JP2010516685A - 軟骨形成を促進するペプチド組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
骨形成
哺乳動物の骨は、身体の構造形状を付与するばかりでなく、身体の機械的負荷を支持する身体の骨格を形成している。
変形性関節症(OA)は変性疾患であり、関節炎の中で最もよくみられる形態である(米国立関節炎、骨格筋、皮膚疾患研究所(NIAMS)、米国立衛生研究所(NIH))。OAは身体のあらゆる部位の軟骨を侵し得るが、腰および膝で最もよく見られ、より程度は低いものの指でも見られる。関節リウマチ(RA)とは異なり、OAの発生率は典型的に年齢と共に増加する。この疾患の特異的原因は不明であるが、関節の過剰な摩耗および裂傷による経年的な変性に関連している場合が多い。これは局所炎症を引き起こし得、次にこの炎症はゆっくりと軟骨を侵食し始める。身体的傷害により変性過程が加速される場合には、OAは若年者でも発症し得る(Buckwalter et al., J Orthop Sports Phy Ther 1998;28:192)。
現在、変形性関節症の治療法はなく、それが引き起こした損傷を逆転させる方法もない。関節の劣化の速度を遅らせるには、通常、身体活動の変更または体重減少による関節ストレスの軽減が推奨される。アセトアミノフェン、NSAID、および選択的シクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)阻害薬などの薬理的治療選択肢は、OAに伴う疼痛に対処するが、一時的な疼痛緩和をもたらすに過ぎず、疾患修飾性ではない。加えて、ステロイドを関節および周囲の滑液に直接注射することもできるが、この場合も同様に一時的な疼痛緩和をもたらすに過ぎず、疾患進行の改変を提供しない。滑液腔に粘着性物質を注射することも、1つの治療選択肢である。ヒアルロン酸(HA)は、関節を滑らかにするために、様々な成否の度合いで使用されている。HA産物は何回かの注射で投与し、数カ月にわたって関節痛の軽減に役立つが、OAによって生じた損傷を逆転させることはない。
本発明は、硬組織(骨および軟骨)の治療において使用するために製造されたペプチド化合物、および薬学的に許容される担体を伴う該ペプチドの製剤を含む。ペプチド化合物は、本明細書に開示するペプチドのいずれかであってよく(単独または互いに併用する)、担体は、注射液、および/または例えば8時間、12時間、24時間、2日、5日、10日、もしくはそれ以上といった長期にわたりペプチドの制御放出を提供し得る固体の生体適合性、生分解性ポリマー埋込物であってよい。
(Xは任意のアミノ酸である)という共通アミノ酸配列モチーフによって表されるペプチドの群に関する。この共通配列を共有する複数のペプチドは、骨および軟骨などの硬組織の増殖を促進することが本明細書において示される。
(Xは任意のアミノ酸である)という共通配列モチーフを共有する、SEQ ID NO:1のペプチドの下位群もまた開示する。この共通配列を共有する複数のペプチドは、骨および軟骨などの硬組織の増殖を促進することが本明細書において示される。
(Xは任意のアミノ酸である)というより大きなアミノ酸配列モチーフをさらに共有するわずかにより大きなペプチドの群もまた開示する。この共通配列を共有する複数のペプチドは、骨および軟骨などの硬組織の増殖を促進することが本明細書において示される。
を含む本発明のペプチド化合物の治療的有効量と、担体材料とを含む製剤を投与すると、膝軟骨の欠損部において新たな軟骨の形成が促進されることが実証された。
本発明の方法、ペプチド、類似体、および製剤について説明する前に、本発明は記載する特定の態様に限定されず、当然のことながらそれ自体変わり得ることが理解されるべきである。本明細書で使用する専門用語は、特定の態様を説明する目的のためのみのものであって、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定する意図はないこともまた理解されるべきである。
「ペプチド」および「ペプチド化合物」という用語は本明細書で互換的に用いられ、コードおよび非コードアミノ酸、化学的もしくは生化学的に修飾されたアミノ酸または誘導体化アミノ酸、L-アミノ酸、またはD-アミノ酸、修飾ペプチド骨格を有するペプチド、ならびにアミノ酸類似体を含むペプチドを含み得る、約10〜約50アミノ酸の重合体型アミノ酸(少なくとも20アミノ酸でありかつ50アミノ酸以下からなり得る)を指す。ペプチド化合物は:(a)天然アミノ酸残基;(b)非天然アミノ酸残基、例えばN-置換グリシン、アミノ酸置換物等;または(c)天然および非天然アミノ酸残基/置換物両方のポリマーであってよい。言い換えると、本ペプチド化合物はペプチドまたはペプトイドであってよい。ペプトイド化合物およびその調製法はWO 91/19735に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み入れられる。本発明のペプチド化合物は、23アミノ酸または18〜28アミノ酸または20〜26アミノ酸を含み得るか、またはそれからなり得る。本発明の活性アミノ酸配列は、インテグリン結合モチーフ配列;グリコサミノグリカン結合モチーフ配列;およびカルシウム結合モチーフである重複し得る3つのモチーフを含むか、またはそれらからなる。
本発明のペプチド化合物は、それらの配列内に約20〜50アミノ酸を含むペプチドであり、少なくとも20アミノ酸でありかつ50アミノ酸以下からなり得る。アミノ酸は好ましくは、20種の天然L-アミノ酸の1つである。しかしながら、D-アミノ酸が存在してもよく、同様にアミノ酸類似体が存在してもよい。
の一般的アミノ酸配列を含み、この配列のみからなってもよい。この共通配列モチーフを有するペプチドは、インビトロおよびインビボにおいて強力な硬組織形成活性を有することが本明細書において示される。
の一般的アミノ酸配列もまた含むそれらの配列内に約21〜35アミノ酸を含み、この配列のみからなってもよい。このより大きな一般的配列(SEQ ID NO:3)は、上記のより小さな一般的配列、すなわち2つめのアミノ酸残基「D」から21番目のアミノ酸残基「F」までを含む。この共通配列モチーフを有するペプチドは、インビボにおいて骨および軟骨形成活性などの強力な硬組織形成活性を示した。
の一般的アミノ酸配列を含む本発明のペプチドの例である。この一般的アミノ酸配列は、いずれもげっ歯類オーソログに対する相同性と比較して相互に比較的高い相同性を示す、ヒト、チンパンジー、マカク、およびイヌなどの比較的進化した哺乳動物種におけるAC-100に対応する配列の共通配列を示す。
などのいくつかの特徴的なモチーフを含み、骨または歯において硬組織形成活性を有するペプチドの1つとして、米国特許第6,911,425号に示されたものである。
という別の共通アミノ酸配列モチーフが、そのような活性に必須であることが本明細書において示される。
であると結論づけられた。
という同じアミノ酸配列モチーフを共有するいくつかのペプチドが、硬組織形成活性に関して強力な活性を示した。本発明の実施例3および実施例4に示されるように、同様にこのアミノ酸配列モチーフを有するSEQ ID NO:21のペプチドすなわちAC-100は、ヤギ変形性関節症モデルの膝関節において用量依存的な軟骨形成活性を示した。
上記配列のすべてまたは任意のアミノ酸はD-構造またはL-構造であってよく、また等価な類似体で置換することができる。好ましい態様は、L-構造の天然アミノ酸を含む。
本発明はまた、SEQ ID NO:21のアミノ酸配列を有するペプチドすなわちAC-100を含む、SEQ ID NO:1の共通アミノ酸配列モチーフを有するペプチド化合物の治療的有効量を投与することによって、軟骨形成を促進する方法を開示する。本発明の方法を用いて、単独でまたは担体材料と併用してペプチド化合物の有効量を投与することにより、哺乳動物の身体において、軟骨の病的なまたは外傷性の減少または欠損を伴う疾患および病態を治療または予防することができる。
本方法と共に使用するためのペプチド化合物の製剤は、インビボ法およびエクスビボ法、ならびに全身性および局所性の投与経路を含む、薬物送達に適した任意の利用可能な方法および経路を用いて個体に投与する。
使用する用量は達成すべき臨床目標に応じて変動するが、適切な用量範囲は、最大約1μg、約1,000μg、約10,000μg、約25,000μg、約50,000μg、または約100,000μgの、本発明の対象の方法と共に使用するAC-100などSEQ ID NO:1のペプチドの製剤を提供する範囲である。本発明の製剤は、単回用量で、または長期にわたる数回のより少ない用量で投与することができる。または、ペプチドの標的用量は、ペプチド投与直後の24〜48時間以内に採取した宿主血液試料中の約0.1〜1000μM、約1〜500μM、または約5〜250μMとみなすことができる。1つの態様では、製剤は一度だけ投与し、再度投与しない。
いくつかの態様において、軟骨の形成または再生を伴う疾患または病態を治療する本方法は、ペプチド化合物および少なくとも第2の治療薬を個体に投与する段階を含む。イブプロフェンまたはステロイドなどの炎症または疼痛を制御する因子は、血管新生を伴う疾患または病態に付随する腫脹および炎症を軽減するために、薬学的組成物の一部であってよい。
適切な抗炎症薬には、これらに限定されないが、ナプロキセンナトリウム、ジクロフェナクナトリウム、ジクロフェナクカリウム、セレコキシブ、スリンダク、オキサプロジン、ジフルニサル、エトドラク、メロキシカム、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナブメトン、レフェコキシブ、メトトレキセート、レフルノミド、スルファサラジン、金塩、RHo-D免疫グロブリン、ミコフェノール酸モフェチル、シクロスポリン、アザチオプリン、タクロリムス、バシリキシマブ、ダクリズマブ、サリチル酸、アセチルサリチル酸、サリチル酸メチル、ジフルニサル、サルサラート、オルサラジン、スルファサラジン、アセトアミノフェン、インドメタシン、スリンダク、メフェナム酸、メフェナム酸ナトリウム、トルメチン、ケトロラク、ジクロフェナク、フルルビプロフェン、オキサプロジン、ピロキシカム、メロキシカム、アンピロキシカム、ドロキシカム、ピボキシカム、テノキシカム、フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン、アンチピリン、アミノピリン、アパゾン、ジロートン、アウロチオグルコース、金チオリンゴ酸ナトリウム、オーラノフィン、メトトレキセート、コルヒチン、アロプリノール、プロベネシド、スルフィンピラゾン、ベンズブロマロン、ベタメタゾン、グルココルチコイドプロピオン酸誘導体、アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ブクロキシ酸、カプロフェン、フェンブフェン、フェノプロフェン、フルプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドプロフェン、ケトプロフェン、ミロプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピルプロフェン、プラノプロフェン、スプロフェン、チアプロフェン酸、チオキサプロフェン、インドメタシン、アセメタシン、アルクロフェナク、クリダナク、ジクロフェナク、フェンクロフェナク、フェンクロジン酸、フェンチアザク、フロフェナク、イブフェナク、イソキセパク、オキシピナク、スリンダク、チオピナク、トルメチン、ジドメタシン、ゾメピラック、フルフェナム酸、メクロフェナム酸、メフェナム酸、ニフルミン酸、トルフェナム酸、ジフルニサル、フルフェニサル、イソキシカム、ピロキシカム、スドキシカム、テノキシカム、アセチルサリチル酸、スルファサラジン、アパゾン、ベズピペリロン、フェプラゾン、モフェブタゾン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、セレコキシブ、およびロフェコキシブが含まれる。
一般に、ペプチド化合物製剤は、宿主に送達するための薬学的に許容される組成物中に調製する。本発明のペプチドとの使用に好ましい薬学的に許容される担体には、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、および乳濁液が含まれ得る。非水性溶媒の例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルがある。水性担体には、水、アルコール/水溶液、乳濁液、または生理食塩水および緩衝培地を含む懸濁液が含まれる。非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖リンゲル液、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または不揮発性油が含まれる。静脈内媒体には、液体および栄養補充剤、電解質補充剤(ブドウ糖加リンゲル液に基づくものなど)等が含まれる。本発明のペプチドを含む組成物は、当技術分野で周知の手段により凍結乾燥した後に、再構成して本発明に従って使用することもできる。また、リポソーム送達用の製剤、およびマイクロカプセル化されたペプチド化合物を含む製剤も対象となる。
インビボにおける軟骨形成の促進を達成するために(例えば、治療的軟骨形成の状況において)、ペプチド化合物製剤は、好ましくは薬学的に許容される担体と共に、任意の適切な様式で投与することができる。本発明の状況における本発明のペプチド化合物を含む製剤を対象に投与する様々な適切な方法が利用できること、および複数の経路を用いて特定の化合物を投与することができるが、特定の経路によって、別の経路よりもより迅速で、より効果的で、および/または伴う副作用がより少ないものを提供できることを、当業者は容易に理解するであろう。一般に、ペプチド化合物製剤は、例えば非経口、皮下(subcutaneous)、静脈内、動脈内、心膜内、筋肉内、腹腔内、関節内、経皮(transdermal)、経皮(transcutaneous)、皮下(subdermal)、皮内、または肺内経路により、本発明の方法に従って投与することができる。
以下の実施例は、当業者に本発明の作製法および使用法の完全な開示および説明を提供するために提示するものであり、本発明者らが自身の発明と見なす範囲を制限することを意図するものではなく、下記の実験が実施した実験のすべて、または実施した実験のみを示していることを意図するものでもない。使用した数字(例えば、量、温度等)に関しては正確性を期すよう努力したが、いくらかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。特記しない限り、割合は重量割合であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏、圧力は大気圧またはその近傍である。
SEQ ID NO:34のペプチドを、ヒト間葉系幹細胞(hMSC)を使用する増殖アッセイ法で試験した。このアッセイ法では、AC-100が、骨形成タンパク質-2(BMP-2)およびインスリン様増殖因子-1(IGF-1)と比較して同様の活性レベルを示している、(Nigel, et. al., Journal of Cellular Biochemistry 93(6):1107-1114, 2004)。本実験でも、同様のプロトコールおよび陽性対照を使用した。
の共通アミノ酸配列を共有するペプチドが、AC-100と同等のレベルの硬組織形成活性を有すると結論づけられた。
導入
正常な関節軟骨は、衝撃を吸収し、負荷に耐え、可動関節に関節連結表面を提供するように機能する。関節軟骨組織の組成は、関節表面上の解剖学的位置、年齢、および表面からの深さによって異なる(Lipshitz H, Etheredge R 3d and Glimcher MJ. In vitro wear of articular cartilage. J Bone Joint Surg [AM], 1975 Jun, 57:4, 527-34)。関節軟骨は、外傷性のまたは病的な苦痛の後に自己再生する能力がないという点で、他の筋骨格組織と異なる。疾患または外傷が関節軟骨の健康に影響を及ぼすと、回避不能な変性過程が生じ得る(Convery FR, Akeson WH, and Keown GH. The repair of large osteochondral defects. An experimental study in horses. Clin Orthop, 1972 Jan, 82:, 253-62)。軟骨が変性する過程において、間隙水の量は増加し、プロテオグリカン含量は減少し、プロテオグリカンの凝集も減少する(McDevitt CA and Muir H. Biochemical changes in the cartilage of the knee in experimental and natural osteoarthritis in the dog. J Bone Joint Surg [Br], 1976 Feb, 58:1, 94-101)。プロテオグリカン含量が減少すると、軟骨は軟化し(Kempson GE, Spivey CJ, Swanson SA and Freman MA. Patterns of cartilage stiffness of normal and degenerate human femoral heads. J Biomech, 1971 Dec, 4:6, 597-609;Jurvelin J, Kiviranta I, Tammi M and Helminen JH. Softening of canine articular cartilage after immobilization of the knee joint. Clin Orthop, 1986 Jun:, 207, 246-52)、損傷を起こしやすくなる。成人の関節軟骨は無血管性で、たった5%の細胞しかないため、この組織の治癒は達成するのが非常に困難である(Bora FW Jr. and Miller G. Joint physiology, cartilage metabolism, and the etiology of osteoarthritis. Hand Clin, 1987 Aug, 3:3, 325-36)。
以下の情報を提供する。
試験物質名 生理食塩水とコラーゲンスポンジ
被験物質の解析法 手術時に、200μl生理食塩水(0μl AC-100)をスポンジに吸収させる。0.5 mL生理食塩水を、手術した後膝関節に3週間にわたり週に1度注射する。
埋込物 およそ直径6 mm×厚さ6 mm
試験物質名 25 mg AC-100とコラーゲンスポンジ(図3および4のHDすなわち高用量)
被験物質の解析法 手術時に、200μlのAC-100、200 mg/mlをスポンジに吸収させる。0.5 mLのAC-100 80 mg/mL(200μlのAC-100、200 mg/mlに相当)を、手術した後膝関節に3週間にわたり週に1度注射する。
埋込物 およそ直径6 mm×厚さ6 mm
試験物質名 2.5 mg AC-100とコラーゲンスポンジ(図3および4のLDすなわち低用量)
被験物質の解析法 手術時に、200μlのAC-100、20 mg/mlをスポンジに吸収させる。0.5 mLのAC-100 8 mg/mL(200μlのAC-100、20 mg/mlに相当)を、手術した後膝関節に3週間にわたり週に1度注射する。
埋込物 およそ直径6 mm×厚さ6 mm
コラーゲンスポンジは無菌で提供した。スポンジは、収縮約30%を考慮して、欠損部の大きさに打ち抜くかまたは切った。手術時に、被験物質をスポンジに吸収させてから、欠損部に埋め込んだ。埋込物の手術時に使用しない余分な物質は、いずれも-20℃で凍結した。被験物質の分割量を、複数回の注射用に提供した。
本試験には、全部で15頭の骨格的に成熟した雌スペインヤギを使用した。これらの動物は、認可されたUSDA供給元から取得した。ヤギの体重は、試験開始時に50〜80 lbであった。
固有の番号タトゥーまたは耳標により、各動物を識別した。
動物は、識別番号のランダム割り付けに基づいて、3群のうちの1つに割り当てた。
試験設計を以下に示す。
単一の全層軟骨欠損を右側後肢の後膝関節に形成した。病変部位は、前内側大腿顆に位置した。基本的な外科的手技はいずれの対象についても同じであった。手術はすべて、厳密な無菌状態下で行った。周術期抗生物質および麻酔前投薬は、外科医の裁量で使用した。麻酔はケタミン-キシラジンの混合物で誘導し、イソフルランおよび酸素のガス状混合物で維持した。
術後1、2、および3週間の時点で、適切な被験物質0.5 mLを、各動物の手術した膝関節に注射した。
動物は、術後84日(12週)目または168日(24週)目に、人道的に屠殺した。屠殺直前に体重を記録した。ケタミン-キシラジンの混合物で深麻酔を誘導し、AVMA安楽死委員会(JAVMA, March, 2000)に記載されている指針に従って、対象を放血させた。
解剖の直後、および肉眼的な関節表面の観察後に、関節を10%リン酸緩衝ホルマリン(少なくとも10倍量)中に少なくとも48時間置いた。10%リン酸緩衝ホルマリン中で固定した後、標本を肉眼的に切り取り余分な組織を除去した。
表4の注記:本ヤギ試験において、組織が「4=硝子軟骨」とスコア化された場合、組織は本質的に硝子軟骨からのみなり、微量の線維軟骨も含まなかった。修復組織の性質を「3=主に硝子軟骨」とするスコア化は、線維軟骨をいくらか微量に有するが、視覚的に決定して25%未満である切片に付与した。「2=硝子軟骨と線維軟骨が混合」というスコアは、およそ75%ヒアリン/25%線維性から25%ヒアリン/75%線維性まで様々な、ヒアリンおよび線維性組織を両方有する修復組織に付与した。「1=主に線維軟骨」というスコアは、いくらか微量(25%未満)のヒアリンを示すが、事実上主として線維性である修復組織に付与した。「0=いくらかは線維軟骨で、主に非軟骨細胞」というスコアは、ヒアリン組織を全く示さない修復組織に付与した。
肉眼的評価において、変性関節軟骨変化は、手術した膝関節と反対側の膝関節との間で良好に一致した。いくつかの例では、反対側の膝で認められた変性変化は同じスコアであったが、対応する手術した膝と比較してより小さな領域が侵されていた。顆溝接合部および遠位滑車溝(大腿骨溝)は、ほぼ同等の変性変化を示した。MFC病変部位と同じ位置の領域およびこれに隣接する領域おいて、骨増殖症が認められた。これは、対象処置群ならびに高用量群および低用量群で認められた。歴史的対照もまた、欠損部と同じ位置でおよびこれに隣接してこの骨増殖症を示し、これが生体力学の変化および結果として生じたおおまかな適応リモデリングによるものであることが示唆され、修復組織は、術後12週の時点(「A」群)でヤギ6頭中4頭のMFC病変部位で検出され、また術後24週時(「B」群)のMFC領域の9部位中9部位で検出された。一般に、修復組織の存在に関して、2A、3A、2B、および3B群は、より良好な肉眼的スコアに反映されるように良好であった。肉眼的に見て、1A群(生理食塩水)における病変は、本質的に空であると等級付けされた。より長期の1B群(生理食塩水)動物における病変は、いくらかの修復組織、おそらくは線維軟骨を示し、これが肉眼的スコアに一役買った。MFC病変部位の周囲の関節軟骨のわずかな陥没が、一般的に認められた。12週の時点では、MFC病変部位の周りにわずかな〜顕著な陥没が認められ、処置した欠損部のいずれも周囲の軟骨に対して平坦ではなかった。24週の対象も病変部位の周りに陥没を示し、肉眼的に見て動物9頭中5頭でわずかであり、動物9頭中2頭で顕著であり、および動物9頭中2頭では平坦であった。組織像により、これは、欠損を形成する際の深さ6 mmの軟骨下骨穿孔に起因すると考えられる。
12週の時点で、AC-100濃度A+コラーゲンスポンジで処置した軟骨欠損は、対照群(250μl生理食塩水+コラーゲンスポンジ)およびAC-100濃度B+コラーゲンスポンジ群(それぞれスコア9.0おおよび10.0)よりもわずかに良好な治癒結果(最大スコア28のうち平均スコア13.5)を示した。軟骨欠損の充填は、主に線維増多/線維増殖によるものであった。調べた切片すべてにおいて、埋込物は1つまたは複数の嚢胞性空間を含み、埋込物の表面は隣接する関節表面に対してくぼんでいた。
全層軟骨欠損モデル±微小破壊におけるAC-100の複数回関節内注射および濃度の効果:ヤギの膝での検討
関節内注射でのAC-100の効果を、ヤギ後膝関節における軟骨病変治癒に対して評価した。AC-100処置は、微小破壊および非微小破壊欠損の治癒を、用量依存的様式で有意に改善した。修復組織で覆われた欠損部の%面積と掛け合わせることによって、肉眼的形態生スコアを正規化スコアに変換した。図5は、正規化スコア 対 ミリグラム表示でのAC-100の投与量を示す。グラフから、AC-100が、インビボにおいて硬組織増殖に対する用量依存的再生効果を誘導することが示される。
被験物質1:AC-100 5 mg
試験物質名 AC-100 5mg/注射
供給業者 Acologix, Inc.
ロット番号 2K06028
試験物質名 AC-100 25mg/注射
供給業者 Acologix, Inc.
ロット番号 2K06028
試験物質名 AC-100 125mg/注射
供給業者 Acologix, Inc.
ロット番号 2K06028
試験物質名 滅菌生理食塩水
供給業者 AmTech
ロット番号 511471F
動物
本試験には、全部で36頭の骨格的に成熟した雌スペインヤギを使用した。
基本的な手技はいずれの対象についても同じであった。注射はすべて、厳密な無菌状態下で行った。術前に、血清解析のために血液試料を採取した。注射期の抗生物質として、手技の開始時に240万単位のBicillin(登録商標)を筋肉内投与した。ケタミン-キシラジンの混合物で、短時間の麻酔を誘導した。後膝関節に標準的な外側傍膝蓋アプローチを行った。滑液を解析用に採取し、凍結した。内側滑車顆隆線と並ぶ、内側顆溝接合部の遠位10 mmの位置に、全層軟骨欠損(ACD1/2)を形成した。この手技のために開発された特殊な器具を使用して、6 mm欠損を形成した。6 mm全層欠損を形成した後、関節包を閉鎖した。この時点で、2インチ×20ゲージの滅菌針を、前内側アプローチにより関節内の空間に導入した。外側大腿顆の内壁を感知し、針をわずかに後ろに引いた。適量(1.5 mL)の適切な試験物質を関節内に注射した。針を抜き、注射部位で圧力を維持した。次に、皮下および皮膚を複数層で縫合閉鎖した。
動物は、42+2日(6週)目に人道的に屠殺した。屠殺前に、血清解析のために血液試料を採取した。屠殺直前に体重を記録した。ケタミン-キシラジンの混合物で深麻酔を誘導し、AVMA安楽死委員会(JAVMA, March 2000)に記載されている指針に従って、対象を放血させた。
膝関節の採取および死後MRIの後、関節を開放し、写真撮影を行い、関節軟骨の表面を剖検シートに記述されている標準的な手順に従ってスコア化した。滑膜を任意の炎症についたて調べた。修復組織で覆われた欠損部の%面積を掛け合わせることによって、肉眼的形態生スコアを正規化スコアに変換した。
解剖の直後、および肉眼的な関節表面の評価後に、以下の組織を関節から採取した:後部滑液嚢および右内側大腿顆。これらの組織を10%リン酸緩衝ホルマリン(少なくとも10倍量)中に少なくとも48時間置き、組織学的処理のために送った。
Claims (25)
- ペプチドが軟骨増殖を増強する生物活性によってさらに特徴づけられる、請求項1記載の化合物。
- 薬学的に許容される担体と共に使用するために製造された、請求項1記載の化合物。
- 担体が、化合物と組み合わせて注射可能な生理食塩水溶液である、請求項6記載の化合物。
- 担体が、哺乳動物と生体適合性のある生体適合性ポリマーである、請求項6記載の化合物。
- 担体が生体適合性であり、ペプチドの持続放出を提供する、請求項8記載の化合物。
- 担体が、欠損部において骨または軟骨の形成を促進するために外科的手技によって骨または軟骨の欠損部に埋め込み可能となるように製造されたコラーゲンスポンジを含む、請求項8記載の化合物。
- 全身投与用に製造された、請求項6記載の化合物。
- 局所投与用に製造された、請求項6記載の化合物。
- 皮下、静脈内、動脈内、心膜内、および関節内注射から選択される注射による投与用に製造された、請求項6記載の化合物。
- 欠損部の硬組織の再生を促進するために、硬組織欠損部に担体上のペプチドを埋め込む外科的手技による埋め込みによる投与用に製造された、請求項12記載の化合物。
- 軟骨形成を刺激するために製造され、かつSEQ ID NO:21を有する、請求項14記載の化合物。
- 変形性関節症または関節リウマチにおける軟骨欠損の治癒を加速させるために製造された、請求項1記載の化合物。
- 注射用製剤として関節内注射による投与用に製造された、請求項6記載の化合物。
- 軟骨の欠損部への埋め込み可能な担体材料中のペプチドの、外科的手技による埋め込みによる投与用に製造された、請求項6記載の化合物。
- 軟骨が異常に欠損している対象を治療するために製造された、請求項6記載の化合物。
- 軟骨細胞の増殖および分化が異常に欠損している対象を治療するために製造された、請求項6記載の化合物。
- 関節リウマチに罹患している対象を治療するために製造された、請求項6記載の化合物。
- 変形性関節症に罹患している対象を治療するために製造された、請求項6記載の化合物。
- 抗炎症薬の治療的有効量と共に投与するために製造された、請求項6記載の化合物。
- 軟骨細胞またはその前駆細胞においてシクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)を活性化することによって軟骨形成を促進するために製造された、請求項6記載の化合物。
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