JP2010509194A - 疾患、悪性病変、および障害の処置のための標的化された分裂生体分子コンジュゲート、ならびにそれらの生成方法 - Google Patents

疾患、悪性病変、および障害の処置のための標的化された分裂生体分子コンジュゲート、ならびにそれらの生成方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2010509194A
JP2010509194A JP2009534889A JP2009534889A JP2010509194A JP 2010509194 A JP2010509194 A JP 2010509194A JP 2009534889 A JP2009534889 A JP 2009534889A JP 2009534889 A JP2009534889 A JP 2009534889A JP 2010509194 A JP2010509194 A JP 2010509194A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
split
polypeptide
nucleic acid
disease
effector
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2009534889A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2010509194A5 (ja
Inventor
バディム デミドフ
ナタリア ブルード
チャールズ カンター
ウィリアム エバンス
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Boston University
St Jude Childrens Research Hospital
Original Assignee
Boston University
St Jude Childrens Research Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boston University, St Jude Childrens Research Hospital filed Critical Boston University
Publication of JP2010509194A publication Critical patent/JP2010509194A/ja
Publication of JP2010509194A5 publication Critical patent/JP2010509194A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0056—Peptides, proteins, polyamino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6819—Plant toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6819—Plant toxins
    • A61K47/6821—Plant heterodimeric toxins, e.g. abrin or modeccin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6819—Plant toxins
    • A61K47/6821—Plant heterodimeric toxins, e.g. abrin or modeccin
    • A61K47/6823—Double chain ricin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6819—Plant toxins
    • A61K47/6825—Ribosomal inhibitory proteins, i.e. RIP-I or RIP-II, e.g. Pap, gelonin or dianthin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6819—Plant toxins
    • A61K47/6825—Ribosomal inhibitory proteins, i.e. RIP-I or RIP-II, e.g. Pap, gelonin or dianthin
    • A61K47/6827—Ricin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0045—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent agent being a peptide or protein used for imaging or diagnosis in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明は、核酸およびポリペプチドの定方向標的化のための分裂生体分子コンジュゲートの組成物およびそれらの生成のための方法に関する。より好ましくは、組成物および方法は、疾患、悪性病変、障害の処置、およびスクリーニングのための分裂生体分子コンジュゲートの使用を可能にする。いくつかの態様において、分裂生体分子コンジュゲートは、プローブにコンジュゲートされた分裂エフェクタータンパク質断片を含み、病原性核酸配列または病原性タンパク質のような標的核酸または標的ポリペプチドとの両プローブの相互作用が、分裂エフェクター断片を集合させ、エフェクター分子の再組み立てを促進する。エフェクター分子に応じて、タンパク質補完は、特に、疾患、悪性病変、および障害の処置のための細胞の作用をもたらす。

Description

相互参照される出願
本願は、35 U.S.C.119(e)の下、その内容が参照により本明細書に組み入れられる2006年10月27日出願の米国仮出願第60/854,892号に基づく優先権を主張する。
分野
本発明は、核酸およびポリペプチドの定方向標的化のための分裂生体分子コンジュゲートの組成物、ならびにそれらの作製のための方法に関する。より好ましくは、組成物および方法は、疾患、悪性病変、および障害の処置のための分裂生体分子コンジュゲートの使用を可能にする。
背景
多くの型の腫瘍／癌（白血病、リンパ腫、肉腫、腺腫を含む）、ウイルス性疾患（HIV/AIDS、トリインフルエンザ、SARSを含む）、およびその他の障害は、病態を引き起こすタンパク質または病原性タンパク質をコードする疾患特異的なRNAを保持している細胞による。アンチセンス・オリゴヌクレオシド、リボソーム、および低分子干渉RNA（siRNA）による配列特異的サイレンシングまたは病原性RNAの分解のため、いくつかの治療的アプローチが開発された。しかしながら、病理学的細胞の処置においてそのような技術およびアプローチを使用した場合ですら、細胞は生存し続け、疾患の再発または退行をもたらすことがある。
代替の戦略としては、タンパク質毒素を病理学的細胞に優先的に送達し、それにより、それらを選択的に死滅させる免疫毒素を使用することである。しかしながら、高い毒性および高い免疫原性の両方が、免疫毒素の臨床的な使用を制限している。これらの状況において、高い毒性は、送達抗体に連結された完全な毒素の使用のためであり、従って、毒素は、より低い効率ではあるが、健康な細胞も標的とし得る。高い免疫原性は、送達抗体により標的細胞に送達される前に、毒素に対する抗体が再生され、それが、無保護で血流中に循環することによる。
免疫毒素は、典型的には、極めて大きな効力を有するタンパク質毒素または抗体に連結された、リガンド、増殖因子、または細胞型選択性を有する抗体のような標的化モエティ（moiety）から構成されている（Hall et al, 2001；Cancer Res;81;93-124）。標的化モエティは、悪性細胞の表面上の特異的な受容体を認識し、それに分子全体を送達する。次いで、毒素が、（i）サイトゾルに達し、致命的な細胞過程を触媒的に不活化することにより、または（ii）腫瘍細胞膜を修飾することにより、細胞死を誘発する。免疫毒素において使用される毒素は、典型的には、癌細胞上に特異的に発現した表面受容体を認識し、それと結合する抗体、または癌性細胞の表面上に特異的に発現した受容体に対するリガンドのいずれかである標的化モエティにタグ付加される。一般的に使用されている免疫毒素は、モノクローナル抗体（MAb）にコンジュゲートされたリボヌクレアーゼを利用しており（Hurset et al, 2002;43;953-959）、それは、しばしば、癌細胞の表面受容体を標的とし、単一の分子により細胞を死滅させることができる毒素を保持している（Yamaizumi et al, 1978;15:245-250；Eiklid et al, 1980;126:321-326）。
組換え免疫毒素の使用にはいくつかの主要な限界が存在し、特に、特異性は、標的化抗原の分布局在および発現事象により決定される。標的受容体が腫瘍細胞のみならず正常細胞にも提示されているようないくつかの場合には、非特異的な結合および副作用が起こり得る。
概要
本発明者らは、疾患、障害、および悪性病変の標的化した処置のための、分裂生体分子コンジュゲートの作製および使用の方法を見出した。より具体的には、本発明は、各エフェクター断片がプローブにコンジュゲートされている分裂エフェクターポリペプチドを含む分裂生体分子コンジュゲートを使用して、疾患、障害、および悪性病変を処置する方法に関する。病原性核酸配列または病原性タンパク質のような標的核酸または標的ポリペプチドとの両プローブの相互作用が、エフェクター断片を集合させ、当技術分野において「タンパク質補完」とも呼ばれるエフェクター分子の再組み立てを促進する。エフェクター分子に応じて、タンパク質補完は、細胞の作用をもたらす。本発明の方法は、治療的なタンパク質補完法に基づく。
いくつかの態様において、標的核酸はDNAまたはRNAであり、いくつかの態様において、それは、変異および／または多型を含む遺伝子をコードする核酸配列である。他の態様において、標的核酸は、例えば、以下に限定はされないが、癌遺伝子、不適切なタンパク質発現（即ち、正常と比較して低下もしくは増加したレベルでのタンパク質発現）のような機能障害性に発現されたタンパク質、または不正確な組織もしくは細胞型において発現されたタンパク質のような病原性タンパク質をコードする核酸である。他の態様において、標的核酸には、病原体のゲノムまたは病原体の核酸、例えば、ウイルス性の（HIVもしくはトリインフルエンザのような）またはその他の病原体のゲノムもしくは核酸配列が含まれる。いくつかの態様において、標的は、例えば、以下に限定はされないが、変異型タンパク質、折り畳まれていないタンパク質、病原体由来のタンパク質、癌遺伝子タンパク質等のようなポリペプチドである。
いくつかの態様において、分裂生体分子コンジュゲートのエフェクター分子成分は、毒素、例えば、細菌または植物の毒素である。他の態様において、エフェクター分子は、ヌクレアーゼ、例えば、DNaseまたはRNaseである。他の態様において、エフェクター分子は、細胞毒素、例えば、サイトカインである。他の態様において、エフェクター分子は、プロテアーゼ分子であり、他の態様において、エフェクター分子は、細胞死経路を誘導し、例えば、エフェクター分子は、Bad、bax、および当業者に一般に公知のその他のアポトーシス促進性タンパク質のようなアポトーシス促進性分子であり得る。別の態様において、エフェクター分子は、細胞死を阻害するか、または細胞生存経路誘導を誘導し、例えば、bcl-2ファミリーおよびIAPタンパク質ファミリーのメンバーのような抗アポトーシス分子である。
もう一つの態様において、エフェクター分子は、二次的な因子を細胞障害性分子へと触媒する感作分子、例えば、以下に限定はされないが、プロドラッグ、アロプリノールを細胞障害機能を有する分子へと触媒するHGPRTのようなエフェクター分子である。本明細書に開示するような方法において有用なエフェクター分子のその他の例には、標的核酸または標的ポリペプチドを修飾する分子、例えば、遺伝子発現を停止させるDNAメチルトランスフェラーゼおよびタンパク質分解を誘導するユビキチン化E3酵素が含まれる。
いくつかの態様において、分裂生体分子コンジュゲートのプローブ成分は、核酸、例えば、DNA、RNA、PNA、pcPNA等であり、他の態様において、プローブはポリペプチドである。核酸プローブおよびポリペプチド・プローブは、いずれも、核酸標的およびポリペプチド標的に結合し、それらを認識することができる。
いくつかの態様において、本明細書に開示するような分裂生体分子コンジュゲートは、細胞死を誘導することができ、この機能性を可能にするエフェクター分子を含む。そのような態様において、分裂生体分子コンジュゲートは、癌、病原体（例えば、ウイルス感染）、および標的化された細胞死が望ましい機能であるようなその他の任意の障害または疾患、例えば、免疫障害の処置において使用され得る。
いくつかの態様において、本明細書に開示するような方法において有用な分裂生体分子コンジュゲートは、標的核酸または標的ポリペプチドを分解することができ、この機能性を可能にするエフェクター分子、例えば、プロテアーゼまたはDNA/RNAヌクレアーゼのようなエフェクター分子を含む。そのような態様において、分裂核酸は、多くの治療的適用のため、例えば、癌、病原体感染の処置および／または防止、ならびに病原性核酸および／または病原性ポリペプチドの発現による細胞および障害の処置のため使用され得る。いくつかの態様において、病原性核酸および／または病原性ポリペプチドの発現は、一塩基多型（SNP）等の変異の結果として起こり得る。いくつかの態様において、本明細書に開示するような分裂生体分子コンジュゲートは、タンパク質の発現が、疾患の少なくとも一つの症状に完全にまたは部分的に寄与するような障害または疾患の処置において有用である。いくつかの態様において、本明細書に開示するような方法により処置され得る疾患には、例えば、以下に限定はされないが、神経変性障害、免疫障害、癌、および病原性の核酸／ポリペプチドの存在が含まれる。
他の態様において、本明細書に開示するような分裂生体分子コンジュゲートは、第二の因子による二次的な傷害に対して細胞を感作することができ、プロドラッグを細胞毒素として機能する分子へと触媒することができる酵素または分子であるエフェクター分子を含む。そのような態様において、感作分裂生体分子コンジュゲートは、標的とされた細胞における選択的な細胞死のため有用である。そのような手段は、細胞死のために複数の侵襲が必要とされる場合、例えば、薬物抵抗性の癌およびウイルス感染細胞の処置のため、特に有用である。
もう一つの態様において、本発明は、分裂生体分子コンジュゲートを含む薬学的組成物の作製のための方法を提供する。一つのそのような態様において、薬学は、例えば、前負荷されたポリマー性ナノ粒子および／またはカチオン性リポソームを介した、分裂生体分子コンジュゲートを投与するための新規の送達法である。
本発明の一つの局面は、分裂エフェクターポリペプチド断片が、標的核酸または標的ポリペプチドに特異的な少なくとも二つのプローブのうちの一つにコンジュゲートされており、標的核酸または標的ポリペプチドが、疾患、悪性病変、または障害に罹患している細胞に存在し、標的の核酸またはポリペプチドとのプローブの結合が、エフェクター分子を再構成し、エフェクター分子が、細胞に対して致死性であり；かつ／またはもう一つの化合物に対して細胞を感作し；かつ／または疾患、悪性病変、もしくは障害を軽減する、分裂エフェクター分子を含む分裂生体分子コンジュゲートに関する。
いくつかの態様において、分裂生体分子コンジュゲートは、エフェクター分子の少なくとも二つのポリペプチド断片を含む分裂エフェクター分子を含んでよく、該断片は、（a）活性化されたコンフォメーションで存在し；（b）単独では活性でなく；（c）さらにプローブを含み；かつ（d）標的の核酸またはポリペプチドの存在下でリアルタイムで活性エフェクター分子を再構成するよう補完する。
本発明のもう一つの局面は、対象における疾患もしくは障害を処置するまたはその影響を低減する方法に関し、本方法は、分裂エフェクター分子を含む本明細書に開示するような分裂生体分子コンジュゲートの薬学的組成物の有効量の、対象への投与であって、分裂エフェクターポリペプチド断片の各々が、疾患または障害に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドに特異的な二つのプローブのうちの少なくとも一つにコンジュゲートされている、投与と、疾患または障害に関連している標的核酸または標的ポリペプチドと少なくとも二つのプローブが結合することにより促進にされる活性エフェクター分子の形成とを含む。
いくつかの態様において、分裂エフェクター分子は、毒素分子もしくはその断片、または免疫毒素もしくはその断片である。いくつかの態様において、毒素または免疫毒素である分裂エフェクター分子は、以下に限定はされないが、タンパク質毒素、細菌毒素、および植物毒素である。本明細書に開示するような方法においてエフェクター分子として有用な植物毒素の例には、以下に限定はされないが、植物完全毒素、クラスIIリボソーム不活性化タンパク質、植物血液毒、クラスIリボソーム不活性化タンパク質が含まれる。本明細書に開示するような方法においてエフェクター分子として有用な植物毒素のさらなる例には、以下に限定はされないが、サポリン（SAP）；アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（PAP）；ブリオジン1；ブーガニン（bouganin）、およびゲロニン、またはそれらの天然に存在する変異体もしくは遺伝子操作された変異体もしくは断片が含まれる。
本明細書に開示するような方法において有用な植物毒素の例には、以下に限定はされないが、炭疽毒素；ジフテリア毒素（DT）；シュードモナス内毒素（PE）；ストレプトリジンO；またはそれらの天然に存在する変異体もしくは遺伝子操作された変異体もしくは断片が含まれる。
本明細書に開示するような方法においてエフェクター分子として有用な植物毒素のさらなる例には、以下に限定はされないが、リシンA鎖（RTA）；リシンB（RTB）；アブリン；ヤドリギ、レクチン、およびモデシン、またはそれらの天然に存在する変異体もしくは遺伝子操作された変異体もしくは断片が含まれる。いくつかの態様において、植物毒素は、リボトキシン、例えば、リシンA鎖（RTA）であるが、これに限定はされない。
いくつかの態様において、分裂エフェクター分子は、細胞障害性分子またはその断片、例えば、以下に限定はされないが、IL-1；IL-2；IL-3；IL-4；IL-13；インターフェロンアルファ；腫瘍壊死因子アルファ（TNFα）；IL-6；顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）；GM-CSF、またはそれらの天然の変異体もしくは遺伝子操作された変異体のようなサイトカインである。
さらなる態様において、植物毒素は、ヌクレアーゼ、例えば、以下に限定はされないが、サルシン；リストリクトシンであり得る。いくつかの態様において、本明細書に開示するような方法において有用な分裂エフェクター分子は、ヌクレアーゼであるか、またはヌクレオチド鎖切断活性を有し、例えば、DNAヌクレアーゼもしくはDNAエンドヌクレアーゼ、例えば、DNAエンドヌクレアーゼI、またはそれらの天然の変異体もしくは遺伝子操作された変異体である。別の態様において、ヌクレアーゼは、RNAヌクレアーゼまたはRNAエンドヌクレアーゼ、例えば、以下に限定はされないが、RNAエンドヌクレアーゼI；RNAエンドヌクレアーゼII；RNAエンドヌクレアーゼIIIであり得る。いくつかの態様において、RNAヌクレアーゼは、例えば、以下に限定はされないが、アンジオゲニン、ダイサー、RNase A、またはそれらの変異体もしくは断片である。
別の態様において、本明細書に開示するような方法において有用なエフェクター分子には、以下に限定はされないが、カスパーゼ酵素；カルパイン酵素；カテプシン酵素；エンドプロテアーゼ酵素；グランザイム；マトリックスメタロプロテアーゼ；ペプシン；プロナーゼ；プロテアーゼ；プロテイナーゼ；レンニン；トリプシン、またはそれらの変異体もしくは断片のようなタンパク質分解酵素が含まれる。
本発明のもう一つの局面は、細胞において細胞死経路を誘導することができる分裂エフェクター分子を含む分裂生体分子コンジュゲートに関する。そのような態様において、本明細書に開示するような方法において有用なエフェクター分子には、以下に限定はされないが、Hsp90；TNFα；DIABLO；BAX；Bcl-2の阻害剤；Bad；ポリADPリボースポリメラーゼ-1（PARP-1）：第二ミトコンドリア由来カスパーゼアクチベーター（SMAC）；アポトーシス誘導因子（AIF）；Fas（Apo-1またはCD95としても公知）；Fasリガンド（FasL）、またはそれらの変異体もしくは断片のようなアポトーシス促進性分子が含まれる。
本発明のもう一つの局面は、細胞において細胞死経路を阻害するか、または細胞生存経路を誘導することができる分裂エフェクター分子を含む分裂生体分子コンジュゲートに関する。そのような態様において、本明細書に開示するような方法において有用なエフェクター分子には、例えば以下に限定はされないが、bcl-2；Bcl-XL；Hsp27；アポトーシス阻害（IAP）タンパク質が含まれる。
本発明のもう一つの局面は、一つまたは複数の二次的な因子に対して細胞を感作することができる分裂エフェクター分子を含む分裂生体分子コンジュゲートに関する。そのような態様において、本明細書に開示するような方法において有用なエフェクター分子には、以下に限定はされないが、β-グルクロニダーゼ；ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；β-ラクタマーゼ；カルボキシルエステラーゼHCE1；ペルオキシダーゼ酵素、およびそれらの変異体または断片が含まれる。いくつかの態様において、二次的な因子は、オセルタミビル；アロプリノールを含む群より選択される抗ウイルス薬である。
本発明のもう一つの局面は、タンパク質分解のため標的ポリペプチドにタグ付加することができるエフェクター分子を含む分裂生体分子コンジュゲートに関する。そのような態様において、本明細書に開示するような方法において有用なエフェクター分子には、以下に限定はされないが、ユビキチン；低分子ユビキチン関連修飾因子（SUMO）；DNAメチルトランスフェラーゼ（DNA MTase）；ヒストンアセチル化酵素（HAT）、およびそれらの変異体または断片が含まれる。
いくつかの態様において、本明細書に開示するような分裂生体分子コンジュゲートは、病態を引き起こす核酸による疾患または障害の処置のために有用である。そのような疾患または障害の例には、決して限定はされないが、癌；神経疾患；変性疾患；炎症性疾患；病原体感染が含まれる。
いくつかの態様において、本明細書に開示するような分裂生体分子コンジュゲートにより処置され得る癌には、例えば、以下に限定はされないが、間葉系起源（肉腫）；繊維肉腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；軟骨肉腫；骨原性肉種；血管肉腫；内皮肉腫（endotheliosarcoma）；リンパ管肉腫；滑膜肉腫；中皮肉腫（mesotheliosarcoma）；ユーイング腫瘍；骨髄性白血病；単球性白血病；悪性白血病；リンパ性白血病；形質細胞腫；平滑筋肉腫；および横紋筋肉腫；上皮起源の癌（細胞腫）；扁平上皮または表皮癌；基底細胞癌；汗腺癌；皮脂腺癌；腺癌；乳頭癌；乳頭状腺癌；嚢胞腺癌；髄様癌；未分化癌（単純癌（simplex carcinoma））；気管支原性肺癌；気管支癌；黒色腫；腎細胞癌；肝細胞癌；胆管癌；移行上皮癌；扁平上皮癌；絨毛癌；精上皮腫；胚性癌腫；悪性奇形腫；および奇形癌腫；白血病；急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄芽球性、骨髄単球性；単球性、および赤白血病）；慢性白血病；慢性骨髄性（顆粒球性）白血病；慢性リンパ性白血病；真性赤血球増加症；リンパ腫；ホジキン病；非ホジキン病；多発性骨髄腫；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；重鎖病が含まれる。いくつかの態様において、癌は、リンパ腫；白血病；肉腫；腺腫であり、いくつかの態様において、癌は急性リンパ芽球性白血病（ALL）である。
いくつかの態様において、本明細書に開示するような分裂生体分子コンジュゲートにより処置され得る神経学的な疾患または障害には、例えば、以下に限定はされないが、アルツハイマー病；パーキンソン病；ハンチントン病；ポリグルタミン病；筋萎縮性側索硬化症（ALS）が含まれる。
いくつかの態様において、本明細書に開示するような分裂生体分子コンジュゲートにより処置され得る病原体には、例えば、以下に限定はされないが、インフルエンザ、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、または酵母が含まれる。
別の態様において、本明細書に開示するような分裂生体分子コンジュゲートを使用して処置され得る疾患は、疾患の遺伝的素因である。
いくつかの態様において、本明細書に開示するような分裂生体分子コンジュゲートを投与される対象は、哺乳類、例えば、ヒトである。いくつかの態様において、分裂生体分子コンジュゲートは、細胞、例えば、インビボの細胞に投与される。別の態様において、細胞が対象から入手され、エクスビボで薬学的組成物を投与され、例えば、ヒト対象のような対象へ移植により戻されてもよい。
いくつかの態様では、分裂生体分子コンジュゲートを、封入体により作製し、別の態様では、無細胞系または封入体の形成を最小限に抑える細菌発現系により、分裂生体分子コンジュゲートを作製する。
いくつかの態様において、分裂生体分子コンジュゲートは、ポンプ；直接注射；局所適用；皮内、皮下を介した対象への投与；静脈内；リンパ内；節内（intranodal）；粘膜内、または筋肉内の投与を含む群により細胞に投与される。または、分裂生体分子コンジュゲートは、前負荷されたポリマー性ナノ粒子および／またはカチオン性リポソームにより細胞に投与することができる。
いくつかの態様において、核酸結合モチーフにコンジュゲートされた分裂エフェクター分子が、従来の手段により細胞へ導入された発現ベクターから、該細胞において発現される。いくつかの態様において、ベクターもエフェクター分子を含む。
いくつかの態様において、標的核酸は、病態を引き起こす標的核酸配列、例えば、以下に限定はされないが、病原性DNAまたは病原性RNAのようなDNA、RNAを含む。いくつかの態様において、病原性DNAは、少なくとも一つの変異および／または多型を含む。いくつかの態様において、標的核酸配列は、ウイルス起源の病原体DNAまたはRNAのような病原体DNAまたはRNAを含み得る。いくつかの態様において、本明細書に開示するような方法により標的とされ得る病原体DNAまたはRNAの例には、例えば、以下に限定はされないが、AIDS/HIV；トリインフルエンザ；SARS；A型肝炎；B型肝炎；C型肝炎；インフルエンザ；水痘；アデノウイルス、HSV-2；HSV-II；牛疫ライノウイルス；エコーウイルス；ロタウイルス；呼吸器多核体ウイルス；パピローマウイルス；パポーバウイルス；サイトメガロウイルス；エキノウイルス（echinovirus）；アルボウイルス；ハンタウイルス；コクサッキーウイルス；麻疹ウイルス；流行性耳下腺炎ウイルス；風疹ウイルス；ポリオウイルス；HIV-I、HIV-II；トリおよび／または鳥類インフルエンザウイルス；エボラウイルス；その他のウイルスが含まれる。
いくつかの態様において、分裂生体分子コンジュゲートにより標的とされる標的ポリペプチドには、以下に限定されないが、正常な非病原性ポリペプチドに対して異常なコンフォメーションを有している病原性ポリペプチドのような病原性ポリペプチドが含まれる。
いくつかの態様において、細胞はインビトロまたはインビボである。
いくつかの態様において、本明細書に開示するような分裂生体分子コンジュゲートは、核酸結合モチーフ、例えば、以下に限定はされないが、DNA、RNA、PNA、LNA、pcPNA、DNA結合タンパク質、RNA結合タンパク質、またはそれらのアナログもしくは断片であるプローブを含む。
別の態様において、本明細書に開示するような分裂生体分子コンジュゲートは、ポリペプチド検出タンパク質（detector protein）であるプローブを含む。いくつかの態様において、ポリペプチド検出タンパク質は、各断片がエフェクタータンパク質の二つまたはそれ以上の断片にコンジュゲートされており、かつ検出ポリペプチド断片の標的核酸または標的ポリペプチドとの結合が、検出タンパク質および活性エフェクタータンパク質を再構成する、少なくとも二つの断片に分裂し得る。さらなる態様において、ポリペプチド検出タンパク質は、例えば、マルチドメインポリペプチド検出タンパク質の各ドメインがエフェクタータンパク質の二つまたはそれ以上の断片にコンジュゲートされており、かつ検出タンパク質のドメインの標的核酸または標的ポリペプチドとの結合が、検出タンパク質および活性エフェクタータンパク質を再構成する、マルチドメインポリペプチド検出タンパク質である。
本発明のもう一つの局面は、分裂エフェクターポリペプチド断片が、二つまたはそれ以上のプローブに各々コンジュゲートされた少なくとも二つのポリペプチド断片を含み、かつ分裂エフェクターポリペプチド断片が、特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、細胞において細胞死経路を開始させることができる活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、分裂エフェクター分子を含む細胞死分裂生体分子コンジュゲートを提供する。
いくつかの態様において、本発明は、（i）分裂エフェクターポリペプチド断片が、癌障害に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドに特異的なプローブにコンジュゲートされており；かつ（ii）分裂エフェクターポリペプチド断片が、腫瘍に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、腫瘍細胞を細胞死分裂エフェクター分子と接触させることを含む、細胞死分裂生体分子コンジュゲートにより癌を処置するための方法を提供する。
いくつかの態様において、本発明は、（i）分裂エフェクターポリペプチド断片が、病原体感染に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドに特異的なプローブにコンジュゲートされており；かつ（ii）分裂エフェクターポリペプチド断片が、病原体感染に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、病原体感染細胞を細胞死分裂エフェクター分子と接触させることを含む、細胞死分裂生体分子コンジュゲートにより病原体感染を処置するための方法を提供する。
いくつかの態様において、細胞死分裂生体分子コンジュゲートは、病理学的核酸および／または病理学的ポリペプチド、例えば、病態の作用として細胞において変化する標的核酸または標的ポリペプチドを含む細胞を死滅させるために有用である。いくつかの態様において、細胞死分裂生体分子コンジュゲートの標的核酸は、以下に限定はされないが、p63；p73；gp40（v-fms）；p21（ras）；p55（v-myc）；p65（gag-jun）；pp60（v-src）；v-abl；v-erb；v-erba；v-fos、またはそれらの変異体のような癌遺伝子またはプロオンコジーンをコードする。または、細胞死分裂生体分子コンジュゲートは、病原性タンパク質または病原性核酸を検出するために使用されてよく、ここで、病原体は、例えば、限定はされないが、インフルエンザ、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、または酵母である。
いくつかの態様において、ウイルスは、AIDS/HIV；トリインフルエンザ；SARS；A型肝炎；B型肝炎；C型肝炎；インフルエンザ；水痘；アデノウイルス、HSV-2；HSV-II；牛疫ライノウイルス；エコーウイルス；ロタウイルス；呼吸器多核体ウイルス；パピローマウイルス；パポーバウイルス；サイトメガロウイルス；エキノウイルス；アルボウイルス；ハンタウイルス；コクサッキーウイルス；麻疹ウイルス；流行性耳下腺炎ウイルス；風疹ウイルス；ポリオウイルス；HIV-I、HIV-II；トリおよび／または鳥類インフルエンザウイルス；エボラウイルス；その他のウイルスを含む群より選択される。
いくつかの態様において、細胞死分裂生体分子コンジュゲートのような分裂生体分子コンジュゲートは、以下に限定はされないが、v-fms；v-myc；v-src；v-abl；v-erb；v-erba；v-fos；M1タンパク質；ウイルス様粒子（VPL）のような核酸または標的ポリヌクレオチドを標的とするために有用である。
本発明のもう一つの局面において、分裂生体分子コンジュゲートは、分裂エフェクターポリペプチド断片が、二つまたはそれ以上のプローブに各々コンジュゲートされた少なくとも二つのポリペプチド断片を含み、分裂エフェクターポリペプチド断片が、特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、細胞において標的核酸もしくは標的ポリペプチドを分解するか、またはそれらの分解を誘導することができる活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、分裂エフェクター分子を含む分解分裂生体分子コンジュゲートである。
いくつかの態様において、分解分裂生体分子コンジュゲートは、例えば、（i）分裂エフェクターポリペプチド断片が、癌障害に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドに特異的なプローブにコンジュゲートされており；かつ（ii）分裂エフェクターポリペプチド断片が、腫瘍に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、腫瘍細胞を細胞死分裂エフェクター分子と接触させることを含む、癌の処置のための方法において有用である。
さらなる態様において、本明細書に開示するような分解分裂生体分子コンジュゲートは、（i）分裂エフェクターポリペプチド断片が、病原体感染に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドに特異的なプローブにコンジュゲートされており；かつ（ii）分裂エフェクターポリペプチド断片が、病原体感染に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、病原体感染細胞を細胞死分裂エフェクター分子と接触させることを含む、病原体感染の処置のための方法において有用である。
さらなる態様において、本明細書に開示するような分解分裂生体分子コンジュゲートは、（i）分裂エフェクターポリペプチド断片が、病原体感染に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドに特異的なプローブにコンジュゲートされており；かつ（ii）分裂エフェクターポリペプチド断片が、疾患または障害に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、病原体感染細胞を細胞死分裂エフェクター分子と接触させることを含む、疾患または障害の処置のための方法において有用である。
いくつかの態様において、本明細書に開示するような分解分裂生体分子コンジュゲートは、病態に影響を及ぼす核酸またはポリペプチドとして同定される、病理学的核酸のような標的核酸または病理学的ポリペプチドのような標的ポリペプチドの分解を標的とする。いくつかの態様において、分解分裂生体分子コンジュゲートの標的核酸は、以下に限定はされないが、p63；p73；gp40（v-fms）；p21（ras）；p55（v-myc）；p65（gag-jun）；pp60（v-src）；v-abl；v-erb；v-erba；v-fos、またはそれらの変異体のような、癌遺伝子またはプロオンコジーンをコードする。または、分解分裂生体分子コンジュゲートは、病原性タンパク質または病原性核酸を検出するために使用され得、ここで、病原体は、例えば、以下に限定はされないが、インフルエンザ、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、または酵母である。
いくつかの態様において、ウイルスは、AIDS/HIV；トリインフルエンザ；SARS；A型肝炎；B型肝炎；C型肝炎；インフルエンザ；水痘；アデノウイルス、HSV-2；HSV-II；牛疫ライノウイルス；エコーウイルス；ロタウイルス；呼吸器多核体ウイルス；パピローマウイルス；パポーバウイルス；サイトメガロウイルス；エキノウイルス；アルボウイルス；ハンタウイルス；コクサッキーウイルス；麻疹ウイルス；流行性耳下腺炎ウイルス；風疹ウイルス；ポリオウイルス；HIV-I、HIV-II；トリおよび／または鳥類インフルエンザウイルス；エボラウイルス；その他のウイルスを含む群より選択される。
いくつかの態様において、分解分裂生体分子コンジュゲートのような分裂生体分子コンジュゲートは、以下に限定はされないが、v-fms；v-myc；v-src；v-abl；v-erb；v-erba；v-fos；M1タンパク質；ウイルス様粒子（VPL）のような核酸または標的ポリヌクレオチドを標的とするために有用である。
いくつかの態様において、分解分裂生体分子コンジュゲートのような分裂生体分子コンジュゲートは、変異型ポリペプチドおよび／または不正確に折り畳まれたポリペプチドのような病理学的ポリペプチドの発現に関連している疾患または障害の処置のために有用である。そのような疾患には、神経疾患；腎疾患；心血管疾患；肝疾患；炎症性疾患；嚢胞性繊維症；神経変性疾患；炎症性疾患；免疫障害等が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、分解分裂生体分子コンジュゲートは、以下に限定はされないが、アルツハイマー病；ハンチントン病；パーキンソン病；筋萎縮性側索硬化症（ALS）、脊椎損傷のような神経疾患の処置のために有用である。
本発明のもう一つの局面において、分裂生体分子コンジュゲートは、分裂エフェクターポリペプチド断片が、二つまたはそれ以上のプローブに各々コンジュゲートされた少なくとも二つのポリペプチド断片を含み、分裂エフェクターポリペプチド断片が、特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、他の二次的な因子に対して細胞を感作することができる活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、分裂エフェクター分子を含む感作分裂生体分子コンジュゲートである。
いくつかの態様において、本明細書に開示するような感作分裂生体分子コンジュゲートは、（i）分裂エフェクターポリペプチド断片が、癌障害に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドに特異的なプローブにコンジュゲートされており；かつ（ii）分裂エフェクターポリペプチド断片が、腫瘍に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、腫瘍細胞を細胞死分裂エフェクター分子と接触させることを含む、癌を処置するための方法において使用され得る。
いくつかの態様において、本明細書に開示するような感作分裂生体分子コンジュゲートは、（i）分裂エフェクターポリペプチド断片が、病原体感染に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドに特異的なプローブにコンジュゲートされており；かつ（ii）分裂エフェクターポリペプチド断片が、病原体感染に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、病原体感染細胞を細胞死分裂エフェクター分子と接触させることを含む、病原体感染を処置するための方法において使用され得る。
いくつかの態様において、本明細書に開示するような感作分裂生体分子コンジュゲートは、病態に作用する核酸またはポリペプチドとして同定される、病理学的核酸のような標的核酸または病理学的ポリペプチドのような標的ポリペプチドの分解を標的とする。いくつかの態様において、感作分裂生体分子コンジュゲートの標的核酸は、以下に限定はされないが、p63；p73；gp40（v-fms）；p21（ras）；p55（v-myc）；p65（gag-jun）；pp60（v-src）；v-abl；v-erb；v-erba；v-fos、またはそれらの変異体のような癌遺伝子またはプロオンコジーンをコードする。または、感作分裂生体分子コンジュゲートは、病原性タンパク質または病原性核酸を検出するために使用され得、ここで、病原体は、例えば、以下に限定はされないが、インフルエンザ、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、または酵母である。
いくつかの態様において、ウイルスは、AIDS/HIV；トリインフルエンザ；SARS；A型肝炎；B型肝炎；C型肝炎；インフルエンザ；水痘；アデノウイルス、HSV-2；HSV-II；牛疫ライノウイルス；エコーウイルス；ロタウイルス；呼吸器多核体ウイルス；パピローマウイルス；パポーバウイルス；サイトメガロウイルス；エキノウイルス；アルボウイルス；ハンタウイルス；コクサッキーウイルス；麻疹ウイルス；流行性耳下腺炎ウイルス；風疹ウイルス；ポリオウイルス；HIV-I、HIV-II；トリおよび／または鳥類インフルエンザウイルス；エボラウイルス；その他のウイルスを含む群より選択される。
いくつかの態様において、感作分裂生体分子コンジュゲートのような分裂生体分子コンジュゲートは、以下に限定はされないが、v-fms；v-myc；v-src；v-abl；v-erb；v-erba；v-fos；M1タンパク質；ウイルス様粒子（VPL）のような核酸または標的ポリヌクレオチドを標的とするために有用である。
いくつかの態様において、感作分裂生体分子コンジュゲートのような分裂生体分子コンジュゲートは、以下に限定はされないが、β-グルクロニダーゼ；ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；β-ラクタマーゼ；カルボキシルエステラーゼHCE1；ペルオキシダーゼ酵素、またはそれらの変異体もしくは断片のようなエフェクタータンパク質を含む。
本発明のもう一つの局面において、分裂生体分子コンジュゲートは、分裂エフェクターポリペプチド断片が、二つまたはそれ以上のプローブに各々コンジュゲートされた少なくとも二つのポリペプチド断片を含み、分裂エフェクターポリペプチド断片が、特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、細胞において細胞生存経路を開始させるか、または細胞死を阻害することができる活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、分裂エフェクター分子を含む生存分裂生体分子コンジュゲートである。
いくつかの態様において、本明細書に開示するような生存分裂生体分子コンジュゲートは、（i）分裂エフェクターポリペプチド断片が、癌障害に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドに特異的なプローブにコンジュゲートされており；かつ（ii）分裂エフェクターポリペプチド断片が、疾患または障害に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、腫瘍細胞を細胞死分裂エフェクター分子と接触させることを含む、疾患または障害を処置するための方法において使用され得る。いくつかの態様において、本明細書に開示するような生存分裂生体分子コンジュゲートは、病態の一部として細胞損失に関連した疾患もしくは障害、または変異型ポリペプチドおよび／もしくは不正確に折り畳まれたポリペプチドのような病理学的ポリペプチドの発現に関連した、もしくは病理学的ポリペプチドの発現による疾患もしくは障害の処置のために有用である。
いくつかの態様において、本明細書に開示するような生存分裂生体分子コンジュゲートは、神経疾患；腎疾患；心血管疾患；肝疾患；炎症性疾患；嚢胞性繊維症；神経変性疾患；炎症性疾患；免疫障害、およびアルツハイマー病；ハンチントン病；パーキンソン病；筋萎縮性側索硬化症（ALS）、脊椎損傷のような神経疾患のような疾患の処置において有用であり得る。
本発明のもう一つの局面において、分裂生体分子コンジュゲートは、分裂エフェクターポリペプチド断片が、二つまたはそれ以上のプローブに各々コンジュゲートされた少なくとも二つのポリペプチド断片を含み、分裂エフェクターポリペプチド断片が、特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、細胞において機能障害性のポリペプチドまたは失われたポリペプチドに取って代わることができる活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、分裂エフェクター分子を含む代理分裂生体分子コンジュゲートである。
いくつかの態様において、本明細書に開示するような代理分裂生体分子コンジュゲートは、（i）分裂エフェクターポリペプチド断片が、癌障害に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドに特異的なプローブにコンジュゲートされており；かつ（ii）分裂エフェクターポリペプチド断片が、例えば、細胞内のポリペプチドの損失もしくは減少した発現または機能障害性の発現に関連している疾患または障害のような疾患または障害に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、腫瘍細胞を細胞死分裂エフェクター分子と接触させることを含む、疾患または障害の処置のための方法において有用である。
いくつかの態様において、代理分裂生体分子コンジュゲートのエフェクターポリペプチドは、例えば、神経疾患；腎疾患；心血管疾患；肝疾患；炎症性疾患；嚢胞性繊維症；神経変性疾患；炎症性疾患；免疫障害のような疾患に関連した、失われたポリペプチドもしくは性のポリペプチド、またはその断片を含む。そのような疾患の例には、例えば、以下に限定はされないが、筋ジストロフィー、嚢胞性繊維症等が含まれる。
本発明のもう一つの局面は、本明細書に開示するような分裂生体分子コンジュゲートのうちの少なくとも一つを含む薬理学的組成物に関し、ここで、薬学的組成物は、少なくとも一つの生体分子コンジュゲートを前負荷されたポリマー性ナノ粒子を含む。
分裂した毒素による病理学的細胞の標的化された死滅、およびALL細胞の標的化された死滅のための核酸に基づく毒素の再組み立ての模式図を示す。病原性RNAに結合するRNA認識アームに連結された毒素半分を含む二つのタンパク質-オリゴヌクレオチド構築物が、非免疫原性の薬物を負荷された媒体（ポリマー性ナノ粒子、カチオン性リポソーム等）により血流から細胞へ送達される。病原性RNA（内因性の癌遺伝子RNAまたはウイルス起源のRNA）は、疾患細胞にのみ存在し；従って、これらの異常細胞のマーカーであり、分裂した毒素の選択的な自滅的な再組み立てのための足場として働く。細胞内核酸分解酵素による可能性のある分解を回避するため、生物学的に安定な（biostable）オリゴヌクレオチドアナログが使用されてもよい。 リシンA構造のリボン図を示す。リシンA毒素（RTA）の主要な二つのサブドメイン：数個のβシート（矢印）により形成されたドメインIおよびαヘリックス状のドメインIIが、ここで明白に認識され得る。 TEL-AML1遺伝子融合の構造を示す。（a）(12;21)(p13;q22)に含まれるTEL遺伝子およびAML1遺伝子のエキソン／イントロン構造の概略図。セントロメア（cen）およびテロメア（tel）の方向、エキソンの番号、ならびに関連するブレークポイント領域が示されている。（b）TEL-AML1融合転写物の概略図。融合遺伝子転写物の下の数字は、上流遺伝子の最後の（39）ヌクレオチドが示される場合以外は、含まれるエキソンの最初の（59）ヌクレオチドをさす。大部分のt(12;21)陽性患者は、AML1イントロンl内のブレークポイントのためにより大きな転写物を有するが、一部の患者においては、オルタナティブスプライシングが、AML1エキソン2のスキッピングを引き起こし、二つのPCR産物を与えることもある。少数の患者においては、AML1ブレークポイントがイントロン2に位置し、それはAML1エキソン2を含まないより短い転写物をもたらす。矢印は、5つのプライマーの相対位置を示し；数字は、各プライマーの59ヌクレオチド位をさす（Van Dongen et aL, 1999）。 リシンのA鎖の二次構造予測（予測タンパク質、Hヘリックス、E-flシート、Lループ）および提案されたタンパク質分裂部位（矢印）を示す。 リシン断片クローニングおよび標的特異的オリゴヌクレオチドとのタンパク質カップリングの模式図を示す（burbulis et al, 2005より修飾）。パネル5Aは、インテインとの融合体としてクローニングされたリシンA断片のスキームを示し、パネル5Bは、5'末に偽システインを含む修飾されたオリゴヌクレオチドの化学構造を示す。パネル5Cは、リシン断片と修飾されたオリゴヌクレオチドとのカップリングの化学を示す。アスタリスクは、リシン断片、CBD-キチン結合ドメインのC末端の機能性システインを示す。 ALLのためのブレークポイント配列の構造を示す。 全長RTA（268アミノ酸）のアミノ酸配列の模式図および第一分裂点の部位を示す。パネル7Aは、試験された三つのRNAの分裂点（↓として示されている）を示す。RTA分裂点を決定するために以下の考慮がなされた：（i）分裂点は、活性にとって重要なアミノ酸を二つのタンパク質半分の間に分離するべきである；（ii）分裂点は非構造領域内に位置するべきである（分裂タンパク質半分に最小限の構造的障害を導入するため）；（iii）分裂タンパク質半分は、フルサイズRTA内のコンパクトな折り畳み単位に相当する。太字イタリック体：活性部位（Y81、V82、G122、Y124、E178、R181、E209、N210 W212）；太字下線：RTA活性にとって重大なアミノ酸（R49、N79、N123、R214、R259）；太字：中心的な構造的な役割を有するアミノ酸（D76、R135）。パネル7Bは、RTA構造のリボン図を示す。リシンA毒素（RTA）の二つの主要なサブドメイン：数個のβシート（矢印）により形成されたドメインI（パネル7B）およびαヘリックス状のドメインII（パネル7C）が示されている。 分裂RTAタンパク質のインテイン1とのN末端融合体を作成するための、PCRにより入手され、PCRクリーン法により精製されたRTA遺伝子の相補的断片を示す（添字nはN末端融合を表す）。これらの断片のゲル電気泳動により推定されたサイズは、予想されたものによく相当する：N1n 189bp、N2n 396bp、N3n 510bp、C1n 681bp、C2n 474bp、C3n 360bp（必要である場合には、その後のクローニングのための制限部位、終止コドン、末端システインのためのコドンを保持しているプライマーを含む）。大腸菌（E.coli）XL10細胞（クローニング宿主）におけるクローニングの後、PCRにより増幅された全てのDNA断片の同一性が、配列決定によりさらに確認され確証された。 インテイン1と融合した中央分裂RTA遺伝子により形質転換された大腸菌BL21/DE3発現宿主の粗細胞調製物におけるSDS/PAGEタンパク質発現パターンを示す。細胞は、2時間（37℃）、3時間（30℃）、および14時間（25℃）、異なる温度で、1mM IPTGにより誘導された（＋）または誘導されなかった（−）。全ての温度において、誘導された細胞は、N2n-RTAおよびC2n-RTAの分裂RTAタンパク質の相当の過剰発現を示す。その後の実験において、本発明者らは、30℃における誘導が、タンパク質発現のさらなる最適化にとって最も適切であることを見出した。 可溶性画分および不溶性画分における過剰発現された分裂RTA融合タンパク質の査定を示す。IPTG誘導は、低い0.05および0.1mMという誘導剤濃度で、30℃で、3時間、実施された（N1nおよびC1nは、0.1mM IPTGによるもののみ示されている）。全てのパネルにおいて、レーン1および2は、可溶性および不溶性の細胞タンパク質画分に相当する。融合タンパク質の予想サイズ：N1n〜30kDa；C1n〜50kDa；N2n〜38kDa；C2n〜40kDa。データは、分裂RNA断片が高頻度に封入体を形成することを示している。本発明者らは、封入体を形成しない二つの相補的な分裂タンパク質半分を入手するために、多数の異なる分裂部位を査定することが必要であることを見出した。特に、タンパク質が共に補完した場合に活性であって、単独では不活性であるような二つの相補的な半分を見出すためには、4個超、または5個超、または6個超、または7個超、または8個超、または9個超、または10個超のタンパク質内の異なる分裂点を試験することが必要である可能性もある。 インテイン1とのN1n-RTA融合体の封入体からの再折り畳みおよびその後のキチンカラム結合インテインの自己分裂により入手されたN1n-RTAを示す。予想タンパク質サイズ〜5.5kDaの単一のバンドが第1レーンに示され、濃縮前のN1n-RTAの総量は〜1mgであった。インテイン2とC末端融合したN1c-RTAも入手された（示されないデータ）。 インビトロの分裂RTAの機能的な再組み立てを試験するための、リシン分裂可能ステムループRNAオリゴヌクレオチドを示す。分裂／再組み立てRTAタンパク質の活性を分析するために開発されたインビトロ試験系。パネル12Bは、ループ領域にdAを含んで設計されたRTA分割可能ステムループRNA、5'- r(GGAAUCCUGCUCAGUACG)-dA-r(GAGGAACCGCAGGUU)（SEQ ID NO：1）を示しており、それは、この特別な核酸塩基の脱プリン化と、その後のアニリン処理によるRNA切断により、RTA作用を加速する。パネル12Bは、RNAがPAGE分析およびSYBR染色のための正確な長さを有することを示している。 各分裂エフェクター断片タンパク質が、核酸プローブ、例えば、アプタマーと会合することができる分裂ポリペプチドプローブにコンジュゲートされている、分裂した毒素による病理学的細胞の標的化された死滅の模式図を示す。病原性RNAのような病原性標的核酸の存在下で、二つのアプタマーが、細胞内の病原性RNAと結合し、分裂エフェクター断片にコンジュゲートされた分裂ポリペプチドプローブの結合を可能にし、エフェクタータンパク質再組み立ておよび活性エフェクタータンパク質の形成を可能にする。細胞内核酸分解酵素による可能性のある分解を回避するために、生物学的に安定なオリゴヌクレオチドアナログが使用されてもよい。 分裂ポリペプチドプローブと融合した分裂エフェクターの断片の模式図を示す。分裂エフェクター断片は、CBD-インテインと融合したN末端RTA断片またはCBD-インテインと融合したC末端RTA断片である。
詳細な説明
本発明者らは、疾患、障害、および悪性病変の標的化した処置ならびにスクリーニングのための分裂生体分子コンジュゲートの作製および使用のための方法を見出した。より具体的には、本発明は、各エフェクター断片がプローブにコンジュゲートされている分裂エフェクターポリペプチドを含む分裂生体分子コンジュゲートを使用して、疾患、障害、および悪性病変を処置する方法に関する。病原性核酸配列または病原性タンパク質のような標的核酸または標的ポリペプチドとの両プローブの相互作用は、エフェクター断片を集合させ、当技術分野で「タンパク質補完」とも呼ばれるエフェクター分子の再組み立てを促進する。エフェクター分子に応じて、タンパク質補完は、細胞の作用をもたらす。本発明の方法は、治療的なタンパク質補完法に基づく。一つの態様において、標的を標識し、処置、例えば、本明細書に開示するような分裂生体分子コンジュゲートによる対象の処置の必要性および有効性をモニタリングすることが可能である。
定義
本明細書において他に定義されない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は、全て、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同一の意味を有する。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York(1994)およびHale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y.(1991)は、本発明において使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。本明細書に記載されたものと類似しているか、または等価である任意の方法および材料が、本発明の実施または試行において使用され得るが、好ましい方法および材料が記載される。数値の範囲は、範囲を画定している数字を含む。他に示さない限り、それぞれ、核酸は5'から3'への方向で左から右に記載し；アミノ酸配列はアミノからカルボキシへの方向で左から右に記載する。本明細書中に提供する標題は、全体として本明細書を参照することにより得られる本発明の様々な局面または態様を限定するものではない。従って、以下に定義される用語は、全体として明細書を参照することにより、より完全に定義される。
「分裂生体分子コンジュゲート」という用語は、本明細書で使用するように、プローブにコンジュゲートされたエフェクター分子を含むポリペプチドをさし、このエフェクター分子は、断片としては不活性であって、付着しているプローブがそれらの特異的な標的、典型的には、核酸またはポリペプチドの標的と相互作用した場合に、機能性の活性エフェクター分子を形成するよう再組み立てまたはタンパク質補完することができる断片を含む。
「コンジュゲート」という用語は、本明細書で使用するように、一つの実体を形成するよう共に接合された二つまたはそれ以上のタンパク質の付着をさす。タンパク質は、リンカー、化学的修飾、ペプチドリンカー、化学的リンカー、共有結合性もしくは非共有結合性の結合、またはタンパク質融合によって、または当業者に公知の任意の手段によって共に付着されてもよい。接合は永久的であってもよいし、または可逆性であってもよい。いくつかの態様において、各リンカーおよび各タンパク質の所望の特性を利用するために、数個のリンカーがコンジュゲートに含まれ得る。フレキシブルリンカー、およびコンジュゲートの溶解度を増加させるリンカーが、単独でまたは本明細書に組み入れられるその他のリンカーと共に、使用するために企図される。ペプチドリンカーは、リンカーをコードするDNAの発現により、コンジュゲート内の一つまたは複数のタンパク質と連結されてもよい。リンカーは、酸切断可能リンカー、光切断可能リンカー、および感熱性リンカーであってよい。
「融合タンパク質」という用語は、本明細書で使用するように、二つまたはそれ以上のタンパク質の組換えタンパク質をさす。融合タンパク質は、例えば、全ての意図されたタンパク質を保有している単一のポリペプチドへと細胞内で翻訳され得る単一のオープンリーディングフレームを構成するよう、別のタンパク質をコードする核酸と接合された、あるタンパク質をコードする核酸配列により作製することができる。タンパク質の配置の順序は変動し得る。非制限的な例として、分裂生体分子コンジュゲートタンパク質の一つの断片をコードする核酸配列は、分裂ポリペプチドプローブをコードする遺伝子の末端、5'または3'末端のいずれかにインフレームで融合したエフェクター断片のうちの一つをコードするヌクレオチド配列に由来する。このようにして、遺伝子の発現により、エフェクター断片が、機能的に発現され、ポリペプチドプローブのN末端またはC末端に融合される。ある種の態様において、ポリペプチドプローブの修飾は、ポリペプチドプローブの機能性がエフェクタータンパク質との融合により実質的に影響を受けずに残るものである。
「リンカー」という用語は、本明細書で使用するように、融合タンパク質の作製以外の手段により、二つまたはそれ以上のタンパク質を接合するための任意の手段をさす。リンカーは、共有結合性リンカーまたは非共有結合性リンカーであってよい。共有結合性リンカーの例には、共有結合、または連結すべきタンパク質のうちの一つもしくは複数に共有結合的に付着したリンカーモエティが含まれる。リンカーは、非共有結合、例えば、白金原子のような金属中心を通した有機金属結合であってもよい。共有結合のため、炭酸誘導体を含むアミド基、エーテル、有機および無機のエステルを含むエステル、アミノ、ウレタン、尿素等のような様々な官能基が使用され得る。連結を提供するため、エフェクター分子および／またはプローブは、カップリングのための部位を提供するため、酸化、水酸化、置換、還元等により修飾され得る。エフェクタータンパク質および／またはプローブの機能を有意に減少させない修飾が好ましいことが認識されるであろう。
「エフェクター分子」という用語は、本明細書で使用するように、エフェクター分子の二つの断片が集合した場合に、機能性となり、所望の機能的作用のための能力を有するようになるポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸をさす。非制限的な例として、エフェクター分子の機能的作用は、細胞死を誘導すること、細胞障害作用を誘導すること、細胞を感作すること、核酸もしくはポリペプチドを分解すること、細胞生存を促進すること、または失われたポリペプチドおよび／もしくは機能障害性のポリペプチドに取って代わること等であってよい。
「プローブ」という用語は、本明細書で使用するように、標的核酸または標的ポリペプチドを認識し、それらと結合し、結合の結果として、コンジュゲートされた分裂エフェクター分子のタンパク質補完または再組み立てを促進する、分裂生体分子コンジュゲートのエフェクター分子の断片にコンジュゲートされた成分をさす。いくつかの態様において、プローブは、核酸またはポリペプチドを含んでもよい。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用するように、本発明のプライマーおよびプローブをさし、二つまたはそれ以上、好ましくは三つ超のリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドから構成された核酸分子と定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、様々な要因、ならびにオリゴヌクレオチドの特定の適用および使用に依るであろう。「プローブ」という用語は、本明細書で使用するように、プローブに相補的な配列を有する核酸もしくはポリペプチドにアニールするか、またはそれらに特異的にハイブリダイズすることができる、精製された制限酵素消化物のような天然に存在するものであってよく、または合成的に作製されたものであってもよい、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、RNAもしくはDNAのいずれか、または核酸アナログまたはポリペプチドまたはプローブをさす。核酸プローブは、一本鎖または二本鎖のいずれかであってよく、プローブの正確な長さは、温度、プローブの起源、および使用される方法を含む多くの要因に依って異なる。例えば、診断的な適用の場合、標的配列の複雑さに依って、オリゴヌクレオチドプローブは典型的には15〜25またはそれ以上のヌクレオチドを含有するが、より少ないヌクレオチドを含有していてもよい。本明細書において、プローブは、標的核酸配列または標的ポリペプチドに実質的に相補的であるよう選択される。これは、プローブが、それぞれの標的に「特異的にハイブリダイズする」か、またはアニールすることができるよう十分に相補的でなければならないことを意味する。従って、プローブは、標的の核酸またはポリペプチドの正確な相補配列またはコンフォメーションを反映している必要はない。例えば、核酸プローブの場合、非相補的なヌクレオチド断片がプローブの5'または3'末端に付着しており、プローブ配列の残りが標的鎖に相補的であってもよい。または、プローブ配列が特異的にアニールするために十分な標的核酸の配列との相補性を有しているのであれば、非相補的な塩基またはより長い配列がプローブに散在していてもよい。
「特異的にハイブリダイズする」という用語は、本明細書で使用するように、当技術分野において一般に使用される所定の条件下でそのようなハイブリダイゼーションを許容するために十分に相補的な（「実質的に相補的な」とも呼ばれる）配列の二つの一本鎖核酸分子の間の会合をさす。いくつかの態様において、その用語は、本発明の一本鎖のDNAまたはRNAプローブに含有されている実質的に相補的な配列とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションをさし、非相補配列の一本鎖核酸とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを実質的に排除する。
本明細書で使用する「核酸」という用語は、一本鎖型または二本鎖型のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーをさす。特に限定されない限り、その用語には、参照核酸と類似した結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドに類似した様式で代謝される天然ヌクレオチドの公知のアナログを含有している核酸が包含される。他に示されない限り、特定の核酸配列は、明示的に示された配列のみならず、それらの保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補配列も暗に包含する。特に、縮重コドン置換は、一つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの三番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基に置換されている配列を作製することにより達成され得る（Batzer, et al., Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka, et al., J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)、およびRossolini, et al., Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994)）。核酸という用語は、遺伝子、cDNA、および遺伝子によりコードされるmRNAと交換可能に使用される。
本明細書で使用するように、「オリゴヌクレオチド」および「プライマー」という用語は、標準的な核酸手法におけるそれに関連した従来の意味を有し、即ち、ポリヌクレオチド鋳型にハイブリダイズして、鋳型鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成のための開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドである。本明細書に記載されたオリゴヌクレオチドの多くは、安定なハイブリッドがそれらの間で形成され得るよう、他のオリゴヌクレオチドまたは核酸のある種の部分に相補的であるよう設計されている。これらのハイブリッドの安定性は、Lesnick and Freier, Biochemistry 34:10807-10815(1995)、McGraw et al., Biotechniques 8:674-678(1990)、およびRychlik et al., Nucleic Acids Res.18:6409-6412(1990)に記載されたもののような公知の方法を使用して計算され得る。
「コンジュゲート」または「コンジュゲートされた」という用語は、本明細書で使用するように、二つまたはそれ以上の実体の接合をさす。接合は、実体の融合、例えば、ポリペプチドの融合であり得る。コンジュゲーションは、分子のモエティが集合し、近接して保持されるような当技術分野において公知のその他の手段、例えば、以下に限定はされないが、共有結合性、イオン性、または疎水性の相互作用によっても実施され得る。
「モエティ」または「モチーフ」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、特定の機能を実施することができる分子；核酸またはタンパク質またはポリペプチドまたはその他をさす。「核酸結合モエティ」または「核酸結合モチーフ」という用語は、特異的な様式で核酸に結合することができる分子をさす。
「病原性核酸」または「病原性DNA」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、疾患障害または悪性病変に寄与する症状、例えば、細胞、組織、および器官における構造的および機能的な変化に、完全にまたは部分的に寄与する核酸配列をさす。
「変異」または「多型」という用語は、本明細書で使用するように、核酸配列の発現に影響を与えることができるまたはできない核酸の核酸配列の変化をさす。多型という用語は、欠失、置換、挿入、一塩基多型（SNP）等を含む全ての多型を含むものとする。例えば、変異および多型は、疾患障害もしくは悪性病変に寄与する可能性があるか、または特定の薬学的因子による処置に対する対象もしくは細胞の応答性に寄与する可能性がある（これは、しばしば「薬理ゲノミクス」と呼ばれる）。同様に、変異および／または多型は、細胞に対して毒性である機能障害性タンパク質の発現に起因して正確に機能し得ない対象または細胞を同定することができ、従って、疾患もしくは障害を発症する可能性が高い対象および細胞、または処置に対して応答性であるもしくは応答性でない細胞もしくは対象を同定する。いくつかの態様において、薬理ゲノミクスは、薬物の開発および選択の過程を支援するために薬学的研究においても使用され得る（Linder et al.(1997), Clinical Chemistry, 43, 254；Marshall(1997), Nature Biotechnology, 15, 1249；国際特許出願WO 97/40462, Spectra Biomedical；およびSchafer et al.(1998), Nature Biotechnology, 16, 3）。
「制御配列」および「制御要素」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、それが機能的に連結されている核酸配列の転写を調整し、従って、転写モジュレーターとして作用する、核酸のセグメントに対する要素、典型的には、以下に限定はされないが、DNAもしくはRNAまたはそれらのアナログをさす。制御配列は、それらが機能的に連結されている遺伝子および／または核酸配列の発現を調整する。制御配列は、転写結合ドメインであり、転写タンパク質および／または転写因子、リプレッサー、またはエンハンサー等の核酸結合ドメインにより認識される核酸配列である「制御要素」を含み得る。典型的な制御配列には、以下に限定はされないが、転写プロモーター、任意的な、転写を調節するオペレート配列、適当なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および／または翻訳の終結を調節する配列が含まれる。いくつかの態様において、制御配列は、発現が意図される細胞型における分裂生体分子コンジュゲートの発現を調節するためにアッセイ用に選択することができる。制御配列は、単一の制御配列もしくは複数の制御配列、またはそれらの修飾された制御配列もしくは断片であってよい。いくつかの態様において、核酸配列が何らかの手段、例えば、以下に限定はされないが、変異、メチル化等により変化または修飾された制御配列である修飾された制御配列が有用である。
本明細書で使用するように、「プロモーター」、「プロモーター領域」、または「プロモーター要素」とは、本明細書では交換可能に使用され、それが機能的に連結されている核酸配列の転写を調節する核酸配列セグメント、典型的には、以下に限定はされないが、DNAもしくはRNAまたはそれらのアナログをさす。プロモーター領域は、RNAポリメラーゼの認識、結合、および転写開始にとって十分な特別な配列を含むことができ、プロモーター領域のこの部分はプロモーターと呼ばれる。さらに、プロモーター領域は、このRNAポリメラーゼの認識、結合、および転写開始の活性を調整する配列を含み得る。いくつかの態様において、これらの配列は、シス作用性であってもよく、またはトランス作用性因子に対して応答性であってもよい。いくつかの態様において、本明細書に開示するような方法で有用なプロモーターは、制御の性質に応じて、構成性プロモーターまたは制御されたもしくは誘導可能なプロモーターであり得る。
「機能的に連結された」または「機能的に会合した」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳の終止部位、ならびにその他のシグナル配列のような制御性ヌクレオチド配列との核酸配列の機能的な関係をさす。例えば、制御配列またはプロモーター領域と機能的に連結された核酸配列、典型的にはDNAとは、制御配列を特異的に認識し、結合し、転写するRNAポリメラーゼにより、連結されたDNAの転写が制御配列またはプロモーターから開始するような、DNAと制御配列またはプロモーターとの間の物理的および機能的な関係をさす。いくつかの態様において、発現および／またはインビトロ転写を最適化するため、それが発現される細胞型の発現のための核酸またはDNAの発現のための制御配列を修飾することが必要である可能性がある。そのような修飾の望ましさまたは必要性は、経験的に決定され得る。
「核酸結合モチーフ」という用語は、本明細書で使用するように、核酸配列と選択的に結合することができるプローブ、核酸、またはポリペプチドの領域をさす。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーをさすために本明細書において交換可能に使用される。その用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーのみならず、一つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的アナログであるようなアミノ酸ポリマーにも適用される。
「病原性ポリペプチド」または「病原性ペプチド」または「病原性タンパク質」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、疾患障害または悪性病変の症状に完全にまたは部分的に寄与するポリペプチドをさす。
本明細書で使用する「疾患、障害、または悪性病変」に関して「実質的に寄与する」という用語は、単独で、または他の核酸および／もしくは他のポリペプチドと共に、疾患、障害、または悪性病変に寄与する病理学的核酸および／または病理学的ポリペプチドをさすものである。
本明細書において交換可能に使用される「障害」または「疾患」という用語は、器官の機能の性能を阻止もしくは妨害し（即ち、器官機能障害を引き起こす）、かつ／または疾患に罹患した対象に不快、機能障害、苦痛、もしくはさらに死のような症状を引き起こす、身体またはその器官のうちの一つの状態の任意の変化をさす。いくつかの態様において、不快、機能障害、苦痛、またはさらに死のような症状は、疾患を有する対象と接触した対象に起こり得る。疾患または障害は、また、ジステンパー、病的状態、病気、病弊、障害、不調、疾病、愁訴、体調不良、罹患に関する可能性がある。
「悪性病変」および「癌」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、細胞の調節されない異常な増殖を特徴とする疾患をさす。癌細胞は、局所的に、または血流およびリンパ系を通って、身体の他の部分へ蔓延することができる。定義の範囲内の癌疾患には、良性新生物、異形成、過形成、ならびに転移性増殖を示す新生物、または、例えば、癌の発生にしばしば先行する白板症のようなその他の任意の形質転換が含まれる。
「毒素」という用語は、本明細書において言及されるように、細胞障害性、即ち、細胞に対して毒性であり得る任意の実体、典型的にはポリペプチドを包含するものとする。「細胞毒素」という用語は、本明細書で使用するように、標的とされた細胞に対して特異的に毒性である毒性実体をさす。
「免疫毒素」という用語は、本明細書で使用するように、特異的な細胞を標的とするための標的化実体にコンジュゲートされた毒性実体を含むポリペプチドをさす。いくつかの態様において、標的化実体は、分裂生体分子コンジュゲートのプローブ成分である。
「ヌクレアーゼ」または「エンドヌクレアーゼ」または「エキソヌクレアーゼ」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、核酸配列を低分子核酸配列または単一ヌクレオチドへと分解することができる分子をさす。
「癌遺伝子」という用語は、本明細書で使用するように、優性様式で、増殖に対する正常な制約から細胞を解放することができる正常遺伝子の変異型および／または過剰発現型をコードする核酸配列またはそのポリペプチドをさす。癌遺伝子は、単独で、または他の変化もしくは遺伝子と連動して、細胞腫瘍原性に寄与し得る。癌遺伝子の例には、gp40（v-fms）；p21（ras）；p55（v-myc）；p65（gag-jun）；pp60（v-src）；v-abl；v-erb；v-erba；v-fos等が含まれる。「原癌遺伝子」または、「プロオンコジーン」とは、癌遺伝子の正常な細胞性の等価物を発現する核酸の正常な発現をさし、典型的には、これらの遺伝子は、通常、細胞増殖のシグナル伝達または制御に関与している遺伝子である。
「感作する（sensitize）」または「感作する（sensitizes）」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、他の二次的な因子、例えば、他のプロドラッグまたは放射線のようなその他の環境作用等に対して細胞を感受性または影響を受けやすくすることをさす。
「細胞」という用語は、本明細書で使用するように、植物、酵母、寄生虫、昆虫、および哺乳類を含む原核生物または真核生物の、任意の細胞をさす。哺乳類細胞には、非制限的に、霊長類細胞、ヒト細胞、ならびに、非制限的に、マウス、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、（ウマ、ウシ、マウス、ヒツジ、イヌ、ネコのような）家畜、およびトランスジェニック動物等を含む任意の関心対象の動物に由来する細胞が含まれる。細胞は、非制限的に、造血、神経、間葉、皮膚、粘膜、間質、筋肉脾臓、細網内皮、上皮、内皮、肝臓、腎臓、胃腸、肺、T細胞等のような多様な組織型であり得る。非制限的に、造血、神経、間質、筋肉、心血管、肝臓、肺、胃腸の幹細胞等を含む、幹細胞、胚性幹（ES）細胞、ES由来細胞、および幹細胞前駆細胞も含まれる。酵母細胞も、本発明において細胞として使用され得る。細胞とは、特定の対象細胞のみならず、ある種の修飾または環境的影響、例えば分化による、そのような細胞の子孫または可能性のある子孫もさし、従って、子孫は、実際、親細胞と同一でない可能性もあるが、それでも本発明の範囲に含まれる。
本発明において使用される細胞は、例えば、インビトロまたはエクスビボの培養細胞であってもよい。例えば、細胞は培養培地においてインビトロで培養される。または、エクスビボの培養細胞の場合、細胞は、対象、例えば、健康な対象および／または疾患により影響を受けた対象から入手することができる。細胞は、非制限的な例として、生検または当業者に公知のその他の外科的な手段により入手することができる。本発明において使用される細胞は、対象に存在してもよく、例えばインビボであってもよい。インビボ細胞に対する使用における本発明のため、細胞は対象に見出すことができ、かつ疾患、障害、または悪性病変の病態の特徴を示し得る。
本明細書で使用するように、「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含むものとする。「非ヒト動物」という用語には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類、げっ歯類等のような、全ての脊椎動物、例えば、哺乳類、非哺乳類が含まれる。ある種の態様において、対象は、哺乳類、例えば、霊長類、例えば、ヒトである。
本明細書で使用するように、「病原体」という用語は、対象において疾患または障害を引き起こす生物または分子をさし、例えば、病原体には、以下に限定はされないが、ウイルス、真菌、細菌、寄生虫、およびその他の感染性生物、またはそれらに由来する分子が含まれる。いくつかの態様において、ウイルスは、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウイルス2型、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトヘルペスウイルス6型、ヒトヘルペスウイルス7型、ヒトヘルペスウイルス8型、痘瘡ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、インフルエンザウイルスA型、インフルエンザウイルスB型、麻疹ウイルス、ポリオーマウイルス、ヒトパピローマウイルス、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、デング熱ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、黄熱病ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ラッサ熱ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレー峡谷熱ウイルス、ウエストナイルウイルス、リフトバレー出血熱ウイルス、ロタウイルスA型、ロタウイルスB型、ロタウイルスC型、シンドビスウイルス、サル免疫不全ウイルス、ヒトT細胞白血球ウイルス1型、ハンタウイルス、風疹ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス1型、およびヒト免疫不全ウイルス2型を含むウイルスの群より選択され得る。
「哺乳類」という用語は、単数形の「哺乳類」および複数形の「哺乳類」を包含するものとし、以下に限定はされないが、ヒト；類人猿、サル、オランウータン、およびチンパンジーのような霊長類；イヌおよびオオカミのようなイヌ科動物；ネコ、ライオン、およびトラのようなネコ科動物；ウマ、ロバ、およびシマウマのようなウマ科動物、ウシ、ブタ、およびヒツジのような食用動物；シカおよびキリンのような有蹄動物；マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットのようなげっ歯類；ならびにクマを含む。いくつかの態様において、哺乳類はヒトである。
「遺伝的素因」という用語は、本明細書で使用するように、対象または細胞の、特定の疾患、障害、もしくは悪性病変に対して感受性である可能性、または疾患障害もしくは悪性病変の処置に応答する可能性を予め決定する対象または細胞の遺伝的体質をさす。
「細胞死経路」という用語は、本明細書で使用するように、当業者に周知のアポトーシスとしても公知の細胞自殺経路またはプログラム細胞死プログラム（PCD）の経路をさす。「抗アポトーシス」および「アポトーシス促進性」とは、本明細書で使用するように、それぞれ、細胞死経路を防止または誘導する分子または実体をさす。
「ヒト化」という用語は、本明細書で使用するように、哺乳類細胞における発現および機能のために最適化された核酸またはポリペプチドが形成されるよう、遺伝的または転写後のいずれかに修飾された核酸配列またはポリペプチドをさす。
「増幅」プライマーという用語は、本明細書で使用するように、選択された核酸配列の増幅のための土台として働くことができる、天然ヌクレオチドまたはアナログヌクレオチドのいずれかを含むオリゴヌクレオチドをさす。それらには、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応プライマーおよびリガーゼ連鎖反応オリゴヌクレオチドが含まれる。
「組換え」という用語は、例えば、細胞または核酸またはベクターに関して使用される場合、細胞または核酸またはベクターが、異種核酸の導入もしくはネイティブ核酸の改変により修飾されていること、または細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示す。従って、例えば、組換え細胞は、ネイティブの（非組換えの）型の細胞には見出されない遺伝子を発現するか、またはそうでなければ異常に発現される、過少発現される、もしくは全く発現されないネイティブ遺伝子を発現する。
「接触」という用語は、本明細書で使用するように、直接の物理的な会合の配置をさす。本発明に関して、その用語は抗体抗原結合をさす。
「細胞障害性」という用語は、本明細書で使用するように、典型的には、選択されたまたは標的とされた細胞の正常な細胞機能の定方向の阻害をさし、例えば、いくつかの場合において、細胞障害性とは、タンパク質合成の阻害をさす。そのようなタンパク質合成の阻害は、Rybak, et al., JNCI 88:747-753(1996)に記載されたプロトコルを使用して、ヒト腫瘍細胞、例えば、HS578T（ATCC No.HTB 126）においてアッセイされ得る。「細胞障害性試薬」とは、本明細書で使用するように、等モル量のポリペプチドの少なくとも50％の相対50％阻害濃度（IC50）を有し得る。いくつかの場合において、相対IC50は、ポリペプチドの少なくとも60％もしくは70％、または少なくとも100％であろう。
いくつかの態様において、特定の細胞が核酸配列によりコードされたタンパク質を発現するよう、核酸は、当業者に一般的に公知の任意の方法を使用して、細胞へ導入され得る。細胞へDNAを導入する方法には、適切なベクターによる形質転換が含まれるが、これに限定はされない。「形質転換」という用語は、本明細書で使用するように、当技術分野において公知の任意の方法、例えば、以下に限定はされないが、直接取り込み、トランスフェクション、または形質導入を使用した、宿主細胞への異種のポリヌクレオチドもしくは核酸配列またはそれらの断片の導入をさす。いくつかの態様において、本明細書に開示するような分裂生体分子コンジュゲートの作製のために、細胞が、本明細書に開示するような分裂生体分子コンジュゲートの少なくとも一つの断片に対する配列を含む少なくとも一つの核酸構築物により形質転換され得、次いで、細胞は、分裂生体分子コンジュゲートが産生されるよう、分裂生体分子コンジュゲートをコードする核酸を発現する。構築物は、ベクター手段、ウイルスベクター手段、および以下に限定はされないが、融合、電気穿孔、微粒子銃、トランスフェクション、リポフェクション、プロトプラスト融合、リン酸カルシウムトランスフェクション、微量注入、圧力による移行、裸のDNA等のような非ウイルス手段のような非ウイルス手段、または当業者に公知のその他の任意の手段を含む当業者に公知の複数の手段により細胞へ導入され得る。
「ベクター」および「プラスミド」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、それが連結されているもう一つの核酸を輸送することができる核酸分子をさす。それらが機能的に連結されている遺伝子および／または核酸配列の発現を指図することができるベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、本明細書に開示するような方法において有用な発現ベクターには、ベクター型であり染色体に結合されていない環状の二本鎖DNAループをさす「プラスミド」を使用した組換えDNA技術が含まれる。その他の発現ベクター、例えば、以下に限定はされないが、プラスミド、エピソーム、バクテリオファージ、またはウイルスベクターは、異なる態様において使用され得、そのようなベクターは、宿主のゲノムへ組み込まれるか、または特定の細胞内で自律的に複製し得る。等価な機能を果たす当業者に公知のその他の型の発現ベクターも使用してよい。発現ベクターには、DNAをコードする、安定的なまたは一過性の発現のための発現ベクターが含まれる。
エフェクター分子
細胞障害性エフェクター分子
いくつかの態様において、エフェクター分子は、細胞毒素、例えば、細菌毒素または細菌細胞毒素であり得る。細菌毒素または細胞毒素は、当業者に周知であり、例えば、以下に限定はされないが、炭疽毒素；ジフテリア毒素（DT）；リシンA毒素（RTA）；シュードモナス内毒素（PE）；ストレプトリジンO；サポリン；ゲラニン（gelanin）、またはそれらの天然に存在する変異体もしくは遺伝子操作された変異体もしくは断片である。細菌毒素は、典型的には、グリコシル化されていないが、グリコシル化された細菌毒素も、本発明において使用するために包含される。例えば、DTは、特異性および正常細胞との非特異的な結合を改良するために遺伝子修飾されており、例えば、DTは、CRM107が得られるようleu390およびSer525を各々フェニルアラニンに変換することにより変異させられており（Greenfield et al;Sci, 1987;238:536-539）、またはDTおよびPE40を含むPEが短縮化されている（Francisco et al;1997;272:24165-24169；Kondo et al, 1988;263:9470；Williams et al, 1987;1:493-498）。使用される細菌毒素の特性を修飾するための変異および修飾の変動に関しては、参照のため完全に本明細書に組み入れられる概説；Immunotoxins for Targeted Cancer Therapy;Kreitman R.J, 2006;APPS Journal;8(3);E532-E551を参照のこと。
もう一つの態様において、エフェクター分子は植物毒素であり得る。植物毒素は、当業者に周知であり、植物完全毒素もしくはクラスIIリボソーム不活性化タンパク質、または血液毒もしくはクラスI不活性化リボソームタンパク質であり得る。植物完全毒素は、例えば、以下に限定はされないが、サポリン（SAP）；ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（PAP）；ブリオジン1；ブーガニン、およびゲロニン、またはそれらの天然に存在する変異体もしくは遺伝子操作された変異体もしくは断片であり得る。植物血液毒は、例えば、リシンA鎖（RTA）；リシンB（RTB）；アブリン；ヤドリギ、レクチン、およびモデシン、またはそれらの天然に存在する変異体もしくは遺伝子操作された変異体もしくは断片であり得る。植物毒素は、典型的には、グリコシル化されているが、グリコシル化されていない植物毒素も、本発明において使用するために包含される。
別の態様において、植物毒素は、ヌクレアーゼ、例えば、以下に限定はされないが、サルシン；リストリクトシンとして機能し得る。
本発明の別の態様において、エフェクター分子は、細胞障害性の分子またはタンパク質のポリペプチドまたは断片を含み得る。細胞障害性の分子の一例はサイトカインである。癌のための毒素として使用されるサイトカインの非制限的な例には、IL-1；IL-2（CD25）；IL-3；IL-4；IL-13；インターフェロンアルファ；腫瘍壊死因子アルファ（TNFα）；IL-6；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）；G-CSFが含まれる。サイトカインは、サイトカインの天然の存在する変異体であってもよいし、またはそれらの遺伝子操作された変異体、または組換えサイトカインの異種配列を含むサイトカインであってもよい。
別の態様において、エフェクター分子は、ヒトまたは哺乳類の毒素、例えば、以下に限定はされないが、RNase、プロタミン／DNA、およびBaxを含むヒト化免疫毒素を含み得る。ヒト化毒素の例の概説に関しては、参照により完全に本明細書に組み入れられるFrankel, A., Clinical Cancer Res, 2004;10:13-15による概説を参照のこと。
ヌクレアーゼエフェクター分子
もう一つの態様において、エフェクター分子は、ヌクレアーゼ活性またはヌクレオチド鎖切断活性を有し得る。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは、DNAヌクレアーゼ、DNAエンドヌクレアーゼ、またはDNAエキソヌクレアーゼである。ヌクレアーゼは、それらの天然の変異体、ホモログ、または遺伝子修飾された変異体であってもよい。公知のDNAエンドヌクレアーゼの例は、当業者に周知であり、免疫毒素のためのコンジュゲートのため使用されており（参照により完全に本明細書に組み入れられるWO0174905を参照のこと）、ウシDNaseI（Worrall and Conolly, 1990; J. Biol. Chem. 265; 21889-21895を参照のこと）；膵臓DNaseI（Shak et al, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87; 9188-9192、およびHubbard et al, 1992; New Eng. J. Med., 326: 812-815を参照のこと）のような例を含む。いくつかの態様において、DNaseヌクレアーゼは哺乳類デオキシリボヌクレアーゼIであり、その他において、それはヒトデオキシリボヌクレアーゼIである。
本発明の別の態様において、ヌクレアーゼは、RNAヌクレアーゼ、RNAエンドヌクレアーゼ、またはRNAエキソヌクレアーゼである。RNAヌクレアーゼは、当業者に周知であり、そのうちの任意のものが、本発明において使用するために包含される。RNAヌクレアーゼの非制限的な例には、RNAエンドヌクレアーゼI；RNAエンドヌクレアーゼII；RNAエンドヌクレアーゼIIIが含まれる。本発明のいくつかの場合において、RNaseは、リボヌクレアーゼA（RNase A）であり得、一つのそのような例は、最初はP-30と命名され、Darzynkiewicz et al, Cell Tissue Kinet, 21; 169 (1998)に最初に記載されたヒョウガエル（Rana pipens）卵母細胞に由来するOnconase（登録商標）（Alfacell Corporation,Bloomingfield, NJより入手可能）という商品名である。当業者は、任意のRNaseまたはRNase A分子が、当業者に公知の多数の方法を使用して修飾され得、そのような修飾されたもしくは組換えのRNaseおよび／もしくはRNase A分子、またはそれらの天然に存在する変異体の、エフェクタータンパク質としての使用が、本明細書に開示するような方法において使用するために包含されることを認識するであろう。いくつかの態様において、ヒョウガエルに由来するリボヌクレアーゼを使用している、参照により本明細書に組み入れられる欧州特許出願EP975671；米国特許出願US6,869,604において、免疫毒素としての使用において開示されたRNase Aが、エフェクター分子として使用され得る。他の態様において、ウシガエル（Rana catesbeiana）卵母細胞に由来するリボヌクレアーゼが、エフェクター分子として使用され得る。ウシガエル卵母細胞RNAse（RaCORl）のアミノ酸配列は、1989年以来公知であるが（Nitta, R., et al., J. Biochem. 106: 729 (1989)；Okabe, Y., et al., J. Biochem. 109: 786 (1991)；Liao, Y, Nucl., Acids Res. 20: 1371 (1992) ；Nitta, K., et al., Glycobiology 3: 37 (1993)；Liao, Y. & Wang, J., Eur. J. Biochem. 222: 215 (1994)；Wang, J., et al., Cell Tissue Res. 280: 259 (1995)；Liao, Y., et al., Protein Expr. Purif. 7: 194 (1996)；およびInokuchi, N., et al., Biol. Pharm. Bull. 20: 471 (1997)）、卵母細胞RNAseをコードするゲノムDNAまたはmRNAおよびそれらの遺伝子修飾された変異体も包含される。
もう一つの関連する態様において、本明細書に開示するような方法において有用なRNaseは、ヒト膵臓RNaseのスーパーファミリーのもの、例えば、ヒトアンジオゲニン、またはそれらの断片、またはリボヌクレアーゼ活性を有する組換えのもしくは遺伝子操作されたそれらの変異型であり得る（Kurachi et al,1985;Biochemistry,24;5494-5499）。アンジオゲニンは、無細胞抽出物において、およびアフリカツメガエル卵母細胞へ注射された場合、タンパク質合成の強力な阻害剤でもある。細胞外アンジオゲニンは、多様な培養細胞に対して細胞障害性でなく、通常ヒト血漿中に存在し、従って、細胞内のその再生は分裂生体分子コンジュゲートのエフェクター分子として理想的な候補である。さらに、ヒトアンジオゲニンは、IL2とコンジュゲートすることにより免疫療法において使用されており（参照のため完全に本明細書に組み入れられる欧州特許出願EP1217070を参照のこと）、二つのヒトタンパク質またはその断片の二つの部分として発現されることも示されている（欧州特許出願EP1217070を参照のこと）。
本発明のもう一つの態様において、RNaseはダイサーであり得る。ダイサーまたはDcr-1ホモログ（ショウジョウバエ）は、通常3'末に2塩基の突出を有する約20〜25ヌクレオチド長の短い二本鎖RNA断片（しばしば低分子干渉RNA（siRNA）と呼ばれる）へと二本鎖RNA（dsRNA）およびプレマイクロRNA（pre-microRNA）（miRNA）を切断するRNase IIIヌクレアーゼである。ダイサーは二つのRNaseドメインおよび一つのPAZドメインを含有しているため、エフェクター分子は、ダイサーの各ドメインを含み得る。ダイサーは、RNA干渉経路における第一工程を触媒し、RNAにより誘導されるサイレンシング複合体（RISC）の形成を開始させ、その触媒成分アルゴノートは、配列がsiRNAガイド鎖の配列に相補的なメッセンジャーRNA（mRNA）を分解することができるエンドヌクレアーゼである。
他の態様において、ヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼ、例えば、微生物II型制限エンドヌクレアーゼである。II型制限エンドヌクレアーゼの例示的な非制限的な例には、BamHI；Hind III；MspI；Sau3AI；Hinfl；NotI；およびEcoRIが含まれる。
その他のエフェクター分子
さらなる態様において、エフェクター分子は、タンパク質分解切断と呼ばれる過程によりタンパク質のアミノ酸間のペプチド結合を破壊する、酵素の活性化または不活性化の一般的な機序であるタンパク質分解酵素またはプロテアーゼ分子（プロテイナーゼ、ペプチダーゼ、またはタンパク質分解酵素としても公知）であり得る。いくつかのプロテアーゼは、タンパク質分解切断のため水分子を使用し、加水分解酵素としても分類される。本明細書に開示するような方法において有用なプロテアーゼは、当業者に周知であり、例えば、以下に限定はされないが、セリンプロテアーゼ；トレオニンプロテアーゼ；システインプロテアーゼ；アスパラギン酸プロテアーゼ（例えば、プラスメプシン）；メタロプロテアーゼ；グルタミン酸プロテアーゼ；エンドペプチターゼ（プロテイナーゼ）、およびエキソペプチダーゼを含む。一般的なプロテアーゼは、例えば、カスパーゼ酵素；カルパイン酵素；カテプシン酵素；エンドプロテアーゼ酵素；グランザイム；マトリックスメタロプロテアーゼ；ペプシン；プロナーゼ；プロテアーゼ；プロテイナーゼ；レンニン；トリプシンを含み、それらの天然に存在するホモログまたは遺伝子操作された変異体の使用が、本発明において使用するために包含される。
もう一つの態様において、エフェクター分子は、細胞における細胞死経路を誘導することができる任意の分子であり得る。そのようなエフェクター分子の例には、以下に限定はされないが、当技術分野において周知のアポトーシス促進性分子が含まれ、例えば、以下に限定はされないが、Hsp90；TNFα；DIABLO；BAX；BID；BID；BIM；Bcl-2の阻害剤；Bad；ポリADPリボースポリメラーゼ-1（PARP-1）；第二ミトコンドリア由来カスパーゼアクチベーター（SMAC）；アポトーシス誘導因子（AIF）；Fas（Apo-1またはCD95としても公知）；Fasリガンド（FasL）が、そのようなアポトーシス促進性分子の天然の変異体または組換えのもしくは遺伝子修飾された変異体と共に、本明細書に開示するような方法によるエフェクター分子として使用するために包含される。
別の態様において、本明細書に開示するような方法において有用なエフェクター分子は、細胞において細胞死経路を阻害するか、または細胞生存経路を誘導することができる。そのような分子の例には、以下に限定はされないが、当業者に周知の多数の抗アポトーシス分子、例えば、以下に限定はされないが、Bcl-2；Bcl-XL；Hsp27；アポトーシス阻害（IAP）タンパク質が含まれる。
本発明のもう一つの態様において、エフェクター分子は、一つまたは複数の二次的な因子に対して細胞を感作する分子またはポリペプチドであり得る。例えば、エフェクター分子は、チロシンキナーゼ、例えば、βグルクロニダーゼ活性であり得る。β-グルクロニダーゼは、9-アミノカンプトテシンおよびp-ヒドロキシアニリンマスタードのような低毒性のプロドラッグを活性化し、またはN-[4-ドキソルビシン-N-カルボニル(オキシメチル)フェニル]O-β-グルクロニルカルバメート（DOX-GA3）のようなアナログが、ドキソルビシン（DOX）の抗腫瘍効果を改良するために開発されている。プロドラッグD0X-GA3は、腫瘍部位において特異的に高度に細胞障害性の作用をもたらすために、ヒトβ-グルクロニダーゼ（GUS）により活性の分子または薬物へと活性化されるよう最初に設計された。そのようなプロドラッグの効力は、抗癌化学放射線組み合わせ治療（CCRTC）戦略における適切な放射性核種の取り込みによっても大いに増強され得る。いくつかの態様において、プロドラッグは、抗癌薬の効率的な送達のためリポソームを修飾するためにも利用され得る（Chen et al,current medicinal chemistry;2003 3;139-150；Chen et al,cancer Gene Ther,2006；）。
もう一つの態様において、もう一つの因子に対して細胞を感作するエフェクター分子は、例えば、ヒトホモログより大きな効率で、プリンアナログであるアロプリノールを対応するヌクレオチドへ変換することができ、従って、プロドラッグ、アロプリノールを細胞障害性の代謝産物へと活性化することができる寄生虫トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）（Tb）に由来するヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRT）である（Trudeau et al,2001;Human Gene Ther;12:1673-1680）。もう一つの態様において、エフェクター分子は、ジニトロベンズアミド癌プロドラッグCB1954および前抗生物質（proantibiotic）ニトロフラゾンを活性化するシュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）JS45に由来する細菌ニトロベンゼンニトロレダクターゼ（NbzA）であり得る（Berne et al,2006;Biomacromolecules,7;2631-6）。
もう一つの態様において、エフェクター分子は、プロドラッグ、デスアセチルビンブラスチン-3-カルボン酸ヒドラジド（DAVLBHYD）またはその他のアナログから活性な因子または薬物を生成させるβ-ラクタマーゼである。そのような態様において、エフェクタータンパク質としてのエンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）β-ラクタマーゼ（bL）は、抗癌プロドラッグ7-（4-カルボキシブタンアミド）セファロスポリンマスタード（CCM）、フェニレンジアミンマスタード（PDM）のセファロスポリンプロドラッグを活性化することができる（Svensson et al,1999;J Med Chem.,41:1507-12）。光線力学的治療において毒性ラジカルを生成させる酵素を含む（wardman et al,2001;scientific yearbook,2001-2002を参照のこと）当技術分野において公知のその他のプロドラッグ／酵素組み合わせが、エフェクター分子として使用され得、本明細書に開示するような方法において使用するために包含され、例えば、ペルオキシダーゼ遺伝子がエフェクター分子として使用され得る。
関連する態様において、エフェクター分子は、抗ウイルス薬を触媒する分子であり得、例えば、以下に限定はされないが、抗ウイルス薬として一般的に使用されているオセルタミビルは、エフェクター分子としてカルボキシルエステラーゼHCE1のための二次的な因子として作用し得る（Shi et al,2006;J Pharmacol Exp Ther.）。
本発明のいくつかの態様において、エフェクター分子は、標的核酸または標的ポリペプチド分子の付加または修飾を開始させることができる。非制限的な例として、標的が標的ポリペプチドである場合、有用なエフェクター分子は、共有結合性の付着により、一つまたは複数のユビキチンモノマーを付加し、プロテアソームを介して分解されるよう標的ポリペプチドにタグ付加するユビキチンであり得る。標的がポリペプチドであるもう一つの態様の例において、エフェクター分子は、増加したポリペプチド安定性、細胞局在等を含む多数の作用のため標的ポリペプチドにタグ付加する低分子ユビキチン関連修飾因子（SUMO）であり得る。その他の転写後事象は、当業者に公知であり、例えば；ISG化；アセチル化、アルキル化、メチル化、ビオチン化、グルタミル化（glutamylation）、グリシル化（glycylation）；グリコシル化、イソプレニル化、リポイル化、ホスホパンテテイニル化（phosphopantetheinylation）、シトルリン化（citrullination）；脱アミド化、リン酸化等を含み、これらの事象を媒介するか、またはそれらに影響を与える分子が、本明細書に開示するような方法においてエフェクター分子として使用され得る。
標的が標的核酸であるもう一つの態様において、本明細書に開示するような方法において有用なエフェクター分子は、核酸を修飾することができ、例えば、化学的修飾には、例えば、遺伝子をサイレンシングし、かつ／または標的核酸の転写を防止するための、メチル化または構造的修飾、例えば、アセチル化またはヒストンの付加が含まれる。一つの態様において、エフェクター分子は、DNAメチルトランスフェラーゼ（DNA MTase）、例えば、DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B、またはタンパク質補完により標的核酸をメチル化するであろう新規メチルトランスフェラーゼもしくはそれらの断片であり得る。もう一つの態様において、エフェクター分子は、CREB結合タンパク質のようなヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素（HAT）またはそれらの修飾型もしくは変異体である。
プローブ
いくつかの態様において、分裂生体分子コンジュゲートのプローブは、標的核酸に結合することができる任意の分子であり得る。標的核酸に結合するプローブの領域は、核酸結合モチーフと呼ばれる。いくつかのそのような態様において、本明細書に開示するような方法において有用なプローブには、核酸、核酸アナログ、およびポリペプチドが含まれる。一つの態様において、プローブはオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、分裂生体分子コンジュゲートの一対のプローブは、同一種類の分子であってもよく、例えば、両方のプローブがオリゴヌクレオチドであってもよいし、または、それらは異なっていてもよく、例えば、分裂生体分子ポリペプチド対の一つのプローブがオリゴヌクレオチドプローブであって、かつ対応する分裂生体分子ポリペプチド対の他方のプローブがポリペプチドプローブであってもよい。
いくつかの態様において、プローブは、近位の標的核酸または標的ポリペプチドに結合することができる、もう一つの分子にカップリングされ得る任意の分子であり得る。いくつかの態様において、プローブは、オリゴヌクレオチドのような核酸または核酸アナログであり得る。もう一つの態様において、プローブは、高い親和性で標的核酸または標的ポリペプチドと相互作用する核酸結合性のポリペプチドまたはタンパク質であり得る。核酸アナログであるプローブには、例えば、以下に限定はされないが、ペプチド核酸（PNA）、偽相補PNA（pcPNA）、ロックド核酸（LNA）、モルホリンDNA、ホスホロチオエートDNA、および2'-O-メトキシメチルRNAが含まれる。
いくつかの態様において、プローブは、一本鎖標的上の同一のハイブリダイゼーション部位に結合して、標的核酸、同一の部位にハイブリダイズする二つのプローブを含む三重鎖をハイブリダイゼーション部位で作成することができる。または、プローブは、一本鎖または二本鎖の標的核酸上の隣接したハイブリダイゼーション部位に結合して、各ハイブリダイゼーション部位でそれぞれ二重鎖または三重鎖のいずれかを作出することができる。
プローブが核酸であるいくつかの態様において、核酸結合モチーフの長さは、核酸標的またはポリペプチド標的との相補的な結合を可能にするために十分な長さであり得、両方のプローブ部分が同一の標的核酸または標的ポリ核酸に結合した場合に、分裂生体分子コンジュゲート断片のうちの一つが、その対応する分裂生体分子コンジュゲート断片と相互作用することを可能にする。例えば、核酸結合モエティプローブは5〜30塩基長であり得、またはその他の態様において、核酸プローブは5〜15塩基長であり得る。例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30塩基。ある種の別の態様において、プローブは30塩基より長くてもよい。
三重鎖の形成を提供するいくつかの態様において、プローブは三重鎖の形成を可能にする任意の核酸であり得る。いくつかの態様において、三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドは、GCリッチであり、例えば、ピリミジン-プリン-プリンからなるプリン三重鎖である。
いくつかの態様において、核酸プローブは、例えば、以下に限定はされないが、オリゴヌクレオチド；一本鎖RNA分子；および偽相補PNA（pcPNA）を含むペプチド核酸（PNA）等であり得る。いくつかの態様において、プローブはオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドを設計し合成する方法は、当技術分野において周知である。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプライマーと呼ばれることもある。本明細書に開示するような方法において有用なオリゴヌクレオチドは、当業者に周知の確立されたオリゴヌクレオチド合成法を使用して合成され得る。そのような方法は、標準的な酵素消化に続くヌクレオチド断片単離（例えば、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)、Wu et al, Methods in Gene Biotechnology(CRC Press, New York, N.Y., 1997)、およびRecombinant Gene Expression Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol.62, (Tuan, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 1997 （これらの開示は参照により本明細書に組み入れられる）を参照のこと）から、例えば、MilligenまたはBeckman System 1Plus DNA合成装置（例えば、Milligen-Biosearch, Burlington, Mass.のModel 8700 automated synthesizerまたはABI Model 380B）を使用した、シアノエチルホスホラミダイト法による純合成法にまでわたることができる。オリゴヌクレオチドを作成するために有用な合成法は、Ikuta et al., Ann.Rev.Biochem.53: 323-356(1984)（ホスホトリエステルおよびホスファイト-トリエステル法）およびNarang et al., Methods Enzymol., 65: 610-620(1980)（ホスホトリエステル法）によっても記載されている。
いくつかの態様において、本明細書に記載されるような方法において有用なオリゴヌクレオチドプローブまたは核酸プローブは、安定的なハイブリッドがそれらの間に形成されるよう、他のオリゴヌクレオチドまたは核酸のある種の部分に相補的であるように設計される。これらのハイブリッドの安定性は、Lesnick and Freier, Biochemistry 34: 10807-10815(1995)、McGraw et al., Biotechniques 8: 674-678(1990)、およびRychlik et al., Nucleic Acids Res.18: 6409-6412(1990)に記載されたもののような公知の方法を使用して計算され得る。
いくつかの態様において、プローブは、一本鎖RNA分子であり得、当業者に周知の一本鎖RNA分子作製の方法を使用して設計され合成される。
別の態様において、プローブは、偽相補PNA（pcPNA）を含むペプチド核酸（PNA）のような核酸結合モエティであり得る。PNAおよびpcPNAを設計し合成する方法は、当業者に周知である。ペプチド核酸（PNA）は、骨格が糖ではなく偽ペプチドであるDNAのアナログである。従って、それらの挙動は、DNAを模倣し、相補的な核酸鎖に結合する。ペプチド核酸において、オリゴヌクレオチドのデオキシリボースリン酸骨格は、糖ホスホジエステルよりペプチドに類似している骨格により交換されている。各サブユニットは、この骨格に付着した天然に存在する塩基または天然には存在しない塩基を有し、例えば、骨格は、アミド結合を通して連結されたN-（2-アミノエチル）グリシンの反復単位から構築され得る。
PNAは、DNAおよびRNAの両方に結合し、対応するDNA/DNAまたはDNA/RNA二重鎖より大きな親和性および増加した特異性で結合するPNA/DNAまたはPNA/RNA二重鎖を形成する。さらに、（適切な核酸塩基またはその他の側鎖基が付着している）PNAのポリアミド骨格は、ヌクレアーゼによってもプロテアーゼによっても認識されず、従って、PNAは、DNAおよびペプチドとは異なり酵素による分解に対して抵抗性である。DNAまたはRNA鎖へのPNA鎖の結合は、平行方向または逆平行方向のいずれかで起こり得る。PNAは、一本鎖DNAおよび二本鎖DNAの両方に結合する。
いくつかの態様において、PNA分子の一種である偽相補PNA（pcPNA）が使用され得、pcPNAは、グアニンおよびシトシンに加え、アデニンおよびチミンの代わりに2,6-ジアミノプリン（D）および2-チオウラシルをそれぞれ保持する。pcPNAは、偽相補性の概念により補足されたワトソンクリック認識原理に基づく別個の結合モード、二重の二本鎖侵入を示す。pcPNAは、天然のA、T、（U）、またはG、Cカウンターパートを認識し、それらに結合する。pcPNAは、当技術分野において公知の任意の方法に従って作成され得る。例えば、PNAの化学的組み立ての方法は周知である（参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,539,082号、第5,527,675号、第5,623,049号、第5,714,331号、第5,736,336号、第5,773,571号、または第5,786,571号を参照のこと）。
いくつかの態様において、プローブは、本明細書において「ポリペプチド検出タンパク質」と呼ばれるポリペプチドであってよい。いくつかの態様において、ポリペプチド検出タンパク質は、標的核酸または標的ポリペプチドに対する高い親和性を有する任意のポリペプチドであり得る。いくつかの態様において、標的核酸は、二本鎖、三本鎖、または一本鎖のDNAまたはRNAであり得る。いくつかの態様において、ポリペプチドプローブは、100アミノ酸未満のペプチド、または全長タンパク質、またはタンパク質断片である。いくつかの態様において、ポリペプチドの標的核酸に対する親和性は、低ナノモルから高ピコモルまでの範囲にあってよい。本明細書に開示するような方法において有用なポリペプチドには、天然の、または合理的アプローチもしくはスクリーニングアプローチにより設計されたかのいずれかの、ジンクフィンガーを含有しているポリペプチドが含まれる。ジンクフィンガーの例には、Zif 2g8、Sp1、Gfi-1のフィンガー5、YY1のフィンガー3、CF2IIのフィンガー4および6、ならびにTTKのフィンガー2が含まれる（PNAS(2000)97: 1495-1500；J Biol Chem(20010 276(21): 29466-78；Nucl Acids Res(2001)29(24): 4920-9；Nucl Acid Res(2001)29(11): 2427-36）。本明細書に開示するような方法において有用なその他のポリペプチドには、特異的な核酸配列に結合するインビトロ選択により入手されたポリペプチド、例えば、血小板由来増殖因子（PDGF）（Nat Biotech(2002)20: 473-77）およびトロンビン（Nature(1992)355: 564-6）のアプタマーのようなアプタマーが含まれる。本明細書に開示するような方法において有用なその他のポリペプチドには、インビトロでDNA三重鎖に結合するポリペプチド；例えば、hnRNP K、L、E1、A2/B1、およびIのようなヘテロ核リボヌクレオ粒子（hnRNP）タンパク質のメンバー（Nucl Acids Res(2001)29(11): 2427-36）が含まれる。
分裂生体分子コンジュゲート断片がプローブとしてポリペプチドを含むいくつかの態様において、分裂ポリペプチド断片およびプローブの全体が、ポリペプチドエフェクタータンパク質断片、リンカー配列をコードする核酸、および核酸結合モエティポリペプチドまたはポリペプチド検出タンパク質をコードする核酸配列を含む単一の核酸構築物によりコードされ得る。いくつかの態様において、ポリペプチド検出タンパク質は細胞内にあるかまたは細胞へ微量注入される。いくつかの態様において、そのような構築物は、関心対象の核酸のインビトロ検出のためにも使用され得る。
プローブがポリペプチド検出タンパク質であるいくつかの態様において、ポリペプチド検出タンパク質は、少なくとも二つの断片に分裂させることができ、各断片は、エフェクタータンパク質の二つまたはそれ以上の断片にコンジュゲートされ、標的核酸または標的ポリペプチドとの検出ポリペプチド断片の結合が、検出タンパク質および活性エフェクタータンパク質を再構成する。例えば、ポリペプチドプローブは、複数のドメイン（例えば、ジンクフィンガーモチーフ）を含有している検出タンパク質、またはeIF-4A（参照のため完全に本明細書に組み入れられる特許出願第60/730,746号を参照のこと）のような二つの別々の成分へ分裂した核酸結合分子であり得る。検出ポリペプチドプローブがマルチドメインポリペプチド検出タンパク質であるいくつかの態様においては、各ドメインが、エフェクタータンパク質の二つまたはそれ以上の断片にコンジュゲートされ得、標的核酸または標的ポリペプチドとの検出タンパク質のドメインの結合により、検出タンパク質および活性エフェクタータンパク質の再構成をもたらす。
標的核酸および標的ポリペプチド
本発明の一つの局面は、各断片がプローブにコンジュゲートされている分裂エフェクター分子を含む本明細書に開示するような分裂生体分子コンジュゲートによる標的核酸または標的ポリペプチドの認識である。一つの態様において、プローブは標的核酸を認識し、もう一つの態様において、プローブは標的ポリペプチドを認識する。
いくつかの態様において、標的核酸はDNAまたはRNAである。いくつかの態様において、標的核酸は、病理学的核酸（DNAもしくはRNA）または病態を引き起こす核酸であり、例えば、病理学的核酸は、疾患、障害、または悪性病変に実質的に寄与する核酸である。これには、以下に限定はされないが、例えば、遺伝子；遺伝子に機能的に連結された制御配列、または遺伝子の5'もしくは3'非翻訳領域（UTR）における変異および／または多型をコードする核酸配列が含まれる。いくつかの態様において、病理学的核酸は、疾患、障害、または悪性病変に部分的にまたは完全に寄与する遺伝子産物を発現する核酸配列、例えば、上皮成長因子受容体（EGFR）、血小板由来増殖因子受容体（PDGFR）、および血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、およびHER2/neuのような、構成性に（即ち、永久に）発現される遺伝子である。遺伝子産物は変異または正常ポリペプチドであり得る。
いくつかの態様において、標的核酸または標的ポリペプチドは、悪性細胞において発現される遺伝子または遺伝子産物である。例示的な例として、標的核酸は、いくつかの身体組織の細胞に、そして尿中の細胞にも発現しており、上皮癌細胞、顕著には卵巣、胃、結腸直腸、および膵臓の癌細胞に発現していることが公知のヒト乳脂肪小球の成分である多形上皮ムチン（PEM）をコードする核酸である。そのような態様において、標的核酸は多形上皮ムチン（PEM）をコードする核酸配列であり、かつ／または標的ポリペプチドはPEMの抗原またはPEMの細胞障害性部分である。いくつかの態様において、プローブは、参照により本明細書に組み入れられるWO0174905に開示されるような、免疫毒素により標的とされるのと同様にPEMを標的とする。いくつかの態様において、標的核酸または標的ポリペプチドは、癌遺伝子または発癌性分子または癌遺伝子または受容体キナーゼシグナル伝達分子であり得る。いくつかの態様において、標的核酸は、血管形成タンパク質、例えば、以下に限定はされないが、血管内皮増殖因子（VEGF）もしくはVEGF-1またはそれらのホモログをコードする。
いくつかの態様において、病理学的核酸は、病原性のDNAまたはRNA、例えば、以下に限定はされないが、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、HSV-1、HSV-II、牛疫ライノウイルス、エコーウイルス、レトロウイルス、ロタウイルス、呼吸器多核体ウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、HIV-1、HIV-II、SARS、トリおよび／もしくは鳥類インフルエンザウイルス、ならびにその他のウイルス、またはそれらの変異体に由来するようなウイルスゲノム配列である。
いくつかの態様において、疾患、障害、または悪性病変の症状に部分的にまたは完全に寄与する病理学的ポリペプチドが、本明細書に開示するような分裂生体分子コンジュゲートの標的である。いくつかの態様において、病理学的ポリペプチドは、機能障害性のまたは異常な発現のために疾患の症状に寄与する任意のタンパク質である。例えば、病原性ポリペプチドは、変異型ポリペプチドおよび／または折り畳まれていない、かつ／または異常なコンフォメーションの、かつ／または不正確な細胞内局在の、かつ／または不適切な細胞および組織型において発現されたタンパク質、または他のタンパク質との不適切な会合もしくは会合の欠如であり得るが、これらに限定はされない。単なる例示的な例として、病原性ポリペプチドは、癌のような疾患の症状に寄与するタンパク質であり得、例えば、そのような病原性ポリペプチドは、EGFおよびVEGFのような血管形成タンパク質であってもよいし、またはアルツハイマー病のβ-アミロイド；筋萎縮性側索硬化症（ALS）の変異体SOD1等のような神経変性疾患に寄与する可能性がある。
いくつかの態様において、病理学的ポリペプチドは、病原体の表面上に発現されたポリペプチド、例えば、ウイルス粒子のコートタンパク質またはカプシドの部分を形成するポリペプチド、非制限的な例として、HIVウイルス粒子上に発現されたgp40、または癌細胞、ウイルス、もしくは感染性粒子上に発現されたその他の表面マーカーであり得る。
生体分子コンジュゲートの使用
いくつかの態様において、本明細書に開示するような生体分子コンジュゲートは、細胞死を誘発するために使用され得る。そのような態様において、分裂生体分子コンジュゲートは、「細胞死分裂生体分子コンジュゲート」と呼ばれ、活性となるよう補完された場合に細胞死を活性化することができる分裂エフェクター分子を含む。例えば、分裂エフェクターポリペプチド断片は、二つまたはそれ以上のプローブに各々コンジュゲートされた少なくとも二つのポリペプチド断片を含み、分裂エフェクターポリペプチド断片は、特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、細胞における細胞死経路を開始させることができる活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる。そのような態様において、エフェクター分子は、毒素、細胞障害性分子、ヌクレアーゼ、タンパク質分解酵素、アポトーシス促進性分子、または上に開示されたような標的核酸もしくは標的ポリペプチドを修飾する任意の分子であり得る。
いくつかの態様において、本明細書に開示するような細胞死分裂生体分子コンジュゲートの使用は、癌の処置のため有用であり、この細胞死分裂生体分子コンジュゲートのプローブは、癌のような障害に関連している特定の標的核酸配列または標的ポリペプチドを認識する。例えば、細胞死分裂生体分子コンジュゲートのプローブは、前述のように、以下に限定はされないが、HER2/Her-2、BRAC1およびBRAC2、Rb、p53等を認識することができる。
いくつかの態様において、癌または疾患または障害または悪性病変は、その組織における正常細胞または異常細胞の不十分に調節された、または調節されない増殖、および全体としての身体に対するその作用を特徴とする、哺乳類における器官または組織の任意の疾患であり得る。いくつかの態様において、癌には、良性新生物、異形成、過形成が含まれ、転移性の増殖を示す新生物、または、例えば、癌の発生にしばしば先行する白板症のようなその他の任意の形質転換が含まれる。細胞および組織が、正常細胞より迅速に増殖して、周辺の健康な組織または身体のその他の任意の組織へ置換または蔓延し、これは転移性増殖と記載され、異常な形およびサイズを呈し、核細胞質比、核多染性の変化を示し、最終的に死滅し得る場合、それらは癌性である。癌性の細胞および組織は、傍腫瘍性症候群を引き起こした場合、全体としての身体に影響を与え、または癌が生命にかかわる器官もしくは組織に起こった場合には、正常な機能が損なわれるか、もしくは停止し、致命的な結果をもたらす可能性がある。いくつかの場合において、原発性または転移性のいずれかである癌または癌細胞により、生命にかかわる器官の機能が損なわれた場合、癌により影響を受けた対象または哺乳類は死に至る可能性がある。悪性の癌とは、蔓延する傾向を有し、処置されなければ、死に至る可能性のある癌である。良性腫瘍は、通常死には至らないが、位置、サイズ、または傍腫瘍性副作用により正常な身体機能に干渉した場合には、死に至る場合もある。
「癌」という用語は、本明細書で使用するように、以下に限定はされないが、単純な良性新形成をさすのみならず、（1）癌、（2）肉腫、（3）癌肉腫、（4）血液形成組織の癌、（5）脳を含む神経組織の腫瘍、（6）皮膚細胞の癌のような、その他の良性および悪性の新形成も含む。細胞腫による癌は、身体の外側（皮膚）を覆い、粘膜、ならびに、例えば、乳房、肺、呼吸器、胃腸管、内分泌腺、および尿生殖器系のような器官の内部空洞性構造を裏打ちする上皮組織に起こる。例えば、甲状腺癌、胃腺癌、子宮腺癌のような腺癌におけるのと同様に、管または腺の要素は、上皮腫瘍において持続し得る。例えば、舌、唇、喉頭、膀胱、子宮頚部、または陰茎の癌のような、皮膚およびある種の粘膜の舗道（pavement）細胞上皮の癌は、それぞれの組織の類表皮癌または扁平上皮癌と呼ばれ得、同様に癌の定義の範囲内である。例えば、骨原性肉種；脂肪肉腫、繊維肉腫、滑膜肉腫のような、肉腫である癌は、線維組織、脂肪（脂質）組織、筋肉、血管、骨、および軟骨を含む結合組織に発達する。癌肉腫である癌は、上皮組織および結合組織の両方に発達する癌である。この定義の範囲内の癌疾患は、原発性または二次性であり得る。ここで、原発性とは、癌が、もう一つの病巣からの転移-54を通して二次的な部位として確立されたのではなく、それが見出される組織において生じたことを示す。
この定義の範囲内の癌および腫瘍疾患は、良性または悪性であり得、哺乳類の身体の任意のおよび／または全ての解剖学的構造に影響を与え得る。例えば、以下に限定はされないが、癌には、（I）骨髄および骨髄由来細胞（白血病）、（II）例えば、甲状腺、上皮小体、下垂体、副腎、唾液腺、膵臓のような内分泌腺および外分泌腺、（III）例えば、雄または雌のいずれかの乳腺、乳管における良性または悪性の腫瘍、腺癌、髄様癌、面疱癌、乳首のパジェット病、若い女性の炎症性癌のような、乳房、（IV）肺、（V）胃、（VI）肝臓および脾臓、（VII）小腸、（VIII）結腸、（IX）悪性または良性の骨腫瘍、例えば、悪性骨原性肉種、良性骨腫、軟骨腫瘍；悪性軟骨肉腫または良性軟骨腫；悪性骨髄腫または良性好酸球性肉芽腫のような骨髄腫瘍、ならびに身体のその他の位置における骨組織からの転移性腫瘍のような、骨ならびにその支持組織および結合組織；（X）口、咽喉、喉頭、および食道、（XI）卵巣、子宮、子宮頚部、精巣、および前立腺のような、雄および雌の膀胱ならびに尿生殖器系の内部および外部の器官および構造、（XII）前立腺、（XIII）膵臓の管癌のような膵臓；（XIV）リンパ腫およびリンパ起源のその他の腫瘍のような、リンパ組織、（XV）皮膚、（XVI）胸部の筋肉および裏打ちを含む呼吸および呼吸器系に属する全ての解剖学的構造の癌および腫瘍疾患、（XVII）リンパ節の原発性または二次性の癌、（XVIII）舌および硬口蓋または洞の骨質構造、（XVIV）口、頬、頸部、および唾液腺、（XX）心臓およびその裏打ちを含む血管、（XXI）平滑筋または骨格筋ならびにそれらの靭帯および裏打ち、（XXII）末梢神経系、自律神経系、小脳を含む中枢神経系、（XXIII）脂肪組織の癌および腫瘍疾患が含まれ得る。
いくつかのある種の態様において、癌は、リンパ腫；白血病；肉腫；腺腫である。いくつかの態様において、癌は急性リンパ性白血病（ALL）である。
本発明のもう一つの局面は、病原体感染を処置するための細胞死分裂生体分子コンジュゲートの使用に関する。いくつかの態様において、方法は、細胞死分裂エフェクター分子と病原体感染細胞を接触させることを含み；細胞死分裂エフェクターポリペプチドのプローブが、病原体に感染した細胞に存在する特定の標的核酸または標的ポリペプチドを特異的に認識し、分裂エフェクターポリペプチド断片が、病原体感染に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる。
いくつかの態様において、病原体感染の処置において有用な細胞死分裂生体分子コンジュゲートは、例えば、ウイルスコートタンパク質またはウイルスゲノムDNAのような病原体に特異的な標的核酸配列および／または標的ポリペプチドを認識するプローブを含む。
いくつかの態様において、分裂生体分子コンジュゲートは、例えば、以下に限定はされないが、感染および感染性疾患に至る可能性がある病原体のような病原体の処置のために有用である。皮膚および基底組織の感染は、病原体により、例えば、蜂巣炎、壊死性筋膜炎、皮膚壊疽、リンパ節炎、急性リンパ管炎、膿痂疹、皮膚膿瘍、毛包炎、おでき（フルンケル）、丹毒、癰（おできおよび皮膚膿瘍のクラスタ）、ブドウ球菌性皮膚剥脱症候群、紅色陰癬、または爪囲炎（多くの細菌および真菌により引き起こされ得る）を含む。これらの大部分は細菌感染である。最も一般的な細菌皮膚感染は、ブドウ球菌およびストレプトコッカスにより引き起こされる。真菌により引き起こされる皮膚感染は、いくつかの異なる真菌により引き起こされ身体上のその位置により一般に分類される真菌皮膚感染である、白癬である。例は、足部白癬（白癬菌（Trichophyton）または表皮菌（Epidermophyton）のいずれかにより引き起こされる足の白癬）、陰股部白癬（鼠径部の白癬、多様な真菌および酵母により引き起こされ得る）、頭皮白癬（白癬菌または小胞子菌（Microsporum）により引き起こされる）、爪白癬、および体部白癬（白癬菌により引き起こされる）である。カンジダ症（酵母感染、モニリア症）は、酵母カンジダ（Candida）による感染である。以下の型のカンジダ感染が区別され得る: 皮下脂肪における感染（間擦性感染）、膣および陰茎のカンジダ感染（外陰腟炎）、鵞口瘡、口角炎（口角におけるカンジダ感染）、カンジダ性爪囲炎（爪床におけるカンジダ増殖、有痛性の腫脹および膿を生ずる）。カンジダは、特に、免疫低下宿主においては、全身性感染に至ることもある。癜風は、皮膚上に白色から薄茶色の斑を引き起こす真菌感染である。皮膚は、寄生虫、主として小型の昆虫または虫によっても影響を受け得る。例は、疥癬（ダニ寄生）、シラミ寄生（シラミ寄生症、アタマジラミおよび恥骨シラミは二つの異なる種である）、または皮膚爬行症（皮膚幼虫移行症、鉤虫感染症）である。多くの型のウイルスが、皮膚に侵入する。例は、（いぼを引き起こす）パピローマウイルス、（例えば、口唇ヘルペスを引き起こす）単純ヘルペスウイルス、またはポックスウイルス科のメンバー（軟属腫（肌色の滑らかな蝋様の隆起を引き起こす皮膚の感染））である。
いくつかの態様において、分裂生体分子コンジュゲートは、例えば、細菌のような病原体の処置のために有用である。菌血症とは、血流中の細菌の存在をさし、除去し得ない程の過剰の細菌が存在する場合には、容易に敗血症が発生し、重度の症状を引き起こす。いくつかの場合には、敗血症は、敗血症性ショックと呼ばれる生命を脅かす状態に至る。桿菌は、それらの特殊な桿状の形に従って分類された細菌の型である。細菌は、球状（球菌）、桿状（桿菌）、または螺旋状／螺旋形（スピロヘータ）のいずれかである。グラム陽性菌またはグラム陰性菌が区別される。グラム陽性桿菌感染の例は、エリジペロスリックス症（erysipelothricosis）（ブタ丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）により引き起こされる）、リステリア症（リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）により引き起こされる）、および炭疽病（炭疸菌（Bacillus anthracis）により引き起こされる）である。炭疽病のうち、肺炭疽、胃腸炭疽、および皮膚炭疽（anthrax skin sores）が区別され得る。グラム陰性桿菌感染の例は、ヘモフィルス（Hemophilus）感染、インフルエンザ菌（Hemophilus influenzas）感染、軟性下疳菌(Hemophilus ducreyi)（軟性下疳を引き起こす）、ブルセラ症（波状熱、マルタ熱、地中海熱、またはジブラルタル熱、ブルセラ（Brucella）菌により引き起こされる）、ツラレミア（野兎熱、野兎病、野兎病菌（Francisella tularensis）により引き起こされる）、疫病（黒死病、ペスト菌（Yersinia pestis）により引き起こされる、腺ペスト、肺ペスト、敗血性ペスト、および軽症ペストが区別される）、ネコ引っ掻き病（ヘンセラ菌（Bartonella henselae）により引き起こされる）、シュードモナス感染（特に、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa））、カンピロバクター（Campylobacter）菌（例えば、カンピロバクター・ウロリ（wlori）[ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）]）により引き起こされる胃腸管または血液の感染、コレラ（コレラ菌（Vibrio cholerae）による引き起こされる小腸の感染）、その他のビブリオ種による感染、腸内細菌（Enterobacteriaceae）感染（例えば、胃腸管の感染を引き起こす、この群のメンバーは、サルモネラ、シゲラ（Shigella）、エスケリキア（Escherichia）、クレブシエラ（Klebsiella）、エンテロバクター（Enterobacter）、セラチア（Serratia）、プロテウス（Proteus）、モルガネラ（Morganella）、プロビデンシア（Providencia）、およびエルシニア（Yersinia）である）、肺炎桿菌（Klebsella pneumonia）感染（重度の肺感染）、腸チフス（チフス菌（Salmonella typhi）により引き起こされる）、非チフス・サルモネラ感染、または細菌性赤痢（細菌赤痢、シゲラ（Shigella）菌により引き起こされる腸感染）である。球形を有する細菌は、球菌と呼ばれる。ヒトにおいて感染を引き起こすことができる球菌には、ブドウ球菌、連鎖球菌（A群連鎖球菌、B群連鎖球菌、C群およびG群連鎖球菌、D群連鎖球菌、ならびに腸球菌）、肺炎球菌（例えば、肺炎、膿胸、細菌性髄膜炎、菌血症、肺炎球菌性心内膜炎、腹膜炎、肺炎球菌性関節炎、または中耳炎を引き起こす）、および髄膜炎菌（meningococci）が含まれる。毒素ショック症候群は、急速に重度の処置不能なショックへと悪化し得る、通常ブドウ球菌により引き起こされる感染である。
いくつかの態様において、病原体は、脳および脊髄を覆う層の感染（髄膜炎）を引き起こし得る髄膜炎菌（ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis））である。ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）は、性感染症である淋病を引き起こす。スピロヘータ感染は、コルク栓抜き形の細菌、スピロヘータによる感染である。例には、トレポネーマ（Treponema）、ボレリア（Borrelia）、レプトスピラ（Leptospira）、およびスピリルム（Spirillum）による感染が含まれる。トレポネーマ症（例えば、いちご腫、ピンタ）は、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）（梅毒を引き起こす）と区別不能なスピロヘータにより引き起こされる。再帰熱（ダニ熱、回帰熱、または飢餓熱）は、ボレリア菌のいくつかの株により引き起こされる疾患である。
もう一つの態様において、病原体は、スピロヘータ、ボレリア・ブルグドルフェリ（burgdorferi）により引き起こされる（シカダニにより伝達される）ライム病であり得る。スピロヘータ感染のその他の例は、レプトスピラ症（ワイル症候群、感染性（スピロヘータ）黄疸、およびカニコラ熱を含む感染の群）、または鼡咬熱である。
疾患を引き起こす嫌気性細菌には、クロストリジウム、ペプトコッカス、およびペプトストレプトコッカスが含まれる。その他の例は、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）、プレボテラ・メラニノゲニカ（Prevotella melaninogenica）、およびフゾバクテリウム（Fusobacterium）である。嫌気性細菌による感染には、歯性膿瘍、顎骨感染、歯周病、慢性副鼻腔炎、および中耳感染、ならびに脳、脊髄、肺、腹腔、肝臓、子宮、性器、皮膚、および血管における膿瘍が含まれる。クロストリジウム感染テタヌス（クロストリジウム・テタニ（tetani）菌により引き起こされる開口障害）または放線菌症（主としてアクチノミセス・イスラエリー（Actinomyces israelii）により引き起こされる慢性感染）の例。
もう一つの態様において、病原体は、特に、風媒性病原体マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、M.ボビス（bovis）、またはM.アフリカヌム（africanum）による、結核およびらいを引き起こすマイコバクテリアであり得る。らい（ハンセン病）は、細菌マイコバクテリウム・レプレ（leprae）により引き起こされる。リケッチア感染も公知である。リケッチア（Rickettsiae）またはエーリキア（Ehrlichieae）により引き起こされる疾患の例は、発疹熱（リケッチア・チフィ（Rickettsia typhi）により引き起こされる）、ロッキー山紅斑熱（リケッチア・リケッチー（rickettsii）により引き起こされる）、発疹チフス（リケッチア・プロワゼキー（prowazekii））、ツツガムシ病（リケッチア-62ツツガムシ（tsutsugamushi））、エーリキア症（エーリキア・カンツ（Ehrlichia cants）または近縁種）、リケッチア痘症（リケッチア・アカリ（akari））、Q熱（コクシエラ・ブルネッティ（Coxiella burnetii））、または塹壕熱（バルトネラ・クインターナ（Bartonella quintana））である。
その他の態様において、病原体は、通常はるかに大きな、もう一つの生物の内部で生活することにより生存する単細胞動物（原虫）または虫のような寄生虫であり得る。寄生虫感染の例は、アメーバ症（赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）により引き起こされる）、ジアルジア症（ランブル鞭毛虫（Giardia lamblia））、マラリア（プラスモジウム（Plasmodium））、トキソプラズマ症（トキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii））、バベシア症（バベシア（Babesia）寄生虫）、鞭虫症（腸回虫である鞭虫（Trichuris trichiura））、回虫症（回虫（Ascaris lumbricoides））、鉤虫感染（ズビニ鉤虫（Ancylostoma duodenale）またはアメリカ鉤虫（Necator americanus））、旋毛虫病（旋毛虫（Trichinella spiralis））、トキソカラ症（内臓幼虫移行症、トキソカラ・カンツ（Toxocara cants）およびトキソカラ・キャット（cat）のような回虫幼虫による器官の侵襲により引き起こされる）、ブタ条虫感染（有鉤条虫（Taenia solium））、または魚類条虫感染（ジフィロボスリウム・ラツム（Diphyllobothrium latum））である。
もう一つの態様において、病原体は真菌であり得る。真菌は、易感染性の免疫系を有する人々において感染を引き起こす傾向がある。真菌感染の例は、ヒストプラズマ症（ヒストプラズマ・カプスラツム（Histoplasma capsulatum）により引き起こされる）、コクシジオイデス症（コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis））、ブラストミセス症（ブラストミセス・デルマティティディス（Blastomyces dermatitidis））、カンジダ症（カンジダの株、特に、カンジダ・アルビカンス（albicans）により引き起こされる）、またはスポロトリクム症（スポロトリクス・シェンキー（Sporothrix schenckii））である。
もう一つの態様において、病原体はウイルスであり得る。ウイルス感染の非限定的な例は以下の通りである；呼吸器ウイルス感染、例えば、感冒（ピコルナウイルス［例えば、ライノウイルス］、インフルエンザウイルス、または呼吸器多核体ウイルスにより引き起こされる）、インフルエンザ（インフルエンザA型またはインフルエンザB型ウイルスにより引き起こされる）、ヘルペスウイルス感染（単純ヘルペス、帯状疱疹、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス6、ヒトヘルペスウイルス7、またはヘルペスウイルス8（エイズを有する人々におけるカポジ肉腫の原因）、中枢神経系ウイルス感染（例えば、狂犬病、クロイツフェルトヤコブ病（亜急性海綿状脳症）、進行性多巣性白質脳症（JCウイルスにより引き起こされる脳のポリオーマウイルス感染の稀な顕現）、熱帯性痙性不全対麻痺症（HTLV-I）、アルボウイルス感染（例えば、アルボウイルス脳炎、黄熱病、またはデング熱）、アレナウイルス感染（例えば、リンパ球性脈絡髄膜炎）、出血熱（例えば、ボリビア出血熱、アルゼンチン出血熱、およびラッサ熱、ハンタウイルス感染、エボラウイルスおよびマールブルグウイルス）。
一般的なウイルスの一例は、リンパ球の進行性の破壊をもたらすHIV-1またはHIV-IIウイルスにより引き起こされる感染であるヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染である。これは後天性免疫不全症候群（エイズ）に至る。その他のウイルスには、例えば、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、SARS、トリインフルエンザ等が含まれる。
その他の病原体ウイルスには、性感染（性行為感染）症、例えば、梅毒（梅毒トレポネーマにより引き起こされる）、淋病（ナイセリア・ゴノレア）、軟性下疳（軟性下疳菌）、鼠径リンパ肉芽腫症（クラミジア・トラコマチス（Chlamydia traehomatis））、鼠径肉芽腫（カリマトバクテリウム・グラニュロマティス（Calymmatobaeterium granulomatis））、非淋菌性尿道炎、およびクラミジア性子宮頸炎（ehlamydial eervieitis）（クラミジア・トラコマティス（traehomatis）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ureaplasma urealytieum）、トリコモナス・バギナリス（Triehomonas vaginalis）、もしくは単純ヘルペスウイルスにより引き起こされる）、トリコモナス症（トリコモナス・バギナリス）、性器カンジダ症、性器ヘルペス、陰部疣贅（パピローマウイルスにより引き起こされる）、またはHIV感染症が含まれる。
もう一つの態様において、病原体は、例えば、以下に限定はされないが、ノカルジア症（ノカルジア・アステロイデス（Nocardia asteroides）により引き起こされる）、アスペルギルス症、ムコール症、およびサイトメガロウイルス感染のような、免疫系障害を有する人々にしばしば感染する日和見病原体による感染であり得る。
いくつかの態様において、本明細書に開示するような細胞死分裂生体分子コンジュゲートは、腫瘍細胞またはウイルス感染細胞以外の細胞の処置において使用され得る。例えば、いくつかの態様において、細胞障害性エフェクター分子を保持している分裂生体分子コンジュゲートは、自己に対する抗体を分泌する細胞、例えば、B細胞を特異的に標的とすることができる。いくつかの態様において、本明細書に開示するような生体分子コンジュゲートは、自己免疫疾患または自己免疫関連疾患、例えば、以下に限定はされないが、橋本甲状腺炎；悪性貧血；アジソン病；I型糖尿病；慢性関節リウマチ；全身性エリテマトーデス；皮膚筋炎；シェーグレン症候群；エリテマトーデス；多発性硬化症；重症筋無力症；ライター症候群；およびグレーブス病の処置において有用である。
本明細書で使用するように、「自己免疫疾患」または自己免疫関連疾患という用語は、身体組織がその自己の免疫系により攻撃された場合に起こる疾病または疾患をさす。免疫系は、通常、感染性因子を含む身体の侵入者を「捜し、破壊する」よう設計されている体内の複雑な機構である。自己免疫疾患を有する患者は、しばしば、自己の身体組織を標的とする血中を循環する異常な抗体を有する。自己免疫疾患の例には、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、慢性関節リウマチ、若年性（1型）糖尿病、多発性筋炎、強皮症、アジソン病、白斑、悪性貧血、糸球体腎炎、多発性硬化症、および肺線維症が含まれる。
もう一つの態様において、本明細書に開示するような分裂生体分子コンジュゲートは、第二の因子が、感作された細胞にのみ特異的に影響を与えるよう、第二の因子に対して細胞を感作するために使用され得る。典型的には、第二の因子は、標的とされた細胞の細胞死を誘発する化学的または物理的な実体または因子である。そのような態様において、「感作分裂生体分子コンジュゲート」は、標的核酸配列または標的ポリペプチドの存在下で、他の二次性の因子に対して細胞を感作することができる活性エフェクター分子を形成するよう再組み立てされる分裂エフェクター分子を含む。いくつかの態様において、エフェクター分子の例には、例えば、以下に限定はされないが、上述のような、βグルクロニダーゼ；ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β-ラクタマーゼ酵素、およびカルボキシルエステラーゼHCE1が含まれる。いくつかの態様において、そのような分裂生体分子コンジュゲートは、本明細書において「感作分裂生体分子コンジュゲート」と呼ばれ、いくつかの態様において、それらは癌および／または病原体感染の処置のために有用であり、その場合、標的核酸配列または標的ポリペプチドは、それぞれ、癌または病原体感染の症状に寄与する。
もう一つの態様において、本明細書に開示するような生体分子コンジュゲートは、標的核酸配列および／または標的ポリペプチドの分解または破壊を誘発し、それにより、細胞を死滅させるかまたは細胞から病原性標的核酸および／もしくはポリペプチドを排除するかのいずれかのために使用され得る。そのような態様において、分裂生体分子コンジュゲートは「分解分裂生体分子コンジュゲート」と呼ばれ、標的核酸またはポリペプチドの存在下で、活性エフェクター配置となった場合に、細胞においてヌクレアーゼもしくはプロテアーゼとして機能するか、または標的核酸もしくは標的ポリペプチドの核酸分解もしくはタンパク質分解を誘発する分裂エフェクター分子を含む。そのような態様において、エフェクター分子は、例えば、以下に限定はされないが、ヌクレアーゼ；プロテアーゼ、およびユビキチナーゼ（ubiquitinase）であり得る。いくつかの態様において、分解分裂生体分子コンジュゲートは、（本明細書に開示するもののような）癌および（本明細書に開示するもののような）病原体感染、ならびに病原性核酸または病原性ペプチドの存在によるその他の疾患および障害を処置するために使用され得る。
いくつかの態様において、疾患、障害、または悪性病変とは、症状が、病理学的核酸配列または病理学的ポリペプチドにより部分的にまたは完全に引き起こされるような任意の疾患、障害、または悪性病変をさす。例えば、神経系に影響を与える神経疾患、呼吸器疾患、心血管障害、肝障害；炎症性疾患；膵疾患、消化器疾患、腎疾患、皮膚疾患；肺疾患等。
いくつかの態様において、神経疾患および神経変性疾患は、例えば、以下に限定はされないが、脳梗塞、脳血管発作、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、脊髄損傷、抑うつ、躁うつ病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、およびその他の神経変性疾患等である。いくつかの態様において、呼吸器系疾患には、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、気管支炎、喘息、間質性肺炎、肺線維症等が含まれる。
いくつかの態様において、心臓血管疾患は、例えば、以下に限定はされないが、閉塞性血管疾患、心筋梗塞、心不全、冠動脈疾患等である。本明細書で使用するように、「心血管の状態、疾患、または障害」という語句は、不十分な、望まれない、または異常な心機能を特徴とする全ての障害、例えば、虚血性心疾患、高血圧性心疾患、および肺高血圧性心疾患、弁膜疾患、先天性心疾患、ならびに対象、特にヒト対象におけるうっ血性心不全に至る任意の状態を含むものとする。不十分な、または異常な心機能は、疾患、損傷、および／または老化の結果であり得る。いくつかの態様において、肝疾患にはB型肝炎、C型肝炎、アルコール性肝炎、肝硬変、肝不全等が含まれ、膵疾患には、糖尿病、膵臓炎等が含まれる。消化器系疾患には、クローン病、潰瘍性大腸炎等が含まれる。腎疾患には、IgA糸球体腎炎、糸球体腎炎、腎不全等が含まれ、皮膚病には、褥瘡、熱傷、縫合傷、裂傷、切傷、咬傷、皮膚炎、瘢痕性ケロイド、ケロイド、糖尿病性潰瘍、動脈潰瘍、静脈潰瘍等が含まれる。肺疾患には、気腫、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性繊維症、特発性間質性肺炎（肺線維症）、びまん性肺線維症、結核、喘息等が含まれる。
本明細書で使用するように、炎症性疾患とは、身体組織の炎症を引き起こし、続いて急性または慢性の炎症状態を生じる、免疫系または組織の細胞性または非細胞性のメディエーターにより誘発される疾患をさす。そのような炎症性疾患の例には、以下に限定はされないが、I〜IV型過敏反応、例えば、以下に限定はされないが、喘息を含む肺の過敏疾患、アトピー性疾患、アレルギー性の鼻炎または結膜炎、蓋の血管浮腫、遺伝性血管浮腫、抗受容体過敏反応、および自己免疫疾患、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、天疱瘡、重症筋無力症、グレーブス病、レイノー病、B型インスリン抵抗性糖尿病、慢性関節リウマチ、乾癬、クローン病、強皮症、混合性結合組織疾患、多発性筋炎、サルコイドーシス、糸球体腎炎、急性または慢性の移植片対宿主反応が含まれる。
もう一つの態様において、本明細書に開示するような分裂生体分子コンジュゲートは、例えば、細胞死経路を阻害し、かつ／または細胞生存経路を活性化して、細胞の生存を誘発するために使用され得る。そのような態様において、分裂生体分子コンジュゲートは、「生存分裂生体分子コンジュゲート」と呼ばれ、特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、細胞において細胞生存経路を開始させるか、または細胞死を阻害することができる分裂エフェクター分子を含み得る。いくつかの態様において、エフェクター分子は、例えば、以下に限定はされないが、bcl-2、hsp70、hsp27、IAPタンパク質等のような抗アポトーシス分子であり得る。そのような態様において、生存分裂生体分子コンジュゲートは、病原性核酸または病原性ペプチドの存在によるような細胞の選択的な損失をもたらす病原体感染を含む疾患および障害を処置するために使用され得る。例えば、そのような疾患には、以下に限定はされないが、神経変性疾患のような全ての変性疾患、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、および筋ジストロフィー症のような筋肉障害等が含まれる。
もう一つの態様において、エフェクター分子が交換ポリペプチドとして機能する分裂生体分子コンジュゲートは、細胞における失われた、もしくは低下した発現、または機能障害性ポリペプチドに選択的に取って代わるために使用され得る。そのような態様において、そのような分裂生体分子コンジュゲートは、「代理分裂生体分子コンジュゲート」と呼ばれ、特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、細胞において機能障害性のまたは失われたポリペプチドに取って代わることができる交換ポリペプチドを形成するよう再組み立てされる分裂エフェクター分子を含み得る。いくつかの態様において、代理分裂生体分子コンジュゲートは、疾患の症状が、ポリペプチドの損失、低下した発現、または疾患もしくは障害の病因に寄与する機能障害性もしくは変異型のポリペプチドの発現による任意の疾患または障害を処置するために使用され得る。そのような疾患の例には、以下に限定はされないが、タンパク質ジスフェリンの損失を有する筋ジストロフィー、嚢胞性繊維症等のような機能喪失型の疾患が含まれる。いくつかの態様において、疾患は、例えば、疾患の遺伝的素因または後天性疾患の結果であり得る。
いくつかの態様において、本発明は、本明細書に開示するような選択的な分裂生体分子コンジュゲートを使用して、選択的に細胞を死滅させるか、または細胞の生存を維持するか、または新たなポリペプチドの特徴もしくは標的核酸もしくはポリペプチドの分解の作用を査定する方法に関する。いくつかの態様において、細胞死分裂生体分子コンジュゲートおよび／または生存分裂生体分子コンジュゲートは、それぞれ、選択的な細胞を死滅させるため、またはそれらの生存を促進するために使用され得る。いくつかの態様において、方法は、不要な型の細胞を選択的に死滅させることにより、例えば、放射線による骨髄焼灼を受ける患者への移植前に骨髄の細胞集団の中の選択された細胞を選択的に死滅させるか、またはそれらの生存を維持することにより、インビトロの細胞分離のために使用され得る。
上記の態様の全てにおいて、処置される対象は、ヒトおよび非ヒト哺乳類を含む哺乳類、動物一般、例えば、哺乳類、以下に限定はされないが、ウシ、ウマ；ヤギ；ヒツジ；ブタ；ロバ等を含む家畜、以下に限定はされないが、ネコ；イヌを含む家庭用ペット；以下に限定はされないが、ウサギ、マウス；ハムスター等を含むげっ歯類；鳥類および家禽ならびにその他の家畜および野鶏のような非ヒト動物である。
分裂生体分子コンジュゲートの作製、およびエフェクター分子の標的により媒介されるタンパク質補完の査定の方法
本発明のもう一つの局面は、本明細書に開示するような分裂生体分子コンジュゲートの作製に関する。いくつかの態様において、方法は、エフェクター分子のタンパク質構造を査定する工程、およびエフェクター分子を分裂させるための適切な部位を決定する工程を含む。方法は、タンパク質断片を発現させる工程、ならびにコンジュゲートされたプローブの存在下および非存在下で、さらに、標的ポリペプチドまたは標的核酸配列の存在下および非存在下で、それらの補完能力を査定する工程をさらに含む。
（i）エフェクターポリペプチド内の分裂部位の位置の設計
最適な分割は、構造的なコンフォメーションを査定し、オルタナティブな分裂点を査定することにより決定され得る。いくつかの態様において、自発的な再組み立てをもたらさない相補的な分裂エフェクター断片を達成するため、または、特に、標的核酸配列または標的ポリペプチドを認識する付着したプローブにより媒介される場合、活性エフェクタータンパク質を形成するよう効率的に再組み立てされ得る二つの分裂エフェクター断片を入手するためには、数回のクローニングの試みが必要とされる可能性もある。
注目すべきことに、エフェクターポリペプチドの分裂部位を設計するための本明細書に開示するような方法は、分裂ポリペプチドプローブの相補パートナーとして使用され得る断片を作製するためにポリペプチドプローブタンパク質の分裂部位を同定するためにも使用され得る。
いくつかの態様において、エフェクタータンパク質を二つまたはそれ以上の分裂エフェクタータンパク質断片へと分裂させる最初の試験のため、三つの分裂点を選ぶ際、以下の基準に従うことができる：（1）分裂点は、活性にとって重要なアミノ酸を二つのタンパク質半分の間に分離するべきである；（2）分裂点は非構造領域内に位置しているべきである（分裂タンパク質半分に最小限の構造的障害を導入するため）；（3）分裂タンパク質半分は、RTAのようなフルサイズのエフェクター分子におけるコンパクトな折り畳み単位に相当する。
いくつかの態様において、さらなる基準が適用され得、例えば、分裂エフェクタータンパク質の断片は、タンパク質を凝集させ易くする大きな疎水性表面を有するべきではない。例えば、タンパク質溶解度予測ソフトウェア（例えば、http://www.biotech.ou.edu）による、タンパク質の表面疎水性を同定する方法は、当技術分野において公知である。
注目すべきことに、相補的な分裂エフェクタータンパク質断片が封入体を形成する可能性のため、エフェクター分子の複数の異なる分裂部位、例えば、単一のエフェクター分子の少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、または10より多い異なる分裂部位を試験することが重要である。相補的な分裂エフェクタータンパク質断片の各組み合わせが、封入体の最小限の形成を伴う発現の効率に関して、次いで、本明細書に開示するような標的の存在下または非存在下でのタンパク質補完の効率に関して、試験されるべきである。
（ii）封入体の最小限の形成を伴う分裂エフェクタータンパク質断片の発現
分裂生体分子コンジュゲートまたは分裂エフェクター断片の作製は、当業者に一般的に公知のインビトロ発現系を使用して実施され得る。発現されたエフェクター断片の妥当なタンパク質再折り畳みは、それらが機能的に活性なエフェクタータンパク質を形成するよう再組み立てされ得ることを確実にするために重要である。いくつかの態様において、そのような発現系には、例えば、封入体の作製を制限する系、例えば、以下に限定はされないが、参照により本明細書に特別に組み入れられるEP1516928およびUS20050130259およびWO0039310に開示されるような方法が含まれる。無細胞遺伝子／タンパク質発現。
分裂エフェクタータンパク質断片の無細胞発現
いくつかの態様において、無細胞遺伝子発現が、分裂エフェクター生体分子コンジュゲートを発現するために有用である。いくつかの態様において、分裂エフェクタータンパク質をコードする核酸が、RNAポリメラーゼ、例えば、T7 RNAポリメラーゼによりインビトロで転写され、次いで、RNAが、例えば、大腸菌から入手された細胞溶解物を使用して続いて翻訳される。無細胞タンパク質発現系、例えば、ラピッドトランスレーションシステム（RTS）は、当業者に一般的に公知であり、例えば、共役転写／翻訳キットとしてRoche Applied Science1またはNovagen2から市販されている。いくつかの態様において、そのようなキットの使用は、全ての必要な制御要素（プロモーター、ターミネーター等）およびその後の精製のためのタグ配列を含有しているPCRで生じた直線DNA鋳型から、所望のタンパク質を、数時間以内に、数マイクログラム〜数ミリグラム、作製することができる。
そのような方法を使用して、分裂RTA断片のような、分裂エフェクタータンパク質断片が、最小限のインビボクローニングにより急速かつ迅速に入手され得、従って、様々な分裂点に対応する一連のRTA断片をより容易に入手することを可能にする。
または、いくつかの態様において、無細胞遺伝子発現系は、可溶型のタンパク質が作製されるよう、本明細書に開示するような分裂エフェクタータンパク質断片を作製するために有用である。RTS反応チャンバ内の低下した高分子の密度（crowding）は、有益であり、正確なタンパク質折り畳みを促進し、従って、不正確に折り畳まれた不溶性の封入体の形成を低下させるため、そのような系は有用である。
いくつかの態様において、無細胞で発現された分裂エフェクタータンパク質断片の可溶性が依然として低い場合には、このタンパク質を可溶性にするため、溶解度を増強する添加剤が容易に含まれ得、かつ／または、例えば、以下に限定はされないが、MBP、Trx、またはNus配列のようなある種の溶解度を促進する融合タグが、オーバーラップ伸長PCRにより、発現された不溶性タンパク質に付加され得る。いくつかの態様において、インビトロ発現効率を減少させる恐らく窮屈なmRNA構造により、無細胞発現に関するいくつかの可能性のある問題が起こり得、また、溶解度タグが、分裂タンパク質毒素の妥当な再組み立てに干渉し得る。従って、分裂エフェクタータンパク質断片を効率的に発現させるためには、細菌発現系および昆虫発現系のみならず、複数の無細胞発現系が利用され得る。
（2）分裂エフェクタータンパク質断片の細胞に基づく遺伝子発現
いくつかの態様において、エフェクター断片は、インビトロ発現系において発現され、細胞の可溶性細胞画分へと分泌され、細胞周囲の上清または培地から採集され得る。
いくつかの態様において、本明細書に開示するような方法において有用な分裂エフェクタータンパク質断片を発現させるための一つの方法は、過剰発現されたタンパク質を細胞から分泌する大腸菌株のような特別な細菌宿主株を使用し、それにより細胞内の封入体の形成を最小限に抑えることである。いくつかの態様において、大腸菌細胞のような宿主細菌細胞は、バクテリオシン放出タンパク質（BRP）3を産生し、これは細胞内タンパク質の培養培地への分泌を容易にし、そこで、それらは正確なタンパク質折り畳みを受けることができる。従って、そのような発現系の使用は、不正確に折り畳まれた不溶性の封入体の形成の最小限の可能性を伴う、分裂エフェクタータンパク質断片の発現のために有用である。
さらなる態様において、本発明は、分裂エフェクター断片のタンパク質補完による活性エフェクタータンパク質の形成の査定に関する。例えば、発現された分裂エフェクタータンパク質断片は、プローブにコンジュゲートされ得、標的の非存在下で自発的にタンパク質補完する断片を同定するためのエフェクタータンパク質の機能の査定。コンジュゲートされたプローブに対する標的の非存在下で自発的に補完するそのような分裂エフェクター断片は、標的の非存在下での分裂生体分子コンジュゲートの非特異的なタンパク質補完を示すため、破棄され得る。
補完分裂エフェクター断片の再組み立てが、自発的に、即ち、標的核酸配列または標的ポリペプチドの非存在下で起こる場合には、自己組み立ては防止するが、二つの断片がタンパク質補完により会合した際のエフェクタータンパク質の機能または活性は改変しないような変異を導入するためにエフェクター断片を修飾することができる。導入された修飾または変異のエフェクタータンパク質の活性に対する作用は、完全なエフェクター分子（即ち、二つの相補的な断片へ分裂していないエフェクター分子）の活性と比較され得る。
標的の非存在下で自発的にタンパク質補完しない分裂エフェクタータンパク質断片が、さらなる分析のために選択され得る。そのような分裂エフェクタータンパク質断片は、分裂エフェクタータンパク質断片にコンジュゲートされたプローブに対する核酸標的またはタンパク質標的のような標的分子の存在下でのみ補完する分裂エフェクタータンパク質断片を同定するために、さらに分析され得る。
（iii）分裂エフェクタータンパク質断片の標的により媒介されるタンパク質補完の査定
上述のように、プローブの非存在下および存在下で、二つの相補的な分裂エフェクタータンパク質断片のタンパク質補完の効率が、査定される。いくつかの態様において、分裂生体分子タンパク質コンジュゲート断片の形成は、分裂エフェクタータンパク質断片の、プローブ、例えば、核酸プローブまたはポリペプチドプローブとのコンジュゲーションにより起こり得る。
コンジュゲーション法：
多様なコンジュゲーション法が使用され得る。
「コンジュゲート」または「コンジュゲートされた」という用語は、二つまたはそれ以上の実体の接合をさす。その接合は、分子のモエティが一緒に保持され、近位に保存されるような、二つまたはそれ以上のポリペプチドの融合、または共有結合性、イオン性、もしくは疎水性の相互作用であり得る。実体の付着は、リンカー、化学的修飾、ペプチドリンカー、化学的リンカー、共有結合性もしくは非共有結合の結合、またはタンパク質融合により、または当業者に公知の任意の手段により、なされ得る。その接合は永久的であるあってもよく、または可逆性であってもよい。いくつかの態様において、各リンカーおよび各タンパク質の所望の特性を利用するために、数個のリンカーがコンジュゲートに含まれてもよい。フレキシブルリンカー、およびコンジュゲートの溶解度を増加させるリンカーが、単独で、または本明細書に組み入れられる他のリンカーと共に使用するために企図される。ペプチドリンカーは、リンカーをコードするDNAの発現により、コンジュゲート内の一つまたは複数のタンパク質に連結され得る。リンカーは、酸切断可能リンカー、光切断可能リンカー、および感熱性リンカーであり得る。
付着は、リンカー、化学的修飾、ペプチドリンカー、化学的リンカー、共有結合性もしくは非共有結合の結合、またはタンパク質融合により、または当業者に公知の任意の手段により、なされ得る。その接合は永久的であるあってもよく、または可逆性であってもよい。いくつかの態様において、各リンカーおよび各タンパク質の所望の特性を利用するために、数個のリンカーがコンジュゲートに含まれてもよい。フレキシブルリンカー、およびコンジュゲートの溶解度を増加させるリンカーが、単独で、または本明細書に開示するような他のリンカーと共に使用するために企図される。ペプチドリンカーは、リンカーをコードするDNAの発現により、コンジュゲート内の一つまたは複数のタンパク質に連結され得る。リンカーは、酸切断可能リンカー、光切断可能リンカー、および感熱性リンカーであり得る。コンジュゲーションの方法は当業者に周知であり、本発明において使用するために包含される。
本発明によれば、分裂エフェクタータンパク質断片は、当技術分野において公知のような任意の適当な手段を介してプローブに連結され得、例えば、参照により完全に本明細書に組み入れられる米国特許第4,625,014号、第5,057,301号、および第5,514,363号を参照のこと。例えば、分裂エフェクタータンパク質断片は、直接または一つもしくは複数のリンカー介するかのいずれかで、共有結合的にプローブにコンジュゲートされ得る。一つの態様において、本発明の分裂エフェクタータンパク質断片は、プローブに直接コンジュゲートされる。もう一つの態様において、本発明の分裂エフェクタータンパク質断片は、リンカー、例えば、輸送増強リンカーを介してプローブにコンジュゲートされる。
分裂エフェクタータンパク質断片のプローブとのコンジュゲーションのための極めて多様な方法が、当技術分野において公知である。そのような方法には、例えば、参照により完全に本明細書に組み入れられるHermanson（1996, Bioconjugate Techniques, Academic Press）、米国特許第6,180,084号、および米国特許第6,264,914号に記載されており、例えば、応用免疫学においてルーチンに使用されるような、ハプテンを担体タンパク質に連結するために使用される方法（Harlow and Lane, 1988, 「Antibodies: A laboratory manual」, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照のこと）が含まれる。いくつかの場合には、分裂エフェクタータンパク質断片が、例えば、コンジュゲーション手順または内部に利用された化学基に応じて、コンジュゲーションによって効力または機能性を失う可能性があることが認識される。しかしながら、極めて多様なコンジュゲーションの方法が存在するため、当業者は、コンジュゲートされる実体の効力もしくは機能性に影響を与えないか、または最も少ない影響を与えるコンジュゲーション法を見出すことができる。
分裂エフェクタータンパク質断片のプローブとのコンジュゲーションのための適当な方法には、例えば、カルボジイミドコンジュゲーション（Bauminger and Wilchek, 1980, Meth. Enzymol. 70: 151-159）が含まれる。または、モエティは、各々、参照により本明細書に組み入れられるNagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7269-7273 (1996)およびNagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1794-1799 (1998)により記載されたようにして、標的化因子にカップリングされ得る。使用可能なもう一つのコンジュゲーション法は、例えば、過ヨウ素酸ナトリウムの酸化に続く適切な反応物の還元的アルキル化およびグルタルアルデヒド架橋である。
本明細書に記載されるような分裂エフェクタータンパク質断片を、核酸プローブのようなプローブにコンジュゲートするため、多様な異なるリンカー、例えば、以下に限定はされないが、アミノカプロン（aminocaproic）西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）またはヘテロ二機能性架橋剤、例えば、カルボニル反応性かつスルフヒドリル反応性である架橋剤を使用することができる。ヘテロ二機能性架橋試薬は、通常、二または三工程の過程で、タンパク質およびその他の高分子の二つの異なる機能標的にカップリングされ得る二つの反応性基を含有しており、それは、ホモ二機能性架橋剤の使用にしばしば関連している重合の程度を制限することができる。そのような多工程プロトコルは、コンジュゲートのサイズおよび成分のモル比の良好な調節を提供することができる。
「リンカー」という用語は、二つまたはそれ以上の実体を接合するための、例えば、ペプチドをもう一つのペプチドまたはリポソームと接合するための、任意の手段をさす。リンカーは、共有結合性リンカーまたは非共有結合性リンカーであり得る。共有結合性リンカーの例には、共有結合、または連結すべきタンパク質のうちの一つもしくは複数に共有結合的に付着したリンカーモエティが含まれる。リンカーは、非共有結合性の結合、例えば、白金原子のような金属中心を通した有機金属結合であってもよい。共有結合のため、炭酸誘導体を含むアミド基、エーテル、有機および無機のエステルを含むエステル、アミノ、ウレタン、尿素等のような様々な官能基が使用され得る。リンキングを提供するために、エフェクター分子および／またはプローブは、カップリングのための部位を提供するために、酸化、水酸化、置換、還元等により修飾され得る。分裂エフェクタータンパク質断片および／またはプローブの機能を有意に減少させない修飾が好ましいことが認識されるであろう。
対象における病原性標的核酸またはポリペプチドをスクリーニングする方法
いくつかの態様において、本発明は、対象における病原性標的核酸または病原性ポリペプチドのレベルを測定する方法を提供し、本方法は、分裂検出分子を含む分裂生体分子コンジュゲートの薬学的組成物の有効量の、対象への投与であって、分裂検出ポリペプチド断片の各々が、疾患または障害に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドに特異的な二つのプローブのうちの少なくとも一つにコンジュゲートされている、投与と；活性エフェクター分子の形成が、疾患または障害に関連している標的核酸または標的ポリペプチドと少なくとも二つのプローブが結合することにより促進される、活性検出分子の形成と；活性検出分子のレベルの測定とを含み、活性検出分子のレベルが、対象における標的核酸または病原性ポリペプチドの測定値となる。
いくつかの態様において、検出ポリペプチドは、β-ラクタマーゼ；DFHR；ルシフェラーゼ；蛍光性タンパク質、またはそれらの変異体もしくは断片を含む群より選択される。
いくつかの態様において、活性検出分子のレベルは、例えば、第一の時点において本明細書に開示するような方法を使用して病原性標的核酸または病原性ポリペプチドのレベルを測定し、第一の時点からのレベルを、第二の時点での病原性標的核酸または病原性ポリペプチドのレベルと比較することにより、対象における病原性標的核酸または病原性ポリペプチドのレベルを決定するために使用され得る。そのような態様は、処置、例えば、本明細書に開示するような方法による分裂生体分子コンジュゲートによる対象の処置の有効性を決定するために有用である。従って、いくつかの態様において、対象は、エフェクター分子を含む分裂生体分子コンジュゲート、および検出分子を含む分裂生体分子コンジュゲートの両方を投与され得る。いくつかの態様において、エフェクター分子を含む分裂生体分子コンジュゲートは、検出分子を含む分裂生体分子コンジュゲートと同時に投与され得、または、別の態様において、それらは連続的に、任意の順序で、任意の回数、投与され得る。
いくつかの態様において、検出分子は、再構成される蛍光性タンパク質の断片のうちの一つが、前もって形成された成熟発色団を含有している、蛍光性タンパク質、例えば、以下に限定はされないが、緑色蛍光タンパク質（GFP）、高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）、緑色蛍光様（green-fluorescent-like）タンパク質；黄色蛍光タンパク質（YFP）、高感度黄色蛍光タンパク質（EYFP）、青色蛍光タンパク質（BFP）、高感度青色蛍光タンパク質（EBFP）、シアン蛍光タンパク質（CFP）、高感度シアン蛍光タンパク質（ECFP）、または赤色蛍光タンパク質（dsRED）である。蛍光を発する蛍光性タンパク質をもたらす前述の蛍光性タンパク質およびそれらの断片の全てが、本発明において使用するために包含される。当業者に公知の蛍光性タンパク質、ならびにそれらの断片および遺伝子操作されたタンパク質も包含される。
いくつかの態様において、活性検出タンパク質、例えば、活性蛍光性タンパク質の存在は、フローサイトメトリー、蛍光プレートリーダー、蛍光光度計、顕微鏡法、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）により、肉眼により、または当業者に公知のその他の方法により検出可能である。別の態様において、蛍光は、蛍光標示式細胞分取器（FACS）を使用したフローサイトメトリーまたは微速度顕微鏡法により検出される。
本発明のもう一つの態様において、分裂検出タンパク質断片が、組み立てられた活性酵素を形成するよう近位で会合し、それが酵素活性アッセイを使用して検出され得るよう、検出分子は、酵素である。好ましくは、酵素活性は、発色反応または蛍光発生反応により検出される。一つの好ましい態様において、酵素は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）またはβ-ラクタマーゼである。
もう一つの態様において、酵素はジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）である。例えば、Michnickらは、単独では酵素活性を欠くが、接近した場合に機能性の酵素を形成する、DHFRのN末端およびC末端の断片からなる「タンパク質補完アッセイ」を開発した。例えば、本明細書に参照により組み入れられる米国特許第6,428,951号、第6,294,330号、および第6,270,964号を参照のこと。発色法および蛍光発生法を含むDHFR活性を検出するための方法は、当技術分野において周知である。
別の態様において、その他の検出分子、例えば、検出可能な産物への基質の変換を触媒する酵素が使用され得る。分裂ポリペプチドの再組み立てのためのいくつかのそのような系には、以下に限定はされないが、β-ガラクトシダーゼ（Rossi et al, 1997, PNAS, 94; 8405-8410）；ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）（Pelletier et al, PNAS, 1998; 95; 12141-12146）；TEM-1β-ラクタマーゼ（LAC）（Galarneau at al, Nat. Biotech. 2002; 20; 619-622）、およびホタルルシフェラーゼ（Ray et al, PNAS, 2002, 99; 3105-3110およびPaulmurugan et al, 2002; PNAS, 99; 15608-15613）の再組み立てが含まれる。例えば、分裂β-ラクタマーゼは、二本鎖DNAの検出に使用されている（Ooi et al,Biochemistry,2006; 45; 3620-3525を参照のこと）。断片が、補完により、迅速なシグナルの検出を可能にする完全に折り畳まれた成熟コンフォメーションとなるような、リアルタイムのシグナル検出のための活性化された分裂ポリペプチド断片の使用が、本発明において使用するために包含される。
薬学的組成物
本発明は、薬学的に許容される担体の中に本発明の分裂生体分子コンジュゲートを含む薬学的組成物にも関する。治療的な適用において、組成物は、疾患およびその合併症を改善するか、または少なくとも部分的に抑止するために十分な量で、疾患に罹患した患者に投与される。これを達成するために適当な量は、治療的に有効な用量として定義される。この使用のために有効な量は、疾患の重度および患者の全身健康状態に依るであろう。
一つの態様において、細胞は、インビボで分裂生体分子コンジュゲートで処置される。もう一つの態様において、細胞は、エクスビボの分裂生体分子コンジュゲートで処置され、この場合、細胞が対象から入手され、エクスビボで薬学的組成物を投与され、そして、ある種の態様において、それらは対象へ移植により戻される。
大部分の態様において、薬学的組成物で処置される対象は、ヒトおよび非ヒト哺乳類を含む哺乳類、動物一般、例えば、哺乳類、以下に限定はされないが、ウシ、ウマ；ヤギ；ヒツジ；ブタ；ロバ；等を含む家畜、以下に限定はされないが、ネコ；イヌを含む家庭用ペット；以下に限定はされないが、ウサギ、マウス；ハムスター等を含むげっ歯類；鳥類および家禽ならびにその他の家畜および野鶏のような非ヒト動物である。
有利なことに、薬学的組成物は非経口投与に適している。本発明の分裂生体分子コンジュゲートは、免疫毒素のようなその他の類似した組成物のための当技術分野において公知の方法により、種々の目的、例えば、身体の様々な部分における腫瘍の処置にとって適切な様々な手段により、投与され得る（例えば、Rybak,et al.,Human Cancer Immunology,in IMMUNOLOGY AND ALLERGY CLINICS OF AMERICA,W.B.Saunders,1990、およびその中に引用された参照を参照のこと）。従って、本発明は、本発明の分裂生体分子コンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物、特に、上記の投与手段に適しているそのような組成物にも関する。
患者により必要とされ許容されるような投薬量および頻度に依って、組成物の単回投与または複数回投与が投与され得る。いずれにせよ、組成物は、患者を有効に処置するために十分な量の本発明のタンパク質を提供するべきである。
好ましくは、投与のための組成物は、一般的に、薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体の中に分裂生体分子コンジュゲートを含む前負荷されたポリマー性ナノ粒子および／またはカチオン性リポソーム（Pattrick et al,2001；Richardson et al.,2001；Sachdeva,1998）を含むであろう。多様な水性担体、例えば、緩衝生理食塩水等が使用され得る。これらの溶液は、無菌であり、一般に有害物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術により滅菌され得る。組成物は、pH調整剤および緩衝剤、毒性調整剤等、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等のような生理学的条件に近似するために必要とされるような薬学的に許容される補助物質を含有してもよい。これらの製剤の中の融合タンパク質の濃度は、広範に変動することができ、選択された特定の投与モードおよび患者の必要性に従い、液体の体積、粘性、体重等に主として基づき選択されるであろう。
従って、静脈内投与用の典型的な薬学的組成物は、1日当たり患者1人当たり約0.01〜100mgであろう。特に、薬物が、血流ではなく、腫瘍または腫瘍が属する器官のような隔離された部位に投与される場合、1日当たりの患者1人当たり0.1〜約1000mgの投薬量が使用され得る。非経口的に投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知または明白であり、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE,15TH ED.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,(1980)のような刊行物に、より詳細に記載されている。
薬学的組成物は、当業者に公知の任意の手段によって投与され得る。例えば、いくつかの方法には、ポンプ、直接注射、局所適用、または皮内、皮下、静脈内、リンパ内、節内、粘膜内、もしくは筋肉内の投与を介した対象への投与が含まれる。
本発明は、癌またはウイルス性疾患、または本発明における方法が使用され得る当業者により同定されたその他の疾患の処置において有用な薬物の調製における、本発明の分裂生体分子コンジュゲートの薬学的組成物の使用にも関する。
本発明の一つの態様において、分裂生体分子コンジュゲートは、封入体によって発現される。「封入体」（IB）とは、本明細書で使用するように、微生物／原核生物におけるコーディング核酸の過剰発現により組換え的に作製された不溶性型のポリペプチドをさす。封入体経路を介した微生物／原核生物におけるタンパク質の組換え作製を記載している多数の刊行物が存在し、任意のそのような方法が、当業者によって、分裂生体分子コンジュゲートの作製のために使用され得る。そのような概説の例は、Misawa,S.,et al.,Biopolymers 51(1999)297-307；Lilie,H.,Curr.Opin.Biotechnol.9(1998)497-501；Hockney,R.C,Trends Biotechnol.12(1994)456-463である。
もう一つの態様において、生体分子コンジュゲートは、発現ベクターからの発現により細胞内で作製される。ベクターを細胞へ導入する方法は、当業者に周知であり、本発明における使用のために包含され、ウイルスにより媒介される機序、裸のDNA機序、直接DNA注射等を含む。
本発明に係る薬理学的組成物は、その他の処置と併せて使用されてもよく、例えば、分裂生体分子コンジュゲートが癌の処置のために使用される場合、薬学的組成物は、例えば、他の任意の抗癌療法、化学療法、および／または抗血管形成処置と共に投与され得る。分裂生体分子コンジュゲートが病原体の処置のために使用される場合には、薬学的組成物は、例えば、一つまたは複数の他の抗ウイルス剤等と共に投与され得る。
本発明の実施において有用な一般技術のさらなる同化のため、実務者は、細胞生物学、組織培養における標準的な教科書および概説を参照することができる。分子細胞生化学における一般の方法は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd Ed.(Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001)；Short Protocols in Molecular Biology,4th Ed.(Ausubel et al.eds.,John Wiley & Sons 1999)；Protein Methods(Bollag et al.,John Wiley & Sons 1996)；Nonviral Vectors for Gene Therapy(Wagner et al.eds.,Academic Press 1999)；Viral Vectors(Kaplift & Loewy eds.,Academic Press 1995)；Immunology Methods Manual(I.Lefkovits ed.,Academic Press 1997)；およびCell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)のような標準的な教科書に見出され得る。本開示において言及された遺伝子操作のための試薬、クローニングベクター、およびキットは、BioRad、Stratagene, Invitrogen, Sigma-AldrichおよびClonTechのような供給元から市販されている。
以下の実施例は、本発明を作成し使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、本発明者らが本発明と見なすものの範囲を限定するためのものではないし、下記の実験が実施された全てのまたは唯一の実験であることを表すためのものでもない。使用された数字（例えば、量、温度等）に関しては正確さを確実にする努力がなされたが、いくつかの実験誤差および偏差は斟酌されるべきである。他に示さない限り、部分は重量部分であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。
本明細書において引用された全ての刊行物および特許出願が、あたかも個々の刊行物または特許出願が各々参照により組み入れられると特別に個々に示すかのように、参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、本発明の実施のための好ましいモードを含むことが本発明者らにより見出された、または提案された特定の態様に関して記載された。本発明の開示を考慮すれば、本発明の意図された範囲を逸脱することなく、例示した特定の態様において多数の修飾および変化がなされ得ることが、当業者により認識されるであろう。例えば、コドン重複性により、タンパク質配列に影響を与えることなく、基礎をなすDNA配列に変化がなされ得る。さらに、生物学的機能的等価性の考慮により、種類的または量的な生物学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造に変化がなされ得る。そのような修飾は、全て、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものとする。
実施例
分裂生体分子コンジュゲートの作製および機能性を証明する例として、急性リンパ性白血病（ALL）細胞、特に、小児急性リンパ性白血病（ALL）細胞を選択的に標的とし死滅させるためのエフェクター分子としてリシンAが使用された。この実施例は、分裂生体分子コンジュゲートの方法および作製の実施例であり、本発明の範囲を限定するためのものではない。
リシンA鎖毒素（RTA）は、リボソームを破壊し（リボトキシン）、標的とされた細胞を急速に死滅させる、高度に効率的な細胞障害性の酵素である（Hartley & Lord, 2004；Bigalke & Rummel, 2005）。RTAは、267アミノ酸の球状タンパク質であり、3ドメイン構造を有し（図2）、ドメインの配置は三層サンドイッチ（Weston et al., 1994；Bigalke & Rummel, 2005）に類似している。ドメインI（およそ120アミノ酸）は数個のβシートにより形成されている。それは、ループにより、少数のaヘリックスにより形成されたドメインIIに接続されており、これらの二つのドメインにより、RTA小球の中央における間隙として、ヌクレアーゼ活性部位が形成される。ドメインIIIは、毒性には必要でない、リシンB鎖（RTB）との界面の役割を果たす。従って、ドメインIおよびII［またはドメインIならびに（IIおよびIII）］に相当する二つの不活性タンパク質断片から機能性のRTAが再組み立てされる可能性が高い。重要なこととして、RTAは、大腸菌において組換えタンパク質として入手され得る（Weston et al, 1994）。RTA再組み立てがリボソームにより支持され（Argent et al, 1994）；インビボで、RTAは、部分的に折り畳まれていないタンパク質としてサイトゾルに入り、次いで、リボソームにより再折り畳みされるということも重要である。
RTA毒素は、治療研究において既に使用されている（Lord et al, 1994、およびwww.ansci.cornell.edu/plants/toxicagents/ricin/ricin.html#ricmech）。それは、不要細胞に優先的に結合する抗体または増殖因子とRTA鎖をコンジュゲートすることにより、特異的な癌細胞へ標的化され得る。これらの免疫毒素は、インビトロ適用、例えば、骨髄移植において極めて良好に奏効した。それらは多くのインビボ状況においてあまり奏効していないが、この研究分野の進歩は、将来的な見込みを示している。重要なこととして、RTAは（リシンB鎖なしで）単独では細胞に入ることができないため、癌細胞を破壊した後に、それが血流に再進入した場合のRTAの有意な毒性作用を、本発明者らは予想しない。完全に安全にするためには、遊離の細胞外RTAを、対応する抗体の注射による我々のアプローチにおいてブロッキングすることができる（Mantis et al, 2006；Wang et al, 2006）。骨髄移植手法において、RTA免疫毒素は、組織適合性のドナーから採取された骨髄におけるTリンパ球を破壊するために成功裡に使用されている。これは、「移植片対宿主病」（GVHD）と呼ばれる問題である、ドナー骨髄の拒絶を低下させる。ステロイド抵抗性の急性GVHDの状況において、RTA免疫毒素は、状態の軽減を補助した。また、自己骨髄移植においては、患者自身の骨髄の試料が、T細胞白血病およびリンパ腫における悪性T細胞を破壊するために抗T細胞免疫毒素により処置される。従って、リシンは、タンパク質補完アプローチの治療的適用のために使用され得る。分裂リシンA断片の自発的な再組み立てがないことを示すインビトロ実験のため、癌細胞の標的化された死滅のために核酸依存性のリシンA再組み立てを採用することができる大きな可能性が存在する。
急性リンパ性白血病。小児急性リンパ性白血病（ALL）は、癌遺伝子の発現をもたらす異常な遺伝子融合と共に染色体転座により引き起こされる種々の免疫表現型および様々な遺伝的サブタイプを含む不均質の疾患である。小児ALLの原因である最も高頻度の転座のうちの一つがt(12;21)である。
TEL-AML1融合遺伝子。t(12;21)転座は、転写因子遺伝子のETSファミリーのメンバーであるTELの5'部分と、成体型造血幹細胞の形成のマスター制御因子であるコア結合因子のαサブユニットをコードするもう一つの転写因子遺伝子AMLlのほぼ全コーディング領域とを含む遺伝子融合体を作出する（図3）。キメラTEL-AML1転写因子は、TELの必須のタンパク質間相互作用ドメイン、ならびにAML1のDNA結合ドメインおよび翻訳制御配列を保持している。TEL-AML1融合タンパク質の顕著な作用は、AML1がコアエンハンサー配列と呼ばれるDNA領域に結合した場合に通常開始する転写活性の阻害である。異常なTEL-AML1融合タンパク質は、コアエンハンサー配列に結合することができるが、転写を活性化するのではなく、ヒストンデアセチラーゼを動員し、それが、クロマチン構造の閉鎖を誘導し、従って転写の阻害を誘導する。
実施例において、本発明者らは、リシンA再組み立てのための足場として働くTEL-AMLlのRNAを標的とする（図1）。このRNAは、発癌性の染色体転座の結果としてALL細胞にのみ存在するであろうことに注意すること。しかし、細胞周期中にはALL RNAが発現されない時間が存在し、従って、少数の癌細胞が毒素の殺傷作用を回避し得る場合もある。反復的な処置が、この問題を軽減し得る。もう一つの別法は、TEL-AML1遺伝子を足場として使用した毒素の再組み立てである。
実施例において、本発明者らは、また、核送達と比較して薬物の細胞質送達が容易であること、そして相補的なオリゴヌクレオチドによるRNA標的化の単純さを考慮して、毒素のRNAに基づく再組み立てに焦点を当てる。しかし、この戦略の遺伝子標的化スキームも可能性が高い。ただし、それは、一般的でない二重鎖DNA侵入オリゴマー（偽相補PNA5；Demidov et al., 2002）を必要とし、特別な核送達媒体がこの場合には必要とされるであろう。
実施例1
リシンのA鎖を二つの断片へ遺伝学的に切開し、インテインとの融合体として細菌においてクローニングする
実験の最初の部分は、リシンAの二つの断片をクローニングすることを含む。リシンA配列は、pKK223-3におけるクローン（Dr.Vitetta, Univ of Texasからの寄贈）として入手可能である。それはB鎖を含まないリシンのA鎖のみであるため、有意な毒性、またはこのプラスミドもしくはタンパク質産物を扱うことによるリスクは存在しない。このプラスミドから、本発明者らは、PCRを使用してリシンA断片を増幅した。PCR産物はインテインとのC末端融合体としてTwinベクター（NE Biolabs）へクローニングされる。分裂RTA遺伝子は、相当するタンパク質断片が、オリゴヌクレオチドとの化学的付着を促進するためのCまたはN末端のシステインを保持するように設計されている。組換えプラスミドの正確な構築は、全ての必要なタンパク質発現要素（プロモーター、開始／終止コドン、およびタンパク質をコードする遺伝子）が相互に正確なフレームにある正しい配列を有していることをチェックするために配列決定により確証されるべきである。
リシンA分子の切開に関するデータが入手可能でないため、本発明者らは、単独では再会合しない二つの補完タンパク質断片をもたらす分裂部位を見出すため、数種の切開を試験した。3D RTA構造（図2）に基づき、提案される分裂部位のうちの一つは、ドメインI-II間ループにあるであろう（中央位およそ120aa）。RTAの二次構造は、図4に概略的に示す。この構造に基づき、その他の二つのRTA分裂点が実行可能である：タンパク質のN末端部分の大ループ内の52aa位およびタンパク質のヘリックスC末端部分に位置する159aa位。これらのオルタナティブな分裂点は、いずれも、非構造領域に位置しており、分裂は、タンパク質の1/3および2/3を作成する二つの断片をもたらす。全ての分裂スキームが、付着したALL特異的オリゴヌクレオチドおよび対照の非特異的核酸の存在下で、自己再組み立ての欠如およびバックグラウンド活性に関して試験されるであろう。
リシンAの最適な分裂は、構造的なコンフォメーションを査定し、オルタナティブな分裂点を査定することにより決定され得、数回のクローニングの試みを必要とする可能性もあるが、全体の目的は、自発的な再組み立てはもたらさないが、相補的な核酸相互作用により容易にされる再組み立てについては効率的であるようなリシンA断片を達成することである。さらに、それは、リシンA自己組み立てを低下させるための変異の導入を必要とする可能性がある。
全長RTAをコードするプラスミドpRTA（Univ.of Texas SW Medical Centerより入手された）を、6個のRTA遺伝子断片全てを入手するためのPCR鋳型として使用し（図2）；そのようにして入手したRTA遺伝子断片を、インテインとの融合体としてpTWINベクターに挿入し、対応するプラスミドを大腸菌XL10クローニング宿主細胞内でまず増殖させ、次いで、IPTG誘導可能な大腸菌BL21-DE3発現宿主細胞へ移した。
実施例2
末端システインを介したプローブ（この実施例において、プローブはオリゴヌクレオチドである）のRTAタンパク質断片への付着、ならびにインテインの分裂およびタンパク質-オリゴヌクレオチドコンジュゲートの精製を同時に行うこと
本発明者らは、タンパク質融合体を大腸菌において発現させ、キチンビーズを有するカラムへの負荷およびインテインからのオンカラム分裂により可溶性細胞画分から単離した。分裂は、5'末に偽システインを有するオリゴヌクレオチドの存在下で実施される（Burbulis et al., 2005）。修飾されたオリゴヌクレオチドの存在下でのインテイン-リシンキメラ分裂のスキームを、図5に示す。タンパク質の精製およびコンジュゲーションの両方を達成することを同時に可能にするため、これは、タンパク質-オリゴヌクレオチドコンジュゲーションのための魅力的な化学である。しかし、これは少数のグループにより試験された非常に新しいコンジュゲーションアプローチであり、タンパク質の再折り畳みを必要とし、そのことが問題となり得る。従って、別のコンジュゲーション化学が実施されてもよい。
粗細胞タンパク質調製物の分析は、N2nおよびC2nの発現の例を示している図2に示すように、異なる分裂RTA-インテイン融合体をコードするプラスミドにより形質転換された全ての大腸菌BL21-DE3クローンのIPTG誘導が、異なる温度で誘導された場合に、対応するタンパク質の過剰発現をもたらすことを示した。
しかしながら、タンパク質のうちのいくつかは、不溶性画分へと過剰発現され、不活性の封入体を形成することが見出された。発現された分裂エフェクタータンパク質断片が封入体を形成する場合、分裂エフェクタータンパク質断片は、本明細書に開示するような、無細胞系、および／または発現されたタンパク質を培養培地中に分泌する大腸菌株を用いた細菌発現系において発現され得る。
分裂エフェクタータンパク質断片が、不溶性画分に示されるような封入体を形成した場合（図9）、本発明者らは、分裂エフェクタータンパク質断片の成功した再折り畳みのために以前に本明細書において利用されたようなドロップバイドロップ（drop-by-drop）希釈法を使用して、不溶性画分から（封入体として）採集された分裂エフェクタータンパク質断片を再折り畳みするため、尿素溶液を使用した可溶化を実施した。この方法を使用して、本発明者らは、封入体から分裂EGPP-インテイン1融合タンパク質断片を可溶化した。本発明者らは、この可溶化の方法が、N1n-RTA分裂エフェクタータンパク質断片の封入体に対し有効であること、および図11に示すようなその後のキチンカラムにおける単離／精製も証明した。
ALL疾患の主要なTEL-ALM1の場合の標的RNA部位を、図6に示す。二つの15〜20nt長のオリゴヌクレオチドがブレークポイントの両側から選ばれ、5'偽シスチン修飾を含んで合成される。この修飾は、オリゴヌクレオチドをタンパク質断片と連結するための官能基を提供する（Burbulis et al, 2005）。オリゴヌクレオチドは、任意の入手可能な供給元（例えば、Dalton Chem Lab Inc.Ontario, Canada）より購入され得る。適切なオリゴヌクレオチドを選ぶことにより、TEL-AML1ブレークポイントおよび融合配列の可能性のある個体差が容易に調整され得ることに注意すること。
分裂RTA-インテイン融合体の発現は、タンパク質再折り畳みが必要な封入体の形成をもたらす可能性もある。タンパク質再折り畳みは、悪名高く困難な技術であり；従って、RTA断片の正確な折り畳みの最適化が必要である可能性もある。
実施例3
分裂再組み立てリシンAのインビトロの機能的活性
リシン活性は、モデルステムループオリゴヌクレオチドまたは28S rRNAにおける特異的なアデニンの脱プリン化をもたらす。脱プリン化されたオリゴまたはRNAは、化学的に二つの断片へ分裂させられ得、その相対量が、リシン活性を定量的に測定することができる。リシン分裂可能ステムループRNAオリゴヌクレオチドおよび／または洗浄されたリボソームの使用は、リシンのヌクレアーゼ活性を試験するための便利な基質である（Argent et al, 2000；Garcia-Mayoral et al, 2005）。試験試料は、ALLマーカーRNAに結合したオリゴヌクレオチドが添付された毒素断片からなる。完全なRTAが陽性対照としてはたらき、オリゴヌクレオチドが添付されていない毒素断片、およびオリゴヌクレオチドは添付されているがALLマーカーRNAを含まない毒素断片が、陰性対照として働く。付加的な陰性対照は、補完複合体の全ての成分に加えて非特異的RNAを含む。RTAを含有している試験試料および対照試料による処理の後、脱プリン化されたオリゴヌクレオチドまたは28S rRNAが、アニリンにより、二つの特徴的なRNA断片へと切断され、それがポリアクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動により分離され得る（Argent et al, 2000）。
陰性対照のうちのいくつかが高いバックグラウンドリシン活性を示す場合には、バックグラウンドを可能な限り低く低下させることを試みて、リシン断片へのオリゴヌクレオチド付着の別の変異体が試験され得る。第一の選択として、オリゴヌクレオチドは、N末端断片のC末端およびC末端断片のN末端に付着させられる。これが高いバックグラウンドをもたらす場合には、両方のオリゴヌクレオチドを両方のペプチドのC末端に付着させることができる。分裂EGFPの再構築による我々の経験に基づき、別のスキームは、タンパク質再組み立てのより低いバックグラウンドをもたらし得る。
これらのインビトロ研究は、最適な構築物（分裂点、RTA断片の配置、コンジュゲーション化学）を選ぶことを可能にし、分裂再組み立てRTAの予想される作用機序を確証することも可能にする。
細胞内のオリゴヌクレオチドの生物学的安定性（Biostability）が問題になる場合；修飾されたヌクレアーゼ抵抗性オリゴヌクレオチドまたはPNAまたはpcPNA（Demidov et al, 1994）が使用されてもよい（Cys反応性SMCC PNAは市販されている）。
28S rRNA内の公知のRTA分裂可能配列に基づき、より高速のRTAにより生じる切断のため、ループ領域にrAの代わりにdAを保持している、RTA標的部位を有する短い34ntステムループRNAが設計された（そのような交換は、RTA作用を有意に加速することが公知である）。図12は、このRNAが、RTA活性回復のゲル電気泳動に基づく高速試験のために使用され得ることを示す：特定の時間にわたる分裂再組み立て毒素処置により生じた二つのRNA断片の相対量は、完全なリシンAのものと比較された場合、インビトロのリシンA活性の定量的尺度になるであろう。
本発明者らがRTAの分裂のため選択した分裂部位は、活性、即ち、N末端N1n-RTAのためのRNA切断活性をもたらさなかったが、それは、この分裂エフェクタータンパク質断片がRTA活性部位を含むアミノ酸を有しないためである。さらに、N1n-RTAおよびC1n-RTAが単純に一緒に混合された場合、RTA活性、即ち、RNA切断活性は起こらず、従って、そのようなRTA分裂エフェクタータンパク質断片は、機能的な再組み立ておよび活性エフェクターRTAタンパク質の形成のために、標的により媒介されるタンパク質補完を必要とすることが示された。
半分のRTAタンパク質とコンジュゲートされた化学的かつ生物学的に安定的な核酸塩基オリゴマーとしてCys末端ペプチド核酸（PNA）オリゴマーを使用して、本発明者らは、PNAオリゴマーをコンジュゲートするための周知のCu2+-フェナントロリン（Cu/Phe）に基づくタンパク質カップリング化学の適当性を査定した。Cu/Pheで処理されたCys-PNAにより、本発明者らは、分解なしの、これらのオリゴマーの迅速な定量的な二量体化を観察したが、一般的なオリゴヌクレオチドはCu/Phe試薬により分解される。この結果は、Cu/Pheカップリング化学が、Cys-PNAのCys末端分裂RTAタンパク質とのコンジュゲーションのために適用され得ることを証明している。本発明者らは、第一の点において分裂したRTAの再組み立ての効率の査定のため、N1n-RTAのC1n-RTAとのコンジュゲーションのためにこの化学を使用した（図7）。または、Cys-PNAは、MESNAに基づく化学およびインテイン2とのC末端タンパク質融合を使用して、オンカラムインテイン切断の間に、末端において活性化された分裂RTAタンパク質へコンジュゲートされてもよい。
本発明者らは、コンジュゲーション化学を使用した、いくつかの分裂RTAタンパク質の分析により証明されるような、分裂エフェクタータンパク質断片の機能的な再組み立てを同定するためのインビトロアッセイも開発した。このアッセイは、プローブ、例えば、オリゴヌクレオチドプローブのような核酸プローブまたはポリペプチドプローブにコンジュゲートされた分裂エフェクタータンパク質断片の機能的な再組み立てのために利用され得る。
実施例4
細胞レベルでの機能性試験のため、二つの補完タンパク質-オリゴヌクレオチド構築物は、標的細胞（例えば、ALLヒト細胞）に注射することができる
健康細胞およびプラセボを注射されたALL細胞が対照として働く。生存率の推定は、細胞および独立実験の統計的に有意な数を提供する。特に、二つのヒトALL細胞系が研究において使用される；t(12;21)転座およびTEL/AML1融合を含有しているB系統ALLであるREH（ATTC Cal No.CRL-8286）、およびt(12;21)またはTEL/AML1融合を有していないNALM6 B系統ALL（DSMZ Cat No.ACC 128）。さらに、初代ALL細胞および以前に記載されたようなMTTアッセイ（Holleman et al, 2004；Lugthart et al, 2005）が、生存率を決定するために使用され、初期および後期アポトーシスがFACS分析により決定される。融合体毒素の最適な曝露時間および濃度は、ヒトALL細胞系、ならびにTEL/AML1融合を有する、および有しない初代ALL細胞を使用した細胞アッセイにおいて試験され得る。
インビボの毒性／効力は、対照ベクターまたはTEL-AML1融合遺伝子を含有しているベクター（Fisher et al, 2005）によりレトロウイルスにより形質導入された骨髄を移植されたマウスを使用することにより査定され得る。
生体分子コンジュゲートの成功したインビトロおよびインビボの査定の後、分裂RTA-オリゴヌクレオチドコンジュゲートのカプセル剤が、新薬の候補型として開発され得る（薬物から細胞質への送達媒体としての、薬物を負荷されたポリマー性ナノ粒子またはカチオン性リポソーム）。次いで、血清中でのそれらの安定性の査定の後、それらは、細胞において試験され得、最終的には、関心対象の疾患の動物モデル、例えば、ALL疾患モデルにおいて試験され得る。
この戦略の遺伝子標的化スキームも、将来の強力な別法として開発され得る。この将来の開発に基づき、新生児における前癌細胞を根絶するための防止的なアプローチが確立される可能性がある。
本発明者らは、特に、標的RNAの存在下での、コンジュゲートされていないタンパク質およびコンジュゲートされたタンパク質のインビトロおよびインビボの活性／再組み立て試験を含む、N1n-RTA／C1n-RTA分裂エフェクタータンパク質断片対を分析した。本発明者らは、可溶性発現を増加させ、封入体からの分裂RTAタンパク質の再折り畳みの方法を開発するため、細胞増殖条件を変動させることにより、他の分裂RTAタンパク質のためのタンパク質発現も最適化した。
参考文献
本明細書中に引用された参考文献は、参照により本明細書に組み入れられる。
Figure 2010509194
Figure 2010509194
Figure 2010509194

Claims (157)

  1. 分裂エフェクター分子を含む分裂生体分子コンジュゲートであって、分裂エフェクターポリペプチド断片が標的核酸または標的ポリペプチドに特異的な少なくとも二つのプローブのうちの一つにコンジュゲートされており、標的核酸または標的ポリペプチドが疾患、悪性病変、または障害に罹患している細胞に存在し、標的の核酸またはポリペプチドとのプローブの結合がエフェクター分子を再構成し、かつエフェクター分子が細胞に対して致死性であり；かつ／またはもう一つの化合物に対して細胞を感作し；かつ／または疾患、悪性病変、もしくは障害を軽減する、分裂生体分子コンジュゲート。
  2. 分裂エフェクター分子がエフェクター分子の少なくとも二つのポリペプチド断片を含み、該断片が、（a）活性化されたコンフォメーションで存在し；（b）単独では活性でなく；（c）さらにプローブを含み；かつ（d）標的の核酸またはポリペプチドの存在下でリアルタイムで活性エフェクター分子を再構成するよう補完する、請求項1記載の分裂生体分子コンジュゲート。
  3. a．分裂エフェクター分子を含む請求項1記載の分裂生体分子コンジュゲートの薬学的組成物の有効量の、対象への投与であって、分裂エフェクターポリペプチド断片の各々が、疾患または障害に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドに特異的な二つのプローブのうちの少なくとも一つにコンジュゲートされている、投与；および
    b．疾患または障害に関連している標的核酸または標的ポリペプチドと少なくとも二つのプローブが結合することにより促進される、活性エフェクター分子の形成
    を含む、対象における疾患もしくは障害を処置するまたはその影響を低減する方法。
  4. 分裂エフェクター分子が毒素分子またはその断片である、請求項1および3のいずれか一項記載の方法。
  5. 毒素分子が免疫毒素またはその断片である、請求項4記載の方法。
  6. 免疫毒素がタンパク質毒素である、請求項5記載の方法。
  7. タンパク質毒素が細菌毒素である、請求項6記載の方法。
  8. タンパク質毒素が植物毒素である、請求項6記載の方法。
  9. 植物毒素が植物完全毒素またはクラスIIリボソーム不活性化タンパク質である、請求項8記載の方法。
  10. 植物毒素が植物血液毒またはクラスIリボソーム不活性化タンパク質である、請求項8記載の方法。
  11. 細菌毒素が、炭疽毒素；ジフテリア毒素（DT）；シュードモナス内毒素（PE）；ストレプトリジンO；またはそれらの天然に存在する変異体もしくは遺伝子操作された変異体もしくは断片を含む群より選択される、請求項7記載の方法。
  12. 植物完全毒素が、サポリン（SAP）；アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（PAP）；ブリオジン1；ブーガニン（bouganin）、およびゲロニン、またはそれらの天然に存在する変異体もしくは遺伝子操作された変異体もしくは断片を含む群より選択される、請求項9記載の方法。
  13. 植物血液毒が、リシンA鎖（RTA）；リシンB（RTB）；アブリン；ヤドリギ、レクチン、およびモデシン、またはそれらの天然に存在する変異体もしくは遺伝子操作された変異体もしくは断片を含む群より選択される、請求項10記載の方法。
  14. 植物毒素がリボトキシンである、請求項8記載の方法。
  15. リボトキシンがリシンA鎖（RTA）である、請求項14記載の方法。
  16. 植物毒素がヌクレアーゼである、請求項8記載の方法。
  17. ヌクレアーゼがサルシン；リストリクトシン（restrictocin）を含む群より選択される、請求項16記載の方法。
  18. 毒素分子が細胞障害性分子である、請求項4記載の方法。
  19. 細胞障害性分子がサイトカインである、請求項14記載の方法。
  20. サイトカインが、IL-1；IL-2；IL-3；IL-4；IL-13；インターフェロンアルファ；腫瘍壊死因子アルファ（TNFα）；IL-6；顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）；GM-CSF、またはそれらの天然の変異体もしくは遺伝子操作された変異体を含む群より選択される、請求項15記載の方法。
  21. エフェクター分子がヌクレアーゼであるか、またはヌクレオチド鎖切断活性を有する、請求項1および3のいずれか一項記載の方法。
  22. ヌクレアーゼがDNAヌクレアーゼまたはDNAエンドヌクレアーゼである、請求項17記載の方法。
  23. DNAヌクレアーゼが、DNAエンドヌクレアーゼI；またはその天然の変異体もしくは遺伝子操作された変異体を含む群より選択される、請求項18記載の方法。
  24. ヌクレアーゼがRNAヌクレアーゼまたはRNAエンドヌクレアーゼである、請求項21記載の方法。
  25. RNAヌクレアーゼがRNAエンドヌクレアーゼI；RNAエンドヌクレアーゼII；RNAエンドヌクレアーゼIIIを含む群より選択される、請求項24記載の方法。
  26. RNAヌクレアーゼがアンジオゲニンである、請求項24記載の方法。
  27. RNAヌクレアーゼがダイサーである、請求項24記載の方法。
  28. RNAヌクレアーゼがRNaseAである、請求項24記載の方法。
  29. 分裂エフェクター分子がタンパク質分解酵素である、請求項1および3のいずれか一項記載の方法。
  30. タンパク質分解酵素が、カスパーゼ酵素；カルパイン酵素；カテプシン酵素；エンドプロテアーゼ酵素；グランザイム；マトリックスメタロプロテアーゼ；ペプシン；プロナーゼ；プロテアーゼ；プロテイナーゼ；レンニン；トリプシンを含む群より選択される、請求項29記載の方法。
  31. 分裂エフェクター分子が細胞において細胞死経路を誘導することができる、請求項1および3のいずれか一項記載の方法。
  32. 分裂エフェクター分子がアポトーシス促進性分子である、請求項1および3のいずれか一項記載の方法。
  33. アポトーシス促進性分子が、Hsp90；TNFα；DIABLO；BAX；Bcl-2の阻害剤；Bad；ポリADPリボースポリメラーゼ-1（PARP-1）：第二ミトコンドリア由来カスパーゼアクチベーター（SMAC）；アポトーシス誘導因子（AIF）；Fas（Apo-1またはCD95としても公知）；Fasリガンド（FasL）を含む群より選択される、請求項32記載の方法。
  34. 分裂エフェクター分子が、細胞において細胞死経路を阻害するかまたは細胞生存経路を誘導することができる、請求項1および3のいずれか一項記載の方法。
  35. エフェクター分子が抗アポトーシス分子である、請求項1および3のいずれか一項記載の方法。
  36. 抗アポトーシス分子が、bcl-2；Bcl-XL；Hsp27；アポトーシス阻害（IAP）タンパク質を含む群より選択される、請求項35記載の方法。
  37. エフェクター分子が、一つまたは複数の二次的な因子に対して細胞を感作する分子またはポリペプチドである、請求項1および3のいずれか一項記載の方法。
  38. 二次的な因子が、オセルタミビル；アロプリノールを含む群より選択される抗ウイルス薬である、請求項37記載の方法。
  39. 細胞を感作するポリペプチドが、β-グルクロニダーゼ；ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；β-ラクタマーゼ；カルボキシルエステラーゼHCE1；ペルオキシダーゼ酵素を含む群より選択される、請求項38記載の方法。
  40. エフェクター分子が、タンパク質分解のため標的ポリペプチドにタグ付加する分子である、請求項1および3のいずれか一項記載の方法。
  41. 分子が、ユビキチン；低分子ユビキチン関連修飾因子（SUMO）；DNAメチルトランスフェラーゼ（DNA MTase）；ヒストンアセチル化酵素（HAT）を含む群より選択される、請求項40記載の方法。
  42. 疾患または障害が、病態を引き起こす核酸によるものである、請求項3記載の方法。
  43. 疾患または障害が、癌；神経疾患；変性疾患；炎症性疾患；病原体感染を含む群より選択される、請求項3記載の方法。
  44. 癌が、間葉系起源（肉腫）；繊維肉腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；軟骨肉腫；骨原性肉種；血管肉腫；内皮肉腫（endotheliosarcoma）；リンパ管肉腫；滑膜肉腫；中皮肉腫（mesotheliosarcoma）；ユーイング腫瘍；骨髄性白血病；単球性白血病；悪性白血病；リンパ性白血病；形質細胞腫；平滑筋肉腫；および横紋筋肉腫；上皮起源の癌（癌腫）；扁平上皮または表皮癌；基底細胞癌；汗腺癌；皮脂腺癌；腺癌；乳頭癌；乳頭状腺癌；嚢胞腺癌；髄様癌；未分化癌（単純癌（simplex carcinoma））；気管支原性肺癌；気管支癌；黒色腫；腎細胞癌；肝細胞癌；胆管癌；移行上皮癌；扁平上皮癌；絨毛癌；精上皮腫；胚性癌腫；悪性奇形腫；および奇形癌腫；白血病；急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄芽球性白血病、骨髄単球性白血病；単球性白血病、および赤白血病）；慢性白血病；慢性骨髄性（顆粒球性）白血病；慢性リンパ性白血病；真性赤血球増加症；リンパ腫；ホジキン病；非ホジキン病；多発性骨髄腫；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；重鎖病を含む群より選択される、請求項43記載の方法。
  45. 癌がリンパ腫；白血病；肉腫；腺腫である、請求項44記載の方法。
  46. 癌が急性リンパ芽球性白血病（ALL）である、請求項43記載の方法。
  47. 疾患が神経学的な疾患または障害である、請求項3記載の方法。
  48. 神経疾患が、アルツハイマー病；パーキンソン病；ハンチントン病；ポリグルタミン病；筋萎縮性側索硬化症（ALS）を含む群より選択される、請求項47記載の方法。
  49. 疾患が病原体である、請求項3記載の方法。
  50. 病原体が、インフルエンザ、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、または酵母を含む群より選択される、請求項49記載の方法。
  51. 病原体がウイルスである、請求項49記載の方法。
  52. 疾患が疾患に対する遺伝的素因である、請求項3記載の方法。
  53. 対象が哺乳類である、請求項3記載の方法。
  54. 哺乳類がヒトである、請求項53記載の方法。
  55. 細胞がインビボである、請求項1記載の方法。
  56. 細胞が対象から入手され、かつエクスビボで薬学的組成物を投与される、請求項3記載の方法。
  57. 細胞が対象内へ移植により戻される、請求項56記載の方法。
  58. 分裂生体分子コンジュゲートが封入体により生成される、請求項1および3のいずれか一項記載の方法。
  59. 分裂生体分子コンジュゲートが封入体により生成される、請求項1および3のいずれか一項記載の方法。
  60. 分裂生体分子コンジュゲートが、ポンプ；直接注射；局所適用；皮内、皮下を介した対象への投与；静脈内；リンパ内；節内（intranodal）；粘膜内、または筋肉内の投与を含む群により細胞に投与される、請求項3記載の方法。
  61. 分裂生体分子コンジュゲートが、前負荷されたポリマー性ナノ粒子および／またはカチオン性リポソームにより細胞に投与される、請求項3記載の方法。
  62. 核酸結合モチーフにコンジュゲートされた分裂エフェクター分子が、前記細胞内で発現ベクターから発現される、請求項1記載の方法。
  63. ベクターが従来の手段により細胞へ導入される、請求項62記載の方法。
  64. ベクターがエフェクター分子を含む、請求項63記載の方法。
  65. 標的核酸が、病態を引き起こす標的核酸配列を含む、請求項1および3のいずれか一項記載の方法。
  66. 標的核酸がDNAである、請求項1および3のいずれか一項記載の方法。
  67. 標的核酸がRNAである、請求項1および3のいずれか一項記載の方法。
  68. 病態を引き起こす標的核酸配列が病原性RNAを含む、請求項65記載の方法。
  69. 病態を引き起こす標的核酸配列が病原性DNAを含む、請求項65記載の方法。
  70. 病原性DNAが少なくとも一つの変異および／または多型を含む、請求項69記載の方法。
  71. 病態を引き起こす標的核酸配列が病原体のDNAまたはRNAを含む、請求項65記載の方法。
  72. 病原体のDNAまたはRNAがウイルス起源のものである、請求項71記載の方法。
  73. ウイルスが、AIDS/HIV；トリインフルエンザ；SARS；A型肝炎；B型肝炎；C型肝炎；インフルエンザ；水痘；アデノウイルス、HSV-2；HSV-II；牛疫ライノウイルス；エコーウイルス；ロタウイルス；呼吸器多核体ウイルス；パピローマウイルス；パポーバウイルス；サイトメガロウイルス；エキノウイルス（echinovirus）；アルボウイルス；ハンタウイルス；コクサッキーウイルス；麻疹ウイルス；流行性耳下腺炎ウイルス；風疹ウイルス；ポリオウイルス；HIV-I、HIV-II；トリおよび／または鳥類インフルエンザウイルス；エボラウイルス；その他のウイルスを含む群より選択される、請求項72記載の方法。
  74. 標的ポリペプチドが病原性ポリペプチドを含む、請求項1および2のいずれか一項記載の方法。
  75. 病原性ポリペプチドが、正常な非病原性ポリペプチドに対して異常なコンフォメーションを有する、請求項74記載の方法。
  76. 細胞がインビトロおよびインビボである、請求項1記載の方法。
  77. 細胞がインビボである、請求項1記載の方法。
  78. プローブが核酸結合モチーフである、請求項1および3のいずれか一項記載の方法。
  79. 核酸結合モチーフが、DNA、RNA、PNA、LNA、pcPNA、DNA結合タンパク質、RNA結合タンパク質、またはそれらのアナログもしくは断片を含む群より選択される、請求項78記載の方法。
  80. プローブがポリペプチド検出タンパク質（detector protein）である、請求項1および3のいずれか一項記載の方法。
  81. ポリペプチド検出タンパク質が少なくとも二つの断片に分裂しており、各断片がエフェクタータンパク質の二つまたはそれ以上の断片にコンジュゲートされており、かつ検出ポリペプチド断片の標的核酸または標的ポリペプチドとの結合が、検出タンパク質および活性エフェクタータンパク質を再構成する、請求項80記載の方法。
  82. ポリペプチド検出タンパク質がマルチドメインポリペプチド検出タンパク質である、請求項80記載の方法。
  83. マルチドメインポリペプチド検出タンパク質の各ドメインがエフェクタータンパク質の二つまたはそれ以上の断片にコンジュゲートされており、かつ検出タンパク質のドメインの標的核酸または標的ポリペプチドとの結合が、検出タンパク質および活性エフェクタータンパク質を再構成する、請求項82記載の方法。
  84. 分裂エフェクター分子を含む細胞死分裂生体分子コンジュゲートであって、分裂エフェクターポリペプチド断片が、二つまたはそれ以上のプローブに各々コンジュゲートされた少なくとも二つのポリペプチド断片を含み、分裂エフェクターポリペプチド断片が、特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、細胞において細胞死経路を開始させることができる活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、細胞死分裂生体分子コンジュゲート。
  85. 腫瘍細胞を細胞死分裂エフェクター分子と接触させることを含む、癌を処置するための、請求項84記載の細胞分裂生体分子コンジュゲートの使用であって、（i）分裂エフェクターポリペプチド断片が、癌障害に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドに特異的なプローブにコンジュゲートされており；かつ（ii）分裂エフェクターポリペプチド断片が、腫瘍に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、使用。
  86. 病原体感染細胞を細胞死分裂エフェクター分子と接触させることを含む、病原体感染を処置するための、請求項84または85記載の細胞死分裂生体分子コンジュゲートの使用であって、（i）分裂エフェクターポリペプチド断片が、病原体感染に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドに特異的なプローブにコンジュゲートされており；かつ（ii）分裂エフェクターポリペプチド断片が、病原体感染に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、使用。
  87. 標的核酸が、病理学的核酸である核酸として同定される、請求項84〜86のいずれか一項記載の細胞死分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  88. 標的ポリペプチドが、病理学的ポリペプチドであるポリペプチドとして同定される、請求項84〜87のいずれか一項記載の細胞死分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  89. 標的核酸または標的ポリペプチドが、病態の作用としての細胞における変化として同定される、請求項84〜88のいずれか一項記載の細胞死分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  90. 標的核酸が癌遺伝子またはプロオンコジーンをコードする、請求項84〜89のいずれか一項記載の細胞死分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  91. 癌遺伝子が、p63；p73；gp40（v-fms）；p21（ras）；p55（v-myc）；p65（gag-jun）；pp60（v-src）；v-abl；v-erb；v-erba；v-fosを含む群より選択される、請求項90記載の細胞死分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  92. 病原体が、インフルエンザ、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、または酵母を含む群より選択される、請求項86〜88のいずれか一項記載の細胞死分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  93. 病原体がウイルスである、請求項84〜93のいずれか一項記載の細胞死分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  94. ウイルスが、AIDS/HIV；トリインフルエンザ；SARS；A型肝炎；B型肝炎；C型肝炎；インフルエンザ；水痘；アデノウイルス、HSV-2；HSV-II；牛疫ライノウイルス；エコーウイルス；ロタウイルス；呼吸器多核体ウイルス；パピローマウイルス；パポーバウイルス；サイトメガロウイルス；エキノウイルス；アルボウイルス；ハンタウイルス；コクサッキーウイルス；麻疹ウイルス；流行性耳下腺炎ウイルス；風疹ウイルス；ポリオウイルス；HIV-I、HIV-II；トリおよび／または鳥類インフルエンザウイルス；エボラウイルス；その他のウイルスを含む群より選択される、請求項84〜93のいずれか一項記載の細胞死分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  95. 標的核酸または標的ポリヌクレオチドが、v-fms；v-myc；v-src；v-abl；v-erb；v-erba；v-fos；M1タンパク質；ウイルス様粒子（VPL）を含む群より選択される、請求項84〜93のいずれか一項記載の細胞死分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  96. エフェクター分子が請求項4〜33および39〜41のいずれか一項記載のエフェクター分子より選択される、請求項84〜95のいずれか一項記載の細胞死分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  97. プローブが請求項79〜84のいずれか一項記載のプローブより選択される、請求項84〜95のいずれか一項記載の細胞死分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  98. 分裂エフェクター分子を含む分解分裂生体分子コンジュゲートであって、分裂エフェクターポリペプチド断片が、二つまたはそれ以上のプローブに各々コンジュゲートされた少なくとも二つのポリペプチド断片を含み、分裂エフェクターポリペプチド断片が、特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、細胞において標的核酸もしくは標的ポリペプチドを分解するかまたはそれらの分解を誘導することができる活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、分解分裂生体分子コンジュゲート。
  99. 腫瘍細胞を細胞死分裂エフェクター分子と接触させることを含む、癌を処置するための、請求項98記載の分解分裂生体分子コンジュゲートの使用であって、（i）分裂エフェクターポリペプチド断片が、癌障害に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドに特異的なプローブにコンジュゲートされており；かつ（ii）分裂エフェクターポリペプチド断片が、腫瘍に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、使用。
  100. 病原体感染細胞を細胞死分裂エフェクター分子と接触させることを含む、病原体感染を処置するための、請求項98記載の分解分裂生体分子コンジュゲートの使用であって、（i）分裂エフェクターポリペプチド断片が、病原体感染に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドに特異的なプローブにコンジュゲートされており；かつ（ii）分裂エフェクターポリペプチド断片が、病原体感染に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、使用。
  101. 病原体感染細胞を細胞死分裂エフェクター分子と接触させることを含む、疾患または障害を処置するための、請求項98記載の分解分裂生体分子コンジュゲートの使用であって（i）分裂エフェクターポリペプチド断片が、病原体感染に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドに特異的なプローブにコンジュゲートされており；かつ（ii）分裂エフェクターポリペプチド断片が、疾患または障害に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、使用。
  102. 標的核酸が、病理学的核酸である核酸として同定される、請求項98〜101のいずれか一項記載の分解分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  103. 標的ポリペプチドが、病理学的ポリペプチドであるポリペプチドとして同定される、請求項98〜101のいずれか一項記載の分解分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  104. 標的核酸または標的ポリペプチドが、病態の作用としての細胞における変化として同定される、請求項98〜101のいずれか一項記載の分解分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  105. 標的核酸が癌遺伝子またはプロオンコジーンをコードする、請求項99記載の分解分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  106. 癌遺伝子が、p63；p73；gp40（v-fms）；p21（ras）；p55（v-myc）；p65（gag-jun）；pp60（v-src）；v-abl；v-erb；v-erba；v-fosを含む群より選択される、請求項105記載の分解分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  107. 病原体が、インフルエンザ、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、または酵母を含む群より選択される、請求項100記載の分解分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  108. 病原体がウイルスである、請求項100記載の分解分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  109. ウイルスが、AIDS/HIV；トリインフルエンザ；SARS；A型肝炎；B型肝炎；C型肝炎；インフルエンザ；水痘；アデノウイルス、HSV-2；HSV-II；牛疫ライノウイルス；エコーウイルス；ロタウイルス；呼吸器多核体ウイルス；パピローマウイルス；パポーバウイルス；サイトメガロウイルス；エキノウイルス；アルボウイルス；ハンタウイルス；コクサッキーウイルス；麻疹ウイルス；流行性耳下腺炎ウイルス；風疹ウイルス；ポリオウイルス；HIV-I、HIV-II；トリおよび／または鳥類インフルエンザウイルス；エボラウイルス；その他のウイルスを含む群より選択される、請求項108記載の分解分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  110. 標的核酸または標的ポリヌクレオチドが、v-fms；v-myc；v-src；v-abl；v-erb；v-erba；v-fos；M1タンパク質；ウイルス様粒子（VPL）を含む群より選択される、請求項100記載の分解分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  111. 疾患または障害が病理学的ポリペプチドの発現に関連している、請求項101記載の分解性分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  112. 病理学的ポリペプチドが、変異型ポリペプチドおよび／または不正確に折り畳まれたポリペプチドである、請求項113記載の分解分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  113. 疾患が、神経疾患；腎疾患；心血管疾患；肝疾患；炎症性疾患；嚢胞性繊維症；神経変性疾患；炎症性疾患；免疫障害を含む群より選択される、請求項112記載の分解分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  114. 神経疾患が、アルツハイマー病；ハンチントン病；パーキンソン病；筋萎縮性側索硬化症（ALS）、脊椎損傷を含む群より選択される、請求項113記載の分解分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  115. エフェクター分子が請求項21〜28および40〜41のいずれか一項記載のエフェクター分子より選択される、請求項98〜101のいずれか一項記載の分解分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  116. プローブが請求項79〜84のいずれか一項記載のプローブより選択される、請求項98〜101のいずれか一項記載の分解分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  117. 分裂エフェクター分子を含む感作分裂生体分子コンジュゲートであって、分裂エフェクターポリペプチド断片が、二つまたはそれ以上のプローブに各々コンジュゲートされた少なくとも二つのポリペプチド断片を含み、分裂エフェクターポリペプチド断片が、特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、他の二次的な因子に対して細胞を感作することができる活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、感作分裂生体分子コンジュゲート。
  118. 腫瘍細胞を細胞死分裂エフェクター分子と接触させることを含む、癌を処置するための、請求項117記載の感作分裂生体分子コンジュゲートの使用であって、（i）分裂エフェクターポリペプチド断片が、癌障害に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドに特異的なプローブにコンジュゲートされており；かつ（ii）分裂エフェクターポリペプチド断片が、腫瘍に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、使用。
  119. 病原体感染細胞を細胞死分裂エフェクター分子と接触させることを含む、病原体感染を処置するための、請求項117記載の感作分裂生体分子コンジュゲートの使用であって、（i）分裂エフェクターポリペプチド断片が、病原体感染に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドに特異的なプローブにコンジュゲートされており；かつ（ii）分裂エフェクターポリペプチド断片が、病原体感染に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、使用。
  120. 標的核酸が、病理学的核酸である核酸として同定される、請求項117〜119のいずれか一項記載の感作分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  121. 標的ポリペプチドが、病理学的ポリペプチドであるポリペプチドとして同定される、請求項117〜119のいずれか一項記載の感作分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  122. 標的核酸または標的ポリペプチドが、病態の作用としての細胞における変化として同定される、請求項117〜119のいずれか一項記載の感作分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  123. 標的核酸が癌遺伝子またはプロオンコジーンをコードする、請求項116記載の感作分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  124. 癌遺伝子が、p63；p73；gp40（v-fms）；p21（ras）；p55（v-myc）；p65（gag-jun）；pp60（v-src）；v-abl；v-erb；v-erba；v-fosを含む群より選択される、請求項123記載の感作分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  125. 病原体が、インフルエンザ、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、または酵母を含む群より選択される、請求項119記載の感作分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  126. 病原体がウイルスである、請求項119記載の感作分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  127. ウイルスが、AIDS/HIV；トリインフルエンザ；SARS；A型肝炎；B型肝炎；C型肝炎；インフルエンザ；水痘；アデノウイルス、HSV-2；HSV-II；牛疫ライノウイルス；エコーウイルス；ロタウイルス；呼吸器多核体ウイルス；パピローマウイルス；パポーバウイルス；サイトメガロウイルス；エキノウイルス；アルボウイルス；ハンタウイルス；コクサッキーウイルス；麻疹ウイルス；流行性耳下腺炎ウイルス；風疹ウイルス；ポリオウイルス；HIV-I、HIV-II；トリおよび／または鳥類インフルエンザウイルス；エボラウイルス；その他のウイルスを含む群より選択される、請求項126記載の感作分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  128. 標的核酸または標的ポリヌクレオチドが、v-fms；v-myc；v-src；v-abl；v-erb；v-erba；v-fos；M1タンパク質；ウイルス様粒子（VPL）を含む群より選択される、請求項128記載の感作分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  129. エフェクタータンパク質が、β-グルクロニダーゼ；ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；β-ラクタマーゼ；カルボキシルエステラーゼHCE1；ペルオキシダーゼ酵素より選択される、請求項117〜119のいずれか一項記載の感作分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  130. エフェクター分子が請求項37および38のいずれか一項記載のエフェクター分子より選択される、請求項117〜119のいずれか一項記載の分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  131. プローブが請求項79〜84のいずれか一項記載のプローブより選択される、請求項117〜119のいずれか一項記載の感作分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  132. 分裂エフェクター分子を含む生存分裂生体分子コンジュゲートであって、分裂エフェクターポリペプチド断片が、二つまたはそれ以上のプローブに各々コンジュゲートされた少なくとも二つのポリペプチド断片を含み、分裂エフェクターポリペプチド断片が、特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、細胞において細胞生存経路を開始させるかまたは細胞死を阻害することができる活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、生存分裂生体分子コンジュゲート。
  133. 腫瘍細胞を細胞死分裂エフェクター分子と接触させることを含む、疾患または障害を処置するための、請求項132記載の生存分裂生体分子コンジュゲートの使用であって、（i）分裂エフェクターポリペプチド断片が、癌障害に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドに特異的なプローブにコンジュゲートされており；かつ（ii）分裂エフェクターポリペプチド断片が、疾患または障害に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、使用。
  134. 疾患または障害が、病態の一部としての細胞損失に関連している、請求項132および133のいずれか一項記載の生存分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  135. 疾患または障害が、病理学的ポリペプチドの発現に関連している、請求項132および133のいずれか一項記載の生存分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  136. 病理学的ポリペプチドが、変異型ポリペプチドおよび／または不正確に折り畳まれたポリペプチドである、請求項133記載の生存分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  137. 標的核酸が、病理学的核酸である核酸として同定される、請求項132および133のいずれか一項記載の生存分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  138. 標的ポリペプチドが、病理学的ポリペプチドであるポリペプチドとして同定される、請求項132および133のいずれか一項記載の生存分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  139. 標的核酸または標的ポリペプチドが、病態の作用としての細胞における変化として同定される、請求項132および133のいずれか一項記載の生存分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  140. 疾患が、神経疾患；腎疾患；心血管疾患；肝疾患；炎症性疾患；嚢胞性繊維症；神経変性疾患；炎症性疾患；免疫障害を含む群より選択される、請求項133記載の生存分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  141. 神経疾患が、アルツハイマー病；ハンチントン病；パーキンソン病；筋萎縮性側索硬化症（ALS）、脊椎損傷を含む群より選択される、請求項140記載の生存分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  142. エフェクター分子が請求項34〜36のいずれか一項記載のエフェクター分子より選択される、請求項82〜84のいずれか一項記載の生存分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  143. プローブが請求項79〜84のいずれか一項記載のプローブより選択される、請求項82〜84のいずれか一項記載の生存分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  144. 分裂エフェクター分子を含む代理分裂生体分子コンジュゲートであって、分裂エフェクターポリペプチド断片が、二つまたはそれ以上のプローブに各々コンジュゲートされた少なくとも二つのポリペプチド断片を含み、分裂エフェクターポリペプチド断片が、特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、細胞において機能障害性のポリペプチドまたは失われたポリペプチドに取って代わることができる活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、代理分裂生体分子コンジュゲート。
  145. 腫瘍細胞を細胞死分裂エフェクター分子と接触させることを含む、疾患または障害を処置するための、請求項144記載の代理分裂生体分子コンジュゲートの使用であって、（i）分裂エフェクターポリペプチド断片が、癌障害に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドに特異的なプローブにコンジュゲートされており；かつ（ii）分裂エフェクターポリペプチド断片が、疾患または障害に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドの存在下で、活性エフェクター分子を形成するよう組み合わされる、使用。
  146. 疾患または障害が、細胞内のポリペプチドの損失または減少した発現または機能障害性の発現に関連している、請求項144および145のいずれか一項記載の代理分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  147. エフェクターポリペプチドが、疾患に関連した、失われたポリペプチドもしくは機能障害性のポリペプチド、またはその断片を含む、請求項144および145のいずれか一項記載の代理分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  148. 疾患が、筋ジストロフィー；嚢胞性繊維症より選択される、請求項146記載の代理分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  149. 標的核酸が、病理学的核酸である核酸として同定される、請求項144および145のいずれか一項記載の代理分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  150. 標的ポリペプチドが、病理学的ポリペプチドであるポリペプチドとして同定される、請求項144および145のいずれか一項記載の代理分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  151. 標的核酸または標的ポリペプチドが、病態の作用としての細胞における変化として同定される、請求項144および145のいずれか一項記載の代理分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  152. 疾患が、神経疾患；腎疾患；心血管疾患；肝疾患；炎症性疾患；嚢胞性繊維症；神経変性疾患；炎症性疾患；免疫障害を含む群より選択される、請求項133記載の代理分裂生体分子コンジュゲートの使用。
  153. 薬学的組成物が、少なくとも一つの生体分子コンジュゲートを前負荷されたポリマー性ナノ粒子を含む、請求項1、85、99、116、131のいずれか一項記載の生体分子コンジュゲートのうちの少なくとも一つを含む薬理学的組成物。
  154. a．分裂検出分子を含む分裂生体分子コンジュゲートの薬学的組成物の有効量の、対象への投与であって、分裂検出ポリペプチド断片の各々が、疾患または障害に関連している特定の標的核酸または標的ポリペプチドに特異的な二つのプローブのうちの少なくとも一つにコンジュゲートされている、投与；
    b．活性エフェクター分子の形成が、疾患または障害に関連している標的核酸または標的ポリペプチドと少なくとも二つのプローブが結合することにより促進される、活性検出分子の形成；
    c．活性検出分子のレベルの測定
    を含む、対象における病原性標的核酸または病原性ポリペプチドのレベルを測定する方法であって、
    活性検出分子のレベルが、対象における標的核酸または病原性ポリペプチドの測定値である、方法。
  155. 検出ポリペプチドが、β-ラクタマーゼ；DFHR；ルシフェラーゼ；蛍光性タンパク質、またはそれらの変異体もしくは断片を含む群より選択される、請求項154記載の方法。
  156. 第一の時点での対象における病原性標的核酸または病原性ポリペプチドのレベルの、第二の時点での病原性標的核酸または病原性ポリペプチドのレベルとの比較をさらに含む、請求項154記載の方法。
  157. 請求項3記載の方法による分裂生体分子コンジュゲートを用いた対象の処置の進行の測定をさらに含む、請求項154記載の方法。
JP2009534889A 2006-10-27 2007-10-26 疾患、悪性病変、および障害の処置のための標的化された分裂生体分子コンジュゲート、ならびにそれらの生成方法 Pending JP2010509194A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US85489206P 2006-10-27 2006-10-27
PCT/US2007/082665 WO2008133709A2 (en) 2006-10-27 2007-10-26 Targeted split biomolecular conjugates for the treatment of diseases, malignancies and disorders, and methods of their production

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2010509194A true JP2010509194A (ja) 2010-03-25
JP2010509194A5 JP2010509194A5 (ja) 2010-12-16

Family

ID=39789617

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2009534889A Pending JP2010509194A (ja) 2006-10-27 2007-10-26 疾患、悪性病変、および障害の処置のための標的化された分裂生体分子コンジュゲート、ならびにそれらの生成方法

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20100047179A1 (ja)
EP (1) EP2097109A2 (ja)
JP (1) JP2010509194A (ja)
KR (1) KR20090073255A (ja)
CN (1) CN101687047A (ja)
AU (1) AU2007352344A1 (ja)
CA (1) CA2667621A1 (ja)
IL (1) IL198358A0 (ja)
MX (1) MX2009004464A (ja)
RU (1) RU2009120007A (ja)
SG (1) SG177995A1 (ja)
WO (1) WO2008133709A2 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021010442A1 (ja) * 2019-07-16 2021-01-21 国立大学法人東京大学 タンパク質とｒｎａとの相互作用評価方法、相互作用調節物質評価方法、及び相互作用調節物質検出方法、並びに、これらに用いる融合タンパク質、キット、及びバイオセンサ

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004033485A2 (en) 2002-10-09 2004-04-22 The Trustees Of Boston University Nucleic acid supported protein complementation
CA2627413A1 (en) * 2005-10-27 2007-05-03 The Trustees Of Boston University Activated split-polypeptides and methods for their production and use
RU2611186C2 (ru) * 2009-12-29 2017-02-21 Курна, Инк. ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ОПУХОЛЕВЫМ БЕЛКОМ 63 (р63), ПУТЕМ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРИРОДНОГО АНТИСМЫСЛОВОГО ТРАНСКРИПТА К р63
WO2012003281A2 (en) * 2010-06-30 2012-01-05 Brandeis University Small-molecule-targeted protein degradation
CN102079780B (zh) * 2010-11-19 2013-06-05 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 蓖麻毒素a链突变体的构建及作为候选疫苗抗原
WO2014052555A1 (en) * 2012-09-26 2014-04-03 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods for treating hepatitis b
US9012170B2 (en) 2013-01-16 2015-04-21 Massachusetts Institute Of Technology Split peroxidases and methods of use
CN103739714B (zh) * 2013-12-30 2016-06-01 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 TNFα与DC-SIGN的融合蛋白及其应用
EP3589330A4 (en) * 2017-03-03 2021-01-06 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR THE MODIFICATION OF DNA
CN112888710B (zh) * 2018-09-30 2023-06-09 美国杰科实验室有限公司 一种多肽组合物
WO2020176553A1 (en) * 2019-02-25 2020-09-03 Sense Therapeutics Inc. Intracellular mutation targeting therapy
CN111793685B (zh) * 2020-08-26 2021-08-06 河南省生殖健康科学技术研究院(河南省出生缺陷干预工程技术研究中心) 一种与单纯性先天性心脏病相关的snp标志物及其应用
CN112500464A (zh) * 2021-01-04 2021-03-16 吉林大学 一种抗贾第虫作用靶点的锌脂蛋白及医用用途
CN113957031A (zh) * 2021-12-06 2022-01-21 上海市农业科学院 一种完全降解硝基苯的大肠杆菌工程菌的构建方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005538049A (ja) * 2002-05-01 2005-12-15 トレリス バイオサイエンス、インク． ２元的ないし多元的ターゲティング及びその使用
JP2009517408A (ja) * 2005-11-29 2009-04-30 ザ・ユニバーシティ・オブ・シドニー デミボディ：二量体化活性化治療剤

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9113475D0 (en) * 1991-06-21 1991-08-07 Hafslund Nycomed As Chemical compound
CA2075858C (en) * 1991-08-15 1998-05-19 Scott J. Eisenbeis Detection of complementary nucleotide sequences
ATE239506T1 (de) * 1992-03-05 2003-05-15 Univ Texas Verwendung von immunokonjugate zur diagnose und/oder therapie der vaskularisierten tumoren
AU4522393A (en) * 1992-05-22 1993-12-30 Dana-Farber Cancer Institute Hybrid SIV/HIV-1 viral vectors and monkey model for aids
WO1995003428A1 (en) * 1993-07-20 1995-02-02 University Of Massachusetts Medical Center In vivo nucleic acid hybridization method
US5854033A (en) * 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US6780413B2 (en) * 1996-09-19 2004-08-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Immunotoxin (mAB-RICIN) for the treatment of focal movement disorders
US6294330B1 (en) * 1997-01-31 2001-09-25 Odyssey Pharmaceuticals Inc. Protein fragment complementation assays for the detection of biological or drug interactions
CA2196496A1 (en) * 1997-01-31 1998-07-31 Stephen William Watson Michnick Protein fragment complementation assay for the detection of protein-protein interactions
EP0878552A1 (en) * 1997-05-13 1998-11-18 Erasmus Universiteit Rotterdam Molecular detection of chromosome aberrations
US6287772B1 (en) * 1998-04-29 2001-09-11 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions for detecting and quantitating target sequences
JP2002518047A (ja) * 1998-06-23 2002-06-25 メディカル リサーチ カウンシル 構造化されたアンチセンス核酸分子
US7306904B2 (en) * 2000-02-18 2007-12-11 Olink Ab Methods and kits for proximity probing
JP2004512012A (ja) * 2000-04-04 2004-04-22 メディカル　リサーチ　カウンシル 細胞検出法
US6951947B2 (en) * 2000-07-13 2005-10-04 The Scripps Research Institute Labeled peptides, proteins and antibodies and processes and intermediates useful for their preparation
GB0226727D0 (en) * 2002-11-15 2002-12-24 Medical Res Council Intrabodies
WO2004033485A2 (en) * 2002-10-09 2004-04-22 The Trustees Of Boston University Nucleic acid supported protein complementation
GB0226729D0 (en) * 2002-11-15 2002-12-24 Medical Res Council Intracellular antibodies
CA2627413A1 (en) * 2005-10-27 2007-05-03 The Trustees Of Boston University Activated split-polypeptides and methods for their production and use
US20090029370A1 (en) * 2005-10-27 2009-01-29 Trustees Of Boston University Real time nucleic acid detection in vivo using protein complementation

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005538049A (ja) * 2002-05-01 2005-12-15 トレリス バイオサイエンス、インク． ２元的ないし多元的ターゲティング及びその使用
JP2009517408A (ja) * 2005-11-29 2009-04-30 ザ・ユニバーシティ・オブ・シドニー デミボディ：二量体化活性化治療剤

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021010442A1 (ja) * 2019-07-16 2021-01-21 国立大学法人東京大学 タンパク質とｒｎａとの相互作用評価方法、相互作用調節物質評価方法、及び相互作用調節物質検出方法、並びに、これらに用いる融合タンパク質、キット、及びバイオセンサ

Also Published As

Publication number Publication date
US20100047179A1 (en) 2010-02-25
AU2007352344A1 (en) 2008-11-06
IL198358A0 (en) 2010-02-17
CA2667621A1 (en) 2008-11-06
RU2009120007A (ru) 2010-12-10
CN101687047A (zh) 2010-03-31
EP2097109A2 (en) 2009-09-09
WO2008133709A2 (en) 2008-11-06
KR20090073255A (ko) 2009-07-02
WO2008133709A3 (en) 2010-01-14
SG177995A1 (en) 2012-02-28
MX2009004464A (es) 2009-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2010509194A (ja) 疾患、悪性病変、および障害の処置のための標的化された分裂生体分子コンジュゲート、ならびにそれらの生成方法
US20140065172A1 (en) Delivery system and conjugates for compound delivery via naturally occurring intracellular transport routes
CA2768598A1 (en) Delivery system and conjugates for compound delivery via naturally occurring intracellular transport routes
JP2023175828A (ja) 腫瘍ホーミング及び細胞透過性ペプチド免疫抗がん剤複合体、ならびにそれらの使用方法
CN111225975A (zh) 抗体介导的cas9向哺乳动物细胞的递送
TWI723363B (zh) 用於治療癌症之包含引導rna及內切酶的藥學組成物
US6720310B1 (en) Transfer method for specific cellular localization of nucleic acids
Taskova et al. Synthetic nucleic acid analogues in gene therapy: an update for peptide–oligonucleotide conjugates
Szlachcic et al. Design and characteristics of cytotoxic fibroblast growth factor 1 conjugate for fibroblast growth factor receptor-targeted cancer therapy
US11697675B2 (en) EPHA3 and multi-valent targeting of tumors
JP2018506581A (ja) 治療目的のための抗体−ウレアーゼコンジュゲート
US20200376139A1 (en) Multi-armed polyrotaxane platform for protected nucleic acid delivery
Wang et al. Synthetic α-l-Threose nucleic acids targeting BcL-2 show gene silencing and in Vivo antitumor activity for cancer therapy
Lu et al. Targeting cancer gene dependencies with anthrax-mediated delivery of peptide nucleic acids
JP2021523733A (ja) 動物病原体由来ポリペプチドおよびその遺伝子工学的利用
ES2355488T3 (es) Proteína de fusión de tranferrina modificadas.
JP5252622B2 (ja) 高いヌクレアーゼ耐性と優れたｒｎａ干渉効果を発現可能な二本鎖ｒｎａ
JP2020501530A (ja) 近接増強反応性による分割タンパク質の鋳型アセンブリ方法
KR20200084819A (ko) pH 의존적 막 투과성 펩타이드를 이용한 약물 운반체 및 그것과 약물의 복합체
WO2022095853A1 (zh) 一种溶酶体靶向的核酸嵌合体的制备及应用
Li et al. Genotype-specific precision tumor therapy using mitochondrial DNA mutation-induced drug release system
US20230414764A1 (en) Template Assembly by Proximity-Enhanced Reactivity via Metabolic Labeling
Zhang et al. Diphtheria toxin‐derived, anti‐PD‐1 immunotoxin, a potent and practical tool to selectively deplete PD‐1+ cells
US20130085095A1 (en) Protein complementation regulators
US20240150771A1 (en) Therapeutic Compounds for Red Blood Cell-Mediated Delivery of an Active Pharmaceutical Ingredient to a Target Cell

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20101025

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20101025

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20130131

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20130207

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20130718