位にて類似する。±6位、±7位及び±11位は結合及び切断活性に対してほとんど影響しないであろうと仮定した。5CCT_P (caaaaccctgt_P; 配列番号22)を切断できる変異体は、I-CreI N75に対する44位、68位、70位、75位及び77位での突然変異誘発により、Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458及び国際PCT出願WO 2006/097784、WO2006/097853に記載されるようにして以前に得られた。10GGT_P標的(cggtacgtcgt_P; 配列番号20)を切断できる変異体は、I-CreI N75及びD75に対する28位、30位、32位、33位、38位、40位並びに70位での突然変異誘発により得られた(Smithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149及び国際PCT出願WO 2007/049095及びWO 2007/057781)。よって、このような変異の対を組み合わせることにより、HBB 5.3標的の切断が可能になる。タンパク質の両方の組は、70位にて変異させる。しかし、2つの分離可能な機能的サブドメインが存在する(Smithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149並びに国際PCT出願WO 2007/060495及びWO 2007/049156)。このことは、この位置が標的の塩基10〜8における特異性にほとんど影響しないことを包含する。よって、組み合わせた変異体がHBB 5.3標的を切断できるかを確認するために、5CCT_Pを切断するタンパク質からの44位、68位、70位、75位及び77位での変異を、10GGT_Pを切断するタンパク質からの28、30、32、33、38及び40変異と組み合わせた。
1) 材料及び方法
メガヌクレアーゼ変異型を作製する方法、及び特異性が変更された変異型をスクリーニングするために用いられる哺乳類又は酵母細胞での切断誘発組換えに基づくアッセイは、国際PCT出願WO 2004/067736; Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜2962; Chamesら, Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178及びArnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458に記載される。これらのアッセイは、機能的LacZレポーター遺伝子をもたらし、これは、標準的な方法によりモニターできる。
a) 標的ベクターの構築
標的は、次のようにしてクローニングした。ゲートウェイクローニング配列と接する標的配列に相当するオリゴヌクレオチドを、Proligoに注文した：5' tggcatacaagttttggtctcctgtacaggagaccaacaatcgtctgtca 3' (配列番号33)。一本鎖オリゴヌクレオチドのPCR増幅により作製した二本鎖標的DNAを、Gatewayプロトコル(INVITROGEN)を用いて、酵母レポーターベクター(pCLS1055, 図14)にクローニングした。酵母レポーターベクターで、エス・セレビシエFYBL2-7B株(MAT a, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202)を形質転換した。
b) コンビナトリアル変異体の構築
10GGT_P又は5CCT_Pを切断するI-CreI変異体を、10GGT_P又は5CCT_P標的についてそれぞれSmithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149; 国際PCT出願WO 2007/049095、WO 2007/057781及びArnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458; 国際PCT出願WO 2006/097784、WO 2006/097853に以前に記載されたようにして同定した。両方のシリーズからの変異を含有するI-CreI由来コード配列を作製するために、別々のオーバーラップPCR反応を行い、これは、I-CreIコード配列の5'末端(aa 1位〜43位)又は3'末端(39位〜167位)を増幅した。5'及び3'の両方の末端について、PCR増幅を、ベクター(pCLS0542, 図13)に特異的なGal10F (5'-gcaactttagtgctgacacatacagg-3'; 配列番号34)又はGal10R (5'-acaaccttgattggagacttgacc-3'; 配列番号35)プライマーと、アミノ酸39〜43についてのI-CreIコード配列に特異的なプライマー(assF 5'-ctannnttgaccttt-3' (配列番号36)又はassR 5'-aaaggtcaannntag-3' (配列番号37) (ここで、nnnは残基40をコードする)とを用いて行う。同じプライマーと残基40について同じコード配列とを用いて行った増幅反応により得られるPCRフラグメントを、プールした。次いで、プライマーGal10FとassR、又はassFとGal10Rを用いる反応により得られるPCRフラグメントのそれぞれのプールを、等モル比で混合した。最後に、2つのオーバーラップPCRフラグメントのそれぞれの最終プールおよそ25 ngと、NcoI及びEagIでの消化により線状にした75 ngのベクターDNA (pCLS0542)とを用いて、酵母サッカロミセス・セレビシエFYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leuΔ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコル(Gietz及びWoods, Methods Enzymol., 2002, 350, 87〜96)を用いて形質転換した。両方の群の変異を含有するインタクトなコード配列を、酵母でのインビボ相同組換えにより作製する。
c) メガヌクレアーゼ発現クローンの交配及び酵母でのスクリーニング
スクリーニングは、以前に記載されたようにして行った(Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)。交配は、コロニーグリッダー(QpixII, Genetix)を用いて行った。変異体を、YPDプレートを覆うナイロンフィルタ上に、低格子密度(low gridding density) (約4スポット/cm2)を用いてグリッドした。2回目のグリッド手順を同じフィルタ上に行って、それぞれの標的について異なるレポーターを保持する酵母株からなる第2層をスポットした。メンブレンを、固形寒天YPDリッチ培地上に置き、30℃にて一晩インキュベートして、交配を可能にした。次いで、フィルタを、ロイシンとトリプトファンを欠き、ガラクトース(1%)を炭素源として有する合成培地に移し、37℃にて5日間インキュベートして、発現及び標的ベクターを有する二倍体を選択した。5日後に、フィルタを、0.5 Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0中の0.02% X-Gal、0.1% SDS、6%ジメチルホルムアミド(DMF)、7mM β-メルカプトエタノール、1%アガロースを含有する固形アガロース上に置き、37℃にてインキュベートして、β-ガラクトシダーゼ活性をモニターした。結果をスキャンにより分析し、適切なソフトウェアを用いて定量を行った。
d) 変異体の配列決定
変異体発現プラスミドを回収するために、酵母DNAを、標準的なプロトコルを用いて抽出し、大腸菌を形質転換するために用いた。変異ORFの配列決定を、次いで、プラスミドに対して、MILLEGEN SAにより行った。或いは、ORFを、酵母DNAからPCRにより増幅し(Akadaら, Biotechniques, 2000, 28, 668〜670)、配列決定を、PCR生成物に対して直接、MILLEGEN SAにより行った。
2) 結果
I-CreIコンビナトリアル変異体を、44位、68位、70位、75位及び77位での変異を、I-CreI N75又はD75足場での28、30、32、33、38及び40変異と組み合わせることにより構築して、1935の複雑さ(complexity)のライブラリーを得た。組み合わせの例を、表IIに示す。このライブラリーで酵母を形質転換し、3456クローン(多様性の1.8倍)を、HBB 5.3 DNA標的(tggtctcctgt_P; 配列番号25)に対する切断についてスクリーニングした。366個の陽性クローンが見出され、これらは、配列決定及び2次スクリーニングによる確認の後に、176個の異なる新規なエンドヌクレアーゼに相当することがわかった(表IIを参照)。表IIに示す20個の新規なエンドヌクレアーゼは、配列表の配列番号38〜57の配列に相当する。HBB 5.3標的を切断する陽性変異体の例は、図6に示す。
実施例の本文及び図面を通して、コンビナトリアル変異体の配列は、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位及び70位、75位及び77位の残基にちなんだ11文字コードで命名する。例えば、KCSRQS/ KASDIは、I-CreI K28, C30, S32, R33, Q38, S40, K44, A68, S70, D75及びI77 (I-CreI 28K30C32S33R38Q40S44K68A70S75D77I)のことである。親の変異体は、28位、30位、32位、33位、38位及び40位の残基にちなんだ6文字コード、又は44位、68位、70位、75位及び77位の残基にちなんだ5文字コードで命名される。例えば、KCSRQSは、I-CreI K28, C30, S32, R33, Q38及びS40Kのことであり、KASDIは、I-CreI K44, A68, S70, D75及びI77のことである。
Figure 2010534070
実施例2：HBB 5.4を切断するメガヌクレアーゼの作製
この実施例は、I-CreI変異型が、パリンドローム形のHBB5標的の左部分に由来するHBB5.4 DNA標的配列を切断できることを示す(図4)。この実施例に記載する標的配列は、全て22 bpのパリンドローム配列である。よって、これらを、最初の11ヌクレオチドと、それに続く接尾辞_Pによってのみ記載する。例えば、HBB5.4は、caagacagggt_P (配列番号26)とよばれる。HBB5.4は、5AGG_Pと、±1位、±2位、±3位、±4位、±5位、±6位、±7位、±9位、±10位及び±11にて類似し、10AAG_Pと、±1位、±2位、±6位、±7位、±8位、±9位、±10位及び±11にて類似する。±6位及び±11位は結合及び切断活性に対してほとんど影響しないであろうと仮定した。5AGG_Pを切断できる変異体は、I-CreI N75に対する44位、68位、70位、75位及び77位での突然変異誘発により、Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458及び国際PCT出願WO 2006/097784、WO 2006/097853に記載されるようにして得られた。10AAG_P標的を切断できる変異体は、I-CreI N75及びD75に対する28位、30位、32位、33位、38位、40位及び70位での突然変異誘発により、Smithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149並びに国際PCT出願WO 2007/049095及びWO 2007/057781に記載されるようにして得られた。よって、このような変異の対を組み合わせることにより、HBB5.4標的の切断が可能になる。
タンパク質の両方の組は、70位にて変異させる。しかし、2つの分離可能な機能的サブドメインが存在する(Smithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149並びに国際PCT出願WO 2007/060495及びWO 2007/049156)。このことは、この位置が標的の塩基10〜8における特異性にほとんど影響しないことを包含する。よって、組み合わせた変異体がHBB5.4標的を切断できるかを確認するために、5AGG_P (caaaacagggt_P; 配列番号23)を切断するタンパク質からの44位、68位、70位、75位及び77位での変異を、10AAG_P (caagacgtcgt_P; 配列番号21)を切断するタンパク質からの28、30、32、33、38、40変異と組み合わせた。
1) 材料及び方法
25 ngのPCR生成物と、DraIII及びNgoMIVでの消化により線状にした75ngのベクターDNA (pCLS1107, 図15)とを用いて、酵母サッカロミセス・セレビシエFYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコル(Gietz及びWoods 2002)を用いて形質転換した以外は、実施例1を参照されたい。I-CreI変異体についてのインタクトなコード配列を含有する発現プラスミドは、酵母でのインビボ相同組換えにより作製する。
2) 結果
I-CreIコンビナトリアル変異体を、44位、68位、70位、75位及び77位での変異を、 I-CreI N75又はD75足場での28、30、32、33、38及び40変異と組み合わせることにより構築して、920の複雑さを有するライブラリーを得た。コンビナトリアル変異体の例を、表IIIに示す。このライブラリーで酵母を形質転換し、1728クローン(多様性の1.9倍)を、HBB5.4 DNA標的(caagacagggt_P; 配列番号26)に対する切断についてスクリーニングした。25個の陽性クローンが見出され、これらは、配列決定及び2次スクリーニングによる確認の後に、19個の異なる新規なエンドヌクレアーゼであることがわかった(表IIIを参照)。表IIIに示す19個の新規なエンドヌクレアーゼは、配列表の配列番号58〜76の配列に相当する。HBB5.4標的を切断する陽性変異体の例は、図7に示す。
Figure 2010534070
実施例3：HBB5を切断するメガヌクレアーゼの作製
パリンドロームのHBB5由来標的(HBB5.3及びHBB5.4)のそれぞれを切断できるI-CreI変異体を、実施例1及び2において同定した。このような変異体の対(HBB5.3を切断するものとHBB5.4を切断するもの)を、酵母で同時発現させた。同時発現の際に、3つの活性分子種、すなわち2つのホモ二量体と、1つのヘテロ二量体とが存在するはずである。形成されるはずのヘテロ二量体がHBB5.2及びHBB5標的を切断するかをアッセイした。
1) 材料及び方法
a) KanRをマーカーとして有する酵母発現ベクターでの変異体のクローニング
2つのI-CreI変異体を酵母で同時発現させるために、HBB5.4配列を切断する変異体を、カナマイシン耐性遺伝子をマーカーとして有する酵母発現ベクターに(pCLS1107, 図15)にサブクローニングした。変異体を、PCR反応により、pCLS0542及びpCLS1107に共通のプライマーを用いて増幅した：Gal10F 5'-gcaactttagtgctgacacatacagg-3' (配列番号34)及びGal10R 5'-acaaccttgattggagacttgacc-3'(配列番号35)。およそ25 ngのPCRフラグメントと、DraIII及びNgoMIVでの消化により線状にした75 ngのベクターDNA (pCLS1107)とを用いて、酵母サッカロミセス・セレビシエFYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコルを用いて形質転換する。I-CreI変異体についてのインタクトなコード配列を、酵母でのインビボ相同組換えにより作製する。pCLS1107ベクターにサブクローニングしたHBB5.4標的を切断する変異体を含有するそれぞれの酵母株を、次いで、HBB5.4標的を有する酵母と交配させて、これを確認した。プラスミドを発現する変異体を回収するために、酵母DNAを、標準的なプロトコルを用いて抽出し、大腸菌を形質転換するために用い、大腸菌DNAを調製した。
b) 変異体の同時発現
pCLS0542発現ベクター中のHBB5.3標的を切断する変異体を発現する酵母株を、pCLS1107発現ベクター中のHBB5.4標的を切断する変異体をコードするDNAで形質転換した。形質転換体を、-L Glu + G418培地で選択した。
c) メガヌクレアーゼ同時発現クローンの交配及び酵母でのスクリーニング
交配は、コロニーグリッダー(QpixII, Genetix)を用いて行った。変異体を、YPDプレートを覆うナイロンフィルタ上に、低格子密度(約4スポット/cm2)を用いてグリッドした。2回目のグリッド手順を同じフィルタ上に行って、それぞれの標的について異なるレポーターを保持する酵母株からなる第2層をスポットした。メンブレンを、固形寒天YPDリッチ培地上に置き、30℃にて一晩インキュベートして、交配を可能にした。次いで、フィルタを、ロイシン及びトリプトファンを欠き、G418を加え、ガラクトース(1%)を炭素源として有する合成培地に移し、37℃にて5日間インキュベートして、発現及び標的ベクターを有する二倍体を選択した。5日後に、フィルタを、0.5 Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0中の0.02% X-Gal、0.1% SDS、6%ジメチルホルムアミド(DMF)、7mM β-メルカプトエタノール、1%アガロースを含有する固形アガロース培地上に置き、37℃にてインキュベートして、β-ガラクトシダーゼ活性をモニターした。結果をスキャンにより分析し、適切なソフトウェアを用いて定量を行った。
2) 結果
HBB5.3 (8変異体)及びHBB5.4 (10変異体)配列を切断する変異体の同時発現は、ほとんど全ての場合において、HBB5.2標的の効率的な切断をもたらした(図8パネルA)。しかし、これらの組み合わせはいずれも、HBB5.2配列とは-2位、+1位及び+2位の3 bpだけが異なる(図4)HBB5天然標的を切断できなかった(図8パネルB)。HBB5.2標的を切断する機能的組み合わせを、表IVにまとめる。
Figure 2010534070
実施例4：HBB 5.4を切断するタンパク質のランダム突然変異誘発及びHBB5.3を切断するタンパク質との組み立てによる、HBB5を切断するメガヌクレアーゼの作製
非パリンドロームのHBB5.2標的を切断できるI-CreI変異体を、パリンドロームのHBB5.3及びHBB 5.4標的を切断する変異体の組み立てにより同定した。しかし、これらの組み合わせはいずれも、HBB5.2配列とは-2位、+1位及び+2位の3 bpだけが異なる(図4)HBB5を切断できなかった。
よって、HBB5.2を切断するタンパク質組み合わせに突然変異を誘発して、HBB5を効率的に切断する変異体をスクリーニングした。その標的に結合したI-CreIタンパク質の構造によると、4つの中央の塩基対(-2位〜2位)とI-CreIタンパク質との間に接触はない(Chevalierら, Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312〜316; Chevalier B.S.及びStoddard B.L., Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜3754; Chevalierら, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜269)。よって、突然変異を誘発する位置の組を合理的に選択することは困難であり、突然変異誘発をタンパク質全体に対して行った。ランダム突然変異誘発は、高い複雑さのライブラリーをもたらし、試験される変異型ライブラリーの複雑さは、HBB 5.2を切断するヘテロ二量体の2つの成分のうち1つのみに突然変異を誘発することにより制限した。
よって、HBB 5.4を切断するタンパク質に突然変異を誘発し、HBB 5.3を切断するタンパク質と同時発現させたときに、これらがHBB 5を効率的に切断できるかを試験した。
1) 材料及び方法
a) ランダム突然変異誘発によるライブラリーの構築
ランダム突然変異誘発ライブラリーを、選択された変異体のプールに対して、Mn2+を用いるPCR、又はJBS dNTP-突然変異誘発キットについてのJENA BIOSCIENCE GmbHからのプロトコルに記載されるようにして、dNTP誘導体である8-オキソ-dGTP及びdPTPを用いる2ステップPCRにより、創出した。用いたプライマーは、preATGCreFor (5'-gcataaattactatacttctatagacacgcaaacacaaatacacagcggccttgccacc-3'; 配列番号77)及びICreIpostRev (5'-ggctcgaggagctcgtctagaggatcgctcgagttatcagtcggccgc-3'; 配列番号78)である。およそ25 ngのPCR生成物と、DraIII及びNgoMIVでの消化により線状にした75 ngのベクターDNA (pCLS1107, 図15)とを用いて、酵母サッカロミセス・セレビシエFYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコル(Gietz及びWoods, Methods Enzymol., 2002, 350, 87〜96)を用いて形質転換した。I-CreI変異体についてのインタクトなコード配列を含有する発現プラスミドを、酵母でのインビボ相同組換えにより作製した。
b) 変異体-標的酵母株、スクリーニング及び配列決定
酵母レポーターベクター(pCLS1055, 図14)中にHBB5標的を含有する酵母FYBL2-7B株(MAT a, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202)を、LEU2遺伝子をマーカーとして有するpCLS0542ベクター中のHBB 5.3標的を切断する変異体で、高効率LiAc形質転換プロトコルを用いて形質転換する。変異体-標的酵母を、実施例1に記載されるような交配アッセイのための標的株として用いる。陽性をもたらすクローンを、実施例1に記載されるようにして配列決定(MILLEGEN)により確認した。
2) 結果
HBB5.4を切断する4つの変異体(KGSYQS/RYSET、KGSYQS/ARSER、KGSYQS/TRSER、KNTYQS/ARSER、表IVの命名法による)をプールし、ランダム突然変異誘発し、酵母を形質転換した。次いで、2280個の形質転換クローンを、(i) レポータープラスミド中のHBB5標的、(ii) HBB5.3標的を切断する変異体(KTSHRS/KYSDT又はKNSRRS/KYSDT、表IVの命名法による)を含有する発現プラスミドを含有する酵母株と交配させた。2つの酵母株との交配の後に、1つの陽性クローンが、HBB5標的を切断することが見出された。対照実験において、この陽性クローンは、KTSHRS/KYSDT又はKNSRRS/KYSDT I-CreI変異体の同時発現なしでHBB5の切断を引き起こすとは見出されなかった。結論として、この陽性クローンは、HBB5標的の切断活性を導くKTSHRS/KYSDT又はKNSRRS/KYSDTとのヘテロ二量体を形成できるタンパク質を含有した。陽性クローンの同定を導く酵母スクリーニングアッセイを、図9に示す。表IVの命名法に基づく陽性クローンの配列を、表Vに列挙する。
Figure 2010534070
実施例5：HBB5.3を切断するタンパク質のランダム突然変異誘発及び部位特異的突然変異誘発、並びにHBB5.4を切断するタンパク質との組み立てによる、HBB5を標的にするメガヌクレアーゼの洗練
パリンドロームのHBB5.3標的を切断するI-CreI変異体を同定し、パリンドロームのHBB5.4標的を切断する変異体との同時発現により、非パリンドローム標的HBB5を切断するその能力について試験した(実施例3)。それにもかかわらず、試験したヘテロ二量体の組み合わせはいずれも、HBB5配列を切断できなかった。この標的の切断を得るために、HBB5.3標的を切断するI-CreI変異体に、ランダム突然変異誘発又は部位特異的突然変異誘発を行い、HBB5.4標的を切断する変異体と同時発現させたときにHBB5を高い効率で切断する新しい変異型をスクリーニングした。
I-CreI誘導体の活性を増強する6つのアミノ酸置換を、HBB5.3を切断するタンパク質のコード配列に個別に導入した。これらの変異は、グリシン19のセリンでの置き換え(G19S)、フェニルアラニン54のロイシンでの置き換え(F54L)、グルタミン酸80のリジンでの置き換え(E80K)、フェニルアラニン87のロイシンでの置き換え(F87L)、バリン105のアラニンでの置き換え(V105A)及びイソロイシン132のバリンでの置き換え(I132V)に相当する。得られた突然変異誘発タンパク質を、次いで、HBB5.4を切断する変異体との同時発現の際にHBB5標的の効率的な切断を誘発するその能力について試験した。
1) 材料及び方法
a) ランダム突然変異誘発によるライブラリーの誘発
25 ngのPCR生成物と、NcoI及びEagIでの消化により線状にした75 ngのベクターDNA (pCLS0542, 図13)とを用いて、酵母サッカロミセス・セレビシエFYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコル(Gietzら, Methods Enzymol, 2002, 350, 87〜96)を用いて形質転換した以外は、実施例4と同じプロトコル。I-CreI変異体についてのインタクトなコード配列を含有する発現プラスミドを、酵母でのインビボ相同組換えにより作製した。
b) 部位特異的突然変異誘発によるライブラリーの構築
ライブラリーを、HBB5.3を切断する最初の変異体のプールに対するPCRにより創出した。例として、G19S置換を、変異体のコード配列に導入するために、2回の別々のオーバーラップPCR反応を行って、I-CreI N75コード配列の5'末端(残基1〜24)又は3'末端(残基14〜167)を増幅した。5'及び3'の両方の末端について、ベクターに対する相同性を有するプライマー(Gal10F 5'-gcaactttagtgctgacacatacagg-3' (配列番号34)又はGal10R 5'-acaaccttgattggagacttgacc-3' (配列番号35))と、置換変異G19Sを含有するアミノ酸14〜24についてのI-CreIコード配列に特異的なプライマー(G19SF 5'-gccggctttgtggactctgacggtagcatcatc-3' (配列番号151)又はG19SR 5'-gatgatgctaccgtcagagtccacaaagccggc-3' (配列番号152))を用いて、PCR増幅を行う。得られたPCR生成物は、33 bpの相同性を互いに有する。PCRフラグメントを精製した。最後に、2つのオーバーラップPCRフラグメントをそれぞれおよそ25 ngと、NcoI及びEagIでの消化により線状にした75 ngのベクターDNA (pCLS0542, 図13)とを用いて、酵母サッカロミセス・セレビシエFYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコル(Gietzら, Methods Enzymol, 2002, 350, 87〜96)を用いて形質転換した。G19S置換を含有するインタクトなコード配列を、酵母でのインビボ相同組換えにより作製した。
同じストラテジーを、以下のオリゴヌクレオチドの対に用いて、それぞれF54L、E80K、F87L、V105A及びI132Vの置換を含有するその他のライブラリーを創出した：
* F54LF: 5'-acccagcgccgttggctgctggacaaactagtg-3' (配列番号153)及びF54LR: 5'-cactagtttgtccagcagccaacggcgctgggt-3' (配列番号154);
* E80KF: 5'-ttaagcaaaatcaagccgctgcacaacttcctg-3' (配列番号155)及びE80KR: 5'-caggaagttgtgcagcggcttgattttgcttaa -3' (配列番号156);
* F87LF: 5'-aagccgctgcacaacctgctgactcaactgcag-3' (配列番号157)及びF87LR: 5'-ctgcagttgagtcagcaggttgtgcagcggctt-3' (配列番号158);
* V105AF: 5'-aaacaggcaaacctggctctgaaaattatcgaa-3' (配列番号159)及びV105AR: 5'-ttcgataattttcagagccaggtttgcctgttt-3' (配列番号160);
* I132VF: 5'-acctgggtggatcaggttgcagctctgaacgat-3' (配列番号161)及びI132VR: 5'-atcgttcagagctgcaacctgatccacccaggt-3' (配列番号162)。
c) 変異体-標的酵母株、スクリーニング及び配列決定：
酵母レポーターベクター(pCLS1055, 図14)中にHBB 5標的を含有する酵母FYBL2-7B株(MATα, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202)を、ロイシンベクター(pCLS0542, 図13)中のHBB 5.3標的を切断する変異体で、高効率LiAc形質転換プロトコルを用いて形質転換した。変異体-標的酵母を、実施例1に記載されるような交配アッセイのための標的株として用いた。陽性をもたらすクローンを、実施例1に記載されるようにして配列決定(Millegen)により確認した。
2) 結果
ランダム突然変異誘発及び部位特異的突然変異誘発により得られたライブラリーを、HBB5.3標的を切断する14の最初のI-CreI変異体のプール(表VI)に対して構築した。それぞれのライブラリーについての2232個及び372個の形質転換クローンを、次いで、(i) レポータープラスミド中のHBB5標的を含有し、(ii) 実施例4に既に記載されたHBB5.4標的を切断する最適化変異型であるKNTYQS / ARSER + 80K + 96Rともよばれる変異体28K30N32T33Y38Q40S44A68R70S75E77R+80K+96Rを発現する酵母株と交配させた。
部位特異的突然変異誘発の後にG19S変異を保持し、HBB 5標的を効率的に切断するいくつかの陽性変異体の同定を、図17、パネルAに示す。この酵母株との交配の後に、HBB5.4標的を切断する変異体とのヘテロ二量体を形成したときに、最初の変異体よりも効率的にHBB5標的を切断する80個の新しいI-CreIクローンを同定した。このような80個の陽性クローン(ランダム突然変異誘発により得られた51クローン、G19S変異を有する15クローン、F87L変異を有する2クローン、V105A変異を有する3クローン、I132V変異を有する9クローン)の配列決定により、HBB5標的の切断のレベルがより高い49個の異なる新規な変異体の同定が可能になった。
例として、HBB5.4を切断する変異体KNTYQS / ARSER + 80K + 96Rとヘテロ二量体を形成したときにHBB5.3標的を切断する14個のI-CreI最適化変異体の配列を、表VIIに編集する。これらの最適化変異型は、配列番号164〜177の配列に相当する。
Figure 2010534070
Figure 2010534070
実施例6：HBB5.4を切断するタンパク質の部位特異的突然変異誘発及びHBB5.3を切断するタンパク質との組み立てによる、HBB5を標的にするメガヌクレアーゼの切断活性の改良
実施例4に記載したように、パリンドロームのHBB5.4標的を切断するKNTYQS / ARSER + 80K + 96Rとよばれる1つのI-CreI最適化変異体のみが、ランダム突然変異誘発により得られたライブラリーのヘテロ二量体酵母スクリーニングから既に同定され、パリンドロームのHBB5.3標的を切断する変異体との同時発現により試験された。HBB5配列についてのI-CreIカッターの数を増大させるために、6つのアミノ酸置換G19S、F54L、E80K、F87L、V105A及びI132Vの挿入によるHBB5.4標的を切断する変異体のプールの部位特異的突然変異誘発に相当するライブラリーの別の組を、構築した。
得られたタンパク質を、HBB5標的の効率的な切断を誘発するその能力について試験した。
1) 材料及び方法
a) 部位特異的突然変異誘発によるライブラリーの構築
2つのオーバーラップPCRフラグメントのそれぞれを25 ngと、DraIII及びNgoMIVでの消化により線状にした75 ngのベクターDNA (pCLS1107, 図15)とを用いて、酵母サッカロミセス・セレビシエFYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコル(Gietzら, Methods Enzymol, 2002, 350, 87〜96)を用いて形質転換した以外は、実施例5と同じプロトコル。異なる変異を含有するインタクトなコード配列を、酵母でのインビボ相同組換えにより作製した。
b) 変異体-標的酵母株、スクリーニング及び配列決定
酵母レポーターベクター(pCLS1055, 図14)中にHBB 5標的を含有する酵母FYBL2-7B株(MAT a, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202)を、カナマイシンベクター(pCLS1107, 図15)中にクローニングされたHBB 5.4標的を切断する変異体で、高効率LiAc形質転換プロトコルを用いて形質転換した。変異体-標的酵母を、実施例1に記載されるような交配アッセイのための標的株として用いた。陽性をもたらすクローンを、実施例1に記載されるようにして配列決定(Millegen)により確認した。
2) 結果
部位特異的突然変異誘発により構築されたライブラリーを、11個の最初の変異体とHBB5.4標的を切断するKNTYQS / ARSER + 80K + 96Rとよばれる1つの最適化変異体(表VIII)とに相当する12個のI-CreI変異体のプールから導いた。それぞれのライブラリーについての372個の形質転換クローンを、次いで、(i) レポータープラスミド中のHBB5標的を含有し、(ii) 実施例3に既に記載されたHBB5.3標的を切断する最初の変異型であるKTSRHS / KSSNIともよばれる変異体28K30T32S33R38H40S / 44K68S70S75N77Iを発現する酵母株と交配させた。
部位特異的突然変異誘発の後にG19S変異を保持し、HBB 5標的を効率的に切断するいくつかの陽性最適化変異体を、図17、パネルBに示す。この酵母株との交配の後に、HBB5.3標的を切断する変異体とヘテロ二量体を形成したときに、最初の変異体よりも効率的にHBB5標的を切断する20個の新しいI-CreIクローンを同定した。このような20個の陽性クローン(G19S変異を有する10クローン、F87L変異を有する6クローン、及びI132V変異を有する4クローン)の配列決定により、8個の異なる新規な変異体の同定が可能になった。
HBB5標的を切断するこのようなI-CreI最適化変異体の配列(配列番号179〜186)を、表IXに編集する。
Figure 2010534070
Figure 2010534070
実施例7：HBB5.3及びHBB5.4を切断するタンパク質のランダム突然変異誘発及び多部位特異的突然変異誘発、並びにHBB5.4及びHBB5.3を切断するタンパク質との組み立てによる、HBB5を標的にするメガヌクレアーゼの切断の効率の洗練
パリンドローム標的HBB5.3及びHBB5.4を標的にする変異体の突然変異誘発の実験の結果は、ヘテロ二量体同時発現酵母スクリーニングアッセイにおいて試験したときに、配列HBB5をより効率的に切断する最適化変異体の同定を導く(実施例5及び6を参照)。さらに、実施例6 (表IX)に示すように、いくつかの最適化変異体の配列(KNTYQS / ARSER + 80K +87L、KNTYQS / ARSER +19S + 80K)は、同じ変異体内での置換E80KのF87Lとの組み合わせ及びG19SのE80Kとの組み合わせが、HBB5標的の切断の効率の増大を導き得ることを示す。HBB5標的の切断の最大効率を有するI-CreI変異体の大きいパネルを得るために、置換G19S、F54L、E80K、V105A及びI132Vに関するランダム及び多部位特異的突然変異誘発の新しいライブラリー(図18)を、配列HBB5.3及びHBB5.4を標的にする最適化変異体のプールから構築した(表X)。
1) 材料及び方法
a) ランダム突然変異誘発によるライブラリーの構築
実施例4と同じプロトコル。HBB5.3又はHBB5.4配列を標的にする変異体のプールに由来するライブラリーについて、25 ngのPCR生成物と、NcoI及びEagIでの消化により線状にした75 ngのベクターDNA pCLS0542 (図13)、又はDraIII及びNgoMIVでの消化により線状にしたpCLS1107 (図15)をそれぞれ用いて、酵母サッカロミセス・セレビシエFYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコル(Gietzら, Methods Enzymol, 2002, 350, 87〜96)を用いて形質転換した。I-CreI変異体についてのインタクトなコード配列を含有する発現プラスミドを、酵母でのインビボ相同組換えにより作製した。
b) 多部位特異的突然変異誘発によるライブラリーの構築
HBB5.3及びHBB5.4標的を切断する変異体のコード配列中にG19S、F54L、E80K、V105A及びI132V置換を複数挿入するために、6群の別々のオーバーラップPCR反応を行って、異なる変異の間の配列を含有するI-CreI N75コード配列の内部フラグメントを増幅した以外は、実施例5と同じプロトコル。例として、変異G19S及びF54Lの挿入のための多部位特異的突然変異誘発のために、PCR増幅を、置換G19Sを含有するか又はしないアミノ酸14〜24についてのI-CreIコード配列に特異的なプライマー(G19SF 5'-gccggctttgtggactctgacggtagcatcatc-3' (配列番号151)及びG19wtF 5'-gccggctttgtggacggtgacggtagcatcatc -3' (配列番号187))を、置換F54Lを含有するか又はしないアミノ酸49〜59についてのI-CreIコード配列に特異的なプライマー(F54LR 5'-cactagtttgtccagcagccaacggcgctgggt-3' (配列番号154)及びF54wtR 5'- cactagtttgtccagaaaccaacggcgctgggt -3' (配列番号188)とともに用いて行い、異なる末端を有するPCRの4つのフラグメントを作製する。
同じストラテジーを、以下の群のオリゴヌクレオチドとともに用いて、他の内部フラグメントを創出した：
* Gal10F: 5'-gcaactttagtgctgacacatacagg-3' (配列番号34)とG19SR: 5'-gatgatgctaccgtcagagtccacaaagccggc-3' (配列番号152)及びG19wtR: 5'- gatgatgctaccgtcaccgtccacaaagccggc-3' (配列番号189)
* F54LF: 5'-acccagcgccgttggctgctggacaaactagtg-3' (配列番号153)及びF54wtF: 5'-acccagcgccgttggtttctggacaaactagtg-3' (配列番号190)とE80KR 5'-caggaagttgtgcagcggcttgattttgcttaa-3' (配列番号156)及びE80wtR 5'- caggaagttgtgcagcggcttgatttcgcttaa-3' (配列番号191)
* E80KF: 5'-ttaagcaaaatcaagccgctgcacaacttcctg-3' (配列番号155)及びE80wtF: 5'-ttaagcgaaatcaagccgctgcacaacttcctg-3' (配列番号192)とV105AR 5'- ttcgataattttcagagccaggtttgcctgttt-3' (配列番号160)及びV105wtR 5'- ttcgataattttcagaaccaggtttgcctgttt-3’ (配列番号193)
* V105AF: 5'-aaacaggcaaacctggctctgaaaattatcgaa-3' (配列番号159)及びV105wtF: 5'-aaacaggcaaacctggttctgaaaattatcgaa-3' (配列番号194)とI132VR 5'-atcgttcagagctgcaacctgatccacccaggt-3' (配列番号162)及びI132wtR 5'- atcgttcagagctgcaatctgatccacccaggt-3' (配列番号195)
* I132VF: 5'-acctgggtggatcaggttgcagctctgaacgat-3' (配列番号161)及びI132wtF: 5'-acctgggtggatcagattgcagctctgaacgat-3' (配列番号196)とGal10R 5'- acaaccttgattggagacttgacc-3' (配列番号35)
得られたオーバーラップPCR生成物は、互いに15 bpの相同性を含有する。それぞれの内部領域に相当するPCRフラグメントを、次いで、精製し、プールし、変異G19S、F54L、E80K、V105A及びI132Vを含有するか又はしないI-CreIコード配列を、PCRアセンブリにより作製した。最後に、HBB5.3及びHBB5.4標的を切断する変異体を用いて得られたそれぞれの組み立てたPCRフラグメントおよそ25 ngと、NcoI及びEagIでの消化により線状にしたベクターDNA pCLS0542 (図13)又はDraIII及びNgoMIVでの消化により線状にしたベクターDNA pCLS1107 75 ngとをそれぞれ用いて、酵母サッカロミセス・セレビシエFYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコル(Gietzら, Methods Enzymol, 2002, 350, 87〜96)を用いて形質転換した。置換を含有するインタクトなコード配列は、酵母でのインビボ相同組換えにより作製した。
c) 変異体-標的酵母株、スクリーニング及び配列決定
酵母レポーターベクター(pCLS1055, 図14)中にHBB 5標的を含有する酵母株FYBL2-7B (MAT a, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202)を、ロイシンベクター(pCLS0542, 図13)中にクローニングされたHBB 5.3標的を切断する変異体、又はカナマイシンベクター(pCS1107, 図15)中にクローニングされたHBB 5.4標的を切断する変異体で、高効率LiAc形質転換プロトコル(Gietzら, Methods Enzymol, 2002, 350, 87〜96)を用いて形質転換した。変異体-標的酵母を、実施例1に記載されるような交配アッセイのための標的株として用いた。陽性をもたらすクローンを、実施例1に記載されるようにして配列決定(Millegen)により確認した。
2) 結果
ランダム突然変異誘発又は多部位特異的突然変異誘発のライブラリーを、標的HBB5.3及びHBB5.4を切断する最適化変異体に相当する8つ及び6つのI-CreI変異体のプールから導いた(表X)。それぞれの種類のライブラリーについての2232個又は2790個の形質転換クローンを得た。HBB5.3変異体に由来するライブラリーに相当するクローンを、(i) レポータープラスミド中のHBB5標的を含有し、(ii) 実施例6に既に記載されたHBB5.4標的を切断する洗練された変異型であるKNSYQS / ARSER +24V +43L + 80K +87L +96Rともよばれる変異体28K30N32S33Y38Q40S / 44A68R70S75E77R +24V +43L + 80K +87L +96Rを発現する酵母株と交配させた。HBB5.4変異体に由来するライブラリーに相当するクローンを、(i) レポータープラスミド中のHBB5標的を含有し、(ii) 実施例5に既に記載されたHBB5.3標的を切断する最適化変異型であるKSSHRS / KYSDTともよばれる変異体28K30S32S33H38R40S / 44K68Y70S75D77Tを発現する酵母株と交配させた。
2種の突然変異誘発を用いて同定した、HBB5標的を効率的に切断する陽性変異体の例を、図19及び20に示す。ランダム突然変異誘発のライブラリーのスクリーニングにより、HBB5.4 (図19、パネルA)又はHBB5.3 (図19、パネルB)配列をそれぞれ標的にする変異体とヘテロ二量体を形成したときに、最初の変異体よりも効率的にHBB5標的を切断する66個及び45個の新しいI-CreIクローンが同定される。多部位特異的突然変異誘発のライブラリーについて、最大効率でHBB5標的を切断する62個及び36個の洗練されたI-CreI変異体も、配列HBB5.3 (図20、パネルA)又は配列HBB5.4 (図20、パネルB)を切断する変異体のプールから得られた。
このような陽性クローンの配列決定により、酵母ヘテロ二量体スクリーニングアッセイにおいてHBB5標的の効率的な切断を導く98個及び45個の新規な最適化変異体の同定が可能になった。HBB5.3及びHBB5.4標的を切断するいくつかのI-CreI最適化変異体の配列を、表XIに編集する。
Figure 2010534070
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実施例8：CHO細胞中の染色体外モデルにおけるHBB 5標的切断の確認
ヘテロ二量体を形成したときに、酵母においてHBB 5標的を効率的に切断できるいくつかのI-CreI洗練変異体を、実施例7において同定した。CHO細胞中でHBB 5配列を切断する最大効率を示すヘテロ二量体を確認して特徴決定するために、HBB 5標的を切断できる経に体の組み合わせの効率を、哺乳動物細胞での染色体外アッセイを用いて試験した。
1) 材料及び方法
a) CHOスクリーニング用のベクターにおけるHBB 5標的のクローニング
興味対象の標的を、次のようにしてクローニングした。ゲートウェイクローニング配列と接する標的配列に相当するオリゴヌクレオチドを、PROLIGOに注文した。一本鎖オリゴヌクレオチドのPCR増幅により作製した二本鎖標的DNAを、Gatewayプロトコル(INVITROGEN)を用いて、CHOレポーターベクター(pCLS1058, 図30)にクローニングした。クローニングした標的を、配列決定(MILLEGEN)により確認した。
b) メガヌクレアーゼの再クローニング
実施例7で同定されたHBB5.3及びHBB5.4標的を切断するI-CreI最適化変異体のORFを、pCLS1069 (図31)中に再クローニングした。ORFを、PCRにより、酵母DNA上で、プライマーattB1-ICreIFor: (5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcgaaggagatagaaccatggccaataccaaatataacaaagagttcc-3' (配列番号221)及びattB2-ICreIRev (5'- ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttagtcggccgccggggaggatttcttcttctcgc-3' (配列番号222)を用いて増幅した。PCR生成物を、INVITROGENからのCHO発現ベクターpCDNA6.2 (pCLS1069, 図31)に、Gatewayプロトコル(INVITROGEN)を用いてクローニングした。得られたクローンを、配列決定により確認した(MILLEGEN)。
c) 哺乳動物細胞における染色体外アッセイ
CHO細胞を、Polyfect (登録商標)トランスフェクション試薬を用いて、供給業者のプロトコル(QIAGEN)に従ってトランスフェクションさせた。トランスフェクションの72時間後に、培養培地を回収し、150μlのβ-ガラクトシダーゼ液体アッセイ用の溶解/明示(revelation)バッファーを加えた(典型的には、1リットルのバッファーは：100 mlの溶解バッファー(Tris-HCl 10 mM pH7.5、NaCl 150 mM、Triton X100 0.1%、BSA 0.1 mg/ml、プロテアーゼ阻害剤)、10 mlのMg 100×バッファー(MgCl2 100 mM、β-メルカプトエタノール35%)、110 ml ONPG 8 mg/ml及び780 ml リン酸ナトリウム0.1M pH7.5を含有する)。37℃でのインキュベーションの後に、ODを420 nmで測定した。全体の手順を、自動化Velocity11 BioCelプラットフォームで行った。アッセイごとに、150 ngの標的ベクターを、12.5 ngのそれぞれのHBB5変異体発現ベクター(パリンドロームのHBB5.3標的を切断する変異体をコードするベクター12.5 ngと、パリンドロームのHBB5.4標的を切断する変異体をコードするベクター12.5 ng)に同時トランスフェクションさせた。
2) 結果
表XIに記載される変異体を、まず、哺乳動物発現ベクターpCLS1069 (図31)に再クローニングした。
図21は、ヘテロ二量体の12の組み合わせについて得られた結果を示し、異なる組み合わせの値を表XIIに編集する。HBB5配列の切断の効率の分析は、I-CreI変異体の主に2つの組み合わせ(MtA2_MtA6、MtA3_MtA6)が、CHO細胞においてHBB5標的を効率的に切断できることを示す。このような知見は、機能的ヘテロ二量体酵母スクリーニングアッセイの結果と一致する。
Figure 2010534070
実施例9：HBB8.3を切断するメガヌクレアーゼの作製
この実施例は、I-CreI変異体が、パリンドローム形のHBB8標的の右部分に由来するHBB8.3 DNA標的を切断できることを示す(図5)。この実施例に記載する標的配列は、22 bpのパリンドローム配列である。よって、これらを、最初の11ヌクレオチドと、それに続く接尾辞_Pによってのみ記載する。例えば、標的HBB 8.3は、cagacttctgt_P (配列番号31)とも記載される。HBB8.3は、5TCT_Pと、±1位、±2位、±3位、±4位、±5位、±8位、±10位及び±11位にて類似し、10AGA_Pと、±1位、±2位、±8位、±9位及び±10位にて類似する。5TCT_Pを切断できる変異体は、I-CreI N75に対する44位、68位、70位、75位及び77位での突然変異誘発により、Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458及び国際PCT出願WO 2006/097784、WO 2006/097853に記載されるようにして得た。10AGA_P標的を切断できる変異体は、I-CreI N75に対する28位、30位、32位、33位、38位、40位及び70位での突然変異誘発により、Smithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149並びに国際PCT出願WO 2007/060495及びWO 2007/049156に記載されるようにして得た。よって、このような変異の対を組み合わせることにより、HBB 8.3標的の切断が可能になる。
タンパク質の両方の組は、70位にて変異させる。しかし、2つの分離可能な機能的サブドメインが存在する(Smithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149並びに国際PCT出願WO 2007/057781及びWO 2007/049095)。このことは、この位置が標的の塩基10及び8における特異性にほとんど影響しないことを意味する。よって、組み合わせた変異体がHBB8.3標的を切断できるかを確認するために、5TCT_P (caaaactctgt_P)を切断するタンパク質からの44位、68位、70位、75位及び77位での変異を、10AGA_P (cagaacgtcgt_P)を切断するタンパク質からの28、30、32、33、38及び40変異と組み合わせた。
1) 材料及び方法
実験手順は、実施例1に記載されるとおりである。
2) 結果
I-CreIコンビナトリアル変異体を、44位、68位、70位、75位及び77位での変異を、I-CreI足場での28、30、33、38及び40変異と組み合わせることにより構築して、1600の複雑さのライブラリーを得た。このライブラリーで酵母を形質転換し、2880クローン(多様性の1,8倍)を、HBB8.3 DNA標的(cagacttctgt_P; 配列番号31)に対する切断についてスクリーニングした。264個の陽性クローンが見出され、これらは、配列決定及び2次スクリーニングによる確認の後に、126個の異なる新規なエンドヌクレアーゼに相当することがわかった(表XIIIを参照)。表XIIIに示す24個の新規なエンドヌクレアーゼは、配列番号80〜103の配列に相当する。HBB8.3標的を切断する陽性変異体の例は、図10に示す。
Figure 2010534070
実施例10：HBB8.4を切断するメガヌクレアーゼの作製
この実施例は、I-CreI変異型が、パリンドローム形のHBB8標的の左部分に由来するHBB8.4 DNA標的配列を切断できることを示す(図5)。この実施例に記載する標的配列は、全て22 bpのパリンドローム配列である。よって、これらを、最初の11ヌクレオチドと、それに続く接尾辞_Pによってのみ記載する。例えば、HBB 8.4は、ctgactcctgt_P (配列番号32)ともよばれる。HBB 8.4は、5CCT_Pと、±1位、±2位、±3位、±4位、±5位、±8位及び±11位にて類似し、10TGA_Pと、±1位、±2位、±8位、±9位、±10位及び±11位にて類似する。±6位及び±11位は、結合及び切断活性に対してほとんど影響しないと仮定した。5CCT_P (caaaaccctgt_P; 配列番号22)を切断できる変異体は、I-CreI N75に対する44位、68位、70位、75位及び77位での突然変異誘発により、Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458及び国際PCT出願WO 2006/097784、WO 2006/097853に記載されるようにして得た。10TGA_P標的(ctgaacgtcgt_P; 配列番号28)を切断できる変異体は、I-CreI N75に対する28位、33位、38位、40位及び70位での突然変異誘発により、Smithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149並びに国際PCT出願WO 2007/060495及びWO 2007/049156に記載されるようして得た。よって、このような変異の対を組み合わせることにより、HBB 8.4標的の切断が可能になる。
タンパク質の両方の組は、70位にて変異させる。しかし、2つの分離可能な機能的サブドメインが存在する(Smithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149並びに国際PCT出願WO 2007/049095及びWO 2007/057781)。このことは、この位置が標的の塩基10及び8における特異性にほとんど影響しないことを意味する。よって、組み合わせた変異体がHBB 8.4標的を切断できるかを確認するために、5CCT_P (caaaaccctgt_P)を切断するタンパク質からの44位、68位、70位、75位及び77位での変異を、10TGA_P (ctgaacgtcgt_P)を切断するタンパク質からの28、33、38及び40変異と組み合わせた。
1) 材料及び方法
実験手順は、実施例2に記載されるとおりである。
2) 結果
I-CreIの組み合わせた変異体を、44位、68位、70位、75位及び77位での変異を、I-CreI足場での28、30、32、33、38及び40変異と組み合わせることにより構築して(表XIV)、1720の複雑さのライブラリーを得た。このライブラリーで酵母を形質転換し、3168クローン(多様性の1,8倍)を、HBB8.4に対する切断についてスクリーニングした。141個の陽性クローンが見出され、これらは、配列決定及び2次スクリーニングによる確認の後に、93個の異なる新規なエンドヌクレアーゼに相当することがわかった(表XIVを参照)。表XIVに示す19個の新規なエンドヌクレアーゼは、配列番号104〜122の配列に相当する。HBB8.4標的を切断する陽性変異体の例は、図11に示す。
Figure 2010534070
実施例11：HBB8を切断するメガヌクレアーゼの作製
パリンドロームのHBB 8由来標的(HBB8.3及びHBB8.4、実施例9及び10を参照)のそれぞれを切断できるI-CreI変異体を、以前に同定した。酵母におけるこのような変異体の対(HBB 8.3を切断するものとHBB 8.4を切断するもの)を、酵母で同時発現させた。同時発現の際に、3つの活性分子種、すなわち2つのホモ二量体と、1つのヘテロ二量体とが存在するはずである。ヘテロ二量体がHBB8.2及びHBB8標的を切断するかを試験した。
1) 材料及び方法
実験手順は、実施例3に記載されるとおりである。
2) 結果
HBB 8.3 (11変異体)及びHBB 8.4 (15変異体)を切断する変異体の同時発現は、ほとんど全ての場合において、HBB 8.2標的の効率的な切断をもたらした(図12、パネルA)。さらに、これらの組み合わせのいくつかは、HBB 8.2とは-1位、-2位及び2位の3 bpが異なる(図5) HBB 8天然標的を切断できた(図12、パネルB)。機能的組み合わせを、表XV及び表XVIにまとめる。
Figure 2010534070
Figure 2010534070
上記から明らかなように、本発明は、上記でより具体的に述べたその実施形態、実行及び応用のものに全く限定されない。逆に、本発明は、本発明の枠組み又は範囲から逸脱しない当業者に思い浮かぶであろう全ての変形を包含する。
実施例12：HBB8.3を切断するタンパク質の部位特異的突然変異誘発及びHBB8.4を切断するタンパク質との組み立てによる、HBB8をより高い効率で切断するメガヌクレアーゼの作製
非パリンドロームのHBB8標的を切断できるI-CreI変異体を、パリンドロームのHBB8.3を切断する変異体とパリンドロームのHBB8.4標的を切断する変異体との同時発現により同定した(実施例11)。非パリンドロームのHBB8標的を切断できるI-CreI変異体の数及び効率を増大させるために、パリンドロームのHBB8.3標的を切断する変異体に部位特異的突然変異を誘発し、HBB 8.4標的を切断する変異体と同時発現させたときに、高い効率でHBB8を切断する新しい変異体をスクリーニングした。
I-CreI誘導体の活性を増強する6個のアミノ酸置換を、HBB8.3を切断するタンパク質のコード配列に個別に導入した。これらの変異は、グリシン19のセリンでの置き換え(G19S)、フェニルアラニン54のロイシンでの置き換え(F54L)、グルタミン酸80のリジンでの置き換え(E80K)、フェニルアラニン87のロイシンでの置き換え(F87L)、バリン105のアラニンでの置き換え(V105A)及びイソロイシン132のバリンでの置き換え(I132V)に相当する。得られた突然変異誘発タンパク質を、次いで、HBB8.4を切断する変異体との同時発現の際にHBB8標的の効率的な切断を誘発するその能力について試験した。
1) 材料及び方法
実験手順は、実施例5に記載されるとおりである。
2) 結果
6個のアミノ酸置換(グリシン19をセリンに、フェニルアラニン54をロイシンに、グルタミン酸80をリジンに、フェニルアラニン87をロイシンに、バリン105をアラニンに、イソロイシン132をバリンに)を含有するライブラリーを、HBB8.3標的を切断する17個の最初のI-CreI変異体のプールに対して構築した(表XVII)。それぞれのライブラリーについての372個の形質転換クローンを、次いで、(i) レポータープラスミド中のHBB8標的を含有し、(ii)実施例11に記載されたHBB8.4標的を切断する変異型であるKNTCQS / DASKRともよばれる変異体28K30N32T33C38Q40S44D68A70S75K77Rを発現する酵母株と交配させた。
この酵母株と交配させた後に、186個の新しいI-CreIクローンが、HBB8.4標的を切断する変異体とヘテロ二量体を形成したときに、最初の変異体よりも効率的にHBB8標的を切断することがわかった。これらの186個の変異体(G19S変異を有する72クローン、F54L変異を有する60クローン、E80K変異を有する21クローン、F87L変異を有する5クローン、V105A変異を有する9クローン、及びI132V変異を有する19クローン)を、次いで、再配置し(再配置プレートのウェルA1〜H9)、1回目と全く同じ条件で行う確認スクリーニングに供した(図22)。186個の陽性クローンの配列決定により、HBB8標的をより高いレベルで切断する114個の別個の新規な変異体の同定が可能になった。
HBB8.4を切断する変異体KNTCQS / DASKRとヘテロ二量体を形成したときにHBB8.3標的を切断する25個のI-CreI最適化変異体の配列を、表XVIIIに列挙する(配列番号231〜255)。これらのI-CreI変異体のいくつかは、部位特異的突然変異誘発による変異体であることが予測されるが、おそらくPCR反応とライブラリー構築のために用いたプールの変異体同士のマイクロ組換え(micro-recombination)による予期せぬ変異も含有する。
HBB8標的の切断の特異性を試験するために、HBB8.3標的を切断する単純な変異F54L、F87L、V105A及びI132Vを有する93個の最適化変異体を、HBB8.5又はHBB6.5標的(図5)をレポータープラスミド内に含有する酵母株と交配させた。試験したI-CreI最適化変異体のほとんど全てについて、鎌状赤血球貧血の原因である変異を有するパリンドローム標的HBB8.5 (図23、パネルA)は、野生型配列に由来するHBB6.5パリンドローム標的(図23、パネルB)よりも効率的に切断される。
Figure 2010534070
Figure 2010534070
実施例13：HBB8.4を切断するタンパク質の部位特異的突然変異誘発及びHBB8.3を切断するタンパク質との組み立てによる、HBB8をより高い効率で切断するメガヌクレアーゼの作製
非パリンドロームのHBB8標的を切断できるI-CreI変異体を、パリンドロームのHBB8.3を切断する変異体とパリンドロームのHBB8.4標的を切断する変異体との同時発現により同定した(実施例11)。非パリンドロームのHBB8標的を切断できるI-CreI変異体の数及び効率を増大させるために、パリンドロームのHBB8.4標的を切断する変異体にも部位特異的突然変異を誘発し、HBB 8.3標的を切断する変異体と同時発現させたときに、高い効率でHBB8を切断する新しい変異体をスクリーニングした。
実施例12に記載される6個の変異(G19S、F54L、E80K、F87L、V105A及びI132V)を、HBB8.4を切断するタンパク質のコード配列に個別に導入し、得られたタンパク質を、HBB8.3を切断する変異体との同時発現の際にHBB8標的の効率的な切断を誘発するその能力について試験した。
1) 材料及び方法
部位特異的突然変異誘発ライブラリーを、実施例5に記載されるようにして、HBB8.4を切断する最初の変異体のプールに対するPCRにより創出した。PCRフラグメントを精製した。2つのオーバーラップPCRフラグメントのそれぞれおよそ25 ngと、DraIII及びNgoMIVでの消化により線状にした75 ngのベクターDNA (pCLS1107, 図15)とを用いて、酵母サッカロミセス・セレビシエFYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコルを用いて形質転換した。単独変異を含有するインタクトなコード配列を、酵母でのインビボ相同組換えにより作製する。
2) 結果
6個のアミノ酸置換を含有するライブラリーを、HBB8.4標的を切断する14個の最初のI-CreI変異体のプールに対して構築した(表XIX)。それぞれのライブラリーについての372個の形質転換クローンを、(i) レポータープラスミド中のHBB8標的を含有し、(ii)実施例11に記載されたHBB8.3標的を切断する変異型であるKTSHRS / KYSNYともよばれる変異体28K30T32S33H38R40S44K68Y70S75N77Yを発現する酵母株と交配させた。
この酵母株と交配させた後に、166個の新しいI-CreIクローンが、HBB8.3標的を切断する変異体とヘテロ二量体を形成したときに、最初の変異体よりも効率的にHBB8標的を切断することがわかった。これらの166個の変異体(G19S変異を有する93クローン、F54L変異を有する6クローン、E80K変異を有する12クローン、F87L変異を有する17クローン、V105A変異を有する23クローン及びI132V変異を有する15クローン)を、次いで、再配置し、1回目と全く同じ条件で行う確認スクリーニングに供した(図24)。166個の陽性クローンの配列決定により、HBB8標的をより高いレベルで切断する78個の別個の新規な変異体の同定が可能になった。
HBB8.3を切断する変異体KTSHRS / KYSNYとヘテロ二量体を形成したときにHBB8.4標的を切断する20個のI-CreI最適化変異体のいくつかの例を、表XXに列挙する。これらのI-CreI変異体のいくつかは、部位特異的突然変異誘発による変異体であることが予測されるが、おそらくPCR反応とライブラリー構築のために用いたプールの変異体同士のマイクロ組換えによる予期せぬ変異も含有する。
HBB8標的の切断の特異性を試験するために、HBB8.4標的を切断する単純な変異F54L、E80K、F87L、V105A及びI132Vを有する93個の最適化変異体を、HBB8.6又はHBB6.6標的(図5)をレポータープラスミド内に含有する酵母株と交配させた。試験したI-CreI最適化変異体のほとんど全てについて、鎌状赤血球貧血の原因である変異を有するパリンドローム標的HBB8.6は、野生型配列に由来するHBB6.6パリンドローム標的よりも効率的に切断される(図25、パネルA及びB)。
Figure 2010534070
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実施例14：哺乳動物細胞中でHBB8を切断するメガヌクレアーゼの機能的効率
実施例12及び13において、酵母中でHBB8標的を効率的に切断できるI-CreI洗練変異体を同定した。この実施例では、HBB8.3及びHBB8.4配列を切断する変異体の組み合わせがHBB8標的を切断する能力を、CHO哺乳動物細胞内での染色体外及び染色体レポーターアッセイを用いて、試験した。
1) 材料及び方法
CHOスクリーニング用のベクター中のHBB8由来標的のクローニング、メガヌクレアーゼの再クローニング及び哺乳動物細胞での染色体外アッセイのプロトコルは、実施例8に記載されるとおりである。
a) CHO細胞での染色体アッセイ。
レポーター系(図27)を保持するCHO株化細胞を、10cmディッシュあたり2×105細胞の密度で、完全培地(2 mM L-グルタミン、ペニシリン(100 UI/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)、アンフォテリシンB (Fongizone) (0.25μg/ml) (INVITROGEN-LIFE SCIENCE)及び10 % FBS (SIGMA-ALDRICH CHIMIE)を補ったKaighnの改変F-12培地(F12-K))中に播種した。次の日に、細胞を、Polyfectトランスフェクション試薬(QIAGEN)を用いてトランスフェクションさせた。簡単に、2μgのlacz修復マトリクスベクターを、種々の量のメガヌクレアーゼ発現ベクターに同時トランスフェクションさせた。37℃にて72時間のインキュベーションの後に、細胞を、0.5%グルタルアルデヒド中で4℃にて10分間固定し、0.02 % NP40含有100 mMリン酸バッファーで2回洗浄し、次の染色バッファーで染色した(10 mMリン酸バッファー、1 mM MgCl2、33 mM Kヘキサシアノ鉄(III)酸、33 mM Kヘキサシアノ鉄(II)酸、0.1 % (v/v) X-Gal)。37℃にて一晩のインキュベーションの後に、プレートを、光学顕微鏡の下で調べて、LacZ陽性細胞クローンの数を計数した。LacZ修復の頻度を、LacZ+増殖巣の数をトランスフェクションされた細胞の数(5×105)で除し、トランスフェクション効率で補正したものとして表した。
2) 結果
2つの標的HBB8及びHBB6に対するI-CreI改良変異体のヘテロ二量体の切断活性の比較は、まず、哺乳動物CHO細胞での染色体外アッセイを用いてモニターした。表XXI及び図26からわかるように、HBB由来標的の効率的な切断を引き起こす19個のヘテロ二量体組み合わせが同定された。HBB8及びHBB6の切断の効率の分析は、同定された活性へテロ二量体組み合わせのほとんどについて、鎌状赤血球貧血の原因である変異を有する標的HBB8が、非変異配列に相当する標的HBB6よりも効率的に切断されることを示す。このような知見は、機能的ヘテロ二量体酵母スクリーニングアッセイの結果と一致する。
Figure 2010534070
2つのI-CreI最適化変異体HBB8.3_H3及びHBB8.4_A4を含有する最も効率的なHBB8へテロ二量体の1つの活性も、HBB8又はHBB6標的のいずれかを含有するCHO株化細胞での染色体アッセイを用いて試験した。この染色体アッセイは、最近の出版物に詳細に記載されている(Arnouldら, J Mol Biol, 2007, 371, 49〜65)。簡単に、単一コピー導入遺伝子を有するCHO株化細胞を、まず創出した。導入遺伝子は、I-SceI切断部位の上流にヒトEF1αプロモーターを含有する(図27、工程1)。次に、I-SceIメガヌクレアーゼを用いて、DSB誘発相同組換えをこの遺伝子座において引き起こし、新規なメガヌクレアーゼ切断部位を有する5.5 kbカセットを挿入した(図27、工程2)。このカセットは、CMVプロモーターにより駆動される非機能的LacZオープンリーディングフレームと、プロモーターレスハイグロマイシンマーカー遺伝子を含有する。LacZ遺伝子自体は、試験されるメガヌクレアーゼ切断部位(ここでは、HBB8又はHBB6切断部位)を含有する50 bp挿入断片により不活性化されている。これらの株化細胞は、次いで、DSB誘発遺伝子ターゲティング効率(LacZ修復)を、HBB8標的を切断する工学的に作製されたI-CreI誘導体を用いて評価するために用いることができる(図27、工程3)。
2つの株化細胞を、修復マトリクスと、メガヌクレアーゼを発現する種々の量のベクターとに同時トランスフェクションさせた。LacZ遺伝子の修復の頻度は、HBB6標的を保持する株化細胞を用いての最大3.9×10-3から、HBB8標的を保持する株化細胞を用いての最大8.8×10-2まで増加した(図28)。
これらの知見により、染色体の関係において、鎌状赤血球貧血の原因である変異を有するHBB8標的も、野生型遺伝子座に由来するHBB6標的よりも効率的に切断されることが確かめられる。このような結果は、染色体外アッセイを用いて得られた結果と一致し、I-CreI最適化変異体を、遺伝病の原因である変異のゲノム修正のために用いることができることを意味する。
実施例15：ヒト株化細胞内のHBB遺伝子座でのゲノム工学のためのストラテジーの設計
酵母及び哺乳動物細胞(CHO K1細胞)内でHBB5及びHBB8/6標的を効率的に切断できるI-CreI洗練変異体が、実施例7、8、12、13及び14で同定された。よって、HBBメガヌクレアーゼが鎌状赤血球貧血の原因である変異を修正する効率を試験するための分子ツールを構築することが有用であった。この目的のために、ノックインマトリクス(KI)を設計して、リンパ芽球ヒトSC-1 (ATCC_CRL_8756)株化細胞のHBB遺伝子座でのI-CreI洗練変異体のヘテロ二量体組み合わせによる相同組換えの誘発を分析した。
1) 材料及び方法
a) ノックイン(KI)マトリクス
ノックインマトリクスは、2つのヒトHBB相同腕[ゲノムコンティグNT009237.17中の4032375〜4034105の1730 bpのLH HBB及び4034106〜4036242の2136 bpのRH HBB]の間にクローニングされたハイグロマイシン耐性コード配列(CDS)で構成される。4034105位は、HBB5標的内にあり(HBB5標的の11位)、配列番号4の1247位に相当する(図3)。得られたプラスミドを図29に示す。相同腕は、鎌状赤血球対立遺伝子についてホモ接合体であるヒトリンパ芽球SC-1株化細胞から精製したゲノムDNAから増幅する。ノックインマトリクスは、HBBメガヌクレアーゼにより切断されず、かつHBBタンパク質のオープンリーディングフレームを変更しないHBB6野生型改変部位を含む(図29)。ハイグロマイシン耐性遺伝子のコード配列(hygro CDS)は、SV40プロモーター領域とSV40ポリAシグナルとに機能可能に連結されている。HSVウイルスのチミジンキナーゼの発現カセットを含めて、HBB遺伝子座での相同組換え事象に相当するクローンの選択のための、ガンシクロビルに対するネガティブ選択を設定した。
b) ヒトSC-1株化細胞でのノックイン実験
ヒトリンパ芽球SC-1株化細胞(ATCC_CRL_8756)を、20%胎児ウシ血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、ファンギゾン、10 mM HEPES、1 mMピルビン酸ナトリウム、4.5 g/Lグルコース、1.5 g/L重炭酸ナトリウムを補った完全RPMI 1640培地で培養する。トランスフェクションの後に、完全培地中のハイグロマイシンを用いて選択を行う。ハイグロマイシンでの選択の10日後に、ガンシクロビルに対するネガティブ選択を行って、ハイグロマイシン及びガンシクロビルに耐性のクローンを選択する。このようなクローンを増幅し、ゲノムDNAを抽出する。
c) ノックイン事象のPCR分析
ノックイン事象は、KI特異的PCR増幅を行うための、LH HBB左側相同腕の上流のヒトHBB配列とハイグロマイシンCDSとにそれぞれ位置するプライマー対を用いるゲノムDNAに対するPCR分析により検出できる。PCR増幅フラグメントの配列決定により、鎌状赤血球貧血変異の修正の効率を決定することが可能になる。
Figure 2010534070
Figure 2010534070

Claims (43)

  1. 2つのI-CreI単量体の少なくとも一方が、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位にそれぞれ位置するLAGLIDADGコアドメインの2つの機能的サブドメイン内に1つずつ存在する少なくとも2つの置換を有し、I-CreI変異型がヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列を切断でき、少なくとも以下の：
    (a) I-CreIの26位〜40位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第1機能的サブドメイン内に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第1シリーズを構築し、
    (b) I-CreIの44位〜77位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第2機能的サブドメイン内に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第2シリーズを構築し、
    (c) 工程(a)の第1シリーズから、少なくとも、(i) I-CreI部位の-10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
    (d) 工程(b)の第2シリーズから、少なくとも、(i) I-CreI部位の-5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
    (e) 工程(a)の第1シリーズから、少なくとも、(i) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
    (f) 工程(b)の第2シリーズから、少なくとも、(i) I-CreI部位の+3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
    (g) 工程(c)及び工程(d)からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を、単一の変異型に組み合わせて、(i) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(iv) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモ二量体I-CreI変異型を得て、及び／又は
    (h) 工程(e)及び工程(f)からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を、単一の変異型に組み合わせて、(i) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(iv) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモ二量体I-CreI変異型を得て、
    (i) 工程(g)及び／又は(h)で得られた変異型を組み合わせて、ヘテロ二量体を形成し、
    (j) ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列を切断できる工程(i)からのヘテロ二量体を選択及び／又はスクリーニングする
    工程を含む方法により得ることができることを特徴とするI-CreI変異型。
  2. I-CreIの44位〜77位に位置するサブドメイン内の前記置換が、44位、68位、70位、75位及び／又は77位に位置する請求項1に記載の変異型。
  3. I-CreIの26位〜40位に位置するサブドメイン内の前記置換が、26位、28位、30位、32位、33位、38位及び／又は40位に位置する請求項1に記載の変異型。
  4. 前記置換が、元のアミノ酸の、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、Y、C、W、L及びVからなる群より選択されるアミノ酸での置き換えである請求項1〜3のいずれか1項に記載の変異型。
  5. I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位に異なる変異を有する第1及び第2単量体の会合により得られるヘテロ二量体であり、前記へテロ二量体がヒトベータグロビン遺伝子からの非パリンドロームDNA標的配列を切断できる請求項1〜4のいずれか1項に記載の変異型。
  6. 前記DNA標的が、配列番号6〜19の配列からなる群より選択される請求項5に記載の変異型。
  7. 第1及び第2単量体がそれぞれ、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位に、KSSGQS/DNSNI及びKNSTAS/QRSYR、KDSRQS/QRSNI及びKNGTQS/ARGNI、KNDYCS/QRSDK及びKNDYCS/QRSNI、KNSTAS/ARHDI及びKNSHSS/YDSRY、KNGTQS/KESYV及びKHSHQS/PRHNI、KDTYQS/QYSYI及びKNDYCS/QYSRQ、KTSGQS/QHHNI及びKNSRTS/ARHDI、KHSSQS/QYSYI及びKDSRQS/QHHDI、KNWTQS/ARHDI及びKNTCQS/ARGNI、KNTYWS/NYSRV及びKNTTQS/ARSER、KQSHQS/ARSER及びKNNGYS/QRSRQからなる群より選択されるアミノ酸を有する請求項6に記載の変異型。
  8. 第1単量体が、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位に、KNSTSS/RYSNQ、KNTCQS/RYSNQ、KNTCQS/HYSNR、KNSCHS/RYSNQ、KNSVHS/RYSNQ、KNSTRQ/NESNR、KNETQS/DASKR、KNTCQS/DASKR、KNSCHS/DASKR、KNSCQS/DASKR、KNSSSS/KASDR、KNSSRS/DASKR、KNSTRQ/DASKR、KNSVRQ/DASKR、KNSTQS/DASKR及びKNSVHQ/DASKRからなる群より選択されるアミノ酸を有し、第2単量体が、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位に、KNSGKS/QASNR、KTSHRS/KYSNY、KNSTRS/KYSNY、KNSGRS/KYSNY、KNSCRS/KYSNQ、KNSGKS/KYSNY、KNSGKS/QYSNR、KNSGKS/KYSNR、KNSGKS/KYSNQ、KQTYRS/KYSNI、KQTYRS/KYSNY、KQTYRS/QASNR、KQTYRS/KYSNQ、KNSRTS/QHHNI及びKTSRQS/KSSNYからなる群より選択されるアミノ酸を有する請求項6に記載の変異型。
  9. 第1単量体が、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位に、KNTYQS/ARSER、KNDYQS/ARSER、KNPYQS/ARSER、KNSPQS/ARSER及びKNSYQS/ARSERからなる群より選択されるアミノ酸を有し、第2単量体が、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位に、KTSHRS/KYSDT、KNSRRS/KYSDT; KNSRRS/KYSDR、KNSRRS/KYSNQ、KNSRRS/RYSNQ、KSSHRS/KYSDT、KNSSKS/KYSNQ、KNSSKS/KYSDR、KNSRRS/KYSNQ、KSSHRS/KYSDQ、KSPHRS/KYSDT、KSSHRS/KYSNQ及びKKSSQS/KESNRからなる群より選択されるアミノ酸を有する請求項6に記載の変異型。
  10. I-CreI部位の±1〜2位、±6〜7位及び／又は±11〜12位のヌクレオチドに対する変異型の特異性を改変する1つ又は複数の置換を、I-CreIの137位〜143位に含む請求項1〜9のいずれか1項に記載の変異型。
  11. ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列に対する変異型の結合及び／又は切断特性を改良する1つ又は複数の置換を、I-CreI配列全体に対して含む請求項1〜10のいずれか1項に記載の変異型。
  12. K4E、K7R、Y12H、F16L、G19S、G19A、I24V、K34R、F43L、T49A、F54L、L58Q、D60N、D60G、V64I、Y66H、S79G、E80G、E80K、I81T、K82R、K82E、H85R、N86S、F87L、Q92R、P93A、F94L、K96R、Q99R、K100R、N103S、V105A、V105I、I109V、Q111H、E117G、D120G、K121R、K121E、V125A、V129A、Q131R、I132V、K139R、T140A、T147A、V151M、L152Q、L155P、K159R、K159E、K160E、S161P、S162P及びP163Sからなる群より選択される1つ又は複数の置換を含む請求項11に記載の変異型。
  13. G19S、F54L、E80K、F87L、V105A及びI132Vからなる群より選択される1つ又は複数の置換を含む請求項12に記載の変異型。
  14. 第1及び第2単量体がそれぞれ、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位並びに付加的な位置に：
    - KNSVHQ/DASKR, 87L及び131R (第1単量体)、並びにKNSGKS/KYSNY, 19S及び117G、KQTYRS/KYSNY, 19S及び64I、KNSGKS/KYSNY, 19S及び132V、KQTYRS/KYSNY及び54L、KQTYRS/KYSNQ及び19S (第2単量体)、
    - KNSTRQ/DASKR及び19S (第1単量体)、並びにKQTYRS/KYSNY, 105A及び152Q、KQTYRS/KYSNY及び54L、KQTYRS/QASNR及び87L、KQTYRS/KYSNI及び19S (第2単量体)、
    - KNSVRQ/DASKR及び19S (第1単量体)、並びにKQTYRS/QASNR, 87L及び58Q、KQTYRS/KYSNY, 105A及び152Q、KNSGKS/KYSNY及び132V、KQTYRS/KYSNY及び54L、KQTYRS/QASNR及び87L (第2単量体)、
    - KNSVHQ/DASKR及び87L (第1単量体)、並びにKNSGKS/KYSNY及び132V、KNSGKS/KYSNY, 19S及び117G、KNSGKS/KYSNY, 19S及び132V、KQTYRS/KYSNY及び54L、KQTYRS/KYSNI及び19S (第2単量体)
    からなる群より選択されるアミノ酸を有する請求項8及び11〜13のいずれか1項に記載の変異型。
  15. 第1及び第2単量体がそれぞれ、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位並びに付加的な位置に、KNTYQS/ARSER, 19S, 80K, 85R, 87L, 96R及び139R (第1単量体)、並びにKSPHRS/KYSDT及び81T又はKTSHRS/KYSDT, 66H, 82R, 86S, 99R, 132V, 139R及び140A (第2単量体)からなる群より選択されるアミノ酸を有する請求項9及び11〜13のいずれか1項に記載の変異型。
  16. 第1単量体及び第2単量体が、以下の配列の対：それぞれ配列番号123〜135 (第1単量体)と配列番号136〜148 (第2単量体); 配列番号79 (第1単量体)と配列番号45、56、164〜177、298〜301のいずれか(第2単量体); 配列番号179〜186 (第1単量体)と配列番号57 (第2単量体); 配列番号179 (第1単量体)と配列番号197〜208、302〜306のいずれか(第2単量体); 配列番号209〜220、292〜297 (第1単量体)と配列番号164 (第2単量体); 配列番号213、214、281 (第1単量体)と配列番号277、278、279又は280 (第2単量体); 配列番号104又は114 (第1単量体)と配列番号82 (第2単量体); 配列番号105又は118 (第1単量体)と配列番号84、85、88、94及び103のいずれか(第2単量体); 配列番号113又は111 (第1単量体)と配列番号103 (第2単量体); 配列番号121 (第1単量体)と配列番号85 (第2単量体); 配列番号118 (第1単量体)と配列番号231〜255 (第2単量体); 配列番号257〜274 (第1単量体)と配列番号103 (第2単量体); 配列番号286 (第1単量体)と配列番号250、236、287、288及び289のいずれか(第2単量体); 配列番号269 (第1単量体)と配列番号290、236、237及び248のいずれか(第2単量体); 配列番号273 (第1単量体)と配列番号291、290、242、236及び237のいずれか(第2単量体); 配列番号261 (第1単量体)と配列番号242、289、287、236及び248のいずれか(第2単量体)から選択される請求項7〜15のいずれか1項に記載の変異型。
  17. 請求項16で規定される配列の1つと少なくとも95%の配列同一性を有する請求項1〜16のいずれか1項に記載の変異型。
  18. 核局在化シグナル及び／又はタグを含む請求項1〜17のいずれか1項に記載の変異型。
  19. 第1単量体がD137R変異をさらに含み、第2単量体がR51D変異をさらに含む偏性へテロ二量体である請求項5〜18のいずれか1項に記載の変異型。
  20. 第1単量体がE8R又はE8K及びE61R変異をさらに含み、第2単量体がK7E及びK96E変異をさらに含む偏性へテロ二量体である請求項5〜18のいずれか1項に記載の変異型。
  21. 請求項1〜20のいずれか1項に記載の1つの変異型の2つの単量体又はコアドメイン、或いはその両方の組み合わせを含む単鎖メガヌクレアーゼ。
  22. ペプチドリンカーで連結された請求項7、8、9、14、15及び16のいずれか1項で規定される第1及び第2単量体を含む請求項21に記載の単鎖メガヌクレアーゼ。
  23. 請求項1〜20のいずれか1項に記載の変異型又は請求項21若しくは22に記載の単鎖メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドフラグメント。
  24. 請求項23の少なくとも1つのポリヌクレオチドフラグメントを含む発現ベクター。
  25. それぞれが請求項5〜20のいずれか1項に記載のヘテロ二量体変異型の単量体の1つをコードする2つの異なるポリヌクレオチドフラグメントを含む請求項24に記載の発現ベクター。
  26. ヒトベータグロビン遺伝子に導入される配列と、請求項1、5及び6のいずれか1項で規定されるI-CreI 変異型のゲノムDNA切断部位と接するヒトベータグロビン遺伝子配列に相同な配列とを含むターゲティング構築物を含む請求項24又は25に記載のベクター。
  27. I-CreI変異型のゲノムDNA切断部位と接するヒトベータグロビン遺伝子配列に相同な前記配列が、配列番号4の508位〜707位、651位〜850位、701位〜900位、1048位〜1247位、1147位〜1346位、1524位〜1723位、1599位〜1798位、1808位〜2007位、2084位〜2283位、2094位〜2293位、2245位〜2444位、2323位〜2522位及び2523位〜2722位を含むヒトベータグロビン遺伝子のフラグメントである請求項26に記載のベクター。
  28. 導入される前記配列が、ヒトベータグロビン遺伝子内の変異を修復する配列である請求項26又は27に記載のベクター。
  29. 前記変異を修復する前記配列が、野生型ヒトベータグロビンの一部分をコードする請求項28に記載のベクター。
  30. I-CreI変異型のゲノムDNA切断部位と接するヒトベータグロビン遺伝子配列に相同な前記配列が、請求項29で規定される野生型ヒトベータグロビンの一部分をコードする配列を含む請求項26又は27に記載のベクター。
  31. 前記変異を修復する前記配列が、ヒトベータグロビンORFと、3'の転写を停止するポリアデニル化部位とを含む請求項28に記載のベクター。
  32. 前記変異を修復する前記配列が、請求項26又は27で規定されるI-CreI変異型のゲノムDNA切断部位に接するヒトベータグロビン遺伝子の配列に相同な配列で挟まれている請求項31に記載のベクター。
  33. 請求項1〜20のいずれか1項に記載の少なくとも1つの変異型、請求項21若しくは22に記載の1つの単鎖メガヌクレアーゼ、及び／又は請求項24〜32のいずれか1項に記載の1つの発現ベクターを含む組成物。
  34. 請求項26〜32のいずれか1項で規定されるターゲティングDNA構築物を含む請求項33に記載の組成物。
  35. 前記ターゲティングDNA構築物が、組換えベクターに含まれる請求項34に記載の組成物。
  36. 請求項23若しくは25で規定される少なくとも1つのポリヌクレオチドフラグメント、又は請求項24〜32のいずれか1項に記載の1つのベクターにより改変された宿主細胞。
  37. 請求項23若しくは25で規定される1つ又は2つのポリヌクレオチドフラグメントを含む非ヒトトランスジェニック動物。
  38. 請求項23若しくは25で規定される1つ又は2つのポリヌクレオチドフラグメントを含むトランスジェニック植物。
  39. 請求項1〜20のいずれか1項に記載の少なくとも1つの変異型、請求項21若しくは22に記載の1つの単鎖メガヌクレアーゼ、及び／又は請求項24〜32のいずれか1項に記載の1つの発現ベクターの、ベータ-グロビン遺伝子の変異により引き起こされる病変状態を予防、改善又は治癒するための医薬品の製造のための使用。
  40. 前記病変状態が、鎌状赤血球病及びベータ-サラセミアからなる群より選択される請求項39に記載の使用。
  41. 請求項1〜20のいずれか1項に記載の少なくとも1つの変異型、請求項21若しくは22に記載の1つの単鎖メガヌクレアーゼ、及び／又は請求項24〜32のいずれか1項に記載の1つの発現ベクターの、非治療目的でのゲノム工学のための使用。
  42. 前記変異型、単鎖メガヌクレアーゼ、又はベクターが請求項26〜32のいずれか1項で規定されるターゲティングDNA構築物と組み合わされている請求項41に記載の使用。
  43. ベータグロビン遺伝子での変異により引き起こされる遺伝性ヘモグロビン障害の動物モデルを作製するための請求項41又は42に記載の使用。
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