JP2005525104A - ビタミンd欠乏の治療のための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
技術分野
本発明は、ビタミンD代謝を操作するために使用され得るペプチドに関する。より具体的には、本発明は、ビタミンDの活性型であるカルシトリオールを生成させる25-ヒドロキシビタミンD3 1α-水酸化酵素活性を刺激し増加させるデントニンペプチドに関する。
ビタミンDは、カルシウムとリン酸とのバランスの維持、及び骨鉱化作用において大きな役割を果たしているホルモンである。ビタミンD欠乏は、成人においても子供においても、くる病及び骨軟化症を引き起こす。いずれの状態も、弱い骨及び骨の奇形へと至る、骨基質である類骨の石灰化の失敗を特徴とする。ビタミンDの活性型、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(カルシトリオールとしても知られる)は、分子の炭素鎖の1α位にヒドロキシル基を置く1α-水酸化酵素(1α-OHase)によって達成される水酸化反応を通して、不活性の25-モノヒドロキシビタミンD3から作成される。24-水酸化酵素(24-OHase)による前駆物質25-モノヒドロキシビタミンD3の水酸化は、活性型の化合物を「迂回」する経路を引き起こす。24-水酸化酵素によるカルシトリオールの水酸化は、カルシトリオールを不活化し、そのさらなる代謝を開始させる。
本発明は、細胞内の25-ヒドロキシビタミンD3 1α-水酸化酵素活性を増加させ、それによって、カルシトリオール(活性ビタミンD又は1α,25ジヒドロキシビタミンD3)レベルを増加させる生物学的活性を有していることを特徴とするペプチドを提供する。そのペプチドは、天然に存在するマトリックス細胞外リン糖タンパク質(PHEX)の残基242〜264位によって画定された連続配列に関連した配列を有する。本発明のペプチドを使用して25-ヒドロキシビタミン1α-水酸化酵素遺伝子発現及びカルシトリオールレベルを調整する方法も、提供される。本発明の方法を実施するためのキットも、提供される。本発明の組成物及び方法は、パジェット病、くる病、骨粗鬆症、腎性骨形成異常、及び乾癬のようなビタミンD関連障害の治療を含む多様な適用において使用可能である。
又はその変種を含み、配列番号:2〜18のペプチドのうちのいずれかの配列を有し得る。本発明のポリペプチドは、配列番号:1の少なくとも15個の連続アミノ酸残基に少なくとも60%関連している配列を有していてもよく、又は式:
(式中、X1〜X7は、独立に、任意のアミノ酸である)を有していてもよい。
との少なくとも約60%を有しているペプチド又はペプチドアナログを含む製剤の投与によって実施される、ビタミンD代謝と関係があるか又はビタミンD欠損によって引き起こされた疾患の治療のための方法である。
「治療する」、「治療すること」、及び「治療」等の用語は、本明細書において交換可能に使用され、所望の薬理学的及び/又は生理学的な効果を得ることを意味する。その効果は、疾患もしくはその症状を完全もしくは部分的に防止するという点で予防的であってもよいし、かつ/又はビタミンDの効果の増強のように、疾患及び/もしくは疾患に起因する有害な効果を部分的もしくは完全に治癒させるという点で治療的であってもよい。本明細書において使用されるように「治療すること」には、脊椎動物、特に哺乳動物、特にヒトにおける疾患の治療が内含され、(a)疾患の素因を有しているが、未だそれを有していると診断されていない対象において疾患が発生するのを防止すること;(b)疾患を阻害すること、即ちその進展を阻止すること;又は(c)疾患を軽減させること、即ち疾患の退行を引き起こすことが含まれる。
本発明は、細胞内の25-ヒドロキシビタミンD3 1α-水酸化酵素活性を増加させ、それによって、カルシトリオール(活性ビタミンD)レベルを増加させる生物学的活性を有していることを特徴とするペプチドを提供する。そのペプチドは、天然に存在するマトリックス細胞外リン糖タンパク質(PHEX)の残基242〜264位によって画定された連続配列に関連した配列を有する。本発明のペプチドを使用して、25-ヒドロキシビタミン1α-水酸化酵素遺伝子発現及びカルシトリオールレベルを調整する方法も、提供される。本発明の方法を実施するためのキットも、提供される。本発明の組成物及び方法は、パジェット病、くる病、骨粗鬆症、腎性骨形成異常、及び乾癬のようなビタミンD関連障害の治療を含む多様な適用において使用可能である。
本発明は、活性ビタミンD生合成の最終工程を触媒する酵素である25-ヒドロキシビタミンD3 1α-水酸化酵素の発現を調整する(即ち、増加又は減少させる)生物学的活性を特徴とするペプチドを提供する。そのようなポリペプチドは、「デントニン」ポリペプチドと名付けられ、一般に、NCBIアクセッション番号AAK70343によって定義されるような天然に存在するマトリックス細胞外リン糖タンパク質(PHEX)の残基242〜264位によって画定された連続アミノ酸配列に関連した配列を有する。そのため、デントニンペプチドは、配列
を含むか、又は1α-水酸化酵素活性を調整する能力を保持している配列番号:1に関連した変種ペプチドである。1α-水酸化酵素活性を調整する能力が、「デントニン活性」であり、その増加は、通常、24-水酸化酵素活性を有意に増加させない。
(X1〜X7は任意のアミノ酸である)によって記載される。ある種の態様において、デントニンペプチドは、式:
(X1〜X2は任意のアミノ酸であり、かつX3はM、L、I、又はVである)によって記載される。その他のある種の態様において、デントニンペプチドの式は、
(X1はD又はGであり、X2はD又はGであり、X3はI、V、又はMであり、X4はP又はSであり、X5はG又はDであり、X6はD又はGであり、かつX7はD又はGである)である。上記の各式中、文字は標準的な一アミノ酸記号を使用したアミノ酸に対応し、Zm及びZnは各々任意のアミノ酸の連続系列であり、n又はmは、各々独立に、0(即ち、アミノ酸なし)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、約10超、約20超、約30超、約40超、約50超、約80超、又は約100超、又はそれ以上、最大約500又はそれ以上のアミノ酸である。
当業者は、単一又は複数のアミノ酸の置換、付加、又は欠失を作成することにより、前記のペプチドの配列を修飾することにより、デントニン活性を有するペプチドを調製し得る。これらの変化は、一般的には、ペプチドの折り畳み又は活性に有意に影響を与えない保存的アミノ酸置換のような、重要性の低い性質の変化である。例えば、トレオニンのようなある極性アミノ酸は、セリンのようなもう一つの極性アミノ酸と置換され得;又は、アスパラギン酸のようなある酸性アミノ酸は、グルタミン酸のようなもう一つの酸性アミノ酸と置換され得;又は、リジン、アルギニン、もしくはヒスチジンのような塩基性アミノ酸は、もう一つの塩基性アミノ酸と置換され得;又は、アラニン、ロイシン、もしくはイソロイシンのような無極性アミノ酸は、もう一つの無極性のアミノ酸と置換され得る。いかなるアミノ酸変化が表現型的にサイレントであるかに関する案内は、Bowie,J.U.ら、「タンパク質配列内のメッセージの解読:アミノ酸置換に対する許容性(Deciphering the Message in Protein Sequences:Tolerance to Amino Acid Substitutions)」、Science 247:1306-1310(1990)に見出され得る。当然、当業者が作成するであろうアミノ酸置換の数は、多くの要因に依存する。さらに、機能にとって不可欠なデントニンのアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発のような当技術分野において既知の方法により同定され得る(Cunningham&Wells,Science 244:1081-1085(1989))。後者の手順は、分子内のすべての残基に単一アラニン変異を導入する。次いで、得られた変異分子が、生物学的活性に関して試験される。
本発明は、デントニンをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、並びにそれを含有しているベクター及び宿主細胞をさらに提供する。多くの態様において、本発明の核酸は、デントニンのコーディング配列を含む。遺伝暗号が既知であり、デントニンの配列が本明細書に記載されているため、これらの核酸の設計及び作製は、十分に当業者の技術の範囲内である(参照、例えばAusubelら、Short Protocols in Molecular Biology、第3版、Wiley&Sons、1995;Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、(1989)Cold Spring Harbor、N.Y.)。
デントニンは、当技術分野において周知の方法を使用して、単離又は合成され得る。そのような方法には、ペプチドの作製のための組み換えDNA法及び化学合成法が含まれる。適当な宿主細胞におけるペプチドをコードする核酸配列の発現によってペプチドを作製する組み換え法は、当技術分野において周知であり、例えば、参照として本明細書に組み込まれるサンブルック(Sambrook)ら(Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、第1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York(1989))に記載されている。
細菌
細菌における発現系には、Changら、Nature(1978)275:615;Goeddelら、Nature(1979)281:544;Goeddelら、Nucleic Acids Res.(1980)8:4057;欧州特許第0 036,776号;米国特許第4,551,433号;DeBoerら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1983)80:21-25;及びSiebenlistら、Cell(1980)20:269に記載されたものが含まれる。
酵母における発現系には、Hinnenら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1978)75:1929;Itoら、J.Bacteriol.(1983)153:163;Kurtzら、Mol.Cell.Biol.(1986)6:142;Kunzeら、J.Basic Microbiol.(1985)25:141;Gleesonら、J.Gen.Microbiol.(1986)132:3459;Roggenkampら、Mol.Gen.Genet.(1986)202:302;Dasら、J.Bacteriol.(1984)158:1165;De Louvencourtら、J.Bacteriol.(1983)154:737;Van den Bergら、Bio/Technology(1990)8:135;Kunzeら、J.Basic Microbiol.(1985)25:141;Creggら、Mol.Cell.Biol.(1985)5:3376;米国特許第4,837,148号及び第4,929,555号;Beach及びNurse、Nature(1981)300:706;Davidowら、Curr.Genet.(1985)10:380;Gaillardinら、Curr.Genet.(1985)10:49;Ballanceら、Biochem.Biophys.Res.Commun.(1983)112:284-289;Tilburnら、Gene(1983)26:205-221;Yeltonら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1984)81:1470-1474;Kelly及びHynes,EMBO J.(1985)4:475479;欧州特許第0 244,234号;及び国際公開公報第91/00357号に記載されたものが含まれる。
昆虫における異種遺伝子の発現は、米国特許第4,745,051号;The Molecular Biology Of Baculoviruses(1986)(W.Doerfler編)の中のFriesenら、「バキュロウイルス遺伝子発現の制御(The Regulation of Baculovirus Gene Expression)」;欧州特許第0 127,839号;欧州特許第0 155,476号;及びVlakら、J.Gen.Virol.(1988)69:765-776;Millerら、Ann.Rev.Microbiol.(1988)42:177;Carbonellら、Gene(1988)73:409;Maedaら、Nature(1985)315:592-594;Lebacq-Verheydenら、Mol.Cell.Biol.(1988)8:3129;Smithら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1985)82:8844;Miyajimaら、Gene(1987)58:273;及びMartinら、DNA(1988)7:99に記載されたようにして達成される。多数のバキュロウイルス株及び異型、並びに宿主由来の対応する許容性昆虫宿主細胞が、Luckowら、Bio/Technology(1988)6:47-55、Millerら、Generic Engineering(1986)8:277-279、及びMaedaら、Nature(1985)315:592-594に記載されている。
哺乳動物発現は、Dijkemaら、EMBO J.(1985)4:761、Gormanら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1982)79:6777、Boshartら、Cell(1985)41:521、及び米国特許第4,399,216号に記載されたようにして達成される。哺乳動物発現のその他の特色は、Ham及びWallace、Meth.Enz.(1979)58:44、Barnes及びSato、Anal.Biochem.(1980)102:255、米国特許第4,767,704号、第4,657,866号、第4,927,762号、第4,560,655号、国際公開公報第90/103430号、国際公開公報第87/00195号、米国再発行特許第30,985号に記載されたようにして助長される。
デントニンは、化学合成により、例えば、参照として本明細書に組み込まれるメリフィールド(Merrifield)ら(J.Am.Chem.Soc.85:2149(1964))の固相ペプチド合成法により、作製され得る。当技術分野において周知の標準的な溶液法も、本発明において有用なペプチドを合成するために使用され得る(例えば、各々参照として本明細書に組み込まれるBodanszky、Principles of Peptide Synthesis、Springer-Verlag、Berlin(1984)及びBodanszky、Peptide Chemistry、Springer-Verlag、Berlin(1993)を参照のこと)。新たに合成されたペプチドは、例えば高速液体クロマトグラフィ(HPLC)により精製され得、例えば質量分析又はアミノ酸配列分析を使用して特徴決定され得る。
本発明は、細胞内の25-ヒドロキシビタミンD3 1α-水酸化酵素(「1α-水酸化酵素」)活性及び/又はカルシトリオールレベルを増加させる方法を提供する。多くの態様において、その方法は、細胞内又は宿主内のカルシトリオール量を調整するため、細胞内の1α-水酸化酵素活性を調整する有効量の1個以上の活性薬剤と、細胞を接触させることを含む。ある種の態様において、1個以上の活性薬剤は、デントニンを含む。いくつかの態様において、所望の増加は、1α-水酸化酵素mRNAレベル、1α-水酸化酵素タンパク質レベル、又は1α-水酸化酵素酵素活性の増加である。
本発明の方法の実施においては、有効量の活性薬剤が宿主へ投与される。ここで、「有効量」という用語は、所望の結果を生じるのに十分な投薬量を意味し、所望の結果とは、1α-水酸化酵素活性及び/又はカルシトリオールレベルの所望の調整、例えば、増強、縮小である。
本発明は、宿主内の1α-水酸化酵素活性及び/又はカルシトリオールレベルを調整する薬剤を含む、薬学的製剤を含む製剤を提供する。一般に、製剤は、宿主内の1α-水酸化酵素活性を調整する薬剤を有効量含む。「有効量」とは、所望の結果、例えば、1α-水酸化酵素活性発現のレベルの増加及び/又はカルシトリオールの増加等を生じるのに十分な量をさす。多くの態様において、所望の結果は、少なくとも、表現型がより正常に近づくような、対照と比較した表現型の縮小又は増加である。
本発明の方法において、1個以上の活性薬剤は、宿主内の1α-水酸化酵素活性及び/又はカルシトリオールレベルの所望の増加をもたらし得る任意の便利な手段を使用して、宿主へ投与され得る。
使用される投薬量は、達成すべき臨床目標に依って変動するであろうが、適当な投薬量範囲は、対象動物におけるビタミンD関連障害の症状を縮小させる薬剤を最大1μg〜1,000μg又は約10,000μg提供するものである。
従来の、薬学的に許容される投与経路には、鼻腔内、筋肉内、気管内、腫瘍内、皮下、皮内、局所適用、静脈内、直腸、鼻、経口、及びその他の非経口の投与経路が含まれる。投与経路は、所望により組み合わせられ得、又は薬剤及び/もしくは所望の効果に依って調整され得る。組成物は、単回投与されてもよいし、又は複数回投与されてもよい。ある種の態様において、製剤は、例えば、直接注射、又は腎動脈への注射を通して、宿主の腎臓へ投与される。
ある種の態様において、薬剤は核酸である。核酸は、ウイルス性及び非ウイルス性の送達媒体を含むいくつかの異なる媒体を使用して送達され得る。
本発明のポリヌクレオチドは、ウイルス性送達媒体と会合させられ得る。本明細書において使用されるように、「ウイルス性送達媒体」とは、送達すべきポリヌクレオチドが、ウイルス粒子内のキャプシドに包囲されていることをさす。
本発明のポリヌクレオチドは、非ウイルス性送達媒体を使用して投与され得る。「非ウイルス性送達媒体」(本明細書において「非ウイルスベクター」とも呼ばれる)とは、本明細書において使用されるように、裸のポリヌクレオチド又は凝縮したポリヌクレオチド(例えば、ポリヌクレオチドとカチオン性化合物(例えば、デキストラン硫酸)との製剤)、及びウイルス粒子のような佐剤と混合された裸のポリヌクレオチド又は凝縮したポリヌクレオチド(即ち、目的のポリヌクレオチドはウイルス粒子内に含有されていないが、形質転換製剤は、裸のポリヌクレオチドとウイルス粒子(例えば、アデノウイルス粒子)との両方から構成されている)を含有している化学的製剤を含むものとする(例えば、Curielら、1992 Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.6:247-52参照)。従って、「非ウイルス性送達媒体」には、ウイルス粒子が目的ポリヌクレオチドを含有していない、ポリヌクレオチド+ウイルス粒子から構成されたベクターが含まれ得る。「非ウイルス性送達媒体」には、送達すべきポリヌクレオチドが、ウイルス粒子内のキャプシドに包囲されていない、又はウイルス粒子内に含有されていない、細菌プラスミド、ウイルスゲノム又はその一部が含まれ、構築物には、ウイルスゲノムの一部と、細菌プラスミド及び/又はバクテリオファージの一部とが含まれる。その用語には、天然及び合成のポリマー及びコポリマーも包含される。その用語には、さらに、脂質に基づく媒体が包含される。脂質に基づく媒体には、フェルグナー(Felgner)ら(米国特許第5,264,618号及び第5,459,127号;PNAS 84:7413-7417,1987;Annals N.Y.Acad.Sci.772:126-139,1995)によって開示されたようなカチオン性リポソームが含まれ;それらは、シュレイアー(Schreier)ら(米国特許第5,252,348号及び第5,766,625号)によって開示されたような人工ウイルスエンベロープを含む、中性もしくは負の電荷を有するリン脂質又はそれらの混合物からなっていてもよい。
送達すべきポリヌクレオチドは、DNA-リポソーム又はRNA-リポソーム複合体製剤として製剤化され得る。そのような複合体は、正電荷(静電的相互作用)によって遺伝材料(DNA又はRNA)と結合する脂質の混合物を含む。本発明において使用され得るカチオン性リポソームには、3β-(N-(N',N'-ジメチル-アミノエタン)-カルバモイル)-コレステロール(DC-Chol)、1,2-ビス(オレオイルオキシ-3-トリメチルアンモニオ-プロパン(DOTAP)(例えば、国際公開公報第98/07408号参照)、リジニルホスファチジルエタノールアミン(L-PE)、リポスペルミンのようなリポポリアミン、N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(ドデシルオキシ)-1-プロパナミニウム(propanaminium)ブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDAB)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、N(1,2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル-N,N,N-トリエチルアンモニウム(DOTMA)、DOSPA、DMRIE、GL-67、GL-89、リポフェクチン、及びリポフェクタミン(Thieryら(1997)Gene Ther.4:226-237;Felgnerら、Annals N.Y.Acad.Sci.772:126-139,1995;Eastmanら、Hum.Gene Ther.8:765-773,1997)が含まれる。米国特許第5,858,784号に記載されたポリヌクレオチド/脂質製剤も、本明細書に記載された方法において使用され得る。これらの脂質の多くは、例えば、ベーリンガー・マンハイム(Boehringer-Mannheim)及びアバンティ・ポーラー・リピッヅ(Avanti Polar Lipids)(Birmingham,AL)より商業的に入手可能である。米国特許第5,264,618号、第5,223,263号、及び第5,459,127号に見出されるカチオン性リン脂質も、包含される。使用され得るその他の適当なリン脂質には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルイノシトール等が含まれる。コレステロールも含まれ得る。
本発明は、宿主細胞内の核酸発現を調整する方法をさらに提供する。一般に、これらの方法は、細胞内の1α-水酸化酵素プロモーター(プロモーターの例は、Shinkiら、PNAS 1999 96:6988-6993;Yoshidaら、J Am Soc Nephrol.2002;Brenzaら、Proc Natl Acad Sci U S A.1998 95:1387-91、及び配列番号:19に記載されている)に機能的に連結された1個以上の標的核酸の発現を調整することを含む。ある種の態様において、1α-水酸化酵素プロモーターへ機能的に連結された標的核酸を含むベクター構築物が、発現カセットが形成されるよう調製され、ベクターが、細胞、特に腎細胞へ移入される。次いで、核酸の発現を達成するために、細胞はデントニンと接触させられる。ある種の態様において、核酸はポリペプチドをコードし、そのため、そのような方法は、宿主細胞における1個以上のポリペプチドの作製において有用である。発現カセットを含有しているベクターを作成するための方法、及びそのようなベクターのための発現系は、当技術分野において一般に周知である(例えば、Ausubelら、Short Protocols in Molecular Biology、第3版、Wiley&Sons、1995;Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、(1989)Cold Spring Harbor、N.Y.参照)。
宿主内の1α-水酸化酵素活性及び/又はカルシトリオールレベルを増加させる本発明の組成物及び方法は、多様な治療プロトコルにおいて使用可能である。一般に、これらのプロトコルは、宿主内のカルシトリオールを増加させ、宿主を治療するため、1α-水酸化酵素活性を調整する有効量の1個以上の活性薬剤を、そのような治療を必要とする宿主(例えば、ビタミンD関連状態に罹患している宿主、又はビタミンDレベルの増加により治療可能な状態を有する宿主)へ投与することを含む。
前記のような本発明の方法を実施するためのキットも、本発明によって提供される。本発明のキットは、前記のようなデントニンを少なくとも含む薬学的調製物を1個以上少なくとも含む。その他の場合により含まれ得るキットの成分には、注射器又はその他の投与装置が含まれる。キットの様々な成分は、所望により、別々のコンテナの中に存在してもよいし、又はある種の適合性の成分が単一のコンテナへ予め組み合わせられていてもよい。多くの態様において、活性薬剤の単位用量、例えば経口用量又は注射可能用量を含むキットが提供される。多くの態様において、本発明の組成物は、リン酸緩衝生理食塩水、トリス、グリセロール等のような媒体内に含有されている。
以下の実施例は、本発明を作成し使用するための方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために示され、本発明者らが本発明と見なすものの範囲を制限するためのものではなく、また、以下の実施例が実施された全ての又は唯一の実験であることを表すものでもない。使用された数値(例えば、量、温度等)に関しては正確さを保証するよう努力がなされたが、いくつかの実験誤差及び偏差は斟酌されるべきである。特記しない限り、割合は重量の割合であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、そして圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。
細胞培養、RNA調製、及びcDNA合成:CL-8細胞(1.6×106個)を60mm培養皿に置き、5%FCS D-MEM/HamF-12(1:1)培地中で48時間培養した。この培地を、FCSを含まない0.5mM Ca定義培地(D-MEM/HamF-12(13:87)、インスリン5μg/ml、トランスフェリン5μg/ml、Na2SeO3 5ng/ml、T3 0.37nM、EGF 2.5ng/ml、ヒドロコルチゾン1nM)に交換した。24時間後、配列番号:1のペプチド(100ng/ml又は500ng/ml)又はPTH 100nMを添加し、5時間培養した。処理後、各ウェルの全細胞内容物をRNA抽出及び逆転写(RT)に使用した。RNAは、製造業者のプロトコルに従い、ISOGEN(Nippon Gene、Japan)を使用して単離した。精製されたRNAを、10μlのRNaseを含まない水に再溶解させ、RTによるcDNA合成に使用した。RTは、10mMトリス緩衝液(pH8.3)、50mMのKCl、5mMのMgCl2、各1mMのdATP、dGTP、dCTP、及びdTTP、20UのRNase阻害剤、1μMの逆方向プライマー、及び5UのAMV逆転写酵素を含有している、20μlの反応混合物において実施した。反応混合物は、30℃で10分、55℃で15分、95℃で5分、その後5℃で5分インキュベートした。
デントニンペプチドによる1α-水酸化酵素mRNA発現の制御
1α-水酸化酵素mRNA発現の制御に対する配列番号:1のペプチドの効果を研究するため、CL-8細胞を、配列番号:1のペプチドの存在下及び非存在下で増殖させ、1α-水酸化酵素に対するペプチドの効果を定量した。図1a及び1bは、これらの実験のグラフ化された結果を示す。図1aは、PTHなしで増殖させられた細胞への100ng/mlの配列番号:1のペプチドの添加が、1α-水酸化酵素mRNAのレベルをおよそ200%増加させることを示している。PTHなしで増殖させられた細胞への500ng/mlの配列番号:1のペプチドの添加は、1α-水酸化酵素mRNAのレベルをおよそ500%増加させる(p<0.05)。図1bは、配列番号:1のペプチドが、細胞が100nM PTHの存在下で増殖させられた場合、1α-水酸化酵素mRNAのレベルをさらには増加させないことを示している。従って、配列番号:1のペプチドは、1α-水酸化酵素遺伝子発現の強力な誘導剤である。1α-水酸化酵素遺伝子はカルシトリオールの生合成経路の最終工程をコードするため、その発現の増加は、1α-水酸化酵素の量を増加させ、カルシトリオールの合成の速度を増加させ、細胞内及び循環血中のカルシトリオールのレベルの増加をもたらすであろうと予想されよう。
1α-水酸化酵素mRNA発現を制御するためにプロテインキナーゼAを必要としないデントニン
PTH及び配列番号:1のペプチドは、1α-水酸化酵素mRNAの発現を誘導する。CL-8細胞を、プロテインキナーゼA阻害剤である化合物H-89の存在下又は非存在下で、配列番号:1のペプチドの存在下又は非存在下で、又はPTHと共に増殖させ、PTHの配列番号:1のペプチドによる1α-水酸化酵素の誘導に対するH-89の効果を調査した。実施例1と同じ実験系において、細胞が分裂した時点で、第1の実験においては、H-89を細胞に添加せず、100nmolの濃度のPTH、又は100もしくは500ng/mlいずれかの濃度の配列番号:1のペプチドを、細胞に添加した。平行の第2の実験においては、10uMの濃度のH-89を、100nmolの濃度のPTH、又は100もしくは500ng/mlいずれかの濃度の配列番号:1のペプチドと共に細胞に添加した。細胞を、さらに5時間増殖させ、RNAを採集し、1α-水酸化酵素の発現レベルを、標準的なノーザンブロッティング又はRT-PCRの手法を使用して、各試料において決定した。
24-水酸化酵素mRNA発現を誘導しないデントニン
24-水酸化酵素は、カルシトリオールの直前の前駆物質である25-モノヒドロキシビタミンD3、又はカルシトリオール自体を水酸化する酵素である。前駆物質の場合、24位における水酸化は、活性型の化合物を「迂回」する経路を引き起こす。活性カルシトリオールの水酸化は、その化合物を不活化する。
1α,25-ジヒドロキシビタミンD3と組み合わせられた場合、24-水酸化酵素mRNA発現を誘導しないデントニン
カルシトリオール(1α,25-ジヒドロキシビタミンD3)は24-水酸化酵素mRNA発現の既知の誘導剤である。カルシトリオールの24-水酸化酵素mRNA誘導効果に対する配列番号:1のペプチドの効果を決定するため、CL-8細胞を前記のように増殖させ、10-9Mの濃度の1α,25-ジヒドロキシビタミンD3を細胞に添加し、配列番号:1のペプチドを、細胞に添加しないか、又は100もしくは500ng/mlいずれかの濃度で細胞に添加した。細胞をさらに5時間増殖させ、RNAを前記の方法を使用して採集し、24-水酸化酵素mRNAの発現レベルを、前記の方法を使用して、各試料において決定した。図4に示されるように、24-水酸化酵素mRNAのレベルの有意な増加が、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3の添加によって観察された。しかしながら、その後の100又は500ng/mlいずれかの配列番号:1のペプチドの添加は、24-水酸化酵素mRNAの発現レベルに対し効果を及ぼさなかった。これらの結果は、その他のメカニズムによる誘導がある場合にも、又はない場合にも、配列番号:1のペプチドが24-水酸化酵素mRNA発現に全く影響を与えないことを示唆している。
デントニンペプチドのインビボ効果
配列番号:1のデントニンペプチドのインビボ効果を研究するため、異なる用量のペプチドを霊長類に皮下注射した後、血清1α,25-ジヒドロキシビタミンD3レベルを研究した。注射されたペプチドの血清レベルも調べた。
Claims (22)
- 25-ヒドロキシビタミンD3 1α-水酸化酵素活性を誘導する生物学的活性を特徴とする、デントニンを含む単離されたポリペプチド。
- デントニンが、配列番号:1〜18のうちのいずれか一つの15個の連続アミノ酸と少なくとも50%同一である、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
- 配列番号:1〜18のうちのいずれか一つの少なくとも15個の連続アミノ酸を含む、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
- 配列番号:1のアミノ酸配列を含む、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
- ビタミンD 24-水酸化酵素活性を有意に誘導しない生物学的活性をさらに特徴とする、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
- カルシトリオール量を増加させる生物学的活性をさらに特徴とする、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
- 請求項1記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
- 細胞を請求項1記載の単離されたポリペプチドと接触させる段階を含む、細胞における25-ヒドロキシビタミンD3 1α-水酸化酵素活性を増加させるための方法であって、
該細胞において、25-ヒドロキシビタミンD3 1α-水酸化酵素活性が、請求項1記載の単離されたポリペプチドと接触させられていない細胞と比較して増加する、方法。 - ビタミンD 24-水酸化酵素活性が細胞において有意に誘導されない、請求項9記載の方法。
- 細胞が哺乳動物宿主の細胞である、請求項9記載の方法。
- 治療的有効量の請求項1記載のポリペプチドを含む製剤。
- 担体をさらに含む、請求項12記載の製剤。
- 担体が生理食塩水溶液であり、かつ製剤が注射可能である、請求項13記載の製剤。
- 対象におけるカルシトリオールのレベルを増加させるための方法であって、該カルシトリオールのレベルを増加させるため、治療的有効量の請求項12記載の製剤を該対象に投与する段階を含む、方法。
- 治療を必要とする対象を治療するための方法であって、該対象を治療するため、治療的有効量の請求項12記載の製剤を該対象に投与する段階を含む、方法。
- 対象がビタミンD関連状態を有している、請求項16記載の方法。
- 状態が、くる病、骨軟化症、骨粗鬆症、パジェット病、骨減少症、骨硬化症又は腎性骨形成異常、乾癬、髄様癌、アルツハイマー病、上皮小体機能亢進症、上皮小体機能低下症、偽性上皮小体機能不全、二次性上皮小体機能不全、糖尿病、肝硬変、閉塞性黄疸又は薬物誘導性代謝、グルココルチコイド拮抗、高カルシウム血症、吸収不良症候群、脂肪便、慢性腎疾患、低リン酸血症性ビタミンD抵抗性くる病、ビタミンD依存性くる病、I型くる病、II型くる病、サルコイドーシス、白血病、前立腺癌、乳癌、結腸癌、臓器移植、骨折、非脱灰歯、又は免疫障害である、請求項17記載の方法。
- 疾患が、骨粗鬆症、パジェット病、骨軟化症、くる病、腎性骨形成異常、上皮小体機能亢進症、高カルシウム血症、I型くる病、II型くる病、及び骨折である、請求項18記載の方法。
- (a)単離されたデントニンポリペプチド;及び
(b)標的核酸へ機能的に連結された25-ヒドロキシビタミンD3 1α-水酸化酵素プロモーター
を含む、細胞における標的核酸発現を増加させるための系であって、該デントニンが、該1α-水酸化酵素プロモーターの活性を誘導して該標的核酸の発現を増加させる系。 - 細胞における標的核酸の発現を増加させる方法であって、
標的核酸を1α-水酸化酵素プロモーターへ機能的に連結して発現カセットを形成する段階;
該発現カセットを細胞に移入する段階;及び
細胞を請求項1記載の単離されたポリペプチドと接触させて、該標的核酸の発現を増加させる段階
を含む方法。 - 細胞が腎細胞である、請求項21記載の方法。
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