JP2010510812A - 細胞イメージング法に基づく、ｈｂｖカプシドタンパク質と表面タンパク質との間の相互作用を用いたｈｂｖ増殖抑制物質のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＨＢＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ）増殖に必要なカプシドタンパク質と表面タンパク質間の相互作用（結合度）を細胞イメージングで測定してＨＢＶの増殖抑制物質をスクリーニングする方法で、詳細には、ＨＢＶの表面タンパク質のＰｒｅＳドメインと細胞膜標的化機能のＰＨ（Ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）ドメインの配列を含む融合タンパク質、該融合タンパク質と相互作用するカプシドタンパク質と蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む融合タンパク質間の相互作用によって細胞イメージングの変化を測定する方法に関するものである。本発明のＨＢＶ増殖に必要なタンパク質間の相互作用を細胞レベルでスクリーニングする方法を使用して、新しいＨＢＶの増殖抑制物質を細胞レベルでのスクリーニングに有効に使用することができる。
Description
本発明は、ＨＢＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ）の増殖に必要なカプシドタンパク質と表面タンパク質との間の相互作用（結合度）を細胞イメージングで測定して、ＨＢＶの増殖抑制物質をスクリーニングする方法であり、より詳細には、ＨＢＶの表面タンパク質のＰｒｅＳドメインと細胞膜標的化機能のＰＨ（Ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）ドメインの配列を含む融合タンパク質と、該融合タンパク質と相互作用するカプシドタンパク質と蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む融合タンパク質との間の相互作用による細胞イメージングの変化を測定して、ＨＢＶ増殖を抑制する物質をスクリーニングする方法に関するものである。
ＨＢＶは、Ｂ型肝炎を誘発するヘパドナウイルス科系統のウイルスであり、世界中の約２億人に達する人々がＨＢＶ保有者である。ＨＢＶに対するワクチンは、すでに開発されて広く普及しているが、すでに感染した人を治療するための治療剤としては、ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）とインターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）のみが使用されている。この中でラミブジンは、ＨＢＶのＤＮＡポリメラーゼの活性を抑制する特性があるが、長期投与すると耐性のあるウイルスが発生するため、その適用が制限されている。したがって、より多様なＨＢＶ治療剤の開発が求められている。
今まで、Ｂ型肝炎ウイルスの抑制物質として、インターフェロン、核酸誘導体または免疫調節物質などが開発されてきたが、満足に値する効能を有したものは、ほとんどないのが実情であり、Ｂ型肝炎ウイルスの増殖を抑制する物質として、ウイルスが受容体に付着することを阻害したり、ウイルスの活性タンパク質やポリメラーゼを特異的に阻害したりする物質を探索する研究が行なわれてきた。最近、ＨＢＶタンパク質の多様な活性を抑制する物質の開発が試みられている。ＨＢＶが感染した細胞において、ＨＢＶの組み立てのためには、ＨＢＶのカプシド（ｃａｐｓｉｄ）タンパク質と表面タンパク質との相互作用が必要である。ＨＢＶのカプシドタンパク質は、ＨＢＶ核酸と結合して、直径３０ｎｍの大きさのヌクレオカプシド粒子を構成する。ＨＢＶの表面タンパク質として、一つの遺伝子（Ｓ ｇｅｎｅ）から三種類のＬ、Ｍ、Ｓタンパク質が生合成された後、細胞内ＥＲ脂質膜で発現し、前記ヌクレオカプシドと特異的結合をし、同時にＥＲの脂質膜がＨＢＶヌクレオカプシドを取り囲みながら、完成した形態のＨＢＶ粒子を形成するようになる（Ｖｏｌｋｅｒ Ｂ＆Ｄｏｎ Ｇ、ＰＮＡＳ ＵＳＡ，１９９１年，第８８巻，１０５９−１０６３頁）。このような過程で、ＨＢＶヌクレオカプシドの表面に存在するカプシドタンパク質と表面タンパク質、特にＰｒｅＳと命名されたＬタンパク質のＮ−末端のアミノ酸残基１−１６３に該当するドメインとの間の選択的な結合が、ＨＢＶ粒子の形成を誘発するようになり、このような二つのタンパク質間の相互作用は、ＨＢＶの増殖を抑制する物質の開発の標的となり得る。このようなＨＢＶのカプシドタンパク質と表面タンパク質との間の相互作用をスクリーニングするために、組換えタンパク質を使用した免疫アッセイが開発された（Ａｓｉｆ−Ｕｌｌａｈ Ｍ等，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ，２００６年，第７０巻，８５−９０頁）。前記方法は、大腸菌で発現した組換えタンパク質を使用することによって特徴付けられる。
しかし、最近の新薬開発過程において、化合物の生理活性を測定する方法として、精製された標的タンパク質の活性を測定する方法以外に、細胞を対象に標的タンパク質の活性を測定する方法が活発に模索されている。標的細胞における化合物の生理活性を測定する方法は、目的とする生理活性を測定すると同時に、化合物の細胞透過性と毒性を同時に検出することができる長所があり、より効果的なスクリーニング方法として認識されている。
ＨＢＶが感染した細胞内で、ＨＢＶのカプシドタンパク質とＨＢＶ核酸を含むヌクレオカプシド粒子は、細胞の小胞体膜に発現したＨＢＶの表面タンパク質と特異的結合をしながら活性を有する完成したＨＢＶ粒子を形成するようになる。このようなＨＢＶタンパク質間の結合は、ＨＢＶのカプシドタンパク質と表面タンパク質のＰｒｅＳドメインとの間の選択的な相互作用によって決定される。したがって、ＨＢＶのカプシドタンパク質と表面タンパク質のＰｒｅＳドメインとの間の結合を細胞レベルで測定することができれば、前記測定方法を細胞スクリーニング方法に使用して、これらタンパク質間の結合を抑制する化合物を効果的にスクリーニングすることができる。このような活性を有する化合物は、ＨＢＶ増殖を抑制することができる機能を有するものであり、したがって、ＨＢＶによって誘発される肝炎治療剤として用いることができる。
本発明は、ＨＢＶの表面タンパク質のＰｒｅＳドメインと細胞膜標的化（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）機能のＰＨ配列を含む融合タンパク質、前記タンパク質と相互作用するカプシドタンパク質と蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む融合タンパク質を使用して、これらタンパク質の相互作用によって蛍光シグナルの細胞分布が変化するようになり、これを蛍光顕微鏡で測定する方法に関するものである。本発明は、ＨＢＶ増殖に必要なタンパク質間の相互作用を細胞レベルでスクリーニングする方法であり、新しいＨＢＶの増殖抑制物質を細胞レベルでスクリーニングするのに有効に用いることができる。
したがって、本発明者等は、ＨＢＶのカプシドタンパク質と表面タンパク質との相互作用を細胞レベルで測定することができる方法を開発して、ＨＢＶのカプシドタンパク質と表面タンパク質との間の相互作用を阻害してウイルス増殖を抑制することができる物質をスクリーニングするのに有効に用いることができることを確認して、本発明を完成した。
本発明の目的は、細胞レベルでＨＢＶカプシドタンパク質と表面タンパク質との間の相互作用を測定して、効果的にＨＢＶの増殖を抑制することができる物質をスクリーニングする方法を提供することである。
前記目的を達成するために、本発明は、ＨＢＶのカプシドタンパク質に蛍光タンパク質が連結された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および、ＨＢＶの表面タンパク質のＰｒｅＳドメインに細胞膜標的化機能を遂行することができるあるタンパク質ドメインが連結された融合タンパク質をコードする他のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
また本発明は、前記発現ベクターまたはＨＢＶの表面タンパク質のＰｒｅＳドメインに細胞膜標的化機能を遂行することができるあるタンパク質ドメインが連結された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む第１発現ベクター、および、前記融合タンパク質と相互作用するＨＢＶのカプシドタンパク質に蛍光タンパク質が連結された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む第２発現ベクターが共に形質導入された動物細胞を提供する。
さらに本発明は、１）培養中に前記動物細胞に候補物質を処理する工程、２）蛍光顕微鏡を使用して、工程１）で発現した蛍光タンパク質の蛍光イメージを得る工程、および、３）細胞質の蛍光イメージに位置付けられた候補物質を選別する工程を含む、ＨＢＶの増殖を抑制する物質をスクリーニングする方法を提供する。
併せて、本発明は、前記動物細胞を含むＨＢＶの増殖を抑制する物質のスクリーニングキットを提供する。
本発明のＨＢＶ増殖に必要なタンパク質間の相互作用をスクリーニングする方法は、新しいＨＢＶの増殖抑制物質を細胞レベルでスクリーニングするのに有効に使用することができる。
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明は、ＨＢＶのカプシドタンパク質に蛍光タンパク質が連結された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および、ＨＢＶの表面タンパク質のＰｒｅＳドメインに細胞膜標的化機能を遂行することができるタンパク質ドメインが連結された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクターを提供する。
前記発現ベクターは、骨格ベクターにＨＢＶのカプシドタンパク質に蛍光タンパク質が連結された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および、ＨＢＶの表面タンパク質のＰｒｅＳドメインに細胞膜標的化機能を遂行することができるタンパク質ドメインが連結された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが連結して含まれる。本発明の方法で使用できる骨格ベクターは、動物細胞形質導入に使用可能な任意のベクターを使用することができ、特に制限されるものではないが、ｐＢｕｄ−ＣＥ４．１、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ４およびｐＥＦ６からなる群から選択されるものが好ましい。本発明の好ましい態様において、ｐＢｕｄ−ＣＥ４．１を使用した。
前記カプシドタンパク質は、カプシドタンパク質全長または表面タンパク質と相互作用することができるフラグメントであり得る。本発明の好ましい態様において、配列番号１９のアミノ酸配列のＨＢＶのカプシドタンパク質の中で、ｐｒｏ配列（ｐｒｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を除外した部位（アミノ酸３０−２１４）を使用した。
前記蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）および強化された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）などを例示することができるが、これらに制限されず、本発明の好ましい態様では、ＧＦＰを使用した。
前記表面タンパク質は、表面タンパク質のＰｒｅＳドメインの全長または、カプシドタンパク質と相互作用することができるＰｒｅＳドメインのフラグメント若しくはコアタンパク質と相互作用することができる９３番アミノ酸から１１７番アミノ酸の範囲のドメインが欠失したＨＢＶの表面タンパク質のＰｒｅＳドメインのフラグメントであることができる。本発明の好ましい態様では、カプシドタンパク質と相互作用することができる表面タンパク質の配列番号２０で表されるアミノ酸配列を有するＰｒｅＳドメインを使用した。また、他の好ましい態様では、前記ＰｒｅＳドメインから、コアタンパク質と相互作用する９３番アミノ酸から１１７番アミノ酸のドメインが欠失したドメインを使用した。
前記細胞膜標的化機能を遂行することができるタンパク質ドメインは、ＰＬＣ−δ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ ｄｅｌｔａ）のＰＨ（Ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）ドメイン（Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：２４１２７６、アミノ酸２−１７５）、ＥＥＡ１（ｅａｒｌｙ ｅｎｄｏｓｏｍｅ ａｎｔｉｇｅｎｅ１）のＦＹＶＥ（Ｎｏ ｆｕｌｌ ｎａｍｅ）ドメイン（Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：Ｌ４０１５７、アミノ酸１３５２−１４１０）、ＩＮＧ２（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ２）のＰＨＤ（Ｐｒｏｌｙｌ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）ドメイン（Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：ＮＭ＿００１５６４、アミノ酸２１２−２６１）、タンパク質キナーゼＣのＣ２（ｃａｌｃｉｕｍ／ｌｉｐｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ）ドメイン（Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：ＮＭ００２７３７、アミノ酸１７２−２６０）およびグアニンヌクレオチド交換因子ＤＢＳ（Ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｆａｃｔｏｒ ＤＢＳ）のＳＥＣ１４（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）ドメイン（Ｇｅｎｅｎｂａｎｋ ＩＤ：ＡＢ＿１１６０７４、アミノ酸９０−２３６）などを例示することができるが、これに制限されず、本発明の好ましい態様では、ＰＬＣ−δのＰＨドメインを使用した。
前記ＨＢＶのカプシドタンパク質に蛍光タンパク質が連結された融合タンパク質は、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する（図２ｂ参照）。前記配列番号４で表されるアミノ酸配列は、配列番号３で表される塩基配列によってコードされることを特徴とする。
前記ＨＢＶの表面タンパク質のＰｒｅＳドメインに細胞膜標的化機能を遂行することができるタンパク質ドメインが連結された融合タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する（図２ａ参照）。前記配列番号２で表されるアミノ酸配列は、配列番号１で表される塩基配列によってコードされることを特徴とする。
また、他の本発明の好ましい態様では、ＨＢＶの表面タンパク質のＰｒｅＳドメインは、前記ＰｒｅＳドメインの、コアタンパク質と相互作用する９３番アミノ酸から１１７番アミノ酸までを除去したドメインと代替して使用可能である。すなわち、コア領域と相互作用するＰｒｅＳドメインの９３番アミノ酸から１１７番アミノ酸までを除去したタンパク質ドメインに、細胞膜標的化機能を遂行することができるタンパク質ドメインが連結された融合タンパク質は、配列番号６で表されるアミノ酸配列を有する（図２ｃ参照）。前記配列番号６で表されるアミノ酸配列は、配列番号５で表される塩基配列によってコードされることを特徴とする。
ＨＢＶのカプシドタンパク質ドメインに蛍光タンパク質が連結された融合タンパク質およびＨＢＶの表面タンパク質のＰｒｅＳドメインに細胞膜標的化機能を遂行することができるタンパク質ドメインが連結された融合タンパク質を同時に発現することができる発現ベクター（ｐＨＢｓＰＨ−ＨＢｃＧＦＰ、図４ｂ参照）を使用したものより、ＨＢＶのカプシドタンパク質ドメインに蛍光タンパク質が連結された融合タンパク質およびＰｒｅＳドメインのコアタンパク質と相互作用する９３番アミノ酸から１１７番アミノ酸までを除去したタンパク質ドメインに細胞膜標的化機能を遂行することができるタンパク質ドメインが連結された融合タンパク質を発現することができる発現ベクター（ｐΔＨＢｓＰＨ−ＨＢｃＧＦＰ、図４ｃ参照）を使用した場合、コアタンパク質と表面タンパク質の相互作用を排除することで、さらに特異的にカプシドタンパク質と表面タンパク質の相互作用を観察することができる（図４参照）。
本発明のカプシドタンパク質ドメインは、蛍光タンパク質と連結して使用することができ、前記表面タンパク質のＰｒｅＳドメインは、細胞膜標的化機能を遂行することができるタンパク質ドメインと連結して使用することができる（図１参照）。前記蛍光タンパク質と連結されたカプシドタンパク質ドメインが、細胞膜標的化機能を遂行することができるタンパク質ドメインと連結された表面タンパク質のＰｒｅＳドメインと結合することで、蛍光タンパク質と連結されたカプシドタンパク質ドメインは、細胞質から細胞膜に移動することができる（図３参照）。ＰｒｅＳ由来のペプチドによってカプシドタンパク質ドメインとＰｒｅＳドメインの相互作用が抑制されて、カプシドタンパク質に連結された蛍光タンパク質の蛍光イメージが、細胞膜ではなく細胞質に位置することを確認することで（図５および図６参照）、本発明の蛍光タンパク質と連結されたカプシドタンパク質ドメインと細胞膜標的化機能を遂行することができるタンパク質ドメインと連結された表面タンパク質のＰｒｅＳドメインの結合が、特異的であることを確認した。
また、本発明は、前記発現ベクターに形質導入された動物細胞を提供する。
前記動物細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＯＳ７、ＨｅＬａおよびＣＨＯなどを例示することができるが、これらに制限されず、本発明の好ましい態様では、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用した。
前記動物細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＯＳ７、ＨｅＬａおよびＣＨＯなどを例示することができるが、これらに制限されず、本発明の好ましい態様では、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用した。
また、本発明は、ＨＢＶの表面タンパク質のＰｒｅＳドメインに細胞膜標的化機能を遂行することができるタンパク質ドメインが連結された融合タンパク質（以下、ＰｒｅＳ−ＰＨ）をコードするポリヌクレオチドを含む第１発現ベクター、および前記融合タンパク質と相互作用するＨＢＶのカプシドタンパク質ドメインに蛍光タンパク質が連結された融合タンパク質（以下、カプシド−ＧＦＰ）をコードするポリヌクレオチドを含む第２発現ベクターが共に形質導入された動物細胞を提供する。
本発明の好ましい実施態様では、ＰｒｅＳ−ＰＨとカプシド−ＧＦＰは、起源が異なるベクターに各々クローニングされて一つの動物細胞に共同形質導入することで、共同発現することができる。
また、本発明は、１）前記動物細胞を培養しながら候補物質を処理する工程と、２）蛍光顕微鏡を使用して工程１）で発現した蛍光タンパク質の蛍光イメージを撮影する工程、および、３）蛍光イメージが細胞質に位置するようにする候補物質を選別する工程とを含む、ＨＢＶの増殖を抑制する物質をスクリーニングする方法を提供する。
同時に、本発明は、前記動物細胞を含むＨＢＶの増殖を抑制する物質のスクリーニングキットを提供する。
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
但し、下記の実施例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
但し、下記の実施例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞発現ベクター製造
＜１−１＞ｐＣａｐｓｉｄ−ＧＦＰ遺伝子の製造
ＨＢＶカプシドタンパク質の中でｐｒｏ配列を除外したドメイン（アミノ酸３０−２１４）（配列番号１９）を含むｐＨＢｃＡｇ（Ｃｈｏｉ ＫＪ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２００４年，第３１９巻，９５９−６６頁）を鋳型にして、配列番号７と配列番号８のプライマー対を使用してＤＮＡ重合連鎖反応法（ＰＣＲ）で、９５℃、１分；５５℃、３０秒；７２℃、１分の条件で２５回反復して合成した後、ＳａｌＩとＫｐｎＩのＤＮＡ制限酵素で切断した後、同じ制限酵素で切断したｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ベクターに、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して挿入して、カプシド−ＧＦＰが含まれたプラスミドであるｐＣａｐｓｉｄ−ＧＦＰを製造した。このＤＮＡを鋳型に、配列番号９と配列番号１０のプライマー対を使用してＤＮＡ重合連鎖反応法でＮｏｔＩとＸｈｏＩのＤＮＡ制限酵素を含んだカプシド−ＧＦＰ ＤＮＡ断片を作った。合成されたカプシド−ＧＦＰとｐＢｕｄ−ＣＥ４．１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国）をＮｏｔＩとＸｈｏＩのＤＮＡ制限酵素で切断した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して連結してｐＨＢｃ−ＧＦＰ（図２ｂ）を製造し、ＤＮＡ塩基配列を分析して配列番号４で表されるアミノ酸を暗号化する配列番号３のカプシド−ＧＦＰ ＤＮＡが適切に挿入されたことを確認した。
＜１−１＞ｐＣａｐｓｉｄ−ＧＦＰ遺伝子の製造
ＨＢＶカプシドタンパク質の中でｐｒｏ配列を除外したドメイン（アミノ酸３０−２１４）（配列番号１９）を含むｐＨＢｃＡｇ（Ｃｈｏｉ ＫＪ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２００４年，第３１９巻，９５９−６６頁）を鋳型にして、配列番号７と配列番号８のプライマー対を使用してＤＮＡ重合連鎖反応法（ＰＣＲ）で、９５℃、１分；５５℃、３０秒；７２℃、１分の条件で２５回反復して合成した後、ＳａｌＩとＫｐｎＩのＤＮＡ制限酵素で切断した後、同じ制限酵素で切断したｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ベクターに、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して挿入して、カプシド−ＧＦＰが含まれたプラスミドであるｐＣａｐｓｉｄ−ＧＦＰを製造した。このＤＮＡを鋳型に、配列番号９と配列番号１０のプライマー対を使用してＤＮＡ重合連鎖反応法でＮｏｔＩとＸｈｏＩのＤＮＡ制限酵素を含んだカプシド−ＧＦＰ ＤＮＡ断片を作った。合成されたカプシド−ＧＦＰとｐＢｕｄ−ＣＥ４．１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国）をＮｏｔＩとＸｈｏＩのＤＮＡ制限酵素で切断した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して連結してｐＨＢｃ−ＧＦＰ（図２ｂ）を製造し、ＤＮＡ塩基配列を分析して配列番号４で表されるアミノ酸を暗号化する配列番号３のカプシド−ＧＦＰ ＤＮＡが適切に挿入されたことを確認した。
＜１−２＞ＰｒｅＳ−ＰＨ遺伝子の製造
マウスｃＤＮＡを鋳型に、配列番号１１と配列番号１２のプライマー対を使用してＰＬＣ−δ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ ｄｅｌｔａ）のＰＨドメイン（Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：２４１２７６，アミノ酸２−１７５）をＤＮＡ重合連鎖反応法（ＰＣＲ）で、９５℃、１分；５５℃、３０秒；７２℃、１分の条件で２５回反復して合成した。ｐＴｒｘ−ＰｒｅＳ（Ｃｈｏｉ ＫＪ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２００４年，第３１９巻，９５９−６６頁）を鋳型に、配列番号１３と配列番号１４のプライマー対を使用してＨＢＶ表面タンパク質の中でＰｒｅＳドメイン（アミノ酸１−１６３）（配列番号２０）を有するＤＮＡをＤＮＡ重合連鎖反応法（ＰＣＲ）で、９５℃、１分；５５℃、３０秒；７２℃、１分の条件で２５回反復して合成した。前記方法で得たＰｒｅＳをコードするＤＮＡとＰＨをコードするＤＮＡを鋳型に、配列番号１５と配列番号１６のプライマー対を使用してＤＮＡ重合連鎖反応法（ＰＣＲ）で、９５℃、１分；５５℃、３０秒；７２℃、１分の条件で２５回反復してＰｒｅＳ−ＰＨ ＤＮＡを合成した。ここで、前記二つの鋳型ＤＮＡがオーバーラップしてＰＣＲが遂行された。増幅されたＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩのＤＮＡ制限酵素で切断した後、同じ制限酵素で切断したｐＨＢｃ−ＧＦＰにＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用して連結して、配列番号２で表されるアミノ酸を暗号化する配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡを含むｐＨＢｓＰＨ−ＨＢｃＧＦＰ（図２ｂ）を製造し、ＤＮＡ塩基配列を分析して増幅されたＤＮＡが適切に挿入されたことを確認した。
マウスｃＤＮＡを鋳型に、配列番号１１と配列番号１２のプライマー対を使用してＰＬＣ−δ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ ｄｅｌｔａ）のＰＨドメイン（Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：２４１２７６，アミノ酸２−１７５）をＤＮＡ重合連鎖反応法（ＰＣＲ）で、９５℃、１分；５５℃、３０秒；７２℃、１分の条件で２５回反復して合成した。ｐＴｒｘ−ＰｒｅＳ（Ｃｈｏｉ ＫＪ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２００４年，第３１９巻，９５９−６６頁）を鋳型に、配列番号１３と配列番号１４のプライマー対を使用してＨＢＶ表面タンパク質の中でＰｒｅＳドメイン（アミノ酸１−１６３）（配列番号２０）を有するＤＮＡをＤＮＡ重合連鎖反応法（ＰＣＲ）で、９５℃、１分；５５℃、３０秒；７２℃、１分の条件で２５回反復して合成した。前記方法で得たＰｒｅＳをコードするＤＮＡとＰＨをコードするＤＮＡを鋳型に、配列番号１５と配列番号１６のプライマー対を使用してＤＮＡ重合連鎖反応法（ＰＣＲ）で、９５℃、１分；５５℃、３０秒；７２℃、１分の条件で２５回反復してＰｒｅＳ−ＰＨ ＤＮＡを合成した。ここで、前記二つの鋳型ＤＮＡがオーバーラップしてＰＣＲが遂行された。増幅されたＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩのＤＮＡ制限酵素で切断した後、同じ制限酵素で切断したｐＨＢｃ−ＧＦＰにＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用して連結して、配列番号２で表されるアミノ酸を暗号化する配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡを含むｐＨＢｓＰＨ−ＨＢｃＧＦＰ（図２ｂ）を製造し、ＤＮＡ塩基配列を分析して増幅されたＤＮＡが適切に挿入されたことを確認した。
ＰｒｅＳドメインの中でコアタンパク質と相互作用する９３番アミノ酸から１１７番アミノ酸の欠失したドメインは、ｐＨＢｓＰＨ−ＨＢｃＧＦＰを鋳型に、ＤＮＡ重合連鎖反応法（ＰＣＲ）で、９５℃、３０秒；５５℃、１分；６８℃、７分の条件で１８回反復して、配列番号１７と配列番号１８のプライマーを使用して、配列番号６で表されるアミノ酸を暗号化する配列番号５の塩基配列を有するＤＮＡを合成した。メチル化されたアデニンを認識して切断するＤｐｎＩ制限酵素を処理して、ＰＣＲ方法で合成してメチル化されないＤＮＡを除外した部分を除去し、塩基配列分析を通じてｐΔＨＢｓＰＨ−ＨＢｃＧＦＰ（図２ｃ）を確認した。
＜実施例２＞動物細胞での形質転換
＜２−１＞動物細胞の培養
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、５％ＣＯ２と３７℃の条件下で、１０％ＦＢＳが供給されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ；Ｇｉｂｃｏ，米国）で培養した。細胞は、９０％の密度で継代培養して、２５％密度を維持しながら形質転換のために準備した。
＜２−１＞動物細胞の培養
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、５％ＣＯ２と３７℃の条件下で、１０％ＦＢＳが供給されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ；Ｇｉｂｃｏ，米国）で培養した。細胞は、９０％の密度で継代培養して、２５％密度を維持しながら形質転換のために準備した。
＜２−２＞動物細胞の形質転換
実施例２−１の方法で培養されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を継代培養して、カバーガラスが入っている６ウェルプレートで培養した。密度条件が４０〜６０％になるように育てた後、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）とＰＬＵＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）を使用して、ｐＨＢｃ−ＧＦＰ、ｐＨＢｓＰＨ−ＨＢｃＧＦＰまたはｐΔＨＢｓＰＨ−ＨＢｃＧＦＰを前記動物細胞に感染させた。前記形質導入した細胞を４８時間培養してタンパク質を生成するようにした。
実施例２−１の方法で培養されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を継代培養して、カバーガラスが入っている６ウェルプレートで培養した。密度条件が４０〜６０％になるように育てた後、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）とＰＬＵＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）を使用して、ｐＨＢｃ−ＧＦＰ、ｐＨＢｓＰＨ−ＨＢｃＧＦＰまたはｐΔＨＢｓＰＨ−ＨＢｃＧＦＰを前記動物細胞に感染させた。前記形質導入した細胞を４８時間培養してタンパク質を生成するようにした。
＜実施例３＞ＰｒｅＳ由来のペプチドによるカプシドタンパク質とＰｒｅＳタンパク質の相互作用の抑制
ＰｒｅＳ由来のペプチド（ΔＬ４ｂペプチド；配列番号２１：ＲＱＰＴＰＩＳＰＰＬＲＤＳＨＰＱＡＭＱＷＮＳ；ペブトロン、韓国）が、ＰｒｅＳタンパク質とカプシドタンパク質の相互作用を抑制できることを確認した。
ＰｒｅＳ由来のペプチド（ΔＬ４ｂペプチド；配列番号２１：ＲＱＰＴＰＩＳＰＰＬＲＤＳＨＰＱＡＭＱＷＮＳ；ペブトロン、韓国）が、ＰｒｅＳタンパク質とカプシドタンパク質の相互作用を抑制できることを確認した。
ｐＴｒｘ−ＰｒｅＳ（Ｃｈｏｉ ＫＪ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２００４年，第３１９巻，９５９−６６頁）が、形質導入された大腸菌から精製されたチオレドキシンが融合したＰｒｅＳタンパク質を緩衝溶液−Ａ（５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）に１０ｇ／ｍｌの濃度で溶解した後、前記混合溶液１００μｌを９６ウェルプレート（ＣｏＳｔａｒ，米国）に入れて、一時間室温でインキュベートして固定化させた。５％（ｗ／ｖ）のスキムミルクを含む緩衝溶液−Ａで前記プレートをブロッキングした後、色々な濃度にシリアル希釈したΔＬ４ｂペプチドとｐＨＢｃＡｇ（Ｃｈｏｉ ＫＪ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２００４年，第３１９巻，９５９−６６頁）が形質導入された大腸菌から精製されたカプシドタンパク質（最終濃度０．４ｍＭ）を添加した。さらに、６０分間室温でインキュベートしてＰＢＳ−Ｔ緩衝溶液（５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４および０．１％ツイーン２０）で６回洗浄した後（３００μｌ／ウェル）、抗−ＨＢｃＡｇ抗体（１：２０００，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ０１１２１６２，ＫＯＭＡ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，韓国）１００μｌで一時間培養して、ＨＲＰが標識された抗ウサギ２次抗体（１：２０００，Ｓｉｇｍａ，米国）で、さらに一時間培養した。前記プレートをＰＢＳ−Ｔ緩衝溶液で６回洗浄した後、ＯＰＤ溶液（ペロキシド基質緩衝溶液に１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し；Ｐｉｅｒｃｅ，米国）１００μｌを添加して発色反応を遂行した。２．５Ｍ硫酸１００μｌを添加して反応を終了させて、マイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ３４０スペクトロメーター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．，米国）を使用して、４９０ｎｍで吸光度を測定した。
その結果、ＰｒｅＳ由来のペプチドが濃度によってカプシドタンパク質とＰｒｅＳタンパク質の相互作用を抑制することを確認した（図５）。
＜実施例４＞蛍光顕微鏡を使用した細胞イメージング測定
＜４−１＞相互結合の測定
ｐＨＢｃ−ＧＦＰ、ｐＨＢｓＰＨ−ＨＢｃＧＦＰまたはｐΔＨＢｓＰＨ−ＨＢｃＧＦＰで形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞が育ったプレートからカバーガラスを回収して、氷冷したＰＢＳで洗浄した後、顕微鏡観察のためのスライドガラスに付けた。蛍光顕微鏡を使用してＧＦＰを観察することができる４９０±２０／５２８±３８ｎｍ（励起／放射）波長のフィルターを通じて細胞を観察した。
＜４−１＞相互結合の測定
ｐＨＢｃ−ＧＦＰ、ｐＨＢｓＰＨ−ＨＢｃＧＦＰまたはｐΔＨＢｓＰＨ−ＨＢｃＧＦＰで形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞が育ったプレートからカバーガラスを回収して、氷冷したＰＢＳで洗浄した後、顕微鏡観察のためのスライドガラスに付けた。蛍光顕微鏡を使用してＧＦＰを観察することができる４９０±２０／５２８±３８ｎｍ（励起／放射）波長のフィルターを通じて細胞を観察した。
その結果、ｐＨＢｃ−ＧＦＰで形質導入した細胞では、ＧＦＰの蛍光イメージが細胞質に位置して、ｐＨＢｓＰＨ−ＨＢｃＧＦＰまたはｐΔＨＢｓＰＨ−ＨＢｃＧＦＰで形質導入した細胞で、ＧＦＰの蛍光イメージが細胞膜に位置することを確認した（図４）。また、ｐΔＨＢｓＰＨ−ＨＢｃＧＦＰで形質導入した細胞での蛍光イメージの面積が、ｐＨＢｓＰＨ−ＨＢｃＧＦＰで形質導入した細胞より狭いことを確認した。
＜４−２＞相互結合抑制の測定
ｐＨＢｃ−ＧＦＰ、ｐＨＢｓＰＨ−ＨＢｃＧＦＰまたはｐΔＨＢｓＰＨ−ＨＢｃＧＦＰで形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養期間の間、ＰｒｅＳとカプシド間の相互作用を抑制するＰｒｅＳ由来のペプチド（ΔＬ４ｂペプチド；配列番号２１）を５０μＭの濃度で一日の間、６０％癒着細胞に処理した。形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞が育ったプレートからカバーガラスを回収して、氷冷したＰＢＳで洗浄した後、顕微鏡観察のためのスライドガラスに付けた。蛍光顕微鏡を使用して、ＧＦＰを観察することができる４９０±２０／５２８±３８ｎｍ（励起／放射）波長のフィルターを通じて細胞を観察した。
ｐＨＢｃ−ＧＦＰ、ｐＨＢｓＰＨ−ＨＢｃＧＦＰまたはｐΔＨＢｓＰＨ−ＨＢｃＧＦＰで形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養期間の間、ＰｒｅＳとカプシド間の相互作用を抑制するＰｒｅＳ由来のペプチド（ΔＬ４ｂペプチド；配列番号２１）を５０μＭの濃度で一日の間、６０％癒着細胞に処理した。形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞が育ったプレートからカバーガラスを回収して、氷冷したＰＢＳで洗浄した後、顕微鏡観察のためのスライドガラスに付けた。蛍光顕微鏡を使用して、ＧＦＰを観察することができる４９０±２０／５２８±３８ｎｍ（励起／放射）波長のフィルターを通じて細胞を観察した。
その結果、前記抑制によって細胞内で発現されたＧＦＰの蛍光イメージが、細胞膜ではなく細胞質に位置することを確認した（図６）。
Claims (13)
- ＨＢＶのカプシドタンパク質ドメインに蛍光タンパク質が連結された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびＨＢＶの表面タンパク質のＰｒｅＳドメインに細胞膜標的化機能を遂行することができるタンパク質ドメインが連結された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 前記ＨＢＶのカプシドタンパク質ドメインが、配列番号１９のアミノ酸配列のＨＢＶのカプシドタンパク質の中でｐｒｏ配列を除外したドメイン（アミノ酸３０−２１４）であることを特徴とする、請求項１に記載の発現ベクター。
- 前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）および強化された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）からなる群から選択されるいずれか１つであることを特徴とする、請求項１に記載の発現ベクター。
- 前記ＨＢＶの表面タンパク質のＰｒｅＳドメインが、配列番号２０のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の発現ベクター。
- 前記ＨＢＶの表面タンパク質のＰｒｅＳドメインが、配列番号２０のアミノ酸の９３番アミノ酸〜１１７番アミノ酸が欠失したドメインであることを特徴とする、請求項１に記載の発現ベクター。
- 前記細胞膜標的化機能を遂行することができるタンパク質ドメインが、ＰＬＣ−δ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ ｄｅｌｔａ）のＰＨ（Ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）ドメイン（Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：２４１２７６、アミノ酸２−１７５）、ＥＥＡ１（ｅａｒｌｙ ｅｎｄｏｓｏｍｅ ａｎｔｉｇｅｎｅ１）のＦＹＶＥ（Ｎｏ ｆｕｌｌ ｎａｍｅ）ドメイン（Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：Ｌ４０１５７、アミノ酸１３５２−１４１０）、ＩＮＧ２（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ２）のＰＨＤ（Ｐｒｏｌｙｌ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）ドメイン（Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：ＮＭ＿００１５６４、アミノ酸２１２−２６１）、タンパク質キナーゼＣのＣ２（ｃａｌｃｉｕｍ／ｌｉｐｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ）ドメイン（Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：ＮＭ００２７３７、アミノ酸１７２−２６０）およびグアニンヌクレオチド交換因子ＤＢＳ（Ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｆａｃｔｏｒ ＤＢＳ）のＳＥＣ１４（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）ドメイン（Ｇｅｎｅｎｂａｎｋ ＩＤ：ＡＢ＿１１６０７４、アミノ酸９０−２３６）からなる群から選択されたいずれかひとつであることを特徴とする、請求項１に記載の発現ベクター。
- 前記ＨＢＶのカプシドタンパク質ドメインに蛍光タンパク質が連結された融合タンパク質が、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の発現ベクター。
- 前記ＨＢＶの表面タンパク質のＰｒｅＳドメインに細胞膜標的化機能を遂行することができるタンパク質ドメインが連結された融合タンパク質が、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の発現ベクター。
- 前記ＨＢＶの表面タンパク質のＰｒｅＳドメインに細胞膜標的化機能を遂行することができるタンパク質ドメインが連結された融合タンパク質が、配列番号６で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の発現ベクター。
- 請求項１ないし請求項９のいずれか一項の発現ベクターまたはＨＢＶの表面タンパク質のＰｒｅＳドメインに細胞膜標的化機能を遂行することができるタンパク質ドメインが連結された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む第１発現ベクター、および前記融合タンパク質と相互作用するＨＢＶのカプシドタンパク質ドメインに蛍光タンパク質が連結された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む第２発現ベクターが共に形質導入された動物細胞。
- 前記動物細胞が、ＨＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＯＳ７、ＨｅＬａおよびＣＨＯ細胞からなる群から選択されたいずれかひとつであることを特徴とする、請求項１０に記載の動物細胞。
- １）請求項１０または請求項１１の形質導入された動物細胞を培養しながら候補物質を処理する工程と、
２）蛍光顕微鏡を使用して、工程１）で発現された蛍光タンパク質の蛍光イメージを撮影する工程、および、
３）蛍光イメージが細胞質に位置するようにする候補物質を選別する工程とを含むＨＢＶの増殖を抑制する物質をスクリーニングする方法。 - 請求項１０または請求項１１の動物細胞を含むＨＢＶ増殖を抑制する物質のスクリーニングキット。
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