JP2010509919A - 内耳細胞の生成 - Google Patents
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- C12N2506/1353—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
Abstract
Description
本出願は、2006年11月15日に出願された米国暫定特許出願第60/859,041号の利益を主張するものであり、その全体の内容は、参照することにより本願明細書に組み込まれる。
本発明は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)の国立聴覚・伝達障害研究所(National Institute on Deafness and other Communicative Disorders:NIDCD)からの認可番号F33 DC006789、RO1 DC007174、およびP30 DC05209の下で政府支援によりなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
神経性潜在力を有する幹細胞の集団を取得するステップと、
内耳前駆細胞への少なくとも一部の該幹細胞の分化を誘発するのに十分な条件下で、該幹細胞を培養するステップと、
(i)少なくとも一部の該内耳前駆細胞が有毛細胞に分化することを誘発するのに十分な量および時間で、該内耳前駆細胞内でAtoh1の発現を誘発するステップ、
(ii)少なくとも一部の該内耳前駆細胞が有毛細胞に分化することを誘発するのに十分な量および時間で、該内耳前駆細胞をNotchシグナル阻害剤(例えば、γセクレターゼ阻害剤または阻害性核酸)と接触させるステップ、または
(iii)該内耳前駆細胞の少なくとも一部が、有毛細胞に分化するのに十分な時間および条件下で、ニワトリ耳胞細胞の存在下において該内耳前駆細胞を培養し、
それによって、有毛細胞および/または支持細胞の集団を提供するステップ、
のうちの1つ(または1つ以上)を行うステップと、を含む。
また、本明細書に記載した方法によって取得される有毛細胞、支持細胞、および内耳前駆細胞の単離集団に関しても本明細書に記載する。
一部の実施形態においては、少なくとも一部の該幹細胞が、有毛細胞に分化するのに十分な時間および条件下で、ニワトリ耳胞細胞の存在下において該幹細胞を培養するステップは、IGF、EGF、およびFGFを含む培地中で該幹細胞を培養するステップを含む。
前駆細胞ならびに有毛細胞および支持細胞を含む分化した内耳細胞を含む、内耳の細胞を生成するための方法を提供する。幹細胞は、広範な増殖が可能な未分化の細胞である。幹細胞は、多能性であり、神経細胞、筋細胞、血液細胞、上皮細胞,皮膚細胞、および内耳の細胞(例えば、有毛細胞およびらせん神経節の細胞)を含む、体内の殆どの細胞型に分化する能力を有すると考えられる(Pedersen,Scientif.Am.280:68(1999))。幹細胞は、分化することなく、生体外の継続的増殖が可能である。それらが分裂するにつれて、正常核型を保持して、成体細胞型するために分化する能力を保持する。
内耳細胞または内耳細胞前駆体は、哺乳類幹細胞から生成することができる。本明細書に記載されているように、本発明の方法における使用に適切な幹細胞は、神経性潜在力を有する任意の幹細胞、つまり、神経細胞、グリア、星状膠細胞、網膜の光受容器、乏突起膠細胞、嗅細胞、有毛細胞、支持細胞等の神経細胞に分化する可能性を有する任意の幹細胞であることができる。骨髄間葉系幹細胞等のヒト成体幹細胞を含む神経性幹細胞は、有毛細胞および支持細胞を含む成熟内耳細胞を生じさせることが可能な内耳前駆細胞に分化するように誘発することができる。本明細書に記載した方法において有用な神経性幹細胞は、ネスチン、sox1、sox2、およびmusashi等の特定の神経性幹細胞マーカーの発現によって同定することができる。代替的にまたは付加的に、これらの細胞は、高レベルのヘリックスループヘリックス転写因子であるNeuroD、Atoh1、およびニューロゲニン1を発現する。
増殖因子処理(例えば、本明細書に記載されているように、EGF、FGF、およびIGFを用いる処理)およびニューロトロフィン(例えば、本明細書に記載されているように、NT3およびBDNFを用いる処理)を含む、神経性潜在力を有する幹細胞の、神経前駆細胞への分化を誘発するための、当技術分野において既知の多くの誘発プロトコルがある。他の分化プロトコルは、当技術分野において既知であり、例えば、Corrales et al.,J.Neurobiol.66(13):1489−500(2006)、Kim et al.,Nature 418,50−6(2002)、Lee et al.,Nat Biotechnol 18,675−9(2000)、およびLi et al.,Nat Biotechnol 23,215−21(2005)を参照されたい。
本明細書に記載した方法によって調製された前駆細胞は、今後の使用のために任意で凍結することができる。
本明細書に記載した方法においては、概して、標準的な培養方法を使用する。適切な培養培地は、Liら(上記参照)等の当技術分野において記述されている。例えば、幹細胞は、血清を含まないDMEM/高グルコースおよびF12培地(1:1で混合)中で培養することができ、N2およびB27溶液ならびに増殖因子を補充することができる。EGF、IGF−1、およびbFGF等の増殖因子は、培養中の球形成を増大させることが実証されている。生体外で、幹細胞は、単一細胞の増殖によって球を形成する特有の可能性を示すことが多い。したがって、球の同定および単離は、内耳の分化した細胞を作るのに用いる成熟組織から幹細胞を単離する工程に役立つことができる。培養した幹細胞の増殖培地は、1つ以上の、または任意の組み合わせの増殖因子を含有することができる。これは、幹細胞が分化することを防ぐ血病抑制因子(leukemia inhibitory Factor:LIF)を含む。細胞(および球の細胞)が分化するように誘発するため、培地は、培地を欠いている増殖因子と交換することができる。例えば、培地は、N2およびB27溶液を補充される無血清DMEM/高グルコースおよびF12培地(1:1で混合)であることができる。また、同等の代替的な培地および栄養分も使用することができる。培養条件は、当技術分野において既知の方法を使用して最適化することができる。
本明細書に記載されているように、幹細胞由来の前駆細胞内でのAtoh1の発現は、有毛細胞マーカーを採用するように、それらを駆動させるのに十分であった。耳内でのAtoh1発現の研究は、このヘリックスループヘリックス転写因子が、有毛細胞の分化に対する内耳転写因子の階層において重要な位置を占めることを示している。
1 atgtcccgcc tgctgcatgc agaagagtgg gctgaagtga aggagttggg agaccaccat
61 cgccagcccc agccgcatca tctcccgcaa ccgccgccgc cgccgcagcc acctgcaact
121 ttgcaggcga gagagcatcc cgtctacccg cctgagctgt ccctcctgga cagcaccgac
181 ccacgcgcct ggctggctcc cactttgcag ggcatctgca cggcacgcgc cgcccagtat
241 ttgctacatt ccccggagct gggtgcctca gaggccgctg cgccccggga cgaggtggac
301 ggccgggggg agctggtaag gaggagcagc ggcggtgcca gcagcagcaa gagccccggg
361 ccggtgaaag tgcgggaaca gctgtgcaag ctgaaaggcg gggtggtggt agacgagctg
421 ggctgcagcc gccaacgggc cccttccagc aaacaggtga atggggtgca gaagcagaga
481 cggctagcag ccaacgccag ggagcggcgc aggatgcatg ggctgaacca cgccttcgac
541 cagctgcgca atgttatccc gtcgttcaac aacgacaaga agctgtccaa atatgagacc
601 ctgcagatgg cccaaatcta catcaacgcc ttgtccgagc tgctacaaac gcccagcgga
661 ggggaacagc caccgccgcc tccagcctcc tgcaaaagcg accaccacca ccttcgcacc
721 gcggcctcct atgaaggggg cgcgggcaac gcgaccgcag ctggggctca gcaggcttcc
781 ggagggagcc agcggccgac cccgcccggg agttgccgga ctcgcttctc agccccagct
841 tctgcgggag ggtactcggt gcagctggac gctctgcact tctcgacttt cgaggacagc
901 gccctgacag cgatgatggc gcaaaagaat ttgtctcctt ctctccccgg gagcatcttg
961 cagccagtgc aggaggaaaa cagcaaaact tcgcctcggt cccacagaag cgacggggaa
1021 ttttcccccc attcccatta cagtgactcg gatgaggcaa gttag(配列番号1)
MSRLLHAEEWAEVKELGDHHRQPQPHHLPQPPPPPQPPATLQAREHPVYPPELSLLDSTDPRAWLAPTLQGICTARAAQYLLHSPELGASEAAAPRDEVDGRGELVRRSSGGASSSKSPGPVKVREQLCKLKGGVVVDELGCSRQRAPSSKQVNGVQKQRRLAANARERRRMHGLNHAFDQLRNVIPSFNNDKKLSKYETLQMAQIYINALSELLQTPSGGEQPPPPPASCKSDHHHLRTAASYEGGAGNATAAGAQQASGGSQRPTPPGSCRTRFSAPASAGGYSVQLDALHFSTFEDSALTAMMAQKNLSPSLPGSILQPVQEENSKTSPRSHRSDGEFSPHSHYSDS
DEAS(配列番号2)
1 tcgacccacg cgtccgccca cgcgtccgga tctccgagtg agagggggag ggtcagagga
61 ggaaggaaaa aaaaatcaga ccttgcagaa gagactagga aggtttttgt tgttgttgtt
121 cggggcttat ccccttcgtt gaactgggtt gccagcacct cctctaacac ggcacctccg
181 agccattgca gtgcgatgtc ccgcctgctg catgcagaag agtgggctga ggtaaaagag
241 ttgggggacc accatcgcca tccccagccg caccacgtcc cgccgctgac gccacagcca
301 cctgctaccc tgcaggcgag agaccttccc gtctacccgg cagaactgtc cctcctggat
361 agcaccgacc cacgcgcctg gctgactccc actttgcagg gcctctgcac ggcacgcgcc
421 gcccagtatc tgctgcattc tcccgagctg ggtgcctccg aggccgcggc gccccgggac
481 gaggctgaca gccagggtga gctggtaagg agaagcggct gtggcggcct cagcaagagc
541 cccgggcccg tcaaagtacg ggaacagctg tgcaagctga agggtggggt tgtagtggac
601 gagcttggct gcagccgcca gcgagcccct tccagcaaac aggtgaatgg ggtacagaag
661 caaaggaggc tggcagcaaa cgcaagggaa cggcgcagga tgcacgggct gaaccacgcc
721 ttcgaccagc tgcgcaacgt tatcccgtcc ttcaacaacg acaagaagct gtccaaatat
781 gagaccctac agatggccca gatctacatc aacgctctgt cggagttgct gcagactccc
841 aatgtcggag agcaaccgcc gccgcccaca gcttcctgca aaaatgacca ccatcacctt
901 cgcaccgcct cctcctatga aggaggtgcg ggcgcctctg cggtagctgg ggctcagcca
961 gccccgggag ggggcccgag acctaccccg cccgggcctt gccggactcg cttctcaggc
1021 ccagcttcct ctgggggtta ctcggtgcag ctggacgctt tgcacttccc agccttcgag
1081 gacagggccc taacagcgat gatggcacag aaggacctgt cgccttcgct gcccgggggc
1141 atcctgcagc ctgtacagga ggacaacagc aaaacatctc ccagatccca cagaagtgac
1201 ggagagtttt ccccccactc tcattacagt gactctgatg aggccagtta ggaaggcaac
1261 agctccctga aaactgagac aaccaaatgc ccttcctagc gcgcgggaag ccccgtgaca
1321 aatatccctg caccctttaa tttttggtct gtggtgatcg ttgttagcaa cgacttgact
1381 tcggacggct gcagctcttc caatcccctt cctcctacct tctccttcct ctgtatgtag
1441 atactgtatc attatatgta cctttacgtg gcatcgtttc atggtccatg ctgccaatat
1501 gctgctaaaa tgtcgtatct ctgcctctgg tctgggtttc acttatttta taccttggga
1561 gttcatcctt gcgtgttgcg ctcactcaca aataagggag ttagtcaatg aagttgtttc
1621 cccaactgct tgagacccgc attgggtact ttactgaaca cggactattg tgttgttaaa
1681 atgcaggggc agataagagt atctgtagag cttagacacc aagtgtgtcc agcagtgtgt
1741 ctagcggacc cagaatacac gcacttcatc actggccgct gcgccgcctt gaagaaactc
1801 aactgccaat gcagagcaac ttttgatttt aaaaacagcc actcataatc attaaactct
1861 ttgcaaatgt ttgtttttgc aaatgaaaat taaaaaaaaa catgtagtgt caaaggcatt
1921 tggtcaattt tattttgctt tgttaacatt agaaaagtta tttattattg cgtatttgga
1981 cccatttcta cttaattgcc ttttttttac attttctact cgagatcgtt ttattttgat
2041 ttagcaaatc cagttgccat tgctttatgt atgtatgctc ttttacaaat gataaaataa
2101 actcggaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa(配列番号3)
MSRLLHAEEWAEVKELGDHHRHPQPHHVPPLTPQPPATLQARDLLVRRSGCGGLSKSPGPVKVREQLCKLKGGVVVDELGCSRQRAPSSKQVNGVQKQRRLAANARERRRMHGLNHAFDQLRNVIPSFNNDKKLSKYETLQMAQIYINALSELLQTPNVGASSGGYSVQLDALHFPAFEDRALTAMMAQKDLSPSLPGGILQPVQEDNSKTSPRSHRSDGEFSPHSHYSDSDEAS(配列番号4)
1 atggccccag gaggtagcga gtgttgttgc agtgatgccg cgcacatcac ttggaggcag
61 tgggagtaca cgcacgagaa ccaactgtgc gtggcaggaa ctgtcagcag gatgaggccc
121 aggacgtggg tctgcaccgg atctttgtgg gaccaggaag cgggaattac tttgatgggc
181 ccccaaatac ccaaagtgga tgaggcagga gtgatgaccc acccggcaag gtcgctttgc
241 agcactgggg cacatccgtg tcccggggtg gtcgtgctgc ccacgggtgg gatagggcag
301 ccttcaaaga agctctccaa gtacgagacg ctgcagatgg cgcaaatcta catcagcgcc
361 ctcgccgagc ttctgcacgg gccgcccgcg ccccccgagc cgcccgccaa ggccgagctc
421 cgcggggccc ccttcgagcc tcccccgccg ccccctcctc cgccgccccg cgcctcgccc
481 cccgcgcccg ccaggactcg cttccccccg gcggcggccg cgggcggttt cgcggcgctt
541 ctcgagccgc tgcgcttccc ttctttcccg gcgcagaaag cgccttctcc cgcgctgctc
601 ctggggccgc ccgcgccgca gcagcccgag aggagcaaag cgtcgccgcg ctctcaccgc
661 agcgacgggg agttctcgcc gcgctcccac tacagtgact cggacgaggc cagctag
(配列番号5)
MAPGGSECCCSDAAHITWRQWEYTHENQLCVAGTVSRMRPRTWVCTGSLWDQEAGITLMGPQIPKVDEAGVMTHPARSLCSTGAHPCPGVVVLPTGGIGQPSKKLSKYETLQMAQIYISALAELLHGPPAPPEPPAKAELRGAPFEPPPPPPPPPPRASPPAPARTRFPPAAAAGGFAALLEPLRFPSFPAQKAPSPALLLGPPAPQQPERSKASPRSHRSDGEFSPRSHYSDSDEAS(配列番号6)
また、本明細書に記載されているように、幹細胞由来の前駆細胞は、外因性Atoh1を必要とすることなく、感覚上皮細胞に分化させることによって、ニワトリ胚からの発生中の耳胞細胞との物理的接触にも応答した。これは、本明細書に記載されているように、同時培養および分化後の、Atoh1エンハンサー−GFPレポーター構築からのnGFP発現およびミオシンVIIaの同時発現から明らかであった。胎生期マウスからの耳胞および後脳条件培地でのインキュベーションによる先行研究(Kondo et al.,Proc Natl Acad Sci U S A102,4789−4794(2005))において、感覚細胞のマーカーを発現する神経細胞は、骨髄MSCから誘発された。
Notchは、原形質膜受容体であり、Notch経路は、Notchおよびそのリガンド、ならびにNotchシグナルを核に伝達する細胞内タンパク質から成る。Notch経路内には、経路のエフェクター機能を有する転写因子が含まれる。
Notchシグナルは、1つの細胞が所与の運命の間、(例えば、有毛細胞への分化)細胞クラスターから選抜される側方抑制に関与する。分化は、分化するように選択されなかったそれらの細胞内で阻害され、その結果、細胞のクラスターの多くの部分への特定の運命拘束が予防される。側方抑制は、発生時に繰り返し生じる。この過程の中心となるのは、Delta、ScabrousおよびSerrateを含む、幾つかのリガンドのうちの1つのNotch受容体への結合である。Notchリガンドへのリガンド結合は、側方抑制をもたらす一連の細胞内事象を引き起こす。Notch経路に関するレビューは、Artavanis−Tsakonas et al.,Science 268:225−232(1995)に記載されている。本明細書に記載されているように、本明細書に記載した内耳前駆細胞におけるNotchの阻害は、有毛細胞および支持細胞への細胞の分化をもたらす。
幹細胞が、前駆細胞に、または例えば有毛細胞もしくは支持細胞等の内耳の細胞に分化されたことを判定するために、様々な方法を利用することができる。例えば、細胞は、細胞マーカー遺伝子の発現に対して検査することができる。有毛細胞マーカー遺伝子は、ミオシンVIIa(myoVIIa)、Atoh1、α9アセチルコリン受容体、エスピン、パルブアルブミン3、およびBrn3cを含む。支持細胞マーカーは、クローディン14、コネキシン26、p75Trk、Notch1およびS100Aを含む。多能性幹細胞は、概して、これらの遺伝子を発現しない。これらの遺伝子の1つ以上を発現する細胞を伝播および産生する幹細胞は、有毛細胞を産生しており、つまり、幹細胞は、少なくとも部分的に有毛細胞に分化した。内耳前駆細胞(有毛細胞の前駆物質)に分化した幹細胞は、ネスチン、sox2、musashi、Brn3C、Pax2、およびAtoh1等の初期耳マーカー遺伝子を発現する。前駆細胞は、これらの遺伝子の1つ以上を発現することができる。前駆細胞は、増殖因子の存在下において、無血清培地中で伝播することができる。増殖因子の除去およびAtoh1の発現、またはニワトリ耳胞での同時培養は、細胞が、さらに有毛細胞および支持細胞等に分化するように誘発するであろう。
本明細書に記載した方法は、治療上の使用のために、細胞を生成するために使用することができる。治療方法は、それを必要としているヒトの耳に移植するための本明細書に記載した方法を使用して、幹細胞から、内耳の細胞(例えば、有毛細胞または支持細胞)を生成するステップを含む。対象の内耳への細胞の移植は、対象の聴力を回復もしくは改善するために、または前庭機能不全の症状を減少させるために有用であり得る。本明細書に記載した方法によれば、幹細胞に由来する内耳細胞は、治療上有用となるように完全に分化する必要はない。対象における聴覚障害の任意の症状を改善させる部分的に分化した細胞は、治療的組成物および本明細書に記載した方法にとって有用である。
本発明において特徴とされる組成物および方法は、感音有毛細胞損失または聴覚性神経障害によって生じる聴覚障害の治療に適している。例えば、感音有毛細胞損失のある患者は、蝸牛の有毛細胞の変性を経験し、これは、有毛細胞損失の領域におけるらせん神経節神経細胞の損失に繋がることが多く、また、コルチ器官における支持細胞の損失、ならびに側頭骨材料における角膜縁、らせん靱帯、および血管条の変性も経験し得る。そのような患者は、内耳への支持細胞および/または有毛細胞の投与から特に恩恵を受け得る。
本発明を、以下の実施例においてさらに説明するが、これらは、特許請求の範囲において記載される本発明の範囲を限定するものではない。
間葉系幹細胞は、高血清条件下において、髄からの接着細胞を培養することによって、マウス骨髄から取得した。
簡潔に述べると、細胞は、10%ウシ胎仔血清(FBS、BioWhittaker,Cambrex,NY)および1mMグルタミン(Gibco/BRL)を含有するMEM−α(Gibco/BRL)で、骨髄を洗い流すことによって、4週齢C57BL/6またはAtoh1−nGFPマウス(Helms et al.,Development 127,1185−1196(2000))の両側性大腿骨および脛骨から取得した。ペレット細胞は再懸濁し、RBC溶解緩衝液(Gibco/BRL)と混合した。約5×106細胞は、5%CO2大気中37℃で、9%ウマ血清、9%FBS、1%Gluta−Max(Invitrogen)ならびに100単位/mlペニシリンおよびストレプトマイシン(100μg/ml、Sigma)を有するMEM−αにおいて、一晩10cmディッシュ上で培養した。非接着造血幹細胞を除去して、接着骨髄間質細胞を残した。細胞が集密的になった時に、トリプシン処理を行い、細胞を培養して3から5回継代し、培地は3〜4日ごとに交換した。これらの細胞を間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell:MSC)と称する。
前駆細胞が内耳前駆体細胞として機能し得るかどうかを試験するため、コンピテント前駆体を有毛細胞運命(Izumikawa et al.,Nat Med 11,271−276(2005);Zheng and Gao,Nat Neurosci 3,580−586(2000))へと進ませることが知られる転写因子Atoh1の過剰発現が、有毛細胞マーカーの発現を増加させるかどうかを評価した。
Atoh1形質移入の効率は、Atoh1に加えてGFP発現をコード化するベクターを形質移入した後、緑色蛍光細胞を計数することによって試験した。CMVプロモーターの下でGFP−Zeocin融合配列を有するpTracer−EFベクター(Invitrogen)内のEF1αプロモーター制御下で配列をコード化するAtoh1を含有するベクターを構成した。遺伝子形質移入は、LIPOFECTAMINE(登録商標)形質移入試薬(Sigma)を使用し、前駆細胞状態で、またはMSCとして行った。細胞は、Zeocin(Invitrogen)中で培養して、安定な形質移入体を取得した。形質移入されたMSCは、増殖因子を併用した無血清条件において培養した。
これらのデータは、増殖因子によって誘発された前駆細胞におけるAtoh1の過剰発現が、有毛細胞への一定の割合のそれらの細胞の分化を誘発することを示す。
発生中の耳胞が、有毛細胞へのMSCの分化を増加させる因子を産生したかどうかを試験するために、MSCとのE3ニワトリ耳胞細胞の同時培養実験を行った。
白色レグホン系統(Charles River)の胚は、受精卵を、38℃で維持した加湿した恒温器の固定プラットフォームに置いた後72時間で採取した。抽出した胚からの耳胞の解離は、内耳周囲の間葉組織を除去した後、pH7.2の冷却PBS中で行った。耳胞は、トリプシン処理し、プレーティングするために単一細胞に解離し、2×104細胞を、10%FBS中4つのウェルプレートで一晩培養した。プレーティングの1日後、耳胞細胞を4%パラホルムアルデヒドで20分間固定するか、またはマイトマイシンC(10μg/ml)で3時間不活性化し、次いで、PBSで4回洗浄した。培養した細胞からの馴化培地を収集し、前駆体細胞に使用する前に凍結した。無血清培地中で増殖因子によって誘発された前駆細胞(5×104細胞/ml)で、ニワトリ耳胞細胞を覆い、EGF/IGFで5〜7日間、続いてEGF/IGF/FGFで10日間培養して、さらに5〜10日間増殖因子を取り除いた。細胞は、本明細書に記載されるように、RT−PCRまたは免疫組織化学で分析した。
ニワトリ耳胞細胞の存在下で21日間培養した後、RT−PCRによるミオシンVIIa、jagged2、p27Kip、Brn3cおよびAtoh1の発現の増加が発見された(図5A)。細胞の固定は、14日間の曝露後に、分化を促進する能力を減少させず、一方で、条件培地が14日の間に効果がなくなったために、因子は、分泌された分子ではないようであった(図5A)。幹細胞の有毛細胞への転換の後に、Atoh1エンハンサー要素が活性化された時に、増強したGFPの核バージョンを発現するトランスジェニックAtoh1−nGFPマウスに由来するMSCを使用した、培養物における緑色蛍光の出現が起こり得る(Chen et al.,Development 129,2495−2505(2002);Lumpkin et al.,Gene Expr Patterns 3,389−395(2003))。これらの緑色細胞は、ニワトリ耳胞細胞との同時培養で観察され(図5B)、細胞は、ミオシンVIIaに対する抗体で同時標識した。
Notch経路は、支持細胞からの有毛細胞の分化を抑止することによって、生体内の有毛細胞および支持細胞の交互のパターンを維持し、胚におけるNotchの活性化は、前駆体からの有毛細胞の発生を遮断するように思われる。
有毛細胞の分化へのNotch経路の効果を検討するため、NT3/BDNF処置の前駆体を、γセクレターゼ阻害剤とともにインキュベートした。NT3、BDNF、FGFとのインキュベーションによって生成され、その後γセクレターゼ阻害剤で処理された前駆体における遺伝子発現の分析は、ノッチシグナルの損失が、Atoh1発現を増加させたことを示した。Atoh1レベルは、阻害剤を1μMで使用した時に、RT−PCRに基づく増殖因子単独での処理と比べて上昇した(図7)。阻害剤添加のタイミングは、後の段階(生体外分化の3日後)での阻害で非常に重要であり、0日目に開始し、10日間継続する阻害ほど、有毛細胞マーカーを誘発しない。低濃度で、γセクレターゼ阻害剤は、ngn1およびNeuroDを活性化し、Atoh1または有毛細胞マーカーを増加させない。γセクレターゼ阻害剤は、高濃度で、Atoh1およびBrn3c発現を増加させる。増加したAtoh1は、細胞が、ミオシン7a、p27Kip等の有毛細胞に対するマーカーを発現させるにつれて、有毛細胞を産生できるように見えた。HLH転写因子が、Notch経路の効果を媒介するため、この結果は、Notchの役割と一致し、通常の条件下で有毛細胞分化を予防する機構を示唆する。
ヒト間葉系幹細胞(human mesenchymal stem cell:hMSC)が、有毛細胞または感覚神経細胞を含む内耳細胞型に分化することができるかどうかを判定するため、健常成人からのヒト骨髄細胞を評価した。
ヒト骨髄細胞を採取し、16時間組織培養プラスチック上にプレートして培養し、非接着造血幹細胞を吸引した。
Math1の恒常的発現の1つの代替案は、細胞培地または蝸牛環境に添加される誘導因子を用いてMath1を上方制御するために、遺伝子発現の条件的または誘導系を使用することである。誘導モデルは、遺伝子発現の一時的効果を検討する時に、特に有用である。
ATGTCCAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGCATTACCGGTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCGCAAGAACCTGATGGACATGTTCAGGGATCGCCAGGCGTTTTCTGAGCATACCTGGAAAATGCTTCTGTCCGTTTGCCGGTCGTGGGCGGCATGGTGCAAGTTGAATAACCGGAAATGGTTTCCCGCAGAACCTGAAGATGTTCGCGATTATCTTCTATATCTTCAGGCGCGCGGTCTGGCAGTAAAAACTATCCAGCAACATTTGGGCCAGCTAAACATGCTTCATCGTCGGTCCGGGCTGCCACGACCAAGTGACAGCAATGCTGTTTCACTGGTTATGCGGCGGATCCGAAAAGAAAACGTTGATGCCGGTGAACGTGCAAAACAGGCTCTAGCGTTCGAACGCACTGATTTCGACCAGGTTCGTTCACTCATGGAAAATAGCGATCGCTGCCAGGATATACGTAATCTGGCATTTCTGGGGATTGCTTATAACACCCTGTTACGTATAGCCGAAATTGCCAGGATCAGGGTTAAAGATATCTCACGTACTGACGGTGGGAGAATGTTAATCCATATTGGCAGAACGAAAACGCTGGTTAGCACCGCAGGTGTAGAGAAGGCACTTAGCCTGGGGGTAACTAAACTGGTCGAGCGATGGATTTCCGTCTCTGGTGTAGCTGATGATCCGAATAACTACCTGTTTTGCCGGGTCAGAAAAAATGGTGTTGCCGCGCCATCTGCCACCAGCCAGCTATCAACTCGCGCCCTGGAAGGGATTTTTGAAGCAACTCATCGATTGATTTACGGCGCTAAGGATGACTCTGGTCAGAGATACCTGGCCTGGTCTGGACACAGTGCCCGTGTCGGAGCCGCGCGAGATATGGCCCGCGCTGGAGTTTCAATACCGGAGATCATGCAAGCTGGTGGCTGGACCAATGTAAATATTGTCATGAACTATATCCGTAACCTGGATAGTGAAACAGGGGCAATGGTGCGCCTGCTGGAAGATGGGGATCAGGCTGGTGCCATGGGCGATCCACGAAATGAAATGGGTGCTTCAGGAGACATGAGGGCTGCCAACCTTTGGCCAAGCCCTCTTGTGATTAAGCACACTAAGAAGAATAGCCCTGCCTTGTCCTTGACAGCTGACCAGATGGTCAGTGCCTTGTTGGATGCTGAACCGCCCATGATCTATTCTGAATATGATCCTTCTAGACCCTTCAGTGAAGCCTCAATGATGGGCTTATTGACCAACCTAGCAGATAGGGAGCTGGTTCATATGATCAACTGGGCAAAGAGAGTGCCAGGCTTTGGGGACTTGAATCTCCATGATCAGGTCCACCTTCTCGAGTGTGCCTGGCTGGAGATTCTGATGATTGGTCTCGTCTGGCGCTCCATGGAACACCCGGGGAAGCTCCTGTTTGCTCCTAACTTGCTCCTGGACAGGAATCAAGGTAAATGTGTGGAAGGCATGGTGGAGATCTTTGACATGTTGCTTGCTACGTCAAGTCGGTTCCGCATGATGAACCTGCAGGGTGAAGAGTTTGTGTGCCTCAAATCCATCATTTTGCTTAATTCCGGAGTGTACACGTTTCTGTCCAGCACCTTGAAGTCTCTGGAAGAGAAGGACCACATCCACCGTGTCCTGGACAAGATCACAGACACTTTGATCCACCTGATGGCCAAAGCTGGCCTGACTCTGCAGCAGCAGCATCGCCGCCTAGCTCAGCTCCTTCTCATTCTTTCCCATATCCGGCACATGAGTAACAAACGCATGGAGCATCTCTACAACATGAAATGCAAGAACGTGGTACCCCTCTATGACCTGCTCCTGGAGATGTTGGATGCCCACCGCCTTCATGCCCCAGCCAGTCGCATGGGAGTGCCCCCAGAGGAGCCCAGCCAGACCCAGCTGGCCACCACCAGCTCCACTTCAGCACATTCCTTACAAACCTACTACATACCCCCGGAAGCAGAGGGCTTCCCCAACACGATCTGA
Kicic et al.,J Neurosci 23,7742−7749(2003).
Ma et al.,J Assoc Res Otolaryngol 1,129−143 (2000).
Wang et al.,Nature 422,897−901(2003).
本発明を、その発明を実施するための形態とともに説明したが、前述の説明は、例証であり、本発明の範囲を限定することを意図せず、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義されると理解されたい。他の態様、利点、および変更は、以下の特許請求の範囲内にある。
Claims (28)
- 有毛細胞の集団を提供する方法であって、
神経性潜在力を有する幹細胞の集団を取得するステップと、
内耳前駆細胞への少なくとも一部の前記幹細胞の分化を誘発するのに十分な条件下で、前記幹細胞を培養するステップと、
少なくとも一部の前記内耳前駆細胞が、有毛細胞に分化することを誘発するのに十分な量および時間で、前記内耳前駆細胞内のAtoh1の発現を誘発し、それによって、有毛細胞の集団を提供するステップと、
を含む、方法。 - 有毛細胞の集団を提供する方法であって、
神経性潜在力を有する幹細胞の集団を取得するステップと、
内耳前駆細胞への少なくとも一部の前記幹細胞の分化を誘発するのに十分な条件下で、前記幹細胞を培養するステップと、
少なくとも一部の前記内耳前駆細胞が、有毛細胞に分化することを誘発するのに十分な量および時間で、前記内耳前駆細胞をNotchシグナル阻害剤と接触させ、それによって、有毛細胞の集団を提供するステップと、
を含む、方法。 - 有毛細胞の集団を提供する方法であって、
神経性潜在力を有する幹細胞の集団を取得するステップと、
内耳前駆細胞への少なくとも一部の前記幹細胞の分化を誘発するのに十分な条件下で、前記幹細胞を培養するステップと、
少なくとも一部の前記内耳前駆細胞が、有毛細胞に分化するのに十分な時間および条件下で、ニワトリ耳胞の存在下において前記内耳前駆細胞を培養し、それによって、有毛細胞の集団を提供するステップと、
を含む、方法。 - 前記Notchシグナル阻害剤は、γセクレターゼ阻害剤である、請求項2に記載の方法。
- 前記前駆細胞を単離するステップをさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記有毛細胞を単離するステップをさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記内耳前駆細胞は、ネスチン、sox2、musashi、Brn3C、Pax2、およびAtoh1を発現する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記有毛細胞は、Atoh1、jagged2、Brn3c、p27Kip、Ngn1、NeuroD、ミオシンVIIaおよびエスピンから成る群から選択される1つ以上の遺伝子を発現する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記有毛細胞は、jagged2、Brn3c、ミオシンVIIaおよびエスピンを発現する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記有毛細胞は、前記細胞の頂端膜側上にVパターンでFアクチンを発現する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 支持細胞の集団を提供する方法であって、
神経性潜在力を有する幹細胞の集団を取得するステップと、
内耳前駆細胞への少なくとも一部の前記幹細胞の分化を誘発するのに十分な条件下で、前記幹細胞を培養するステップと、を含み、
(i)少なくとも一部の前記内耳前駆細胞が支持細胞に分化することを誘発するのに十分な量および時間で、前記内耳前駆細胞内でAtoh1の発現を誘発するステップ、
(ii)少なくとも一部の前記前駆細胞が支持細胞に分化することを誘発するのに十分な量および時間で、前記内耳前駆細胞をNotchシグナル阻害剤と接触させるステップ、または
(iii)少なくとも一部の前記内耳前駆細胞が、支持細胞に分化するのに十分な時間および条件下で、ニワトリ耳胞細胞の存在下において前記内耳前駆細胞を培養し、
それによって、支持細胞の集団を提供するステップ、
のうちの1つ以上を含む、方法。 - 前記支持細胞を単離するステップをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 前記支持細胞は、クローディン14、コネキシン26、p75Trk、Notch1、およびS100Aのうちの1つ以上を発現する、請求項1に記載の方法。
- 前記内耳前駆細胞は、ネスチン、sox2、musashi、Brn3C、Pax2、およびAtoh1を発現する、請求項11に記載の方法。
- それを必要としている対象に、前記細胞を移植するステップをさらに含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記幹細胞の集団は、前記移植を必要としている対象から取得される、請求項15に記載の方法。
- 請求項6に記載の方法によって取得される、有毛細胞の単離集団。
- 請求項12に記載の方法によって取得される、支持細胞の単離集団。
- 有毛細胞および/または支持細胞の移植で治療可能な障害を有する、または発症する危険性がある対象を治療する方法であって、請求項17または18に記載の前記細胞を、前記対象の蝸牛に移植し、それによって、前記対象を治療する、方法。
- 幹細胞の集団は、前記移植を必要としている前記対象から取得された、請求項19に記載の方法。
- 前記細胞内でAtoh1の発現を誘発するステップは、前記細胞内で外因性Atoh1の発現を誘発するステップを含む、請求項1または11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞内で外因性Atoh1の発現を誘発するステップは、Atoh1ポリペプチドをコードするベクターを有する前記細胞を形質導入するステップを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記ベクターは、ウイルスベクターである、請求項22に記載の方法。
- 前記ベクターは、プラスミドベクターある、請求項22に記載の方法。
- 前記幹細胞内で外因性Atoh1の発現を誘発するステップは、内因性Atoh1の発現を増加させるステップを含む、請求項21に記載の方法。
- 少なくとも一部の前記幹細胞が、有毛細胞に分化するのに十分な時間および条件下で、ニワトリ耳胞細胞の存在下において前記幹細胞を培養するステップは、IGF、EGF、およびFGFを含む培地中で前記幹細胞を培養するステップを含む、請求項3または11に記載の方法。
- 前記幹細胞は、間葉系幹細胞である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記幹細胞は、ヒト幹細胞である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
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