JP2010505958A - 神経防護作用組成物および方法 - Google Patents

神経防護作用組成物および方法 Download PDF

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Abstract

神経突起伸長促進プロスタグランジン類（ＮＥＰＰｓ）および他の求電子化合物は、転写因子の負の調節因子Ｎｒｆ２であるＫｅａｐ１に結合し、かつＮｒｆ２のＫｅａｐ１媒介不活性化を予防し、したがって、Ｎｒｆ２の神経細胞の核への転位を強化する。したがって、かかる神経保護化合物、およびかかる化合物のプロドラッグを使用し、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２複合体からのＮｆｒ２の解離をもたらす神経保護組成物および関連方法が提供される。

Description

本発明は、神経防護作用、ならびにニューロン傷害およびニューロン死につながる酸化ストレスに関連する状態の処置の分野に関する。
（政府の権利に関するステートメント）
本発明は、少なくとも一部は、アメリカ合衆国政府からの助成金（国立衛生研究所からの助成金番号Ｐ０１ ＨＤ２９５８７、Ｒ０１ ＮＳ４３２４２、およびＲ０１ ＥＹ０５４７７）によって支えられた。政府は、本発明に対して一部の権利を有する可能性がある。
細胞の抗酸化剤は、酸化ストレスを減らしニューロン死を防止するために重要である。抗酸化剤酵素を誘発するための最近解明された経路は、抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）を介する転写活性化を含む（非特許文献１；非特許文献２）。この場合、求電子試薬は、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、ＮＡＤＰＨキニーネオキシドレダクターゼ１、およびγ−グルタミルシステインリガーゼ（γ−ＧＣＬ；γ−グルタミン酸システインリガーゼまたはγ−グルタミルシステインリガーゼ［γ−ＧＣＳ］としても知られている）を含む、「第２相」酵素をコードする一群の遺伝子を誘発する。これらの酵素は、一部は細胞内酸化還元状態を調節することにより、効率よい細胞保護をもたらす（非特許文献１；非特許文献２）。
ＡＲＥは、求電子剤による第２相の遺伝子の転写活性化に必須のシス作動性要素である（非特許文献１；非特許文献２）。転写因子Ｎｆｒ２は、Ｍａｆファミリーのタンパク質と複合体を形成してＡＲＥをトランス活性化する。基本条件下で、細胞質の調節タンパク質Ｋｅａｐ１はしっかりとＮｒｆ２に結合し、それを細胞質に保持する（非特許文献１；非特許文献２）。この点については、Ｋｅａｐ１の作用はＩκＢの作用と類似しており、転写因子ＮＦ−κＢの活性化および転座を防止する（非特許文献１；非特許文献２）。Ｋｅａｐ１の場合、求電子剤は、この調節タンパク質中の重要なシステイン残基とマイケル付加体を作り、Ｎｒｆ２の遊離を引き起こし、それを核へと転座させる（非特許文献１；非特許文献２）。
第２相酵素の中で、ＨＯ−１は、神経変性疾患に対する治療効果に起因して特に注目されてきた（非特許文献３；非特許文献４）。ＨＯ−１は、ヘムをビリベルジンへと酸化的に切断し、ＣＯを生成し、キレートされたＦｅ2+を放出する（非特許文献３）。ビリルビン（ビリベルジンの還元生成物）は、強力なラジカルスカベンジャーとしての役割を果たし（非特許文献４）、ｎＭレベルの濃度で酸化ストレスからニューロン細胞を保護する（非特許文献５）。遺伝子ノックアウトしたトランスジェニックマウスを用いた研究により、細胞の抗酸化剤としてのＨＯ−１の生物学的重要性が確認された（非特許文献６）。ＨＯ−１-/-マウス由来の細胞は非常に酸化的損傷を受けやすいため、ＨＯ−１は、酸化ストレスに対する内因性防御において必須の役割を果たしていると提唱されている（非特許文献６）。神経変性疾患に対する医薬品の開発に関するＨＯ−１の重要性は、（ｉ）ＨＯがビリベルジンおよびビリルビンを含めたいくつかの抗酸化性化合物を産生すること（非特許文献５）、および（ｉｉ）ＨＯ−１の誘発は種々の化合物によって調節することができる（非特許文献７）、という２つの事実に基づく。このように、ニューロンにおけるＨＯ−１の誘発因子が効率よい神経防護作用化合物を代表することができるであろうと提唱されてきた（非特許文献３；非特許文献５；非特許文献７）。
Ｉｔｏｈら， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３６−４５，２００４年 Ｇｏｎｇら， Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．，２００２年，第４巻，２４９−２５７頁 ＭａｉｎｅｓおよびＰａｎａｈｉａｎ，「Ｈｙｐｏｘｉａ：Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｂｅｄｓｉｄｅ」，Ｒｏａｃｈら編（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｋｌｕｗｅｒ），２００１年，２４９−２７２頁 Ｓｔｏｃｋｅｒら， Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７年，第２３５巻，１０４３−１０４６頁 Ｄｏｒｅら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９９年，第９６巻，２４４５−２４５０頁 ＰｏｓｓおよびＴａｎｅｇａｗａ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９７年，第９４巻，１０９２５−１０９３０頁 Ｓａｔｏｈら， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００３年，第１７巻，２２４９−２２５５頁
われわれは、Ｋｅａｐ１−Ｎｒｆ２経路を調節し、Ｎｒｆ２によるＨＯ−１プロモーターの活性化をもたらす神経保護求電子化合物、およびかかる化合物のプロドラッグ形態を発見した。ＨＯ−１タンパク質の誘導は興奮毒性および脳虚血に対して重要な神経保護の役割を果たすことが知られている。
本発明の一実施形態によれば、神経保護的量の求電子化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩または溶媒を含んでなる組成物が提供されるが、ここで求電子化合物は、例えば、ニューロンなど哺乳動物の細胞におけるＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２複合体からのＮｒｆ２の解離をもたらす。別の実施形態によれば、求電子化合物はＫｅａｐ１に結合し、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２複合体からのＮｒｆ２の解離をもたらす。別の実施形態によれば、求電子化合物は、ＨＯ−１を含むがこれに限定されることなく、細胞における第二相酵素の発現を増大させる。別の実施形態によれば、求電子化合物は、ニューロンもしくは星状細胞またはその両方など神経細胞において蓄積する。別の実施形態によれば、求電子化合物は親油性である。別の実施形態によれば、求電子化合物は細胞へ活発に輸送される。別の実施形態によれば、組成物は薬学的に許容される担体をさらに含んでなる。
かかる組成物の別の実施形態によれば、求電子化合物は、細胞におけるＧＳＨレベルを実質的に削減することなくＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２複合体からＮｒｆ２の解離をもたらす。
かかる組成物の別の実施形態によれば、求電子化合物は、クルクミンを含むがこれに限定されないエノン化合物、またはＮＥＰＰなど、例えば、ＮＥＰＰ６またはＮＥＰＰ１１を含むがこれに限定されないジエノン化合物である。
別の実施形態によれば、前記求電子化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩または溶媒は、コアベンゼン環を有する化学式Ｉ
Figure 2010505958
 ［式中、
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5およびＸ6は、それぞれ独立して、Ｘ1−Ｘ6の少なくとも２つがＯＨであり、かつＸ1−Ｘ6の少なくとも１つがＹであるという条件で、Ｈ、ＯＨ、アルキルまたはＹであり、
ＹはＢ−Ｃ−ＤもしくはＣ−Ｂ−ＤまたはＣ−Ｂ−Ｃ−Ｄであり、そのいずれかはコアベンゼン環に付着され、縮合環を形成することができ、
Ｂは不存在、カルボニル、カルボキシ、エーテル、スルファニル、アミノ、−ＮＨＣ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−より成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、
Ｃは不存在、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アリール、アリールアルキル、およびアリールアルケニルより成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、かつ縮合環を形成するためにコアベンゼン環に付着されうるとともに、
Ｄは不存在、カルボキシ、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3、ＮＯ3、ＮＯ2、ＮＯ、アミノ、ヒドロキシル、かつそのエーテルおよびエステル誘導体より成る群から選択される］の化合物である。
別の実施形態によれば、前記求電子化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩または溶媒は、上述した化学式Ｉの化合物であり、かつＸ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5およびＸ6が、それぞれ独立して、Ｘ1−Ｘ6の２つがヒドロキシであり（ヒドロキシ基のパラ配置およびオルト配置が好ましく、かつパラ配置がより好ましい）かつＸ1−Ｘ6の１つがＹであるという条件で、Ｈ、ヒドロキシ、アルキルまたはＹである。
別の実施形態によれば、前記求電子化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩または溶媒は、上述した化学式Ｉの化合物であり、かつＸ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5およびＸ6が、それぞれ独立して、Ｘ1−Ｘ6の２つがパラまたはオルト配置でヒドロキシであり、かつＸ1−Ｘ6の１つがＹであるという条件で、Ｈ、ＯＨ、アルキルまたはＹである（すなわち、化合物は、側鎖Ｙで一置換されたｐ−またはｏ−ジヒドロキシベンゼン環構造を含む）。
別の実施形態によれば、前記求電子化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩または溶媒は化学式Ｉのかかる化合物であり、ここでＸ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5およびＸ6が、それぞれ独立して、Ｘ1−Ｘ6の２つがパラ配置でヒドロキシであり、かつＸ1−Ｘ6の１つがＹであるという条件で、Ｈ、ＯＨ、アルキルまたはＹであり（すなわち、化合物は、側鎖Ｙで一置換されたｐ−またはｏ−ジヒドロキシベンゼン環構造を含む）かつＤがカルボキシ、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3、ＮＯ3、ＮＯ2、ＮＯ、アミノ、ヒドロキシ、かつそのエーテルおよびエステル誘導体より成る群から選択される。好ましくは、ＹはＢ−Ｃ−Ｄであり、Ｄはカルボキシまたはそのエステル誘導体であり、かつＢは不存在またはカルボニルである。
別の実施形態によれば、前記求電子化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩または溶媒は化学式ＩＩまたは化学式ＩＩＩ
Figure 2010505958
 ［式中、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、およびＸ20は、それぞれ独立して、Ｘ11−Ｘ20の少なくとも２つがＯＨであるという条件でＨ、ＯＨ、またはＹであり、ＹはＢ−Ｃ−ＤもしくはＣ−Ｂ−ＤまたはＣ−Ｂ−Ｃ−Ｄであり、そのいずれかは環炭素に付着されて縮合環を形成することができ、Ｂは不存在、カルボニル、カルボキシ、エーテル、スルファニル、アミノ、−ＮＨＣ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−より成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、Ｃは不存在、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アリール、アリールアルキル、およびアリールアルケニルより成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、かつ縮合環を形成するために環炭素に付着されうるとともに、Ｄは不存在、カルボキシ、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3、ＮＯ3、ＮＯ2、ＮＯ、アミノ、ヒドロキシル、かつそのエーテルおよびエステル誘導体より成る群から選択される］の化合物である。別の実施形態によれば、前記求電子化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩または溶媒は化学式ＩＩまたは化学式ＩＩＩのかかる化合物であり、ここでＸ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、およびＸ20が、それぞれ独立して、Ｘ11−Ｘ15の２つがＯＨであり、またはＸ16−Ｘ19の２つがＯＨであり、またはＸ11−Ｘ15の２つがＯＨであり、かつＸ16−Ｘ19の２つがＯＨであるという条件でＨ、ＯＨ、またはＹである。好ましくは、Ｘ11−Ｘ20の少なくとも１つがＹである。好ましくはＹは親水性または不存在であり、かつより好ましくは親水性である。好ましくは化学式ＩＩまたは化学式ＩＩＩの前記化合物は、パラまたはオルト配置で、かつより好ましくはパラ配置で２つのＯＨ基を含んでなるＥ環を含んでなる。好ましくは化学式ＩＩまたは化学式ＩＩＩの前記化合物は、パラまたはオルト配置で、かつより好ましくはパラ配置で２つのＯＨ基を含んでなるＧ環を含んでなる。
別の実施形態によれば、前記求電子化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩または溶媒は化学式ＩＶ、化学式Ｖまたは化学式ＶＩ
Figure 2010505958
 ［式中、Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、Ｘ26およびＸ27は、それぞれ独立してＨ、ＯＨ、オキソ、またはＹであり、ＹはＢ−Ｃ−ＤもしくはＣ−Ｂ−ＤまたはＣ−Ｂ−Ｃ−Ｄであり、そのいずれかは環炭素に付着されて縮合環を形成することができ、Ｂは不存在、カルボニル、カルボキシ、エーテル、スルファニル、アミノ、−ＮＨＣ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−より成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、Ｃは不存在、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アリール、アリールアルキル、およびアリールアルケニルより成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、かつ縮合環を形成するために環炭素に付着されうるとともに、Ｄは不存在、カルボキシ、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3、ＮＯ3、ＮＯ2、ＮＯ、アミノ、ヒドロキシル、かつそのエーテルおよびエステル誘導体より成る群から選択される］の化合物である。好ましくはＢは不存在である。好ましくは前記求電子化合物、もしくは薬学的に許容されるプロドラッグ、塩または溶媒は化学式ＩＶまたは化学式Ｖの化合物であり、より好ましくは化学式ＩＶの化合物である。好ましくはＸ21およびＸ24は、それぞれ独立してメチル、カルボキシ、−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ3、ＣＨ2ＯＨ、またはＣＨ2ＯＣ（Ｏ）ＣＨ3である。好ましくはＸ22およびＸ23は、それぞれ独立してＨ、ＯＨ、オキソ、または−ＯＣＨ3であり、かつより好ましくは、Ｘ22およびＸ23の少なくとも１つはＯＨまたはオキソである。好ましくはＸ25もしくはＸ27またはその両方はメチルである。好ましくは、Ｘ21、Ｘ26またはＸ27の少なくとも１つはカルボキシであり、かつより好ましくは、Ｘ21またはＸ24の１つはＣＨ3であり、かつもう１つはカルボキシ、−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、および−ＣＨ2ＯＣ（Ｏ）ＣＨ3より成る群から選択される。Ｘ26のＲエナンチオマーが好ましい。
かかる組成物の別の実施形態によれば、前記求電子化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩または溶媒は、ＴＢＨＱ；ＮＥＰＰ；パラＬ−ドーパ；ベンゼン酢酸、２，５−ジヒドロキシ−α−オクチリデン−，（Ｚ）−（９ＣＩ）；ベンゼンデカン酸、２，５−ジヒドロキシ−ι−オキソ−（９ＣＩ）；ベンゼンウンデカン酸、２，５−ジヒドロキシ−（９ＣＩ）；ベンゼンブタン酸、２，５−ジヒドロキシ−γ−オキソ−β−フェニル−（９ＣＩ）；ベンゼンブタン酸、２，５−ジヒドロキシ−β−（４−メチルフェニル）−γ−オキソ−（９ＣＩ）；安息香酸、２−［２−（２，５−ジヒドロキシフェニル）エチル］−６−ヒドロキシ−（９ＣＩ）；安息香酸、５−［２−（２，５−ジヒドロキシフェニル）エチル］−２−ヒドロキシ−（９ＣＩ）；安息香酸、４−［２−（２，５−ジヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル］−（９ＣＩ）；安息香酸、３−［［（２，５−ジヒドロキシフェニル）メチル］アミノ］−（９ＣＩ）；［１，１’−ビフェニル］−４−カルボン酸、２’，５’−ジヒドロキシ−（９ＣＩ）；ペンタン酸、５−（２，５−ジヒドロキシフェノキシ）−２，２−ジメチル−（９ＣＩ）；オクタン酸、８−［（２，５−ジヒドロキシベンゾイル）アミノ］−（９ＣＩ）；ベンゼンブタン酸、２，５−ジヒドロキシ−γ−フェニル−（９ＣＩ）；５，９−ウンデカジエン酸、２−［２−（２，５−ジヒドロキシフェニル）エチリデン］−１１−ヒドロキシ−６，１０−ジメチル−，（２Ｚ，５Ｅ，９Ｅ）−（９ＣＩ）；５，９−ウンデカジエン酸、２−［２−（２，５−ジヒドロキシフェニル）エチリデン］−６，１０−ジメチル−，（２Ｚ，５Ｅ）−（９ＣＩ）；ベンゼンブタン酸、α−［（３Ｅ）−４，８−ジメチル−３，７−ノナジエニル］−２，５−ジヒドロキシ−γ−オキソ−，（＋）−（９ＣＩ）；２，６−オクタジエン酸、８−（２，５−ジヒドロキシフェニル）−２，６−ジメチル−８−オキソ−，（２Ｅ，６Ｅ）−（９ＣＩ）；３−（３，４）−ジヒドロキシフェニル］−２−プロペン酸（カフェ酸）のエステル；および３−（２，５）−ジヒドロキシフェニル］−２−プロペン酸のエステルより成る群から選択される。
かかる組成物の別の実施形態によれば、組成物は前記求電子化合物の前記プロドラッグを含んでなる。一実施形態によれば、プロドラッグは、例えば、カルノシン酸、パラカルノシン酸、またはカルノシン酸誘導体などテルペノイドまたはフラボノイド化合物である。別の実施形態によれば、細胞は酸化的ストレス下にあり、かつ前記プロドラッグは細胞において酸化され、求電子化合物を産生する。
かかる組成物の別の実施形態によれば、組成物は、ヒトを含むがこれに限定されることなく哺乳動物における神経学的障害、眼科学的障害、およびその組合せより成る群の一員を治療するために有効である量の前記求電子化合物を含んでなる。別の実施形態によれば、神経学的障害、眼科学的障害、またはその組合せは、精神的外傷，虚血，および低酸素症．別の実施形態によれば、神経学的障害、眼科学的障害、またはその組合せは、疼痛を伴う神経障害、神経障害痛、糖尿病性神経障害、薬物依存、薬物添加、薬物離脱症状、ニコチン離脱症状、アヘン耐性、アヘン離脱症状、うつ病、不安神経症、運動障害、遅発性ジスキネジー、血液−脳関門を中断させる脳感染、髄膜炎、髄膜脳炎、発作、低血糖症、心停止、脊髄傷害、頭部傷害、周産期低酸素症、心停止、低血糖神経傷害、緑内障、網膜虚血、虚血性視神経障害、黄斑変性症、多発性硬化症、高ホモシステイン血症の続発症、けいれん、疼痛、統合失調症、筋けいれん、片頭痛、尿失禁、嘔吐、脳浮腫、遅発性ジスキネジー、ＡＩＤＳ−誘発認知症、眼傷害、網膜症、認知障害、およびＨＩＶ感染と関連した神経傷害より成る群の少なくとも一員を起因とする。別の実施形態によれば、神経学的障害、眼科学的障害、またはその組合せは、てんかん、アルツハイマー病、血管（多発梗塞性）認知症、ハンチントン病、パーキンソニズム、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、および最小認知障害（ＭＣＩ）より成る群から選択される。
かかる組成物の別の実施形態によれば、組成物は、哺乳動物における老化またはその症状を削減または減速させるために有効である量の求電子化合物、そのプロドラッグ、塩または溶媒を含んでなる。
かかる組成物の別の実施形態によれば、組成物は、神経保護的量の求電子化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩または溶媒を含んで成り、ここで求電子化合物は哺乳動物の細胞においてＫｅａｐ１に結合し、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２複合体からＮｒｆ２の解離をもたらし、かつ細胞におけるＧＳＨレベルを実質的に削減することなく細胞における第二相酵素の発現を増大させる。
本発明の別の実施形態によれば、上述した組成物のいずれかを細胞に投与するステップを含んでなる（アポトーシス、ネクローシスまたはオートファジーを含むがこれらに限定されない過程による）哺乳動物の細胞の傷害、損傷または死を予防または遅延させるための方法が提供される。かかる一実施形態によれば、方法は組成物をインビトロで細胞に投与するステップを含んでなる。かかる一実施形態によれば、方法は組成物をインビボで細胞に投与するステップ、すなわち組成物を哺乳動物に投与するステップを含んでなる。
本発明の別の実施形態によれば、かかる治療を必要とする哺乳動物における神経学的障害、眼科学的障害、またはその組合せを治療するための方法が提供され、かかる方法は上述した組成物のいずれかを哺乳動物に投与するステップを含んでなる。
本発明の別の実施形態によれば、化学式ＩＶ
Figure 2010505958
 ［式中、Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、Ｘ26およびＸ27はそれぞれ独立してＨ、ＯＨ、オキソ、またはＹであり、ＹはＢ−Ｃ−ＤまたはＣ−Ｂ−ＤまたはＣ−Ｂ−Ｃ−Ｄであり、そのうちいずれかは環炭素に付着され縮合環を形成することができ、Ｂは不存在、カルボニル、カルボキシ、エーテル、スルファニル、アミノ、−ＮＨＣ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−より成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、Ｃは不存在、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アリール、アリールアルキル、およびアリールアルケニルより成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、かつ縮合環を形成するために環炭素に付着されうるとともに、Ｄは不存在、カルボキシ、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3、ＮＯ3、ＮＯ2、ＮＯ、アミノ、ヒドロキシル、かつそのエーテルおよびエステル誘導体より成る群から選択される］の化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩又は溶媒和物が提供される。好ましくはＢは不存在である。好ましくはＸ21およびＸ24は、それぞれ独立してメチル、カルボキシ、−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ3、ＣＨ2ＯＨ、またはＣＨ2ＯＣ（Ｏ）ＣＨ3である。好ましくはＸ22およびＸ23は、それぞれ独立してＨ、ＯＨ、オキソ、または−ＯＣＨ3であり、かつより好ましくは、Ｘ22およびＸ23の少なくとも１つはＯＨまたはオキソである。好ましくはＸ25もしくはＸ27またはその両方はメチルである。好ましくは、Ｘ21、Ｘ26またはＸ27の少なくとも１つはカルボキシであり、かつより好ましくは、Ｘ21またはＸ24の１つはＣＨ3であり、かつもう１つはカルボキシ、−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、および−ＣＨ2ＯＣ（Ｏ）ＣＨ3より成る群から選択される。Ｘ26のＲエナンチオマーが好ましい。
本発明の別の実施形態によれば、（ａ）上述した化学式ＩＶの化合物、パラカルノシン酸、パラＬ−ドーパ、パラカフェ酸、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩または溶媒より成る群の一員から選択される神経保護的量の化合物と、（ｂ）薬学的に許容される担体とを含んでなる医薬組成物が提供される。
本発明の別の実施形態によれば、神経保護求電子化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩または溶媒を特定するための方法が提供され、かかる方法は、前記求電子化合物、そのプロドラッグ、塩または溶媒を含んでなる組成物を（インビトロまたはインビボで）細胞に投与するステップと、組成物の投与が細胞におけるＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２複合体からのＮｒｆ２の解離をもたらすかを判定するステップと含んでなる。一実施形態によれば、かかる方法は、求電子化合物がＫｅａｐ１に結合するかを判定するステップを含んでなる。別の実施形態によれば、かかる方法は、組成物の投与が細胞におけるＮｒｆ２による転写活性をもたらすかを判定するステップを含んでなる。別の実施形態によれば、かかる方法は、組成物の投与が細胞におけるＨＯ−１を含むがこれに限定されない第二相酵素の発現の増大をもたらすかを判定するステップを含んでなる。別の実施形態によれば、かかる方法は、組成物の投与が（例えば、アポトーシス、ネクローシスまたはオートファジーによる）細胞のストレス誘発死を低下または遅延させるかを判定するステップを含んでなる。別の実施形態によれば、かかる方法は、組成物の投与が適切なインビボアッセイにおいて脳虚血／再灌流傷害に対して細胞を含んでなる実験動物を保護するかを判定するステップを含んでなる。別の実施形態によれば、かかる方法は、求電子化合物が、例えば、ニューロンもしくは星状細胞またはその両方など神経細胞において蓄積するかを判定するステップを含んでなる。別の実施形態によれば、かかる方法は、組成物の投与が細胞におけるＧＳＨレベルを実質的に削減することなくＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２複合体からＮｒｆ２の解離をもたらすかを判定するステップを含んでなる。
本発明の別の実施形態によれば、患者の細胞におけるＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２複合体からＮｒｆ２の解離をもたらす求電子化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩又は溶媒和物が使用され、神経学的障害、眼科学的障害、またはその組合せを治療する薬剤を調製する。
本発明の上述の態様および他の態様は、以下の詳細な説明、添付の図面、および特許請求の範囲からさらに明らかになるであろう。
特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明が関係する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または均等な方法および物質が、本発明を実施または試験する際に使用され得るが、適切な方法および物質が以下に記載される。
種々の選択神経保護求電子またはプロ求電子化合物、すなわち、パラＬ−ドーパ、ＴＢＨＱ、ＮＥＰＰ６、ＮＥＰＰ１１、クルクミン、カルノシン酸およびパラカルノシン酸を示す図である。 カテコール型およびエノン型の神経保護求電子化合物のコア化学構造を示す図である。 カルノシン酸および種々の神経保護カルノシン酸誘導体の構造を示す図である。 カルノシン酸および種々の神経保護カルノシン酸誘導体の構造を示す図である。 ＣＡがＮｒｆ２によってＰＣ１２ｈ細胞を保護することを示す図である。（ａ）Ｎｒｆ２ＤＮは細胞死を増大させる。ＰＣ１２ｈ細胞、ＰＣ１２ｈＷ１Ｂ細胞、およびＰＣ１２ｈＤ５Ｄ細胞（Ｎｒｆ２ＤＮを発現）を種々の濃度のグルタミン酸塩で２０時間インキュベートした。細胞生存率をＭＴＴアッセイを使用して評価した。*ＡＮＯＶＡによるＰＣ１２ｈ細胞からの有意差（ｐ＜０．０１）。 （ｂ）ＣＡおよびスルホラファンによるＡＲＥの用量依存活性化。ＰＣ１２ｈ細胞をＡＲＥ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミドでトランスフェクトし、次いで２０時間、種々の濃度のＣＡまたはスルホラファンでインキュベートした。*ＡＮＯＶＡによるＣＡとスルホラファンとの有意差（ｐ＜０．０１）。 （ｃ）ＣＡはＮｒｆ２依存方法でＰＣ１２ｈ細胞を保護する。ＰＣ１２細胞、ＰＣ１２ｈＷ１Ｂ細胞またはＰＣ１２ｈＤ５Ｄ細胞に種々の濃度のＣＡを２０時間５ｍＭグルタミン酸塩に曝露する１時間前に添加した。次いでＭＴＴアッセイによって生存能力を評価した。*ＡＮＯＶＡによるＰＣ１２ｈ細胞からの有意差（ｐ＜０．０１）。 ＣＡがＡＲＥを活性化し、かつＮｒｆ２依存方法で皮質ニューロンを保護することを示す図である。皮質培養液（Ｅ１７、ＤＩＶ２１）をＡＲＥ−ルシフェｒ−ゼレポーター遺伝子ＤＮＡ（１μｇ／ウェル）でトランスフェクトし、かつｐＥＦ６またはｐＥＦＮｒｆ２で同時トランスフェクトした。次いでＣＡ（３μＭ）または賦形剤を培養液に添加した。２４時間のインキュベーション後、細胞溶解物をルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ用に使用した。値は平均±ＳＥＭであり、*ＡＮＯＶＡによるｐ＜０．０１。 ＣＡが脳におけるＧＳＨの還元当量を増大させたことを示す図である。マウスに対し１週間０．０３％ＣＡを与え、次いでその脳を除去し、溶解し、ＧＳＨおよびＧＳＳＧ測定にかけた。 ＣＡが２時間ＭＣＡＯ／２４時間再灌流およびＴＴＣ染色による梗塞容積の定量化によって脳虚血誘発に対して保護することを示す図である。ＣＡは賦形剤処置マウスに比べ梗塞容積を低下させた。データは平均±ＳＥＭを表す（賦形剤処置、ｎ＝９、ＣＡ処置、ｎ＝９、*ＡＮＯＶＡによるｐ＜０．０５）。 ＣＡ、ＮＥＰＰ１１およびＴＢＨＱの神経保護作用の提案された機序を示す図である。ＮＥＰＰ１１はニューロンを直接保護し、ＴＢＨＱは星状細胞に対する効果によって保護し、これは順次、生存因子または神経栄養因子を放出しうる（アールグレン・ベッケンドルフら（Ａｈｌｇｒｅｎ−Ｂｅｃｋｅｎｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ．）、Ｇｌｉａ １５：１３１−１４２頁、１９９９年、コサカ（Ｋｏｓａｋａ）とヨコイ（Ｙｏｋｏｉ）、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２６：１６２０−１６２２頁、２００３年）とともに、ＣＡはニューロンと星状細胞の両方に対する作用によって媒介される保護の「混合」型によって保護するように思われる。
定義
以下でさらに詳しく述べるように、求電子剤そのものだけではなく反応性酸素種（ＲＯＳ）などフリーラジカルをも除去し、したがって神経変性を予防するニューロンによって「求電子剤反撃」を活性化する神経保護求電子剤を含んでなる組成物および関連方法が提供される。かかる求電子物質による神経保護は、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２シグナル伝達経路および第二相遺伝子の誘導を含む転写に基づく機序を伴うが、これらの遺伝子は、γ−ＧＣＬおよびＨＯ−１など神経保護物質の細胞内レベルの増大を含む求電子剤に対する調整された反応を表す酵素をコード化する。かかる化合物はまた、細胞におけるフリーラジカル媒介事象による損傷を予防、削減または遅延させる。別の実施形態によれば、かかる方法は、組成物の投与が細胞の（例えば、アポトーシス、ネクローシスまたはオートファジーによる）ストレス誘発細胞損傷、傷害、または死を低下または遅延させるかを判定するステップを含んでなる。患者の体内で代謝されてかかる求電子化合物を産生するかかる神経保護求電子剤（または「プロ求電子剤」）のプロドラッグ形態を含んでなる組成物および関連使用方法も提供される。
図１は、神経保護求電子化合物（パラＬ−ドーパ、ＴＢＨＱ、ＮＥＰＰ６、ＮＥＰＰ１１、およびクルクミン）およびプロ求電子化合物（カルノシン酸（ＣＡ）、パラカルノシン酸、およびカルノシン酸誘導体）の例を示す。
本発明の一実施形態によれば、本発明による神経保護求電子化合物はエノン型求電子化合物であるが、これにはエノン類およびジエノン類が含まれるがこれらに限定されない（図２Ｂ）。エノン類の例がクルクミンである。ジエノン類の例としては、ＮＥＰＰ６およびＮＥＰＰ１１を含むがこれらに限定されない神経突起伸長促進プロスタグランジン類（ＮＥＰＰｓ）など交差共役ジエノン類が含まれる。ジエノン類が好ましい。
本発明の別の実施形態によれば、本発明による神経保護求電子化合物はカテコール型求電子化合物である（図２Ａ）。本発明による他のカテコール型神経保護求電子化合物の例としては、メチルおよびエチルエステルを含むがこれらに限定されない、化合物を細胞膜に通過させることが可能であるｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）、パラＬ−ドーパ、および３−（３，４）−ジヒドロキシフェニル］−２−プロペン酸（カフェ酸） または３−（２，５）−ジヒドロキシフェニル］−２−プロペン酸のエステルが含まれるがこれらに限定されない。
本発明の一実施形態によれば、本発明によるカテコール型神経保護求電子化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩または溶媒は構造化学式Ｉ
Figure 2010505958
 ［式中、
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5およびＸ6は、それぞれ独立して、Ｘ1−Ｘ6の少なくとも２つがＯＨであり、かつＸ1−Ｘ6の少なくとも１つがＹであるという条件で、Ｈ、ＯＨ、アルキルまたはＹであり、
ＹはＢ−Ｃ−ＤもしくはＣ−Ｂ−ＤまたはＣ−Ｂ−Ｃ−Ｄであり、そのいずれかはコアベンゼン環に付着され、縮合環を形成することができ、
Ｂは不存在、カルボニル、カルボキシ、エーテル、スルファニル、アミノ、−ＮＨＣ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−より成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、
Ｃは不存在、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アリール、アリールアルキル、およびアリールアルケニルより成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、かつ縮合環を形成するためにコアベンゼン環に付着されうるとともに、
Ｄは不存在、カルボキシ、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3、ＮＯ3、ＮＯ2、ＮＯ、アミノ、ヒドロキシル、かつそのエーテルおよびエステル誘導体より成る群から選択される］を有する。
別の実施形態において、かかる化合物は構造化学式Ｉを有し、ここでＸ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5およびＸ6は、それぞれ独立して、Ｘ1−Ｘ6の少なくとも２つがＯＨであり、かつＸ1−Ｘ6の少なくとも１つがＹであるという条件で、Ｈ、ＯＨ、アルキルまたはＹであり（すなわち、化合物は側鎖Ｙで一置換されたパラ、オルトまたはメタジヒドロキシベンゼン環構造を有する）、ＹはＢ−Ｃ−ＤもしくはＣ−Ｂ−ＤまたはＣ−Ｂ−Ｃ−Ｄであり、そのいずれかはコアベンゼン環に付着され、縮合環を形成することができ、Ｂは不存在、カルボニル、カルボキシ、エーテル、スルファニル、アミノ、−ＮＨＣ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−より成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、Ｃは不存在、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アリール、アリールアルキル、およびアリールアルケニルより成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、かつ縮合環を形成するためにジヒドロキシベンゼン環に付着されうるとともに、Ｄは不存在、カルボキシ、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3、ＮＯ3、ＮＯ2、ＮＯ、アミノ、ヒドロキシル、かつそのエーテルおよびエステル誘導体より成る群から選択される。
別の実施形態において、かかる化合物は構造化学式Ｉを有し、ここでＸ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5およびＸ6は、それぞれ独立して、Ｘ1−Ｘ6の２つがパラ配置でＯＨであり、かつＸ1−Ｘ6の１つがＹであるという条件で、Ｈ、ＯＨ、アルキルまたはＹであり（すなわち、化合物は側鎖Ｙで一置換されたｐ−ジヒドロキシベンゼン環構造を含む）、ＹはＢ−Ｃ−ＤもしくはＣ−Ｂ−ＤまたはＣ−Ｂ−Ｃ−Ｄであり、そのいずれかはコアベンゼン環に付着され、縮合環を形成することができ、Ｂは不存在、カルボニル、カルボキシ、エーテル、スルファニル、アミノ、−ＮＨＣ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−より成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、Ｃは不存在、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アリール、アリールアルキル、およびアリールアルケニルより成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、かつ縮合環を形成するためにコアベンゼン環に付着されうるとともに、Ｄは不存在、カルボキシ、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3、ＮＯ3、ＮＯ2、ＮＯ、アミノ、ヒドロキシル、かつそのエーテルおよびエステル誘導体より成る群から選択される。
別の実施形態において、かかる化合物は構造化学式Ｉを有し、ここでＸ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5およびＸ6は、それぞれ独立して、Ｘ1−Ｘ6の２つがパラ配置でＯＨであり、かつＸ1−Ｘ6の１つがＹであるという条件で、Ｈ、ＯＨ、アルキルまたはＹであり（すなわち、化合物は側鎖Ｙで一置換されたｐ−ジヒドロキシベンゼン環構造を含む）、ＹはＢ−Ｃ−ＤもしくはＣ−Ｂ−ＤまたはＣ−Ｂ−Ｃ−Ｄであり、そのいずれかはコアベンゼン環に付着され、縮合環を形成することができ、Ｂは不存在、カルボニル、カルボキシ、エーテル、スルファニル、アミノ、−ＮＨＣ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−より成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、Ｃは不存在、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アリール、アリールアルキル、およびアリールアルケニルより成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、かつ縮合環を形成するためにジヒドロキシベンゼン環に付着されうるとともに、Ｄはカルボキシ、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3、ＮＯ3、ＮＯ2、ＮＯ、アミノ、ヒドロキシル、かつそのエーテルおよびエステル誘導体より成る群から選択される。
好ましくはＹはＢ−Ｃ−Ｄである。
好ましくはＢは不存在またはカルボニルである。
好ましくはＤはカルボキシまたはそのエステル誘導体である。
本発明の別の実施形態によれば、本発明によるカテコール型神経保護求電子化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩または溶媒は構造化学式ＩＩまたは化学式ＩＩＩ
Figure 2010505958
 ［式中、
Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、およびＸ20は、それぞれ独立して、Ｘ11−Ｘ20の少なくとも２つがＯＨであるという条件でＨ、ＯＨ、またはＹであり、
ＹはＢ−Ｃ−ＤもしくはＣ−Ｂ−ＤまたはＣ−Ｂ−Ｃ−Ｄであり、そのいずれかは環炭素に付着されて縮合環を形成することができ、
Ｂは不存在、カルボニル、カルボキシ、エーテル、スルファニル、アミノ、−ＮＨＣ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−より成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、
Ｃは不存在、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アリール、アリールアルキル、およびアリールアルケニルより成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、かつ縮合環を形成するために環炭素に付着されうるとともに、
Ｄは不存在、カルボキシ、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3、ＮＯ3、ＮＯ2、ＮＯ、アミノ、ヒドロキシル、かつ
そのエーテルおよびエステル誘導体より成る群から選択される］によるコアフラボノイド構造を有する。
別の実施形態において、かかる化合物は構造化学式ＩＩまたはＩＩＩを有し、ここでＸ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、およびＸ20は、それぞれ独立して、Ｘ11−Ｘ15の２つがＯＨであり（すなわち、環Ｅはパラ、オルト、またはメタ配置で２つのＯＨ基を有する）、またはＸ16−Ｘ19の２つがＯＨであり（すなわち、環Ｇはパラ、オルト、またはメタ配置で２つのＯＨ基を有する）またはＸ11−Ｘ15の２つがＯＨであり、かつＸ16−Ｘ19の２つがＯＨであるという条件でＯＨである。
好ましくはＸ11−Ｘ20の少なくとも２つがＹである。Ｙは親水性または不存在であることが好ましく、最も好ましくは親水性である。
好ましくは、環Ｅ上に２つのＯＨ基を有する化合物のために、ＯＨ基はパラまたはオルト配置であり、より好ましくはパラ配置である。同様に、環Ｇ上に２つのＯＨ基を有する化合物のために、ＯＨ基はパラまたはオルト配置であることが好ましく、より好ましくはパラ配置である。最も好ましくは、化合物は環Ｅ上のパラ配置で２つのＯＨ基を有する。
本発明によるフラボノイド化合物の一例が以下の化合物である。
Figure 2010505958
 他の例としては、（ＣＡ指標別名）、すなわち、β−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸、（２Ｓ）−２−（２，５−ジヒドロキシフェニル）−３，４−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−４−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−７−イル；およびβ−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸、２−（２，５−ジヒドロキシフェニル）−５−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−７−イルを含むがこれに限定されない。
本発明の別の実施形態によれば、本発明による神経保護プロ求電子化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩または溶媒は、構造化学式ＩＶ、化学式Ｖ、または化学式ＶＩ
Figure 2010505958
 ［式中、
Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、Ｘ26およびＸ27は、それぞれ独立してＨ、ＯＨ、オキソ（＝Ｏ）、またはＹであり、
ＹはＢ−Ｃ−ＤもしくはＣ−Ｂ−ＤまたはＣ−Ｂ−Ｃ−Ｄであり、そのいずれかは環炭素に付着されて縮合環を形成することができ、
Ｂは不存在、カルボニル、カルボキシ、エーテル、スルファニル、アミノ、−ＮＨＣ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−より成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、
Ｃは不存在、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アリール、アリールアルキル、およびアリールアルケニルより成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、かつ縮合環を形成するために環炭素に付着されうるとともに、
Ｄは不存在、カルボキシ、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3、ＮＯ3、ＮＯ2、ＮＯ、アミノ、ヒドロキシル、かつそのエーテルおよびエステル誘導体より成る群から選択される］を有するカルノシン酸（ＣＡ）誘導体である。
好ましくは、Ｂは不存在である。化学式ＩＶ（環Ｈ上に示されている２つのＯＨ基はパラ配置である）および化学式Ｖ（環Ｈ上に示されている２つのＯＨ基はオルト配置である）が好ましく、かつ化学式ＩＶの化合物がより好ましい。好ましくはＸ21およびＸ24は、それぞれ独立してメチル、カルボキシ、−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ3、ＣＨ2ＯＨ、またはＣＨ2ＯＣ（Ｏ）ＣＨ3である。好ましくはＸ22およびＸ23は、それぞれ独立してＨ、ＯＨ、オキソ（＝Ｏ）、または−ＯＣＨ3である。Ｘ25およびＸ27は好ましくはメチルである。好ましくは、Ｘ21、Ｘ26またはＸ27の少なくとも１つはカルボキシであり、かつより好ましくはＸ21およびＸ24の１つはＣＨ3であるとともに、もう１つはカルボキシ、−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、または−ＣＨ2ＯＣ（Ｏ）ＣＨ3であり、かつＸ22およびＸ23の少なくとも１つはヒドロキシまたはオキソである。Ｘ26のＲナンチオマーはＳエナンチオマーであることが好ましい。化学式ＩＶ、ＶおよびＶＩの化合物は、例えば、上述したものと同様の置換基を有するカルノソールおよびカルノソール誘導体を含むと理解すべきである（すなわち、Ｘ26はＹであり、ここでＢおよびＣは不存在であり、かつＤはカルボキシであるとともに、カルボキシ基はＸ22と同じ環炭素に付着される）。
図３はカルノシン酸および種々の神経保護カルノシン酸誘導体の構造を示し、必要に応じて化学式ＩＶまたはＶに関して、カルノシン酸（化合物１）からの以下の変更を示す、すなわち、化合物２、Ｘ24はカルボキシであり、化合物３、Ｘ24はＣＯＯＣＨ3であり、化合物４、Ｘ24はＣＨ2ＯＨであり、化合物５、（オルト、化学式ＶＩ）Ｘ24はＣＯＯＣＨ3であり、（パラ、化学式ＩＶ）Ｘ21はＣＨ2ＯＨであり、化合物６、Ｘ22はオキソ（＝Ｏ）であり、化合物７、Ｘ22はＯＨであり、かつＸ23はオキソ（＝Ｏ）であるとともに、化合物８、Ｘ21は−ＣＨ２ＯＡｃである。
本明細書で使用される以下の用語は指示された意味を有する。
本明細書で使用される（Ａｃと略されうる）「アシル」という語は、単独でまたは組合せて、アルケニル、アルキル、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、複素環、または他の部分に付着したカルボニルを指し、ここでカルボニルに付着した原子は炭素である。「アセチル」基は−Ｃ（Ｏ）ＣＨ3基を指す。「アルキルカルボニル」または「アルカノイル」基は、カルボニル基を通じて親分子部分に付着したアルキル基を指す。かかる基の例として、メチルカルボニルおよびエチルカルボニルが含まれる。アシル基の例として、ホルミル、アルカノイルおよびアロイルが含まれる。
本明細書で使用される「アルケニル」という語は、単独でまたは組合せて、１つもしくはそれ以上の二重結合を有し、かつ２〜２０個、好ましくは２〜６個の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖炭化水素ラジカルを指す。アルケニレンは、エテニレン［（−ＣＨ＝ＣＨ-）、（−Ｃ：：Ｃ−）］など２つもしくはそれ以上の位置で付着した炭素−炭素二重結合を指す。適切なアルケニルラジカルとして、エテニル、プロペニル、２−メチルプロペニル、１，４−ブタジニルなどが含まれる。
本明細書で使用される「アルコキシ」という語は、単独でまたは組合せて、アルキルエーテルラジカルを指し、ここでアルキルという語は以下で定義されている通りである。適切なアルキルエーテルラジカルとして、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシなどが含まれる。
本明細書で使用される「アルキル」という語は、単独でまたは組合せて、１ないし２０個を含み、好ましくは１〜１０個、かつより好ましくは１〜６個の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖アルキルラジカルを指す。アルキル基は、場合により、本明細書で定義されている通り置換されうる。アルキルラジカルの例として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソ−アミル、へキシル、オクチル、ノイルなどが含まれる。
本明細書で使用される「アルキレン」という語は、単独でまたは組合せて、メチレン（−ＣＨ2−）など２つもしくはそれ以上の位置で付着した直鎖または分岐鎖飽和炭化水素由来の飽和脂肪族基を指す。
本明細書で使用される「アルキルアミノ」という語は、単独でまたは組合せて、アミノ基を通じて親分子部分に付着したアルキル基を指す。適切なアルキルアミノ基は、モノアルキル化またはジアルキル化され、例えば、Ｎ−メチルアミノ、Ｎ−エチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ、Ｎ，Ｎ−エチルメチルアミノなどの基を形成しうる。
本明細書で使用される「アルキリデン」という語は、単独でまたは組合せて、炭素−炭素二重結合の１個の炭素原子がアルケニル基が付着されている部分に属するアルケニル基を指す。
本明細書で使用される「アルキルチオ」という語は、単独でまたは組合せて、アルキルチオエーテル（Ｒ−Ｓ−）ラジカルを指し、ここでアルキルという語は上記で定義されている通りであり、かつここで硫黄は単独または二重に酸化されうる。適切なアルキルチオエーテルラジカルの例として、メチルチオ、エチルチオ、ｎ−プロピルチオ、イソプロピルチオ、ｎ−ブチルチオ、イソ−ブチルチオ、ｓｅｃ−ブチルチオ、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、メタンスルホニル、エタンスルフィニルなどが含まれる。
本明細書で使用される「アルキニル」という語は、単独でまたは組合せて、１つもしくはそれ以上の三重結合を有し、かつ２〜２０個、好ましくは２〜６個、より好ましくは２〜４個の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖炭化水素ラジカルを指す。「アルキニレン」は、エチニレン（−Ｃ：：：Ｃ−、−Ｃ≡Ｃ−）など２つの位置で付着した炭素−炭素三重結合を指す。アルキニルラジカルの例として、エチニル、プロピニル、ヒドロキシプロピニル、ブチン−１−イル、ブチン−２−イル、ペンチン−１−イル、３−メチルブチン−１−イル、ヘキシン−２−イルなどが含まれる。
本明細書で使用される「アミド」および「カルバモイル」という語は、単独でまたは組合せて、カルバモイル基を通じて、または逆に親分子部分に付着した以下で述べるアミノ基を指す。本明細書で使用される「Ｃアミド」という語は、単独でまたは組合せて、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ2基を指し、Ｒは本明細書で定義されている通りである。本明細書で使用される「Ｎアミド」という語は、単独でまたは組合せて、ＲＣ（＝Ｏ）ＮＨ基を指し、Ｒは本明細書で定義されている通りである。本明細書で使用される「アシルアミノ」という語は、単独でまたは組合せて、アミノ基を通じて親部分に付着したアシル基を包含する。「アシルアミノ」基の例がアセチルアミノ（ＣＨ3Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）である。
本明細書で使用される「アミノ」という語は、単独でまたは組合せて、−ＮＲＲ’を指し、ここでＲおよびＲ’は独立して水素、アルキル、アシル、ヘテロアルキル、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、およびヘテロシクロアルキルより成る群から選択され、そのいずれかはそれ自体、場合により置換されうる。
本明細書で使用される「アリール」という語は、単独でまたは組合せて、１つ、２つまたは３つの環を含有する炭素環芳香族系を意味し、ここでかかる環は懸垂方法でいっしょに付着され、または縮合されうる。「アリール」という語は、ベンジル、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントリル、インダニル、インデニル、アンヌレニル、アズレニル、テトラヒドロナフチル、およびビフェニルなど芳香族ラジカルを包含する。
本明細書で使用される「アリールアルケニル」または「アラルケニル」という語は、単独でまたは組合せて、アルケニル基を通じて親分子部分に付着したアリール基を指す。
本明細書で使用される「アリールアルコキシ」または「アラルコキシ」という語は、単独でまたは組合せて、アルコキシ基を通じて親分子部分に付着したアリール基を指す。
本明細書で使用される「アリールアルキル」または「アラルキル」という語は、単独でまたは組合せて、アルキル基を通じて親分子部分に付着したアリール基を指す。
本明細書で使用される「アリールアルキニル」または「アラルキニル」という語は、単独でまたは組合せて、アルキニル基を通じて親分子部分に付着したアリール基を指す。
本明細書で使用される「アリールアルカノイル」もしくは「アラルカノイル」または「アロイル」という語は、単独でまたは組合せて、ベンゾイル、ナフトイル、フェニルアセチル、３−フェニルプロピオニル（ヒドロシンナモイル）、４−フェニルブチリル、（２−ナフチル）アセチル、４−クロロヒドロシンナモイルなどアリール置換アルカンカルボン酸由来のアシルラジカルを指す。
本明細書で使用されるアリールオキシという語は、単独でまたは組合せて、オキシを通じて親分子部分に付着したアリール基を指す。
本明細書で使用される「ベンゾ」および「ベンズ」という語は、単独でまたは組合せて、ベンゼン由来の二価ラジカルＣ6Ｈ4＝を指す。例としてベンゾチオフェンおよびベンズイミダゾールが含まれる。
本明細書で使用される「カルバミン酸塩」という語は、単独でまたは組合せて、カルバミン酸（−ＮＨＣＯＯ−）のエステルを指し、これは窒素または酸末端のいずれかから親分子部分に付着されうるとともに、場合により本明細書で定義されている通り置換されうる。
本明細書で使用される「Ｏ−カルバミル」という語は、単独でまたは組合せて、ＯＣ（Ｏ）ＮＲＲ’、基を指し、ＲおよびＲ’は本明細書で定義されている通りである。
本明細書で使用される「Ｎ−カルバミル」という語は、単独でまたは組合せて、ＲＯＣ（Ｏ）ＮＲ’−基を指し、ＲおよびＲ’は本明細書で定義されている通りである。
本明細書で使用される「カルボニル」という語は、単独の場合にはホルミル［−Ｃ（Ｏ）Ｈ］を含み、かつ組合せた場合には−Ｃ（Ｏ）−基である。
本明細書で使用される「カルボキシ」という語は、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、またはカルボン酸素におけるような対応する「カルボキシレート」陰イオンを指す。「Ｏ−カルボキシ」基はＲＣ（Ｏ）Ｏ−基を指し、ここでＲは本明細書で定義されている通りである。「Ｃ−カルボキシ」基は−Ｃ（Ｏ）ＯＲ基を指し、ここでＲは本明細書で定義されている通りである。
本明細書で使用される「シアノ」という語は、単独でまたは組合せて、−ＣＮを指す。
本明細書で使用される「シクロアルキル」という語は、単独でまたは組合せて、飽和した、または部分的に飽和した単環、二環または三環式のアルキルラジカルを指し、ここでそれぞれの環部分は３〜１２個、好ましくは５〜７個の炭素原子環員を含有し、かつ場合より、本明細書で定義されている通り場合により置換されたベンゾ縮合環系でありうる。かかるシクロアルキルの例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロへキシル、シクロヘプチル、オクタヒドロナフチル、２、３−ジヒドロ−１Ｈ−インデニル、アダマンチルなどが含まれる。本明細書で使用される「二環」および「三環」は、デカヒドロナフタレン、オクタヒドロナフタレンのほか、多環（多中心）式の飽和した、または部分的に不飽和の型など両方の縮合環系を含むことが意図されている。異性体の後者の型は、ビシクロ［１，１，１］ペンタン、ショウノウ、アダマンタン、およびビシクロ［３，２，１］オクタンによって一般に例示される。
本明細書で使用される「エステル」という語は、単独でまたは組合せて、炭素原子で連結された２つの部分を架橋するカルボキシ基を指す。
本明細書で使用される「エーテル」という語は、単独でまたは組合せて、炭素原子で連結された２つの部分を架橋するオキシ基を指す。
本明細書で使用される「ハロ」または「ハロゲン」という語は、単独でまたは組合せて、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を指す。
本明細書で使用される「ハロアルコキシ」という語は、単独でまたは組合せて、酸素原子を通じて親分子部分に付着したハロアルキル基を指す。
本明細書で使用される「ハロアルキル」という語は、単独でまたは組合せて、上記の定義と同じ意味を有するアルキルラジカルを指し、ここで１つもしくはそれ以上の水素がハロゲンで置き換えられている。具体的に包含されるのは、モノハロアルキル、ジハロアルキルおよびポリハロアルキルラジカルである。モノハロアルキルラジカルは、例えば、ラジカル内にヨード、ブロモ、クロロまたはフルオロ原子を有しうる。ジハロアルキルおよびポリハロアルキルラジカルは２個もしくはそれ以上の同じ原子または異なる組合せのハロラジカルを有しうる。ハロラジカルの例として、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、ペンタフルオロエチル、ヘプタフルオロプロピル、ジフルオロクロロメチル、ジクロロフルオロメチル、ジフルオロエチル、ジフルオロプロピル、ジクロロエチルおよびジクロロプロピルが含まれる。「ハロアルキレン」は２つもしくはそれ以上の位置で付着したハロアルキル基を指す。例として、フルオロメチレン（−ＣＦＨ−）、ジフルオロメチレン（−ＣＦ２−）、クロロメチレン（−ＣＨＣｌ−）などが含まれる。
本明細書で使用される「ヘテロアルキル」という語は、単独でまたは組合せて、完全に飽和した、もしくは１〜３程度の不飽和を含有し、規定数の炭素原子およびＯ、Ｎ、およびＳより成る群から選択される１〜３個のヘテロ原子から成る安定な直鎖もしくは分岐鎖、または環炭化水素ラジカル、またはその組合せを指し、ここで窒素および硫黄原子は場合により酸化されうるとともに、窒素へテロ原子は場合により四級化されうる。ヘテロ原子（類）Ｏ、ＮおよびＳはヘテロアルキル基の任意の内部位置に配置されうる。例えば、−ＣＨ2−ＮＨ−ＯＣＨ3など２個までのヘテロ原子が連続的でありうる。
本明細書で使用される「ヘテロアリール」という語は、単独でまたは組合せて、３〜７員の、好ましくは５〜７員の、不飽和のヘテロ単環式の環、または縮合多環式の環を指し、ここで縮合環の少なくとも１つは不飽和であり、ここで少なくとも１個の原子はＯ、Ｓ、およびＮより成る群から選択される。この語は、複素環ラジカルがアリールラジカルと縮合し、ここでヘテロアリールラジカルが他のヘテロアリールラジカルと縮合し、またはここでヘテロアリールラジカルがシクロアルキルラジカルと縮合している縮合多環基をも包含する。ヘテロアリール基の例としては、ピロリル、ピロリニル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアゾリル、ピラニル、フリル、チエニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、イソチアゾリル、インドリル、イソインドリル、インドリジニル、ベンズイミダゾリル、キノリル、イソキノリル、キノキサリニル、キナゾリニル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾピラニル、ベンゾキサゾリル、ベンゾキサジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、クロモニル、クマリニル、ベンゾピラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラゾロピリダジニル、テトラヒドロイソキノリニル、チエノピリジニル、フロピリジニル、ピロロピリジニルなどが含まれる。例となる三環式複素環基としてはカルバゾリル、ベンズイドリル、フェナントロリニル、ジベンゾフラニル、アクリジニル、フェナントリジニル、キサンテニルなどが含まれる。
本明細書で使用される「ヘテロシクロアルキル」という語および、同じ意味での「複素環」という語は、単独でまたは組合せて、それぞれ、少なくとも１個、好ましくは１〜４個、かつより好ましくは１〜２個のヘテロ原子を環員として含有する飽和した、部分的に不飽和の、または完全に不飽和の単環式、二環式、または三環式の複素環ラジカルを指し、ここでそれぞれ前記へテロ原子は独立して窒素、酸素、および硫黄より成る群から選択され、かつここで好ましくはそれぞれの環において３〜８個の環員、より好ましくはそれぞれの環において３〜７個の環員、かつ最も好ましくはそれぞれの環において５〜６個の環員が存在する。「ヘテロシクロアルキル」および「複素環」は、スルホン、スルホキシド、第三級窒素環員のＮ−オキシド、かつ炭素環縮合系およびベンゾ縮合環系を含むことが意図されており、また、両方の語は、複素環が、本明細書で定義されているアリール基に縮合している系、または追加の複素環基をも含む。本発明の複素環基は、アジリジニル、アゼチジニル、１，３−ベンゾジオキソリル、ジヒドロイソインドリル、ジヒドロイソキノリニル、ジヒドロシンノリニル、ジヒドロベンゾジオキシニル、ジヒドロ［１，３］オキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジニル、ベンゾチアゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロピリジニル、１，３−ジオキサニル、１，４−ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、イソインドリニル、モルホリニル、ピペラジニル、ピロリジニル、テトラヒドロピリジニル、ピペリジニル、チオモルホリニル、などによって例示される。複素基は、特に禁止されていない限り、場合により置換されうる。
本明細書で使用される「ヒドラジニル」という語は、単独でまたは組合せて、単結合によって連結される２つのアミノ基、すなわち、−Ｎ−Ｎ−を指す。
本明細書で使用される「ヒドロキシ」という語は、単独でまたは組合せて、−ＯＨを指す。
本明細書で使用される「ヒドロキシアルキル」という語は、単独でまたは組合せて、アルキル基を通じて親分子部分に付着したヒドロキシ基を指す。
本明細書で使用される「イミノ」という語は、単独でまたは組合せて、＝Ｎ−を指す。
本明細書で使用される「イミノヒドロキシ」という語は、単独でまたは組合せて、＝Ｎ（ＯＨ）および＝Ｎ−Ｏ−を指す。
「主鎖における」という語句は、本発明の化合物への基の付着の点で開始する炭素原子の最長の隣接鎖または近接鎖を指す。
「イソシアナート」という語は、−ＮＣＯ基を指す。
「イソチオシアナート」という語は、−ＮＣＳ基を指す。
「原子の直鎖」という語句は、炭素、窒素、酸素および硫黄から独立して選択される原子の最長の直鎖を指す。
本明細書で使用される「低」という語句は、単独でまたは組合せて、１個ないし、かつ６個を含む炭素原子を含有することを意味する。
本明細書で使用される「メルカプチル」という語は、単独でまたは組合せて、ＲＳ基を指すが、Ｒは本明細書で定義されている通りである。
本明細書で使用される「ニトロ」という語は、単独でまたは組合せて、−ＮＯ2を指す。
本明細書で使用される「オキシ」または「オキサ」という語は、単独でまたは組合せて、−Ｏを指す。
本明細書で使用される「オキソ」という語は、単独でまたは組合せて、＝Ｏを指す。
「ペルハロアルコキシ」という語は、水素原子のすべてがハロゲン原子によって置き換えられているアルコキシ基を指す。
本明細書で使用される「ペルハロアルキル」という語は、単独でまたは組合せて、水素原子のすべてがハロゲン原子によって置き換えられているアルキル基を指す。
本明細書で使用される「スルホン酸塩」、「スルホン酸」、および「スルホン」という語は、単独でまたは組合せて、−ＳＯ3Ｈ基およびスルホン酸が塩の生成で使用されるとその陰イオンを指す。
本明細書で使用される「スルファニル」という語は、単独でまたは組合せて、−Ｓ−を指す。
本明細書で使用される「スルフィニル」という語は、単独でまたは組合せて、−Ｓ（Ｏ）−を指す。
本明細書で使用される「スルホニル」という語は、単独でまたは組合せて、−Ｓ（Ｏ）2−を指す。
「Ｎ−スルホンアミド」という語は、ＲＳ（＝Ｏ）2ＮＲＲ’を指し、ＲおよびＲ’は本明細書で定義されている通りである。
「Ｓ−スルホンアミド」という語は、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲＲ’、基を指し、ＲおよびＲ’は本明細書で定義されている通りである。
本明細書で使用される「チア」および「チオ」という語は、単独でまたは組合せて、−Ｓ−基またはエーテルを指し、ここで酸素は硫黄で置き換えられている。チオ基の酸化誘導体、すなわちスルフィニルおよびスルホニルは、チアおよびチオの定義に含まれている。
本明細書で使用される「チオール」という語は、単独でまたは組合せて、−ＳＨ基を指す。
本明細書で使用される「チオカルボニル」という語は、単独の場合にはチオホルミル−Ｃ（Ｓ）Ｈを含み、かつ組合される場合には−Ｃ（Ｓ）−基である。
「Ｎ−チオカルバミル」という語は、ＲＯＣ（Ｓ）ＮＲ’−基を指し、ＲおよびＲ’は本明細書で定義されている通りである。
「Ｏ−チオカルバミル」という語は、−ＯＣ（Ｓ）ＮＲＲ’、基を指し、ＲおよびＲ’およびＲ’は本明細書で定義されている通りである。
「チオシアナート」という語は、−ＣＮＳ基を指す。
「トリハロメタンスルホンアミド」という語は、Ｘ3ＣＳ（Ｏ）2ＮＲ−基を指し、Ｘはハロゲンであり、かつＲは本明細書で定義されている通りである。
「トリハロメタンスルホニル」という語は、Ｘ3ＣＳ（Ｏ）2−基を指し、ここでＸはハロゲンである。
「トリハロメトキシ」という語は、Ｘ3ＣＯ−基を指し、ここでＸはハロゲンである。
本明細書で使用される「三置換シリル」という語は、単独でまたは組合せて、置換アミノの定義下に本明細書で示されている基によりその３つの自由原子価で置換されているシリコーン基を指す。例としては、トリメチシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、トリフェニルシリルなどが含まれる。
本明細書でのずれの定義も他の定義と組合せて使用し、複合構造基を記述することができる。慣例により、かかる定義の後続要素は、親部分に付着するものである。例えば、複合基アルキルアミドは、アミド基を通じて親分子に付着したアルキル基を表すことになり、かつアルコキシアルキルという語はアルキル基を通じて親分子に付着したアルコキシキ基を表すことになる。
基が「不存在」であることが定義されると、前記基がないことが意味される。
「場合により置換される」という語は、置換または非置換されうる先行する基を意味する。置換される場合、「場合により置換される」基の置換基としては、以下の基または特定の一連の基から、単独でまたは組合せて独立して選択される１つもしくはそれ以上の置換基を含むがこれらに限定されない。すなわち、低アルキル、低アルケニル、低アルキニル、低アルカノイル、低ヘテロアルキル、低ヘテロシクロアルキル、低ハロアルキル、低ハロアルケニル、低ハロアルキニル、低ペルハロアルキル、低ペルハロアルコキシ、低シクロアルキル、フェニル、アリール、アリールオキシ、低アルコキシ、低ハロアルコキシ、オキソ、低アシルオキシ、カルボニル、カルボキシル、低アルキルカルボニル、低カルボキシエステル、低カルボキサミド、シアノ、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、低アルキルアミノ、アリールアミノ、アミド、ニトロ、チオｌ、低アルキルチオ、アリールチオ、低アルキルスルフィニル、低アルキルスルホニル、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、アリールチオ、スルホン酸塩、スルホン酸、三置換シリル、Ｎ３、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ＣＯ２ＣＨ３、ＣＯ２Ｈ、ピリジニル、チオフェン、フラニル、低カルバメート、および低尿素。２つの置換基が結合され、例えばメチレンジオキシまたはエチレンジオキシを形成するために０〜３個のヘテロ原子から成る５員、６員、または７員炭素鎖または複素環を形成しうる。場合により置換される基は非置換され（例えば、−ＣＨ2ＣＨ3）、完全に置換され（例えば、−ＣＦ2ＣＦ3）、一置換され（例えば、−ＣＨ2ＣＨ2Ｆ）または完全置換と一置換との中間のレベルで置換されうる（例えば、−ＣＨ2ＣＦ3）。置換基が置換について限定なしに開示されている場合、置換と非置換の両方の形態が包含されている。置換基が「置換した」としての資格がある場合、置換形態は具体的に意図されている。また、特定の部分に対する異なる一連の任意の置換基が必要と定義されうるが、これらの場合、任意の置換は、多くの場合に「と場合により置換した」という語句の直後に定義される。
特に別の規定がない限り、単独または数の指定なしに現れるＲという語またはＲ’という語は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクロアルキルより成る群から選択される部分を指し、そのいずれかは場合により置換されうる。かかるＲ基およびＲ’基は、本明細書で定義されている通り場合により置換されると理解すべきである。Ｒ基が数の指定を有するかどうかは、Ｒ、Ｒ’およびｎ＝（１、２、３、．．．ｎ）であるＲnを含むすべてのＲ基、すべての置換基、およびすべての用語が、群から選択の点で他のすべてから独立していると理解すべきである。変数、置換基、または用語（例えば、アリール、複素環、Ｒ等）が化学式または一般的構造において２回以上発生することがあれば、それぞれの発生時のその定義は他のすべての発生時での定義から独立している。当業者は、特定の基が親分子に付着し、または記載通りいずれかの末端からの一連の原子の位置を占有しうることをさらに理解するであろう。したがって、ほんの一例として、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−など不斉基が炭素または窒素のいずれかで親部分に付着しうる。
不斉中心が本発明の化合物には存在する。これらの中心は、キラル炭素原子周囲の置換基の配置に応じて「Ｒ」または「Ｓ」の記号で示されている。本発明は、ジアステオレマー、エナンチオマー、およびエピマー形態のほか、ｄ−異性体および１−異性体、およびその混合物を含めてすべての立体化学的異性体形態を包含することを理解すべきである。化合物の個々の立体化学的異性体は、キラル中心を含有する市販の出発原料から合成的に調製され、またはエナンチオマー製品の混合物の調製後にジアステレオマーの混合物への変換などの分離後に分離または再結晶化、クロマトグラフィー法、キラルクロマトグラフィーカラム上でのエナンチオマーの直接分離、または当業界で周知の適切な方法によって調製されうる。特定の立体化学の開始化合物は市販され、または当業界で周知の方法によって作製および分解されうる。また、本発明の化合物は幾何異性体として存在しうる。本発明は、すべてのｃｉｓ、ｔｒａｎｓ、ｓｙｎ、ａｎｔｉ、ｅｎｔｇｅｇｅｎ（Ｅ）異性体、およびｚｕｓａｍｍｅｎ（Ｚ）異性体のほか、その適切な混合物を含む。また、化合物は互変異性体として存在しうるが、すべての互変異性異性体が本発明によって提供される。また、本発明の化合物は、水、エタノールなど薬学的に許容される溶媒により非溶媒和形態および溶媒和形態で存在しうる。一般に、溶媒和形態は本発明のための非溶媒和形態と等価であると考えられている。
したがって、例えば、本明細書で考えられるのは、Ｒエナンチオマーを実質的に含んでいないＳエナンチオマーを含んでなる組成物、またはＳエナンチオマーを実質的に含んでいないＲエナンチオマーを含んでなる組成物である。「実質的に含んでいない」によって、組成物は１０％未満、または８％未満、または５％未満、または３％未満、または１％未満の微量エナンチオマーを含んでなることが意味される。特定の化合物が２個以上のキラル中心を含んでなる場合は、本開示の範囲は種々のジアステレオマーの混合物を含んでなる組成物のほか、他のジアステレオマーを実質的に含まないそれぞれのジアステレオマーを含んでなる組成物をも含む。その特定のジアステレオマーのいずれも考慮しない化合物の列挙には、４つのすべてのジアステレオマーを含んでなる組成物、Ｒ、ＲおよびＳ、Ｓ異性体のラセミ混合物を含んでなる組成物、Ｒ、ＳおよびＳ、Ｒ異性体のラセミ混合物を含んでなる組成物、その他のジアステレオマーを実質的に含まないＲ、Ｒエナンチオマーを含んでなる組成物、その他のジアステレオマーを実質的に含まないＳ、Ｓエナンチオマーを含んでなる組成物、その他のジアステレオマーを実質的に含まないＲ、Ｓエナンチオマーを含んでなる組成物、およびその他のジアステレオマーを実質的に含まないＳ、Ｒエナンチオマーを含んでなる組成物が含まれる。
「結合」という語は、結合によって連結された原子が大きめの下部構造の一部であると考えられる場合に２個の原子間、または２個の部分間の共有結合を指す。結合は、他に特に規定がなければ、単一、二重、または三重でありうる。分子の図面における２個の原子間の点線は、追加の結合がその位置で存在し、または存在しないことを示す。
カテコール型神経保護求電子剤の追加の例が表１に示されている。
表１：パラ配置で２つのＯＨ基とともにコアベンゼン環を有する種々のカテコール型神経保護求電子化合物
Figure 2010505958
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本発明の神経保護求電子化合物には、例えば、上述した神経保護求電子化合物におけるヒドロキシル基およびカルボキシ基のエステルおよびエーテル誘導体も含まれるが、これらは、例えば、薬物送達および化学的安定性を増大させうる。
本発明によるプロ求電子剤（本明細書ではかかる神経保護求電子剤のプロドラッグとも称される）の例として、例えば、パラカルノシン酸、カルノソール等を含むカルノシン酸およびその誘導体（図１および図３を参照）が含まれるがこれらに限定されない。カルノシン酸の誘導体は当業界で公知であり、例えば、米国特許第６，４７９，５４９号明細書および米国特許出願第 ２００４００１４８０８号明細書を参照。
他の天然由来および合成テルペノイドおよびフラボノイド化合物も神経保護的である。
他の特徴を有する化合物を除外することを意図せず、かかるプロ求電子剤は、好ましくは、それらが血液−脳関門を通過させることを可能にするために親油性であり、かつ水溶性であるために親水性である。
かかるプロ電子剤の中には、「病理学的に活性化され」うる、すなわち、それらが治療を必要とするまさしく酸化的ストレスによって活性化されうる化合物が含まれる。したがって、（例えば、脳におけるなど）酸化的ストレス下の標的組織において、それらは神経保護求電子化合物に変換される。かかる病理学的に活性化されるプロ求電子剤の使用は、それらが損傷組織においてのみ、または主にそこで活性化されるため副作用を削減する。かかるプロ求電子剤の中には、例えば、本発明による神経保護求電子化合物のパラ類似体も含まれる。かかるパラ類似体は場合により病理学的に活性化されうる。
本明細書中で使用される場合、「神経防護作用物質」は、低酸素症、虚血、異常なミスフォールドしたタンパク質、興奮毒、フリーラジカル、小胞体ストレス因子、ミトコンドリアストレス因子（電子伝達系の阻害因子が挙げられるが、これに限定されない）、およびゴルジ装置拮抗物質によって引き起こされる神経ストレスを含めた（これらに限定されない）、ストレスからニューロンを保護する任意の物質である。同様に、本明細書中で使用される場合、用語「神経防護作用」は、ストレスからのニューロンの任意の検出可能な保護をいう。本発明の神経保護組成物および方法は、実施例において示されている通り、細胞の細胞傷害、損傷または死を防ぎ、または遅らせる。
神経防護作用は、例えば、ストレス後の大脳皮質培養物におけるアポトーシスニューロンの数の減少によるニューロン死の遅延または防止を測定することにより、直接測定されてよい。神経防護作用はまた、例えば、ＭＣＡＯ／再灌流傷害後の脳梗塞のサイズの減少を測定することにより、例えば、このようなストレス後の神経系の組織または器官に対する損傷の重症度もしくは程度、またはこのような組織または器官による機能喪失を測定することにより、直接測定されてもよい。神経防護作用は、ニューロンを保護するための１つ以上の生物学的機構の活性化を検出することにより間接的に測定されてもよく、この検出としては、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路の活性化および／または１種以上の第２相酵素（ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）が挙げられるがこれに限定されない）の誘発を検出することが挙げられるが、これに限定されない。ニューロン保護を検出し測定する方法は、以下の実施例で提供され、そして他のこのような方法は当該技術分野で公知である。
本明細書中で使用される場合、「ＮＥＰＰ」は、神経突起伸長促進性プロスタグランジン（Δ7−プロスタグランジンＡ1類似体）ならびにその任意の誘導体および薬学的に許容可能な塩をいう。
本明細書中で使用される場合、「剤」は、所望の生物学的活性を有する任意の物質をいう。例えば、「神経防護作用剤」は、酸化ストレスからニューロンを保護することにおいて、検出可能な生物学的活性を有する。加えて、神経防護作用剤は、例えば、宿主において酸化ストレスによって引き起こされる状態およびその症状（脳虚血／再灌流傷害（発作）および種々の神経変性障害が挙げられるが、これらに限定されない）を処置することにおいて、検出可能な生物学的活性を有する。
本明細書中で使用される場合、「神経学的薬剤」は、神経系に対して効果を有する物質（例えば、化合物）、例えば、神経系に影響を及ぼす障害を処置、阻害もしくは予防することができる化合物、あるいは神経障害および／もしくは眼科障害またはそれらの症状を誘発することができる化合物をいう。
本明細書中で使用される場合、「有効量」は、観察可能な生物学的効果において検出可能な差（このような効果の統計的に有意な差が挙げられるが、これに限定されない）を引き起こす組成物の量をいう。この検出可能な差は、その組成物の単一の物質から、その組成物中の物質の組合せから、または複数の組成物の投与の組合せ効果から生じてもよい。例えば、「有効量」の本発明にかかる神経防護作用組成物は、適切なインビトロまたはインビボアッセイにおいて、ニューロン死の遅延、防止、または減少、あるいはストレス後の神経系の組織または器官に対する損傷の重症度もしくは程度、またはこのような組織または器官による機能喪失の減少を検出可能に測定するか、または別の態様で示す、その組成物の量をいう。また、本発明にかかる「有効量」の神経防護作用組成物は、適切なアッセイにおいて、ニューロンを保護するための１つ以上の生物学的機構を検出可能に活性化する（Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路の活性化および／または１種以上の第２相酵素（ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）が挙げられるがこれに限定されない）の誘発を検出することが挙げられるが、これに限定されない）、組成物の量をいう。
所与の組成物または処置における本発明の神経防護作用物質と別の活性成分との組合せは、相乗的な組合せであるかも知れない。用語「併用療法」とは、本開示に記載された治療的病態または障害を治療するために、２種以上の治療薬を投与することを意味する。このような投与は、一定比率の活性成分を有する単一カプセル、または各活性成分に関して複数の別個のカプセルなどにおいて、実質的に同時的様式におけるこれらの治療薬の同時投与を包含する。このような投与はまた、連続的様式における各タイプの治療薬の使用も包含する。いずれの場合でも、該治療法は、本明細書に記載された病態または障害の治療において、薬剤併用の有益な効果を提供する。
例えばＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙ， Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ．２２：２７−５５（１９８４）によって記載される用語「相乗効果」は、組合せて投与された場合のその化合物の効果が、単一の薬剤として単独で投与された場合のそれらの化合物の加法的な効果より大きい場合に起こる。一般に、相乗効果は、化合物の次善の濃度で最もはっきりと示される。相乗効果は、個々の成分と比較したより低い細胞毒性、活性の上昇、または組合せの何らかの他の有益な効果という点であってよい。
本発明にかかる神経防護作用物質は、必要に応じて別の神経防護薬または他の活性成分と同時投与され得る。この他の活性成分としては、抗緑内障薬、βアドレナリン遮断薬、炭酸脱水酵素阻害剤、縮瞳薬、交感神経刺激薬、アセチルコリン遮断薬、抗ヒスタミン薬、抗ウイルス薬、キノロン、抗炎症薬、ステロイド系または非ステロイド系の抗炎症薬、抗鬱薬（例えば、セロトニン再取り込み阻害剤、ＳＳＲＩなど）、精神治療薬、抗不安薬、鎮痛薬、抗てんかん薬、抗痙攣薬、ガバペンチン、降圧薬、ベンゾポルフィリン光増感剤、免疫抑制性代謝拮抗薬、抗痙攣薬、バルビツール酸系催眠薬、ベンゾジアゼピン系薬剤、ＧＡＢＡ阻害剤、ヒダントイン、抗精神病薬、神経遮断薬（ｎｅｕｒｏｌａｐｔｉｃ）、抗運動障害薬（ａｎｔｉｄｙｓｋｎｅｔｉｃ）、アドレナリン系薬物、三環系抗鬱薬、抗低血糖薬（ａｎｔｉ−ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉｃ）、グルコース溶液、ポリペプチドホルモン、抗生物質、血小板溶解薬、抗凝血薬、抗不整脈薬、副腎皮質ステロイド薬、発作性疾患のための薬剤、抗コリンエステラーゼ薬、ドーパミンブロッカー、抗パーキンソン病薬、筋弛緩薬、抗不安性筋弛緩薬、ＣＡＮ賦活薬、制吐薬、βアドレナリン遮断薬、麦角誘導体、イソメテプテン、抗セロトニン作用薬（ａｎｔｉｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ａｇｅｎｔ）、鎮痛薬、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、モノアミン酸化酵素阻害剤、ＡＩＤＳ補助薬、抗感染薬、全身性ＡＩＤＳ補助抗感染薬（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ＡＩＤＳ ａｄｊｕｎｃｔ ａｎｔｉ−ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ）、ＡＩＤＳ化学療法薬、ヌクレオシド系逆転写酵素、およびプロテアーゼ阻害剤の１種以上が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用される場合、「処置する」ことは、（ｉ）病的状態が発生することを防止すること（例えば、予防）、（ｉｉ）その病的状態を阻害すること、またはその進行を停止させること、および（ｉｉｉ）その病的状態を解放すること、ならびに／あるいはこのような病的状態に関連する１つ以上の症状を予防するか、またはその重症度を低下させることを含む。
本明細書中で使用される場合、用語「患者」は、本発明の組成物および方法によって治療されるべき生物をいう。このような生物としては、哺乳動物が挙げられるがこれに限定されず、哺乳動物としては、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウスなどが挙げられるがこれらに限定されない。このような生物としてはまた、本発明にかかる神経防護作用物質のスクリーニングにおいて有用な、他の生物、ならびにこのような生物の細胞、組織および器官が挙げられる。本発明に関しては、用語「被検体」は、一般に、処置（例えば、本発明にかかる神経防護作用物質を含む組成物の投与）を将来受けるかまたはすでに受けた個体をいう。
本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容可能な塩」は、本発明にかかる神経防護作用物質の誘導体であって、親化合物がその酸塩または塩基塩を作製することにより改変されている誘導体をいう。薬学的に許容可能な塩の例としては、塩基性残基（例えば、アミン）の鉱酸または有機酸の塩；酸性残基（例えば、カルボン酸など）のアルカリ塩もしくは有機塩が挙げられるが、これらに限定されない。この薬学的に許容可能な塩は、例えば、無毒の無機もしくは有機酸から形成される親化合物の従来の無毒の塩または四級アンモニウム塩を含む。例えば、このような従来の無毒の塩としては、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などのような無機酸から誘導される塩；ならびに酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸などのような有機酸から調製される塩が挙げられる。
本発明の組成物および方法において有用なＮＥＰＰまたは他の神経防護作用物質の薬学的に許容可能な塩は、塩基性部分または酸性部分を含有する親化合物から従来の化学的方法によって合成され得る。一般に、このような塩は、これらの化合物の遊離酸または遊離塩基の形態を、水中もしくは有機溶媒中、またはそれら２種の混合物中で化学量論量の適切な塩基または酸と反応させることにより調製され得る。一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水系媒体が好ましい。適切な塩の一覧は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１７版， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１４１８頁（１９８５）に見出され、参照によりこれを本明細書に援用する。
語句「薬学的に許容可能な」は、本明細書において、妥当な医学的判断の範囲内で、適度な便益／リスク比と釣り合って過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題または合併症なしにヒトおよび動物の組織と接触して使用するために適切な化合物、物質、組成物、および／または剤形をいうために用いられる。
本発明にかかる神経防護作用物質は、親化合物、その親化合物のプロドラッグ、またはその親化合物の薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、もしくは活性代謝産物として投与され得る。
「プロドラッグ」は、このようなプロドラッグが哺乳類の被検体に投与された場合にインビボで本発明の活性な親薬物または他の化学分子もしくは化合物を放出する、任意の共有結合された物質を包含することが意図されている。本発明の化合物のプロドラッグは、その化合物に存在する官能基を、このような改変部分がインビボでの慣用の操作のいずれかで親化合物に切断されるように改変することによって、調製される。プロドラッグの例としては、患者内で代謝され神経防護作用がある求電子化合物を形成するプロ求電子性のテルペノイドまたはフラボノイド化合物（ジテルペンまたはトリテルペン（例えば、カルノシン酸））が挙げられるが、これらに限定されない。一例として、このようなプロ求電子化合物は、（例えば、パーキンソン病において観察されるように、）酸化ストレス下にある神経系の細胞および組織において酸化によって活性化され得る（求電子性代謝産物へと代謝される）であろう。従って、このプロドラッグは、病理学的活性を介して活性化されて神経防護作用求電子性代謝産物を形成し、神経防護作用が必要とされる標的部位に神経防護作用をもたらすであろう。
「代謝産物」は、このような本発明の活性な親薬物または他の化学分子もしくは化合物が哺乳類の被検体に投与された場合に生細胞が本発明の活性な親薬物または他の化学分子もしくは化合物とインビボで相互作用する生化学的プロセスから生じる任意の物質をいう。代謝産物は、任意の代謝経路に由来する生成物または中間体を包含する。
本明細書中で使用される場合、「代謝経路」は、１つの化合物を別の化合物に変換して細胞機能のための中間体およびエネルギーを提供する一連の酵素が媒介する反応をいう。この代謝経路は、一方向（ｌｉｎｅａｒ）またはサイクリック（ｃｙｃｌｉｃ）であり得る。
本明細書中で使用される場合、「神経障害」は、神経系および／または視覚系の任意の障害をいう。「神経障害」は、中枢神経系（脳、脳幹および小脳）、末梢神経系（脳神経を含む）、ならびに自律神経系（この一部は中枢神経系および末梢神経系の両方に存在する）が関与する障害を包含する。神経障害の主要な群としては、頭痛、昏迷および昏睡、認知症、てんかん、睡眠障害、外傷、感染、腫瘍（ｎｅｏｐｌａｓｍ）、神経眼科学、運動障害、脱髄性疾患、脊髄障害、ならびに末梢神経、筋肉、および神経筋接合部の障害が挙げられるが、これらに限定されない。嗜癖および精神疾患としては双極性障害が挙げられるが、これらに限定されず、そして統合失調症もまた、神経障害の定義内に包含される。以下に挙げるのは、本発明にかかる組成物および方法を用いて治療することができるいくつかの神経障害、症状、徴候および症候群の一覧である：後天性てんかん様失語症（ａｃｑｕｉｒｅｄ ｅｐｉｌｅｐｔｉｆｏｒｍ ａｐｈａｓｉａ）；急性散在性脳脊髄炎；副腎白質ジストロフィー；加齢性黄斑変性症；脳梁欠損症；失認；アイカルディ症候群；アレキサンダー病；アルパース病；交代性片麻痺；アルツハイマー病；血管性認知症；筋萎縮性側策硬化症；無脳症；アンジェルマン症候群；血管腫症；無酸素症；失語症；失行症；くも膜嚢胞；くも膜炎；アーノルド−キアリ奇形；動静脈奇形；アスペルガー症候群；毛細血管拡張性運動失調症；注意欠陥多動性障害；自閉症；自律神経障害；背痛；バッテン病；ベーチェット病；ベル麻痺；良性本態性眼瞼けいれん；良性限局性筋萎縮症（ｂｅｎｉｇｎ ｆｏｃａｌ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｙ）；良性頭蓋内圧亢進症；ビンスワンガー病；眼瞼痙攣；ブロッホ−ズルツベルガー症候群；腕神経叢損傷；脳膿瘍；脳傷害；脳腫瘍（多形神経膠芽腫を含む）；脊椎腫瘍；ブラウン・セカール症候群；カナバン病；手根管症候群；灼熱痛；中枢痛症候群；橋中心髄鞘融解；先天性脳障害（ｃｅｐｈａｌｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）；脳動脈瘤；脳動脈硬化症；大脳萎縮症；脳性巨人症；脳性麻痺；シャルコー−マリー−トゥース病；化学療法起因性のニューロパチーおよび神経因性疼痛；キアリ奇形；舞踏病；慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー；慢性痛；慢性局所性疼痛症候群（ｃｈｒｏｎｉｃ ｒｅｇｉｏｎａｌ ｐａｉｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；コフィン−ローリー症候群；昏睡（遷延性植物状態を含む）；先天性顔面両側麻痺；皮質基底核変性症；頭部動脈炎；頭蓋骨癒合症；クロイツフェルト−ヤコブ病；累積外傷性障害；クッシング症候群；巨大細胞封入体症（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｉｃ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ ｄｉｓｅａｓｅ）；サイトメガロウイルス感染症；ダンシングアイズ−ダンシングフィート症候群（ｄａｎｃｉｎｇ ｅｙｅｓ−ｄａｎｃｉｎｇ ｆｅｅｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；ダンディ・ウォーカー症候群；ドーソン病（Ｄａｗｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ）；ド・モルシェ症候群（Ｄｅ Ｍｏｒｓｉｅｒ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；デジェリン−クルンプケ麻痺（Ｄｅｊｅｒｉｎｅ−Ｋｌｕｍｋｅ ｐａｌｓｙ）；認知症；皮膚筋炎；糖尿病性神経障害；広汎性硬化症；自律神経障害；書字障害；失読症；ジストニア；早期乳児てんかん性脳症；トルコ鞍空虚症候群；脳炎；脳ヘルニア；脳三叉神経領域血管腫症；癲癇；エルプ麻痺（Ｅｒｂ’ｓ ｐａｌｓｙ）；本態性振戦；ファブリー病；ファール症候群（Ｆａｈｒ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；失神；家族性痙性麻痺；熱性痙攣；フィッシャー症候群；フリードライヒ運動失調症；前頭側頭型認知症および他の「タウオパチー」；ゴーシェ病；ゲルストマン症候群；巨細胞性動脈炎；巨細胞性封入体病；グロボイド細胞白質ジストロフィー；ギラン−バレー症候群；ＨＴＬＶ−１関連脊髄症；ハラーホルデン・スパッツ症候群；頭部傷害；頭痛；片側顔面攣縮；遺伝性痙性対麻痺；遺伝性多発神経炎性失調；耳帯状疱疹；帯状疱疹；平山症候群；ＨＩＶ関連の認知症およびニューロパチー（ＡＩＤＳの神経症状発現も）；全前脳症；ハンチントン病および他のポリグルタミンリピート疾患；水無脳症；水頭症；副腎皮質ホルモン過剰症；低酸素症；免疫介在性脳脊髄炎；封入体筋炎；色素失調症；乳児フィタン酸蓄積症（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ｐｈｙｔａｎｉｃ ａｃｉｄ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅ）；乳児レフサム病；点頭てんかん；炎症性筋疾患；頭蓋内嚢胞；頭蓋内圧亢進；ジュベール症候群；カーンズ−セイヤー症候群；ケネディ病、キンズボーン症候群（Ｋｉｎｓｂｏｕｒｎｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；クリッペル・ファイル症候群；クラッベ病；クーゲルベルク−ヴェランダー病；クールー；ラフォラ病；ランバート−イートン筋無力症症候群；ランドウ・クレフナー症候群；外側髄（ワレンベルク）症候群；学習障害；リー病；レノックス−ガストー症候群（Ｌｅｎｎｏｘ−Ｇｕｓｔａｕｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；レッシュ−ナイハン症候群；白質ジストロフィー；レビー小体型認知症；脳回欠損；閉じ込め症候群；ルー・ゲーリック病（すなわち、運動ニューロン疾患または筋萎縮性側策硬化症）；腰部椎間板症；ライム病−神経系後遺症；マシャド−ジョセフ病；大脳髄症；巨大脳髄症；メルカーソン−ローゼンタール症候群；メニエール病；髄膜炎；メンケス病；異染性白質ジストロフィー；小頭症；片頭痛；ミラー−フィッシャー症候群；小卒中；ミトコンドリア筋障害；ミトコンドリア筋疾患；メービウス症候群；単肢筋萎縮症（ｍｏｎｏｍｅｌｉｃ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｙ）；運動ニューロン疾患；もやもや病；ムコ多糖症；多発性脳梗塞性認知症；多巣性運動ニューロパチー；多発性硬化症および他の脱髄性障害；体位性低血圧を伴う多系統萎縮症；筋ジストロフィー；重症筋無力症；ミエリン破壊性広汎性硬化症；乳児期ミオクロニー脳症；ミオクロニー；筋疾患；先天性筋強直症；ナルコレプシー；神経線維腫症；向精神薬悪性症候群；ＡＩＤＳの神経症状発現；狼瘡の神経系後遺症；神経筋強直症；神経セロイドリポフスチン症；ニューロン遊走異常；ニーマン−ピック病；オサリバン−マックレオド症候群（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ−ＭｃＬｅｏｄ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；後頭神経痛；潜在性脊椎管列癒合異常（ｏｃｃｕｌｔ ｓｐｉｎａｌ ｄｙｓｒａｐｈｉｓｍ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）；大田原症候群；オリーブ橋小脳萎縮症；眼球クローヌス・ミオクローヌス；視神経炎；起立性低血圧；過剰使用症候群；錯感覚；パーキンソン病；先天性パラミオトニア；腫瘍随伴性疾患；発作性発病；パリー−ロンベルク症候群（Ｐａｒｒｙ Ｒｏｍｂｅｒｇ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；ペリツェウス−メルツバッハー病；周期性四肢麻痺；末梢神経障害；有痛性神経障害および神経因性疼痛；遷延性植物状態；広汎性発達障害；光性くしゃみ反射；フィタン酸蓄積症；ピック病；神経圧迫（ｐｉｎｃｈｅｄ ｎｅｒｖｅ）；下垂体腫瘍；多発性筋炎；孔脳症；ポリオ後症候群；帯状疱疹後神経痛；麻疹後脳脊髄炎；体位性低血圧；プラダー−ウィリー症候群；原発性側索硬化症；プリオン病；進行性片側顔面萎縮症；進行性多病巣性白質脳症；進行性硬化性ポリオジストロフィー；進行性核上性麻痺；偽脳腫瘍；ラムゼイ−ハント症候群（Ｉ型およびＩＩ型）；ラスムッセン脳炎（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ’ｓ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）；反射性交感神経性ジストロフィー；レフサム病；反復運動性疾患；反復性ストレス傷害；下肢静止不能症候群；レトロウイルス関連脊髄症；レット症候群；ライ症候群；聖ウィトゥス舞踏病（Ｓａｉｎｔ Ｖｉｔｕｓ ｄａｎｃｅ）；ザントホフ病；シルダー病；裂脳症；中隔視神経異形成症；揺さぶられっ子症候群；帯状疱疹；シャイ−ドレーガー症候群；シェーグレン症候群；睡眠時無呼吸；ソートー症候群；痙縮；二分脊椎；脊髄傷害；脊髄腫瘍；脊髄性筋萎縮症；全身硬直症候群；発作；スタージ−ウェーバー症候群；亜急性硬化性汎脳炎；皮質下動脈硬化性脳症；シデナム舞踏病；失神；脊髄空洞症；遅発性ジスキネジア；テイ−サックス病；側頭動脈炎；脊髄係留症候群（ｔｅｔｈｅｒｅｄ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；トムゼン病（Ｔｈｏｍｓｅｎ ｄｉｓｅａｓｅ）；胸郭出口症候群；疼痛性チック；トッド麻痺；トゥレット症候群；一過性脳虚血発作；伝染性海綿状脳症；横断性脊髄炎；外傷性脳損傷；振戦；三叉神経痛；熱帯痙性不全対麻痺症；結節硬化症；血管性認知症（多発性脳梗塞性認知症）；側頭動脈炎を含む脈管炎；フォンヒッペル−リンダウ病；ワレンベルク症候群；ウェルドニッヒ−ホフマン病；ウエスト症候群；むち打ち；ウィリアムズ症候群；ウィルソン病；ならびにツェルウェーガー症候群。
本明細書中で使用される場合、「眼科疾患」または「眼科障害」は、視覚系の生体構造および／または機能が関与する疾患または障害をいう。その例としては、緑内障、網膜動脈閉塞症、虚血性視神経症および黄斑変性症（滲出型または非滲出型）が挙げられるが、これらに限定されない。
神経障害は、感情障害（例えば、鬱病または不安症）であってもよい。本明細書中で使用される場合、「感情障害」または「気分障害」は、気分の障害（ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅ）を主な特徴とする種々の状態をいう。軽症で時おりのものであれば、感情は正常であるかも知れない。より重症な場合には、それらは大鬱病性障害または情緒異常反応の徴候であるかも知れないし、または双極性障害の症状を示しているかも知れない。他の気分障害は、一般的な医学的状態によって引き起こされ得る。例えば、Ｍｏｓｂｙ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ， Ｎｕｒｓｉｎｇ ＆ Ａｌｌｉｅｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ， 第５版（１９９８）を参照のこと。
本明細書中で使用される場合、「鬱病」は、悲しみ、失望、および落胆の感情を特徴とする異常な気分障害をいう。鬱病は、悲しみ、憂鬱、落胆（ｄｅｊｅｃｔｉｏｎ）、無気力、空虚感、および絶望感の、不適切で現実とはかけ離れた誇張された感情を特徴とする異常な情動状態をいう。Ｍｏｓｂｙ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ， Ｎｕｒｓｉｎｇ ＆ Ａｌｌｉｅｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ， 第５版（１９９８）を参照のこと。鬱病としては、大鬱病性障害（一度の発症のもの、反復性のもの、軽症のもの、精神病性特徴を伴わずに重症のもの、精神病性特徴を伴って重症のもの、慢性のもの、緊張病の特徴を有するもの、憂鬱な特徴を有するもの、非定型的特徴を有するもの、産後の発症を伴うもの、一部寛解したもの、完全に寛解したもの）、気分変調性障害、押うつ気分をともなう適応障害、混合性の不安症および押うつ気分をともなう適応障害、月経前不快気分障害、軽症の鬱病性障害、反復性の短期間の鬱病性障害、統合失調症の精神病後鬱病性障害、パーキンソン病に関連する大鬱病性障害、および認知症に関連する大鬱病性障害が挙げられるが、これらに限定されない。
神経障害は、疼痛に関連する鬱病（ｐａｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＰＡＤ）であってもよい。本明細書中で使用される場合、「疼痛に関連する鬱病」または「ＰＡＤ」は、疼痛および非定型鬱病の併存症を特徴とする鬱病性障害をいうことが意図されている。具体的には、疼痛は慢性疼痛、神経因性疼痛、またはこれらの組合せであってよい。具体的には、このＰＡＤは、慢性疼痛が非定型鬱病に先立つか、または非定型鬱病が慢性疼痛に先立つ、非定型鬱病および慢性疼痛を含み得る。
「慢性疼痛」は、種々の疾患または異常な状態、例えば関節リウマチなどによって引き起こされる、長時間にわたって（すなわち、３ヶ月より長く）継続するか繰り返される疼痛をいう。慢性疼痛は、急性疼痛よりも強度は低いかも知れない。慢性疼痛を抱える人は、疼痛に対する自動的な反応が長期間持続されることはあり得ないため、通常は心拍数の上昇および急激な発汗を示さない。慢性疼痛を抱える人の中には、その環境から閉じこもり、単にその苦痛のみに専念し、その家族、および友人、ならびに外的刺激をすべて無視している人もいるかも知れない。例えば、Ｍｏｓｂｙ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ， Ｎｕｒｓｉｎｇ ＆ Ａｌｌｉｅｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ， 第５版（１９９８）を参照のこと。
慢性疼痛としては、例えば、関節炎、顎関節機能不全症候群、外傷性脊髄損傷、多発性硬化症、過敏性腸症候群、慢性疲労症候群、月経前症候群、多種化学物質過敏症、閉鎖性頭部外傷、線維筋痛症、関節リウマチ、糖尿病、癌、ＨＩＶ、間質性膀胱炎、片頭痛、緊張型頭痛、ヘルペス後神経痛，末梢神経損傷、灼熱痛、発作後症候群（ｐｏｓｔ−ｓｔｒｏｋｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ファントム四肢症候群、および慢性骨盤痛などの疾患または状態によって引き起こされる腰痛、非定型胸部痛、頭痛、骨盤痛、筋筋膜痛、腹部痛、および頚部痛、または慢性疼痛が挙げられるが、これらに限定されない。
「非定型鬱病」は、前向きな生活の効果に反応して一時的に気が楽になる能力（気分反応性）、ならびに２種以上の自律神経系の症状（過眠症、食欲の上昇または体重増加、鉛様の麻痺（ｌｅａｄｅｎ ｐａｒａｌｙｓｉｓ）、および知覚された対人関係の拒否に対する極端な感度の長期にわたるパターンが挙げられるがこれらに限定されず、この自律神経系の症状は約２週間より長く存在する）を伴う鬱状態の情動をいう。このような自律神経系の症状は、他の鬱病性障害（例えば、メランコリー型鬱病）において見出される症状と比べて好転され得る。
「急性神経障害」は、迅速な発症と、それに続く短期間であるが重症な経過（熱性痙攣、ギラン−バレー症候群、発作、および脳内出血が挙げられるが、これらに限定されない）とを有する神経障害をいう。
「慢性神経障害」は長期間（例えば、約２週間より長く；具体的にはこの慢性神経障害は、約４週間より長く、約８週間より長く、または約１２週間より長く続くかまたは繰り返すことがある）続く神経障害をいい、またはこれは頻繁な繰り返しを特徴とし、例としては、ナルコレプシー、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、脳性麻痺、癲癇、多発性硬化症、失読症、アルツハイマー病、およびパーキンソン病が挙げられるが、これらに限定されない。
「外傷」は、暴力もしくは事故からのような身体に対する任意の傷害またはショックをいうか、または人の心理的な発達に対して実質的な、長く続く損傷を与える心の傷（ｗｏｕｎｄ）もしくはショックのような、任意の心の傷もしくはショックをいう。
「虚血状態」は、血管の狭窄もしくは閉塞によって引き起こされる身体の臓器、組織もしくは部分に対する血液供給の減少をもたらす任意の状態であり、これはしばしばその臓器、組織または部分への酸素の減少をもたらす。
「低酸素状態」は、空気、血液もしくは組織の中の酸素の量または濃度が低い（正常以下である）状態である。
「有痛性神経障害」または「ニューロパチー」は、末梢神経系もしくは中枢神経系に対する損傷、またはそれらの病理学的変化から生じる慢性疼痛である。末梢神経因性疼痛はまた、有痛性神経障害、神経痛、末梢性感覚ニューロパチー、もしくは末梢神経炎とも呼ばれる。ニューロパチーについては、疼痛は傷害の症状ではなく、むしろそれ自体が病気の経過である。ニューロパチーは、治癒のプロセスとは関連していない。どこかに傷害があることを伝えるのではなく、神経それ自体が機能障害を起こしており、疼痛の原因となる。
「神経因性疼痛」は、炎症または末梢神経、脳神経、脊髄神経の変性、あるいはこれらの組合せに関連する疼痛である。この疼痛は、典型的には、鋭いか、刺すようであるか、または突き刺すようである。この根底にある障害は、末梢神経組織の破壊をもたらすことがあり、皮膚の色、体温、および浮腫の変化を伴うことがある。例えば、Ｍｏｓｂｙ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ， Ｎｕｒｓｉｎｇ ＆ Ａｌｌｉｅｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ， 第５版（１９９８）；およびＳｔｅｄｍａｎ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，第２５版（１９９０）を参照のこと。
「糖尿病性神経障害」は、糖尿病によって引き起こされる末梢神経障害／神経損傷をいい、糖尿病に関連する末梢神経、自律神経、および脳神経の障害／損傷を含む。糖尿病性神経障害は、高血糖（高い血糖レベル）の結果として神経が損傷を受ける、真性糖尿病の一般的な合併症である。
「薬物依存」は、化学物質に対する習慣、化学物質の濫用、および／または化学物質に対する嗜癖をいう。たいていは心理的欲求に起因して、薬物依存性の人の生活は、気分または意識の状態に対する１種以上の化学物質の特異的な効果への要求を中心に展開する。このように、この用語は、嗜癖（これは生理学的依存性を強調する）だけでなく、薬物濫用（この状態では、薬物に対する病的欲求が身体的依存性に関係していないように見える）も含む。例としては、アルコール、アヘン薬、モルヒネ様の効果を有する合成鎮痛薬、バルビツール酸塩、催眠薬、鎮静薬、いくつかの抗不安薬、コカイン、精神刺激薬、マリファナ、ニコチン、および幻覚薬に対する依存性が挙げられるが、これらに限定されない。
「休薬」は、薬物摂取の停止をいう。休薬はまた、薬物が突然に中止された場合に、特定の薬物の持続的な使用から生じる心理的かつ、時折は、身体的な要因の臨床的症候群をいう。症状は、さまざまであるが、不安症、神経質、過敏性、発汗、吐き気、嘔吐、頻脈、呼吸促迫、およびてんかんを挙げることができる。
「薬物嗜癖」または依存性は、１つ以上の以下の徴候を有するとして定義される：薬物に対する耐性（同じ効果を達成するために増加された量を必要とする）、退薬症状、意図されたものより多い量で、または意図されたものより長い時間にわたってその薬物を摂取すること、消費された薬物の量を減らしたいという持続する欲望を有するかもしくは消費された薬物の量を減らすことができないこと、その薬物を入手しようと非常に多くの時間を費やすこと、あるいはその人がその薬物によって引き起こされる身体的または心理的な問題を分かっているにもかかわらず、その薬物の使用を継続すること。
「鬱病」は、悲しみ、失望および落胆の感情を特徴とする押うつ気分の精神状態をいう。鬱病は、抑うつの正常な感情から、気分変調症を経て、大鬱病までにわたる。
「不安障害」は、憂慮、不確実さ、または恐怖の感情を特徴とする過剰または不適切な興奮状態をいう。不安障害は、それらの症状の重症度および継続期間、ならびに固有の行動上の特徴に従って分類されてきた。分類としては、全般性不安障害（これは長く続くが低悪性度である）、パニック障害（これはより劇的な症状を有する）、恐怖症、強迫性障害、外傷後ストレス障害、および分離不安障害が挙げられる。
「遅発性ジスキネジア」（例えば、トゥレット症候群）は、任意の年齢で起こり得る重篤の、不可逆的神経障害をいう。遅発性ジスキネジアは、抗精神病薬／神経遮断薬の長期の使用の副作用であり得る。症状は、ほとんど目立たないか、または根深くない場合がある。症状は、身体、体幹、脚、腕、指、口、唇、または舌が挙げられる種々の身体部分の制御不可能な動きを伴う。
「運動障害」は、運動系（ｍｏｔｏｒ ａｎｄ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ）が関与する神経障害の群をいい、例として、運動失調症、パーキンソン病、眼瞼痙攣、アンジェルマン症候群、毛細血管拡張性運動失調症、発声障害、筋緊張異常疾患、歩行障害、斜頸、書痙、進行性核上性麻痺、ハンチントン舞踏病、ウィルソン病、ミオクロニー、痙縮、遅発性ジスキネジア、チック、トゥレット症候群、および振戦が挙げられるがこれらに限定されない。
「血液脳関門を破壊する脳感染」は、血液脳関門の実効性の変化、物質および／もしくは生物が血流から出て中枢神経系へと通るのを防ぐその能力の上昇または低下のいずれかをもたらす、脳または大脳の感染をいう。
「血液脳関門」は、巨大分子、免疫細胞、多くの損傷を与える可能性がある物質、ならびに異質な生物（例えば、ウイルス）が血流から出て中枢神経系（例えば、脳および脊髄）へと通るのを防ぐ中枢神経系の毛細管内の内皮細胞の半透過性層をいう。血液脳関門の機能不全は、一部は、多発性硬化症の病気の経過の根底にあるかも知れない。
「髄膜炎」は脳および脊髄の髄膜の炎症をいい、最も頻繁には、細菌感染またはウイルス感染によって引き起こされ、発熱、嘔吐、激しい頭痛、および斜頸を特徴とする。
「髄膜脳炎」は、脳および髄膜の一方または両方の炎症をいう。
脳卒中または脳血管発作とも呼ばれる「発作」は、脳への血管の封鎖もしくは破裂によって引き起こされる（脳への酸素の欠乏を生じる）脳機能の突然の喪失をいい、筋制御の喪失、感覚もしくは意識の減少または喪失、眩暈、不明瞭な発語、または脳への損傷の程度および重症度によって変わる他の症状を特徴とする。
「低血糖症」は、血中のブドウ糖の異常に低いレベルをいう。
「脳虚血」（発作）は、脳への血液供給の不全をいい、しばしば脳への酸素の欠乏を生じる。
「心停止」は、心拍および心機能の突然の休止をいい、有効な循環の一時的または永久的な喪失を生じる。
脊髄傷害または圧迫症とも呼ばれる「脊髄外傷」は、脊髄自体に対する直接の傷害から生じるか、または骨および軟部組織ならびに脊髄を取り囲む血管への損傷によって間接的に生じる脊髄への損傷をいう。
「頭部外傷」は、頭皮、頭蓋骨、または脳の頭部傷害をいう。これらの傷害は、頭皮上の小さな瘤から壊滅的な脳傷害の範囲にわたり得る。頭部外傷は閉鎖性または穿通性のいずれかに分類することができる。閉鎖性頭部外傷では、頭部は物体と衝突することによる鈍力に耐える。脳震盪は脳が関与する閉鎖性頭部外傷である。穿通性頭部外傷では、物体（通常は高速で動いている。例えば、自動車のフロントガラスまたは他の部分）は頭蓋骨を貫いて破壊し、脳に到達する。
「周産期低酸素症」は、周産期（すなわち、出生のすぐ直前およびすぐ直後に短時間発生する期間、妊娠の第２０〜２８週の経過で始まり、出生の７〜２８日後に終わるとして、様々に定義される）の間の酸素の欠乏をいう。
「低血糖神経障害」は低血糖状態（すなわち、異常に低い血糖値）から生じるニューロンの損傷、例えば、神経損傷をいう。
「神経変性障害」は、神経細胞の喪失を特徴とする神経疾患のタイプをいい、例としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側策硬化症、タウオパチー（前頭側頭型認知症を含む）、およびハンチントン病が挙げられるがこれらに限定されない。
「癲癇」は、意識の喪失または痙攣性てんかんを伴うか、もしくは伴わない、運動機能障害、感覚機能障害、または精神機能障害突然の再発性発作を特徴とする種々の神経障害いずれかをいう。
「アルツハイマー病」は、一般に１０〜１５年にわたり、かつ大脳皮質における異常な組織およびタンパク質沈着物（プラークまたは濃縮体）の発達を伴う、認知能力の喪失を特徴とする疾患をいう。
「ハンチントン病」は、成人期に発症し、最後には認知症になる遺伝性疾患をいう。それは、制御できない運動、知的能力の喪失、および感情障害を引き起こす、脳のある領域における遺伝子的プログラムされたニューロンの変性から生じる。
「パーキンソンニズム」は、パーキンソン病に類似しているが、薬物療法、異なる神経変性障害、または別の疾病の効果によって引き起こされる障害をいう。用語「パーキンソンニズム」はまた、脳のある領域でドーパミンニューロンを損傷または破壊することにより、パーキンソン病で観察される運動異常性のタイプの任意の組合せを引き起こす任意の状態をもいう。
ルー・ゲーリック病とも呼ばれる「筋萎縮性側策硬化症」（ＡＬＳ）は、進行性で致命的な神経疾患をいう。ＡＬＳは、運動ニューロン疾患として公知の障害のクラスに属する。ＡＬＳは、随意運動を制御する脳および脊髄における特異的神経細胞が徐々に（通常は、「上位」（すなわち、大脳皮質にある）および「下位」（脊髄にある））の運動ニューロンを変性するときに発生する。これらの運動ニューロンの喪失は、それらの制御下にある筋肉を弱めて萎縮させ、麻痺へと導く。ＡＬＳは、どの筋肉が最初に弱まるかに依存して、様々な方法で現れる。症状としては、つまずき（ｔｒｉｐｐｉｎｇ）および転倒（ｆａｌｌｉｎｇ）、手足の運動制御の喪失、発話、嚥下および／または呼吸の困難さ、持続的な疲労、ならびに単収縮および筋痙攣を挙げることができ、非常に重篤になることもある。上位運動ニューロン異型（例えば、原発性側索硬化症）もまた包含される。
「緑内障」は、異常に高い眼内の流体圧、損傷した視神経乳頭、眼球の硬化、視力の完全な喪失から部分的な喪失を特徴とする一群の眼疾患のいずれかをいう。網膜神経節細胞は、緑内障では失われている。緑内障のいくつかの異型（低眼圧緑内障）は、正常な眼圧を有する。
「網膜虚血」は、網膜への血液供給の減少をいう。
「虚血性視神経症」は、一方向に減少した視力の突然の発症とともに通常存在する状態をいう。この状態は、視神経への血流量の減少（虚血）の結果である。動脈炎性虚血性視神経症および非動脈炎性虚血性視神経症の２つの基本のタイプが存在する。非動脈炎性虚血性視神経症は、一般に、心血管疾患の結果である。最も高いリスクの患者は、高血圧、高いコレステロール、喫煙、糖尿病またはこれらの組合せの病歴を有する。動脈炎性虚血性視神経症は、側頭動脈炎として公知の、視神経に血液を供給している血管の炎症によって引き起こされる。この状態は、通常、一方の眼において突然かつ重篤な視力喪失、咀嚼の際の顎の疼痛、こめかみ部の圧痛、食欲低下、および疲労または疾病全身的な感覚を伴って存在する。
「黄斑変性症」は、網膜黄斑と呼ばれている網膜の中央の物理的障害をいい、中心視の喪失に至るが、色覚および周辺視は明瞭なままであることもある。視力喪失は、通常徐々に発生して、典型的には異なる進度で両眼に影響を及ぼす。
「脱髄性障害」は、神経を取り囲みかつ神経インパルスを脳へと効率よく伝達することを担う髄鞘への損傷から生じる状態である。脱髄性障害は、筋肉の弱さ、協調性の乏しさおよび麻痺の可能性をもたらし得る。脱髄性障害の例としては、多発性硬化症、視神経炎、横断性神経炎およびギラン−バレー症候群が挙げられるが、これらに限定されない。脱髄性障害を処置する場合、本発明にかかる組成物は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸型グルタミン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）拮抗薬（例えば、メマンチン）またはβインターフェロンアイソフォーム、コパクソン（ｃｏｐａｘｏｎｅ）またはアンテグレン（Ａｎｔｅｇｒｅｎ）（ナタリズマブ（ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ））を含んでいてよい。ニューロン損傷は多発性硬化症などの脱髄性状態で起こり得るため、有用な薬物組成物は、ミエリンの代わりに、またはミエリンに加えてニューロンを保護を保護するかも知れない。
「多発性硬化症」は、主に若年成人に影響を及ぼし、かつ脱髄の領域および脳の白質におけるＴ−細胞が支配的な血管周囲の炎症を特徴とする、中枢神経系の慢性疾患をいう。いくつかの軸索がこれらの病理学的プロセスのために残されているかも知れない。この疾患は、最も一般的には、神経の異常性の急性もしくは亜急性の発症とともに始まる。最初およびそれに続く症状は、通常は多年にわたって継続するその疾患の過程にわたってその発現および重症度が劇的に異なる。早期の症状としては、しびれ感および／または錯感覚、不全単麻痺もしくは不全対麻痺症、複視、視神経炎、運動失調症ならびに膀胱の制御の問題を挙げることができる。それに続く症状としては、より目立つ上位運動ニューロン徴候、すなわち、痙縮の高まり、不全対麻痺または四肢不全麻痺の増大も挙げられる。回転性めまい、協調運動障害および他の小脳の問題、鬱病、情緒不安定、歩行の異常性、構語障害、疲労および疼痛もまた、一般的に観察される。
「高ホモシステイン血症の続発症」は、高ホモシステイン血症の結果として続く状態、すなわち、ホモシステインレベルの上昇をいう。
「痙攣」は、激しい無意識の収縮または一連の筋肉の収縮を指す。
「疼痛」は、脳への固有の神経線維によって媒介される現実の、または潜在的な組織損傷に関連する不快感をいい、その意識的な認識は、種々の要因によって修正され得る。例えば、Ｍｏｓｂｙ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ， Ｎｕｒｓｉｎｇ ＆ Ａｌｌｉｅｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，第５版（１９９８）；およびＳｔｅｄｍａｎ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ， 第２５版（１９９０）を参照のこと。
「不安症」は、現実的または空想的な切迫する事象または状況の予想から生じる憂慮、不確実さ、および／または恐怖の状態をいい、これはしばしば身体的および心理的な機能を損なう。
「統合失調症」は、通常、現実からの閉じこもり（離脱）、非論理的な思考パターン、妄想、および幻覚を特徴とし、様々な程度で他の情動障害、行動障害、または知的障害を伴う一群の精神障害のいずれかをいう。統合失調症は、脳のドーパミン不均衡および前頭葉の欠陥を伴う。
「筋痙攣」は、しばしば痛みを伴う不随意の筋収縮を指す。
「片頭痛」は、しばしば羞明およびかすみ目を伴う、重篤な衰弱させる頭痛をいう。
「尿失禁」は、尿の流れおよび不随意の排尿を制御することができないことを指す。
「ニコチン離脱」は、タバコで見出される嗜癖性化合物であるニコチンの休薬をいい、これは、頭痛、不安症、吐き気およびより多くのタバコを求める欲求が挙げられる症状を特徴とする。ニコチンは薬物依存を引き起こし、その結果、身体は常にニコチンのあるレベルの要求を呈する。そのレベルが維持されない限り、その身体は退薬症状を経験し始める。
「アヘン製剤耐性」は、高レベルのアヘン製剤、例えば、ヘロインまたはモルヒネへの継続した露出を補正するために、系の感度を減らす恒常性反応を指す。薬物が停止されると、その系はもはやエンケファリンニューロンの鎮静効果を感知できず、退薬症状の疼痛生成される。
「アヘン製剤離脱」は、それまで大量かつ長期（数週間以上）であったアヘン製剤薬物の使用の、休止もしくは劇的な減少によって引き起こされる急性状態をいう。アヘン製剤としては、ヘロイン、モルヒネ、コデイン、オキシコンチン、ジラウジッド、メサドンなどが挙げられる。アヘン製剤離脱は、しばしば、発汗、揺れ、頭痛、薬物欲求、吐き気、嘔吐、腹部痙攣、下痢、眠れないこと、錯乱、動揺、鬱病、不安症、および他の行動変化を含む。
「嘔吐」は、嘔吐の行動をいう。
「脳浮腫」は、脳における、脳での、脳の周囲での、および／または脳に関連した過剰な流体の蓄積をいう。
「ＡＩＤＳ−（またはＨＩＶ−）誘導性（または関連）認知症」は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こすヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって誘発される認知症（脳の器質性疾患または器質性障害から生じる、記憶、集中力、および判断などの知的能力の劣化）をいう。
「ＨＩＶ関連のニューロパチー」は、ニューロパチーが例えばＣＭＶまたはヘルペスファミリーの他のウイルスへの感染によって引き起こされる、ＨＩＶに感染している哺乳動物におけるニューロパチーをいう。ニューロパチーは、症状がつま先および指の刺すような痛みの感覚またはしびれ感から疼痛に、さらに麻痺にわたることがある一群の障害に与えられる名称である。
「眼損傷」は、眼に対する任意の損傷または眼に関する任意の損傷をいう。
「網膜症」は、網膜の任意の病理学的障害をいう。
「認知障害」は、任意の認知機能不全、例えば、記憶障害（例えば、健忘症）または学習障害をいう。
本発明の別の実施形態において、本発明の神経保護化合物はまた、フリーラジカルに誘導された損傷による老化を処置するために、例えば、生体の神経系の通常の老化の過程およびその症状を緩徐化するためにも用いられる（フィンケル（Ｆｉｎｋｅｌ）、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６：９７１−９７６頁、２００５年；フィンケル（Ｆｉｎｋｅｌ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ４０８：２３９−２４７頁、２０００年）。したがって、個体における老化過程の神経症状またはその症状の緩徐化に有効な本発明による化合物の量を含んでなる組成物が提供される。
（神経毒性求電子剤および神経防護作用求電子剤）
いくつかの求電子剤（本明細書中で「神経毒性」求電子剤と呼ばれる）と、還元型システイン残基、例えば、グルタチオン（ＧＳＨ）の還元型システイン残基との反応は、その細胞の還元能を低下させることにより、神経毒性を誘発することができる（Ｓｕｚｕｋｉら， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：２３７６−２３８５，１９９７；Ｓｐｅｎｃｅｒら， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２４：２４６−２５０，１９９４）。このように、初期の研究は１５ｄ−ＰＧＪ2（Ｓｈｉｂａｔａら， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：１１９６−１２０４，２００５）、カテコールアミン代謝産物（ドーパミンを含む）（Ｓｐｅｎｃｅｒら， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２４：２４６−２５０，１９９４）、および抗腫瘍薬（ドキソルビシンを含む）（Ｗｅｔｚｅｌら， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：１０５０−１０６０，２００３）のような内因性求電子剤の神経毒性効果に焦点を当てていた。この点に関して、求電子剤は、いくつかの機構：（１）ＧＳＨ削除、（２）活性酸素種（ＲＯＳ）産生、（３）ＤＮＡ損傷、（４）ｐ５３活性化、（５）Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド誘発、および（６）ミトコンドリア機能不全（Ｓｕｚｕｋｉら， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：２３７６−２３８５，１９９７；Ｓｐｅｎｃｅｒら， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２４：２４６−２５０，１９９４；Ｓｈｉｂａｔａら， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：１１９６−１２０４，２００５；Ｗｅｔｚｅｌら， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：１０５０−１０６０，２００３）、によってニューロン死に寄与することができる。求電子剤によるＧＳＨシステインのアルキル化（Ｓｕｚｕｋｉら， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：２３７６−２３８５，１９９７）はその細胞の還元能を削除し（Ｓｕｚｕｋｉら， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：２３７６−２３８５，１９９７；Ｓｈｉｂａｔａら， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：１１９６−１２０４，２００５；Ｗｅｔｚｅｌら， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：１０５０−１０６０，２００３）、同時にそのアルキル化された複合体は、多剤耐性関連タンパク質−１（ＭＲＰ−１）によって、細胞膜を通って押し出される（Ｓｅｋｉｎｅら， Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９０：Ｆ２５１−Ｆ２６１，２００６）。ＧＳＨ削除によって誘起された活性酸素種（ＲＯＳ）の蓄積はミトコンドリア機能不全に寄与し、このミトコンドリア機能不全はアポトーシスの仕組みを活性化し、チトクロムｃ放出、ミトコンドリア内膜へのＢａｘ転座、およびカスパーゼ活性化をもたらす（Ｓｈｉｂａｔａら， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：１１９６−１２０４，２００５；Ｗｅｔｚｅｌら， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：１０５０−１０６０，２００３）。加えて、グアニン残基のアルキル化はＤＮＡの転写および複製を阻害し、ｐ５３依存性アポトーシス経路を活性化する（Ｓｐｅｎｃｅｒら， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２４：２４６−２５０，１９９４；Ｓｈｉｂａｔａら， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：１１９６−１２０４，２００５）。
他方で、求電子剤に応答して、いくつかの細胞は、「求電子剤の逆襲」、すなわち求電子剤を解毒して直ちに除去する系、を埋め込んでいる（Ｅｇｇｌｅｒら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１００７０−１００７５，２００５；Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａら， Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１８：１７７９−１７９１，２００５；Ｔａｌａｌａｙ， Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ １２：５−１１，２０００；Ｈｏｎｇら， Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１８：１９１７−１９２６，２００５；Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎら， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２１：６８９−７００，２００６）。この求電子的逆襲は、通常は比較的休眠状態で存在しているが、求電子剤それ自体によって活性化された状態になる（Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａら， Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１８：１７７９−１７９１，２００５；Ｔａｌａｌａｙ， Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ １２：５−１１，２０００；Ｈｏｎｇら， Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１８：１９１７−１９２６，２００５；Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎら， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２１：６８９−７００，２００６）。この求電子剤の逆襲は求電子剤だけではなくＲＯＳをも取り除くため、それは神経変性および腫瘍増殖を防止することができる（Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａら， Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１８：１７７９−１７９１，２００５；Ｔａｌａｌａｙ， Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ １２：５−１１，２０００；Ｈｏｎｇら， Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１８：１９１７−１９２６，２００５；Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎら， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２１：６８９−７００，２００６）。このように、求電子剤は、抗腫瘍薬（Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａら， Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１８：１７７９−１７９１，２００５；Ｔａｌａｌａｙ， Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ １２：５−１１，２０００；Ｈｏｎｇら， Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１８：１９１７−１９２６，２００５；Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎら， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２１：６８９−７００，２００６）および神経防護作用剤（Ｓａｔｏｈら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：７６８−７７３，２００６；Ｓｈｉｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：１０３２１−１０３３５，２００５；Ｋｒａｆｔら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１１０１−１１１２，２００４；Ｓｈｉｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：３３９４−３４０６，２００３）の両方として使用することが恐らくできるであろう。Ｔａｌａｌａｙ（Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ １２：５−１１，２０００）は、この概念を最初に導入した人であり、この現象をその癌と戦う特性を考慮して「化学防御」と名付けた。多くの化学防御剤は求電子性であり、酸化ストレスに対する細胞の耐性を高める（Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａら， Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１８：１７７９−１７９１，２００５；Ｔａｌａｌａｙ， Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ １２：５−１１，２０００；Ｈｏｎｇら， Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１８：１９１７−１９２６，２００５；Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎら， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２１：６８９−７００，２００６）。この形態の化学防御は、特異的なシグナル経路（Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路）、ならびに以下の酵素：抗酸化剤（ビリルビン）を生成する、ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）；キノンをヒドロキノンに還元する、ＮＡＤＰＨ−キノンオキシドレダクターゼ（ＮＱＯ１）；ＧＳＨ接合化合物を細胞から外へ輸送する、多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ−１）；ＧＳＨの合成に関与する、γ−グルタミルシステインシンテターゼ（γ−ＧＣＳ）；およびシステインの前駆体であるシスチンの取り込みに関与する、システイン／グルタミン酸アンチポーター（ｘＣＴ）をコードする遺伝子を含めた、求電子剤に対して協調した応答を示す酵素をコードする第２相遺伝子の誘発を伴う、転写に基づく機構がしばしば必要である。他の第２相酵素としては、求電子剤をＧＳＨに接合する、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ；過酸化水素を解毒する、カタラーゼ；スーパーオキシドを解毒する、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ；および重金属を解毒する、メタロチオネイン−１およびメタロチオネイン−２が挙げられる。第２相酵素は薬物解毒および酸化還元調節に関与し、求電子化合物によって誘発される（Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａら， Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１８：１７７９−１７９１，２００５；Ｔａｌａｌａｙ， Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ １２：５−１１，２０００；Ｈｏｎｇら， Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１８：１９１７−１９２６，２００５；Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎら， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２１：６８９−７００，２００６）。
ニューロンにおいて、求電子剤は２つの本質的に異なる作用、全細胞還元能の低下によって媒介される神経毒性効果だけではなく、第２相遺伝子の誘発を介する求電子剤逆襲、も示す。神経毒性効果が支配的である場合、特定の求電子剤はニューロンを殺す［例えば、ドキソルビシン（Ｗｅｔｚｅｌら， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：１０５０−１０６０，２００３）およびメナジオン［Ｎｇｕｙｅｎら， Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．５：６２９−６３４，２００３）］。対照的に、求電子剤の逆襲が支配的である場合、これは弱い求電子剤に応答して特に起こるが、その場合にはこの求電子性応答は、ニューロンをフリーラジカル関連損傷から救出する［例えば、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）（Ｓｈｉｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：１０３２１−１０３３５，２００５；Ｋｒａｆｔら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１１０１−１１１２，２００４；Ｓｈｉｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：３３９４−３４０６，２００３）および神経突起伸長促進性プロスタグランジン（ＮＥＰＰ）化合物に関して観察されるように］。このように、全細胞酸化還元状態を消耗させる求電子剤の神経毒性効果を最少にしつつ、求電子剤の逆襲の優先的な活性化することは、神経変性に対する新しい治療戦略として謳われている（Ｓａｔｏｈら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０３：７６８−７７３，２００６；Ｓｈｉｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：１０３２１−１０３３５，２００５；Ｋｒａｆｔら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１１０１−１１１２，２００４；Ｓｈｉｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：３３９４−３４０６，２００３）。Ｍｕｒｐｈｙら（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：９９０−９９５，１９９１）は、外因性の求電子剤が神経防護作用を果たし得ることを最初に実証した。例えば、ＴＢＨＱおよびフマル酸ジメチルは、酸化ストレスからニューロンを保護した。この防護効果は、第２相酵素であるＮＡＤＰＨ−キノンオキシドレダクターゼ−１（ＮＱＯ１）の誘発に関連していた（Ｍｕｒｐｈｙら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：９９０−９９５，１９９１；Ｓｈｉｈら， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２２９２５−２２９３６，２００５）。求電子性神経防護作用は、以下のパラメータを示す：（１）この防護は転写依存性であり、従って前処理を必要とする；（２）この防護作用化合物それ自体は求電子剤であってもよいし、または求電子剤を生成してもよい；（３）これらの化合物はＧＳＨなどの必須の細胞酸化還元因子を残す；および（４）これらの化合物は、しばしばＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２転写因子経路を介してＮＱＯ１およびヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）などの第２相酵素の発現を誘発する（Ｓａｔｏｈら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：７６８−７７３，２００６；Ｓｈｉｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：１０３２１−１０３３５，２００５；Ｋｒａｆｔら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１１０１−１１１２，２００４；Ｓｈｉｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：３３９４−３４０６，２００３）。興味深いことに、Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊｏｈｎｓｏｎおよび共同研究者らは、発作に対するＴＢＨＱの神経防護作用効果が星状膠細胞におけるＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路の活性化、および生成するパラクリン効果が適正な濃度で使用される場合には、ニューロンに対する生成するパラクリン効果を介して媒介されることを示した（Ｓｈｉｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：１０３２１−１０３３５，２００５；Ｋｒａｆｔら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１１０１−１１１２，２００４；Ｓｈｉｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：３３９４−３４０６，２００３；Ｓｈｉｈら， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２２９２５−２２９３６，２００５）。対照的に、ドキソルビシンおよびメナジオンは神経毒性キニーネに基づく求電子化合物であり、それらは、事実上任意の濃度で酸化ストレスを誘起することによって細胞内ＧＳＨを消耗させニューロンを殺す（Ｗｅｔｚｅｌら， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：１０５０−１０６０，２００３；Ｎｇｕｙｅｎら， Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．５：６２９−６３４，２００３）。このように、求電子剤は、神経毒性求電子剤および神経防護作用求電子剤の２つの群に分類することができる。低濃度では、ＮＥＰＰファミリーの求電子剤、特にＮＥＰＰ１１は、酸化ストレスからニューロンを保護する（実施例１；Ｓａｔｏｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７：５０−６２，２００１も参照のこと）。シクロペンテノンプロスタグランジンの化学構造に基づき生成されたＮＥＰＰ化合物は、ＨＯ−１依存性の様式で酸化ストレスからニューロンを保護する（Ｓａｔｏｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７：５０−６２，２００１；Ｓａｔｏｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７５：１０９２−１１０２，２０００；Ｓａｔｏｈら， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：２２４９−２２５５，２００３）。本発明者らは、ＮＥＰＰは求電子化合物であるため、それらの神経防護作用を理解するための鍵はそれらが反応するタンパク質チオールの同定であるとの結論を下した。この方針に沿って、多くの求電子剤が、ＫｅａｐＩ／Ｎｒｆ２転写経路と密接に結びついた神経防護作用効果を発揮することが見出された（実施例１；Ｓｈｉｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：１０３２１−１０３３５，２００５；Ｋｒａｆｔら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１１０１−１１１２，２００４；Ｓｈｉｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：３３９４−３４０６，２００３も参照のこと）。しかしながら、２つ目の重要な点は、このクラスの分子はニューロンに優先的に濃縮され、従って標的化されたやり方でニューロンで直接作用することである。
ＮＥＰＰによって開始される化学反応およびシグナル伝達経路に関して、システイン残基（１個又は複数個）に結合する求電子剤は、以下の一連の証拠に基づき神経防護作用を開始することができる：（１）ＮＥＰＰおよび関連化合物は無細胞系におけるシステインに結合する（Ｓｕｚｕｋｉ．ら， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：２３７６−２３８５，１９９７）；（２）スルフヒドリルアルキル化剤であるＮ−エチルマレイミドは、ウシ血清アルブミンのシステイン残基に対するＮＥＰＰ化合物の結合を破壊する（実施例１）；（３）ＮＥＰＰの求電子性部分である交差共役型ジエノンは神経防護作用およびＨＯ−１誘発のために必要とされる（Ｓａｔｏｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７：５０−６２，２００１；Ｓａｔｏｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７５：１０９２−１１０２，２０００）；（４）Ｋｅａｐ１変異体（位置１５１のシステインがセリンによって置き換えられている）がＮＥＰＰ１１およびその神経防護作用効果によるＨＯ−１誘発を停止させる（実施例１）。このように、ＮＥＰＰ１１によるＫｅａｐｌのアルキル化／酸化還元シグナル伝達は、第２相遺伝子の誘発を通して神経防護作用事象を開始するであろう（実施例１；Ｓａｔｏｈら， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：２２４９−２２５５，２００３）。
多くの研究は、求電子剤がＫｅａｐｌ／Ｎｒｆ２経路の活性化とその結果として起こるＨＯ−１および他の第２相酵素の誘発を介して、ニューロンを保護することができるという証拠を与えている。これらの酵素は、細胞内酸化還元状態の調節を介して神経防護作用を生じさせる（実施例１；Ｓｈｉｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：１０３２１−１０３３５，２００５；Ｋｒａｆｔら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１１０１−１１１２，２００４；Ｓｈｉｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：３３９４−３４０６，２００３）。抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）は、第２相酵素をコードする遺伝子の５’上流のプロモーター領域に存在する転写要素である。ＡＲＥに結合する転写因子は、従って第２相酵素の誘発を媒介する（Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａら， Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１８：１７７９−１７９１，２００５；Ｔａｌａｌａｙ， Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ １２：５−１１，２０００；Ｈｏｎｇら， Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１８：１９１７−１９２６，２００５；Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎら， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２１：６８９−７００，２００６）。Ｙａｍａｍｏｔｏのグループは、このＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路がＡＲＥを活性化することを最初に実証した（Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎら， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２１：６８９−７００，２００６）。Ｋｅａｐ１は、Ｎｒｆ２のユビキチン化のためのアダプタータンパク質であり、従ってこの転写因子の連続的な分解を駆動する（Ｅｇｇｌｅｒら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１００７０−１００７５，２００５；Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａら， Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１８：１７７９−１７９１，２００５；Ｔａｌａｌａｙ， Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ １２：５−１１，２０００；Ｈｏｎｇら， Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１８：１９１７−１９２６，２００５；Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎら， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２１：６８９−７００，２００６）。求電子剤がＫｅａｐ１上の重要なシステイン残基と反応して付加体を形成するとき、それらはこの系をかき乱し、Ｎｒｆ２を安定化し、Ｎｒｆ２の遊離を引き起こし、それが核の中へと転座することを可能にし、その核の中でＮｒｆ２はＡＲＥに結合して第２相遺伝子の発現を刺激する（Ｅｇｇｌｅｒら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１００７０−１００７５，２００５；Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａら， Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１８：１７７９−１７９１，２００５；Ｔａｌａｌａｙ， Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ １２：５−１１，２０００；Ｈｏｎｇら， Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１８：１９１７−１９２６，２００５；Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎら， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２１：６８９−７００，２００６）。実際、Ｎｒｆ２は、脳における求電子剤の逆襲応答を担う一次転写因子である（Ｓａｔｏｈら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：７６８−７７３，２００６；Ｓｈｉｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：１０３２１−１０３３５，２００５；Ｋｒａｆｔら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１１０１−１１１２，２００４；Ｓｈｉｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：３３９４−３４０６，２００３；Ｊｏｈｎｓｏｎら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８１：１２３３−１２４１，２００２，Ｌｅｅら， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３７９４８−３７９５６，２００３）。ＡＲＥレポーターマウスを用いた実験は、ＴＢＨＱが星状膠細胞においてＡＲＥを活性化し、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路の活性化および後に続くニューロンの酸化的損傷からの保護をもたらし、従って、ＴＢＨＱは星状膠細胞においてＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路を活性化することによってニューロンを保護するということを実証した（Ｓｈｉｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：１０３２１−１０３３５，２００５；Ｋｒａｆｔら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１１０１−１１１２，２００４；Ｓｈｉｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：３３９４−３４０６，２００３；Ｊｏｈｎｓｏｎら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８１：１２３３−１２４１，２００２；Ｌｅｅら， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３７９４８−３７９５６，２００３）。Ｎｒｆ２ノックアウトマウス由来の大脳皮質培養物を用いた実験から、星状膠細胞におけるＴＢＨＱによる第２相遺伝子の誘発およびその結果生じる神経防護作用効果についてのＮｒｆ２タンパク質の重要性が確認された（Ｊｏｈｎｓｏｎら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８１：１２３３−１２４１，２００２，Ｌｅｅら， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３７９４８−３７９５６，２００３）。
我々の研究は、求電子剤に誘発される神経防護作用についての経路を示唆する。求電子剤は、細胞質制御因子タンパク質Ｋｅａｐ１に結合し、Ｋｅａｐ１は次に転写因子Ｎｒｆ２を遊離させる。次いでＮｒｆ２は核に転座し、その核でＮｒｆ２はＨＯ−１プロモーター上のＡＲＥ部位を活性化する。ＨＯ−１の転写はこのように活性化され、生じたＨＯ−１タンパク質の増加はヘム分子の分解を導き、ビリベルジンおよび最終的にはビリルビンを産生する。強力な抗酸化剤分子であるビリルビンの蓄積は、少なくとも一部はＨＯ−１の神経防護作用効果を媒介する。求電子剤ＴＨＢＱへの曝露の後に、この経路は星状膠細胞において開始されるが、ＮＥＰＰ化合物への曝露の後は、この経路はニューロンにおいて活性化される。
求電子性ＮＥＰＰ化合物は、星状膠細胞よりはむしろニューロンに蓄積し、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路を活性化し、ＨＯ−１などの第２相遺伝子を直接ニューロン中に誘発する（Ｓａｔｏｈら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：７６８−７７３，２００６）。ＴＢＨＱ対ＮＥＰＰの曝露後の活性化されたＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２を現す細胞型の見かけ上の相違は、恐らくは、それらの細胞での取り込みに異なって影響を及ぼすことができるこれらの化合物の本質的に異なる化学構造に起因しているかもしれない（Ｓａｔｏｈら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：７６８−７７３，２００６）。（表１に挙げた化合物などのカテコール型求電子性化合物を、典型的には、ニューロンおよび星状細胞双方に入れる。）
植物は非常に広範な求電子剤を産生するため、いくつかの食物は化学防御作用化合物を含み得る（Ｔａｌａｌａｙ， Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ １２：５−１１，２０００）。例えば、Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ Ｌｉｎｎの粉末化した根茎であるクルクミンは、神経防護作用剤として作用する植物起源の多くの潜在的な求電子剤のうちの１つを代表する（Ｔａｌａｌａｙ， Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ １２：５−１１，２０００）。クルクミンは、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２／ＨＯ−１経路を活性化し、脳虚血に対する防護効果を発揮する（Ｂａｌｏｇｕｎら， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７１：８８７−８９５，２００３）。クルクミンはまた、アルツハイマー病のマウスモデルにおいて慢性神経変性からニューロンを保護する（Ｌｉｍら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：８３７０−８３７７，２００１）。さらに、クルクミンは抗腫瘍（アポトーシス促進）効果を示す（Ｔａｌａｌａｙ， Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ １２：５−１１，２０００）。これらの背景情報に基づき、Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：３４０４−３４０９，２００１）はＮＱＯ１活性の誘発についてクルクミンの類似体をスクリーニングし、ビス（４−ヒドロキシベンジリデン）アセトン（４−ＨＢＡ）が最も強力な抗癌活性を有することを見出した（Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：３４０４−３４０９，２００１）。興味深いことに、本発明者らのグループ（Ｓａｔｏｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７：５０−６２，２００１）は、独立に、ニューロンの生存を促進することにおけるＮＥＰＰ１１の活性に起因して、このクラスの化学構造、すなわち交差共役型ジエノンに関して同様の結論に到達した。従って、神経防護作用求電子剤の構造のクラスの１つは交差共役型ジエノンを含む。
Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路の求電子的活性化によって誘発される１つの第２相遺伝子産物はＨＯ−１である。この酵素は、ヘムをビリベルジンへと酸化的に切断し、一酸化炭素（ＣＯ）を形成し、かつキレートされたＦｅ2+を放出する（ＭａｉｎｅｓおよびＧｉｂｂｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３８：５６８−５７７，２００５）。ビリベルジンの還元の産物であるビリルビンは、強力なフリーラジカルスカベンジャーとしての役割を果たす（Ｓｔｏｃｋｅｒ， Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．６：８４１−８４９，２００４）。ＨＯ−１-/-マウス由来の線維芽細胞は酸化ストレスに敏感であるが（ＰｏｓｓおよびＴｏｎｅｇａｗａ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１０９２５−１０９３０，１９９７）、他方、ＨＯ−１トランスジェニックマウス由来の小脳顆粒ニューロンは酸化ストレスに対して耐性である（Ｃｈｅｎら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７５：３０４−３１３，２０００）という報告によって明らかなように、ＨＯ−１は、酸化ストレスに対する耐性において必須の役割を果たす。第２相酵素の中で、ＨＯ−１は、例えば炎症に対する治療効果に起因して、特に注目されてきた（Ｌｅｅら， Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：２４０−２４６，２００２）。ＢａｒａｎａｎｏおよびＳｎｙｄｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１０９９６−１００２，２００１）、ＭａｉｎｅｓおよびＧｉｂｂｓ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３８：５６８−５７７，２００５）、および本発明者らのグループ（実施例１）はすべて、ＨＯ−１誘発因子は神経防護作用性であると提唱している。例えば、実施例１で実証されるように、ＨＯ−１タンパク質は、以下の事実から証明されるように、ＮＥＰＰ１１の神経防護作用効果において中心的な役割を果たす：（１）ＨＯ−１は、ＮＥＰＰ１１によって劇的に増加する（実施例１；Ｓａｔｏｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７５：１０９２−１１０２，２０００）；（２）ＨＯ−１阻害剤はＮＥＰＰ１１の神経防護作用効果を無効にする（実施例１）；（３）ＨＯ−１ ｃＤＮＡでのトランスフェクションは神経防護作用性である（Ｓａｔｏｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７５：１０９２−１１０２，２０００）；および、ＨＯ−１酵素活性から下流にあるビリルビンもまた神経防護作用性である（Ｓａｔｏｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７５：１０９２−１１０２，２０００）。
さらに、すでに明記したように、ＮＥＰＰ化合物はニューロンに蓄積し、ＨＯ−１は、ＮＥＰＰ１１を用いたマウスの腹腔内注入の後に、皮質ニューロンで誘発される。従って、ＮＥＰＰ１１または類似の薬剤を用いた処置によるＨＯ−１の誘発は、神経変性障害についての標的化ニューロン療法の新規な方法を示す（実施例１）。ＨＯはＨＯ−１（誘発型）およびＨＯ−２（構成型）の２種のイソザイムとして存在する（ＭａｉｎｅｓおよびＧｉｂｂｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３８：５６８−５７７，２００５）。ＨＯ−２活性はまた、ＨＯ−２ノックアウトマウスに対する研究によって証明されるように、酸化ストレスからニューロンを保護するためにも必須である（Ｄｏｒｅ．ら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：２４４５−３４５０，１９９９）。本発明者らは、ＨＯ−１およびＨＯ−２が、酸化ストレスから、しかし異なった調節を介してニューロンを保護することにおいて中心的な役割を果たす、つまりＨＯ−２が最初にリン酸化によって活性化され、ＨＯ−１は引き続いて転写機構を介して活性化されることを提唱した：（Ｓａｔｏｈら， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：２２４９−２２５５，２００３）。
神経防護作用求電子剤は、しばしばＧＳＨの基礎レベルを上昇させる（Ｓｕｎら， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４：３７１−３７７，２００５）。ＧＳＨは細胞の酸化ストレスから保護する主要な還元物質であるため、そのレベルの上昇は、求電子剤の神経防護作用を一部は説明することができるであろう（Ｓｕｎら， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４：３７１−３７７，２００５）。このＧＳＨの上昇は、シスチン（システインの前駆体）取り込みとＧＳＨ合成との両方の上昇に起因する。ＡＲＥは、シスチン／グルタミン酸アンチポーター（ｘＣＴ）およびγ−グルタミルシステインシンテターゼ（γ−ＧＣＳ）（これらは、それぞれ、シスチン取り込みおよびＧＳＨ合成についての律速段階を示す）の両方の発現を調節する（Ｔａｌａｌａｙ， Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ １２：５−１１，２０００）。従って、ＡＲＥを介するｘＣＴおよびγ−ＧＣＳの求電子的誘発は、ＧＳＨを増加させることによって神経防護作用に寄与し得る。
加えて、ＮＱＯ１は、求電子剤によって誘発される第２相遺伝子産物である。ＮＱＯ１は、いくつかのキノンから対応するヒドロキノンへの２電子還元を触媒する（Ｔａｌａｌａｙ， Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ １２：５−１１，２０００；Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：３４０４−３４０９，２００１）。還元されたキノンは、潜在的には有効な抗酸化剤として機能することができるが、他の証拠は、（１）ＮＱＯ１遺伝子を用いたニューロン細胞のトランスフェクションは防護をもたらさない（Ｍｕｒｐｈｙら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：９９０−９９５，１９９１），および（２）ＮＱＯ１は、逆説的に未知の機構によってニューロン細胞死を高めているかも知れない（Ｋａｐｉｎｙａら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８４：１０２８−１０３９，２００３）という理由で、ＮＱＯ１活性は求電子剤の神経防護作用効果に関与しているらしいということを示唆する。
ＴＢＨＱおよびＮＥＰＰ１１は、神経防護作用に特異的なシステインに対するＴＢＨＱおよびＮＥＰＰ１１の結合に起因して神経毒性効果を最小にしつつ、優先的に求電子性の逆襲を活性化する。１つのこのようなシステイン残基は、Ｋｅａｐ１のＣｙｓ１５１であるようである（Ｅｇｇｌｅｒら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１００７０−１００７５，２００５；Ｈｏｎｇら， Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１８：１９１７−１９２６，２００５）；このようなシステインチオールは神経変性疾患に対する新規な神経防護作用剤の開発のための潜在的な薬物標的である。
全身投与された際、ＮＥＰＰ１１および４−ＨＢＡなどの求電子体とチオールは、該求電子体が脳内のそれらの意図された標的に到着する前に反応し得る可能性がある。したがって、プロドラッグとして作用し、意図された標的に到着した際に酸化によって求電子体に変換する化合物が望ましいと言える。例えば、カテコール環を有するテルペノイドは、酸化によってキノン型の求電子体に変換し得るプロ求電子性化合物である（ディンコバ−コストバ（Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：４５８４−４５８９頁、２００５）。パーキンソン病では、酸化ストレスは疾患の進行において重要な役割を果たしている（ジェナー（Ｊｅｎｅｒ）、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．５３：Ｓ３６−Ｓ３８頁、２００３年）が、標的部位にプロ求電子性化合物を、それらの酸化を介して活性化させるために用いて、必要な場所に神経保護を提供することはできなかった。このアプローチは、病的活性を介して求電子薬を活性化し得る神経変性障害に対する新規な戦略である。
カルノシン酸（ＣＡ）は、例えば、植物のローズマリー（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）およびセージ（Ｓａｌｖｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌ．）由来のポリフェノール抗酸化剤である。我々は、カルノシン酸（ＣＡ）が、酸化によって神経保護性のキノンに変換し得るテルペノイドであることを見出した。これは、ＮＥＰＰｓと同様な様式でＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路を活性化する。ＣＡはまたある利点を有する。ＣＡは脳透過性である。また、これは酸化によって活性化され、したがって、すなわち、傷害の部位において、その神経保護性のキノン代謝物に変換し得る。さらにこれは、傷害組織により長期間留まる。インビトロでは、およそ０．１μＭから１０１μＭのＣＡが神経保護的である。インビボでは、１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの間の用量範囲が最適であると考えられるが、他の用量も使用することができる。本発明の実施に有用な正確な用量は、過度の実験をせずに決定することができる。ローズマリーおよびセージからカルノシン酸を得るための方法は、例えば、米国特許第５，２５６，７００号明細書；および米国特許第６，３３５，３７３号明細書に教示されており、精製された化合物は市販品が入手できる。
カルノシン酸誘導体もまた、本発明の実施に使用することができる。カルノシン酸誘導体およびそれらの化学的合成いくつかの例に関しては、例えば、米国特許第６，４７９，５４９号明細書を参照されたい。他のＣＡ誘導体も当業界に知られており、過度の実験をせずに当業者によって製造することができる。例としては、ベンゼン環がオルト配位ではなく、パラ配位での２つのヒドロキシル基を有する以下の化合物およびそれらの誘導体が挙げられる（ＣＡの指標名による）：：１，４ａ（２Ｈ）−フェナントレンジカルボン酸、１，３，４，９，１０，１０ａ−ヘキサヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−１メチル−７−（１−メチルエチル）−， （１Ｒ，４ａＲ，１０ａＳ）−；１，４ａ（２Ｈ）−フェナントレンジカルボン酸、１，３，４，９，１０，１０ａ−ヘキシドロ−５，６−ジヒドロキシ−１−メチル−７−（１−メチルエチル）−，１−メチルエステル、（１Ｒ，４ａＲ，１０ａＳ）−；４ａ（２Ｈ）−フェナントレンカルボン酸、１，３，４，９，１０，１０ａ−ヘキサヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）−１−メチル−７−（１−メチルエチル）−、（１Ｒ，４ａＲ，１０ａＳ）−；４ａ（２Ｈ）−フェナントレンカルボン酸、１，３，４，９，１０，１０ａ−ヘキサヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−７−（２−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−１，１−ジメチル−，［４ａＲ−［４ａα，７（Ｒ*），１０ａβ］］−（９ＣＩ）（１６−ヒドロキシカルノシン酸とも呼ばれる）； ５ε，１０ε−ポドカルパ−８，１１，１３−トリエン−１７−オン酸、７，１１，１２−トリヒドロキシ−１３−イソプロピル（７ＣＩ）；４ａ（２Ｈ）−フェナントレンカルボン酸、１，３，４，９，１０，１０ａ−ヘキサヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−１，１−、ジメチル−７−（１−メチルエチル）−９−オキソ−，（４ａＲ−トランス）−（９ＣＩ）；４ａ（２Ｈ）−フェナントレンカルボン酸、１，３，４，９，１０，１０ａ−ヘキサヒドロ−５，６，９−トリヒドロキシ−１，１−ジメチル−７−（１−メチルエチル）−１０−オキソ−、［４ａＲ−（４ａα，９β，１０ａβ）］−（９ＣＩ）；４ａ（２Ｈ）−フェナントレンカルボン酸、１，３，４，９，１０，１０ａ−ヘキサヒドロ−５，６，９−トリヒドロキシ−１，１−ジメチルｌ−７−（１−メチルエチル）−、（４ａＲ，９Ｓ，１０ａＳ）−（カルノシン酸とも呼ばれる）；および４ａ（２Ｈ）−フェナントレンカルボン酸、７−［２−（アセチルオキシ）−１−メチルエチル］−１，３，４，９，１０ａ−ヘキサヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−１，１−ジメチル（９ＣＩ）。
（スクリーニング方法）
多くのＮＥＰＰならびに他の求電子性およびプロ求電子性化合物が、文献に公知である。
実施例に詳細に記載されるように、神経防護作用について有効である他の物質についてスクリーニングするための方法が提供される。本明細書に教示される方法加えて、神経防護作用物質についてスクリーニングするための方法は当該分野で公知である。
（医薬組成物および方法）
本発明の組成物は、医薬組成物として処方することができ、そして哺乳類の宿主（例えば、ヒト患者）に、選択された投与経路、すなわち、経口または非経口による、静脈内経路、筋肉内経路、局所経路もしくは皮下経路によるに経路に適合された種々の形態で投与することができる。
このような組成物は、種々の経路によってインビボで全身投与され得る。例えば、それらは、不活性希釈剤または同化可能な可食担体などの薬学的に許容可能な賦形剤と組合せて経口投与され得る。それらは、軟殻または硬殻ゼラチンカプセルに封入されていてもよく、錠剤へと圧縮されていてもよく、または患者の食事の食物に直接組み込まれていてもよい。経口投与のために、活性成分（１種または複数種）は、１種以上の賦形剤と組み合わされ、体内摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ、ウェーハなどの形態で使用され得る。このような組成物および調製物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含有する。組成物および調製物の割合（％）は当然変わり得るが、好都合には、所与の単位投与量形態の重量の約２〜約６０％であってよい。このような有用な組成物における活性成分の量は、有効投与量レベルが得られるであろうような量である。
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などはまた、以下のものを含有し得る：トラガカント、アラビアゴム、トウモロコシデンプンまたはゼラチンなどの結合剤；第二リン酸カルシウムなどの賦形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；そして、スクロース、フルクトース、ラクトースまたはアスパルテームなどの甘味剤、またはペパーミント、冬緑油、もしくはサクランボ香味料などの矯味矯臭剤が加えられ得る。単位投与量形態がカプセルである場合、それは、上記の種類の物質に加えて、植物油またはポリエチレングリコールなどの液体担体を含有し得る。種々の他の物質が、コーティングとして、または固体単位投与量形態の物理的形態を別の態様で変更するために、存在してよい。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤は、ゼラチン、ワックス、シェラックまたは糖類などでコーティングされ得る。シロップまたはエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤としてのスクロースまたはフルクトー−ス、防腐剤としてのメチルパラベンおよびプロピルパラベン、色素かつ香味料としてのサクランボフレーバーまたはオレンジフレーバーを含み得る。当然、任意の単位投与量形態を調製する際に使用される任意の物質は、薬学的に許容可能なものであるべきであり、用いられる量において実質的に無毒であるべきである。加えて、上記化合物は、徐放性調製物および装置に組み込まれ得る。
上記組成物は、点滴または注射によって静脈内もしくは腹腔内投与され得る。本発明にかかる神経防護作用化合物、その塩または溶媒和物、ならびに他の活性成分の溶液は、水の中で、必要に応じて無毒の界面活性剤と混合されて調製され得る。分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、およびこれらの混合物中、ならびに油中で調製され得る。通常の保存および使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含有する。
注射または点滴のために適切な薬理学的投与量形態は、滅菌された水溶液もしくは水系分散液、あるいは必要に応じてリポソームに封入された、滅菌された注射可能もしくは点滴可能な溶液または分散液の即席調製に適合された活性成分を含む滅菌された粉末を含み得る。すべての場合において、最終的な投与量形態は、滅菌され、流体であり、かつ製造および保存の条件下で安定であるべきである。液体担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、無毒のグリセリルエステル、およびこれらの適切な混合物を含む溶媒または液体分散液媒体であり得る。適正な流動性は、例えば、リポソームの形成によって、分散液の場合には必要とされる粒子径の維持によって、または界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の活動の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、緩衝液または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能組成物の長期にわたる吸収は、その組成物における、吸収を遅らせる薬剤、例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチンなどの使用によってもたらされ得る。
滅菌された注射可能な溶液は、本発明にかかる神経防護作用化合物または他の活性成分を、適切な溶媒中に、必要とされる量で、必要に応じて上に列挙された種々の他の成分とともに組み込み、次いで濾過滅菌することにより調製される。滅菌された注射可能な溶液の調製のための滅菌された粉末の場合には、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これらは、それまでに滅菌濾過された溶液中に存在した任意の付加的な所望の成分を加えた活性成分の粉末を与える。
局所投与のために、本発明にかかる神経防護作用化合物および他の活性成分は、純粋形態で、すなわち、それらが液体であるときに適用され得る。しかしながら、それらを、組成物または処方物として、固体又は液体であってもよい皮膚科学的に受容可能な担体と組合せて、皮膚に投与することが一般に望ましい。
有用な固体担体としては、細かく分割された固体、例えばタルク、粘土、微結晶性セルロース、シリカ、アルミナなどが挙げられる。有用な液体担体としては、水、アルコールもしくはグリコール、または有効なレベルで、必要に応じて無毒の界面活性剤の助けを得て、本発明の化合物が溶解もしくは分散され得る水−アルコール／グリコールのブレンドが挙げられる。香料およびさらなる抗菌剤などのアジュバントは、所与の用途のための特性を最適化するために加えられ得る。得られる液体組成物は、吸収性パッドから適用されるか、絆創膏および他の包帯材を含浸するために使用されるか、またはポンプタイプの噴霧器もしくはエアロゾル噴霧器を用いて患部に噴霧され得る。
合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩およびエステル、脂肪アルコール、変性セルロースまたは変性無機質などの増粘剤もまた、液体担体と一緒に用いることができ、使用者の皮膚に直接塗布するための塗布できるペースト、ゲル、軟膏、石鹸などを形成することができる。
本発明にかかる神経防護作用化合物または他の活性成分の有用な投与量は、それらのインビトロにおける活性と動物モデルにおけるインビボ活性とを比較することにより決定され得る。マウス、および他の動物での有効投与量をヒトに外挿するための方法は、当該技術分野で公知である。例えば、米国特許第４，９３８，９４９号を参照のこと。
一般に、液体組成物における本発明にかかる神経防護作用化合物または本発明の他の活性成分の濃度は、約０．１〜２５重量％、好ましくは約０．５〜１０重量％である。ゲルまたは粉末などの半固体または固体の組成物の濃度は、約０．１〜５重量％、好ましくは約０．５〜２．５重量％である。
単独での使用または他の薬剤と一緒の使用のために必要とされる上記化合物、または活性塩もしくは誘導体の量は、選択された特定の塩に応じてだけでなく、投与経路、処置される状態の性質、およびその患者の年齢および状態に応じても変わり、最終的には主治医である医師または臨床医の裁量による。
しかしながら、一般に、適切な用量は、１日あたり、体重１ｋｇにつき約０．５〜約１００ｍｇ、例えば、約１〜約７５ｍｇ、または１日あたり、レシピエントの体重１ｋｇあたり１．５〜約５０ｍｇ、または約２〜約３０ｍｇ／ｋｇ／日、または約２．５〜約１５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にある。
上記化合物は、例えば、１つの単位投与量形態あたり５〜１０００ｍｇ、好都合には１０〜７５０ｍｇ、最も好都合には５０〜５００ｍｇの活性成分を含有する単位投与量形態で好都合に投与され得る。
上記活性成分は、約０．５〜約７５μＭ、好ましくは、約１〜５０μＭ、最も好ましくは約２〜約３０μＭの活性化合物のピーク血漿濃度を達成するように投与され得る。これは、例えば、必要に応じて生理食塩水中の活性成分の０．０５〜５％溶液の静脈内注射により、または約１〜１００ｍｇの活性成分を含有するボーラスとして経口投与することにより達成され得る。望ましい血液レベルは、約０．０１〜５．０ｍｇ／ｋｇ／時間を提供するための連続的な点滴によって、または約０．４〜１５ｍｇ／ｋｇの活性成分（１種または複数種）を含有する間欠的な点滴によって維持され得る。
所望の用量は、単一の用量で、または適切な間隔で投与される分割用量として（例えば、１日に２回、３回、４回、またはこれより多い回数の部分用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）で）好都合に提供され得る。この部分用量自体は、例えば、多くの別個のかなり間隔を空けた投与、例えば、吸入器からの多数回の吸入もしくは複数の液滴を眼に適用することによるように、さらに分割され得る。
本発明にかかる医薬組成物は、１種または１種より多い本発明にかかる神経防護作用物質を含み得る。本発明にかかる神経防護作用化合物を含む医薬組成物は、他の活性成分も含み得る。
本発明の数多くの変更態様およびバリエーションが、上記の教示を考慮すると可能である。それゆえ、添付の特許請求の範囲の範囲内で、本発明は、具体的に本明細書に記載されたものとは別の態様で実施され得るということが理解されるべきである。
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。
（実施例１）
最近の研究は、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２／ＡＲＥ経路の活性化が求電子剤によるＨＯ−１誘発を媒介することを示した（Ｉｔｏｈら， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３６−４５，２００４；Ｇｏｎｇら， Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．４：２４９−２５７，２００２）。従って、本発明者らは、神経突起伸長促進性プロスタグランジン（ＮＥＰＰ）がＨＯ−１誘発および神経防護作用を促進する、可能性のある機構としてこの経路に焦点を当てた。本発明者らは、ＮＥＰＰが、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路を活性化するための求電子剤として作用することにより、インビトロおよびインビボの両方において、ニューロン変性から皮質ニューロンを保護することを見出した。
（物質および方法）
細胞培養物、トランスフェクション、およびグルタチオン（ＧＳＨ）測定
ＨＴ２２細胞（Ｓａｔｏｈら， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：２２４９−２２５５，２００３；Ｓａｔｏｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７：５０−６２，２００１；Ｓａｇａｒａら， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３６２０４−３６２１５，２００２）および一次皮質ニューロン（Ｂｏｎｆｏｃｏら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７１６２−７１６６，１９９５）を、記載されているように培養した。トランスフェクションを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。レポーター遺伝子アッセイでは、細胞溶解物における蛍ルシフェラーゼ活性を照度計（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。全ＧＳＨ（還元体および酸化体）を、記載されているように測定した（Ｌｅｅら， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８０：２８６−２９２，２００１）。
免疫沈降、ウエスタンブロットおよび免疫蛍光法
これらのアッセイを、以下の抗体を用いることによって記載されているように行った（Ｇｕら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：１１８６−１１９０，２００２）：抗−ＨＯ−１（ＳＰＡ８９５、１：１０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗−Ｋｅａｐ１（１：１００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）， または抗−アクチン（１：５，０００、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）。
電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）
二本鎖抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）を、ビオチン３’−末端ＤＮＡ標識キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いることによって標識した。核溶解物を、標識したプローブとともに室温で２０分間インキュベーションし、８％ 未変性ポリアクリルアミドゲルに展開させ、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ+（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に移した。シグナルを、ペルオキシダーゼ接合ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて視覚化した。
局所脳虚血および再灌流
記載されているように（Ｇｕら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：１１８６−１１９０，２００２；支援テキスト（Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ Ｔｅｘｔ）の支援方法（Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ）を参照のこと）、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）／再灌流の繊維モデルを用いた。
統計分析
提示した実験は、４つのサンプルを用いて少なくとも３回繰り返した。データを、（インビトロにおける実験については）平均±標準偏差（ＳＤ）として、（インビボでの実験については）平均±標準誤差（ＳＥＭ）として提示する。
（結果）
求電子性ＮＥＰＰの標的としてのチオール
本発明者らは、シクロペンテノンプロスタグランジンの化学構造に基づいて、ＮＥＰＰ関連化合物を生成させ、そしてＮＥＰＰ６およびＮＥＰＰ１１が酸化ストレスからニューロンを保護すること（Ｓａｔｏｈら， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：２２４９−２２５５，２００３；Ｓａｔｏｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７：５０−６２，２００１）およびＨＯ−１の誘発が神経防護作用効果において必須の役割を果たすこと（Ｓａｔｏｈら， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：２２４９−２２５５，２００３）を見出した。ＮＥＰＰ１１は、ＮＥＰＰ６よりも強力な神経防護作用を与え、これはおそらく、ＮＥＰＰ１１がより親油性で、より良好なＣＮＳ浸透性を可能にするためである（Ｓａｔｏｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７：５０−６２，２００１）。ＮＥＰＰの交差共役型ジエノン構造はそれらの生物学的効果にとって非常に重要であり（Ｓａｔｏｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７：５０−６２，２００１）、炭素＃１１の求電子性、およびひいてはそのチオールとの高い化学反応性の根拠をなす（Ｓａｔｏｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７：５０−６２，２００１）。
（システイン残基＃３４上の）その単一の遊離チオール基によって、ＢＳＡは、求電子化合物による付加体形成についてのインビトロでの実験として使用されてきた。本発明者らは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の遊離システインがＮＥＰＰ化合物と付加体を形成することができるかどうかを試験した。ＮＥＰＰ化合物上の炭素＃１１がＢＳＡのこの遊離のシステインに結合する場合には、不可逆的チオールアルキル化剤であるＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）での前処理はこの結合を破壊するであろう。この発想を試験するための実験において、本発明者らは、ＮＥＰＰ６−ビオチンを合成した（Ｓａｔｏｈら， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７：５０−６２，２００１）。ビオチンを、化学リンカーを用いることによって、ＮＥＰＰ６上のＣ１炭酸部位に接合した。ストレプトアビジンをプローブとして用いると、本発明者らは、ＮＥＰＰ６−ビオチンに結合したタンパク質を検出することができた。ＮＥＰＰ結合の標的としてチオールを研究するために、ＢＳＡ（１レーンあたリ１μｇ）を、種々の濃度（０〜１０００μＭ）のＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）とともに室温で３０分間インキュベーションした。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のビヒクルまたはＮＥＰＰ６−ビオチン（１０μＭ）を加え、この混合物を室温で５時間インキュベーションし、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、ペルオキシダーゼ接合ストレプトアビジンを用いてプローブした。またこのゲルを、クマシーブリリアントブルーで染色した。ＮＥＰＰ６−ビオチンへの曝露後、ＢＳＡ／ＮＥＰＰ６−ビオチンに対応する単一のバンド（６８ｋＤａ）を検出した。Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）での前処置は、用量依存性の様式でこのシグナルを低下させたが、タンパク質のレベルは、このゲルのクマシーブリリアントブルーによる染色から判断すると、事実上同じであった。ＮＥＭは、ＨＴ２２細胞または脳の溶解物に対するＮＥＰＰ６−ビオチンの結合も破壊した。これらの結果は、システインチオールが細胞タンパク質に結合するＮＥＰＰ化合物の標的であることを示唆する。
ＮＥＰＰは、ＡＲＥを介するＨＯ−１転写を活性化する。
本発明者らは、次に、ＮＥＰＰによるＨＯ−１プロモーターおよびＡＲＥの活性化を研究した。ＮＥＰＰ１１によるＨＯ−１タンパク質の誘発を試験するために、ＮＥＰＰ１１の種々の濃度を、ＨＴ２２細胞に２４時間添加した。その後、細胞溶解物（１レーンあたり１０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、抗ＨＯ−１または抗βアクチンでプローブした。本発明者らは、ＮＥＰＰ１１が、ＨＯ−１タンパク質レベルを、神経細胞死を防護する同じＮＥＰＰ濃度での基準条件より約５倍誘発したことを見出した（Ｓａｔｏｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：２２４９−２２５５，２００３）。次に、本発明者らは、１５−ｋｂマウスＨＯ−１プロモーター断片の制御下で、ルシフェラーゼレポーター構築物である、ｐＨＯ１５ｌｕｃでトランスフェクトした、分化したニューロン細胞株である、ＨＴ２２細胞においてＮＥＰＰ１１によるＨＯ−１遺伝子の転写活性化を研究した。ＨＴ２２細胞を、レポーターｃＤＮＡ（ウェルあたり１μｇ）でトランスフェクトし、ＮＥＰＰ１１の種々の濃度を培養物に添加した。２４時間のインキュベーション後、細胞溶解物をルシフェラーゼレポーターアッセイにかけた。ルシフェラーゼ活性に基づいて、ＮＥＰＰ１１は、用量依存的に５倍より多いＨＯ−１転写の発現を促進した。同様の反応をＮＥＰＰ６で得た。Ｇｏｎｇら（Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．４：２４９−２５７，２００２）は、１５−デオキシ−Δ12,14−ＰＧＪ2による活性化に関与する要素を含む転写開始部位の約４および１０ｋｂ上流に位置する２つのエンハンサー領域、Ｅ１およびＥ２を同定した（Ｇｏｎｇら、Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．４：２４９−２５７，２００２）。Ｅ１およびＥ２エンハンサーの役割を決定するために、本発明者らは、両方のエンハンサー部位を欠く変異プロモーター構築物を発現した［ｐＨＯ１５ｌｕｃΔ（Ｅ１＋Ｅ２）］。変異は、ＮＥＰＰ１１にごくわずかに反応するだけであった（１．８倍誘発）。同様の結果をＮＥＰＰ６で得た。
ＨＯ−１プロモーターにおけるＥ１およびＥ２エンハンサー部位は、各々、ＡＲＥを含む。最近の証拠により、求電子剤が、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路を介してＡＲＥを活性化することができると示唆されている（Ｉｔｏｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３６−４５，２００４；Ｇｏｎｇら、Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．４：２４９−２５７，２００２）。ＮＥＰＰ化合物は、＃１１位に求電子的炭素を有し、細胞タンパク質のシステイン残基に結合することができるため、本発明者らは、ＡＲＥ活性化のこの経路を研究した。ＮＥＰＰ１１が、ＡＲＥを介してＨＯ−１エンハンサーを活性化できるという直接的証拠を提供するために、本発明者らは、野生型ＡＲＥ核心要素（ｐＡＲＥｌｕｃ）および変異型（ｐＧＣ−ＡＲＥｌｕｃ）の転写活性化を研究した（Ｌｅｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８０：２８６−２９２，２００１）。ｃＤＮＡ構築物は、野生型ｐＡＲＥｌｕｃ（５’−ＣＴＣＡＧＣＣＴＴＣＣＡＡＡＴＣＧＣＡＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＣＡＧ−ＣＡＧＡＡＴＣ−３’）および変異型ｐＧＣ−ＡＲＥｌｕｃ（５’−ＣＴＣＡＧＣＣＴＴＣＣＡＡＡＴＣＧＣＡＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＣＡＡＴＡＧＡＡＴＣ−３’）を示した（Ｋｒａｆｔら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１１０１−１１１２，２００４）。ＮＥＰＰ１１は、用量依存的に野生型転写活性を７倍まで促進したが、変異型は影響を受けなかった。同様の反応を、ＮＥＰＰ６で得た。これらの結果は、ＮＥＰＰ化合物が、ＡＲＥを活性化することによりＨＯ−１エンハンサーを活性化するという概念を強く支持する。
Ｅ１およびＥ２領域はまた、他のエンハンサー要素を含むため、本発明者らは、ｃＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ；ｐ３ｘＣＲＥｌｕｃ）、ＡＰ−１結合部位（ｐ３ｘＡＰ１ｌｕｃ）、ＮＦ−κＢ結合部位（ｐ３ｘＮＦ−κＢｌｕｃ）、ＮＦＡＴ結合部位（ｐ３ｘＮＦＡＴｌｕｃ）、ＥＴＳ結合部位（ｐ３ｘＥＴＳｌｕｃ）、およびＭＥＦ２結合部位（ｐ３ｘＭＥＦ２ｌｕｃ）を含む、これらの要素由来のルシフェラーゼ活性の発現に対するＮＥＰＰ１１（２μＭ）の効果を試験した。比較のために使用したプラスミドｐＨＯ１５ｌｕｃは、５倍より高いレポーター活性の誘発を示した。対照的に、ＮＥＰＰ１１（２μＭ）は、ｐ３ｘＭＥＦ２ｌｕｃの活性に対する効果を有さず、ｐ３ｘＣＲＥｌｕｃ、ｐ３ｘＡＰ１ｌｕｃ、ｐ３ｘＮＦＡＴｌｕｃ、ｐ３ｘＥＴＳｌｕｃ構築物の活性をわずかに低下させ、ｐ３ｘＮＦ−κＢｌｕｃ発現を最小限に活性化させた。これらの結果により、これらの転写要素の活性化が、ＮＥＰＰ１１によるＨＯ−１プロモーターの活性化においてそれほど重要な役割を果たしていないことが示唆される。
ＮＥＰＰ１１が、Ｎｒｆ２を含む、ＡＲＥに結合する転写因子の増加を引き起こすことを確認するために、本発明者らは、ＥＭＳＡを実施した。ＨＴ２２細胞を、ビヒクルまたはＮＥＰＰ１１（１μＭ）とともに８時間インキュベーションした。ＥＭＳＡを、１レーンにつき１０μｇの核溶解物およびビオチン標識したＡＲＥプローブを用いることによって実施した。１つのレーンにおいて、抗Ｎｒｆ２抗体（１００倍）を、ＡＲＥプローブに結合するスーパーシフトＮｒｆ２タンパク質に添加した。別のレーンにおいて、過剰量の標識されていないプローブを、核溶解物におけるタンパク質への結合から標識したＡＲＥを競合させるために試料に添加した。標識したＡＲＥプローブを示すバンドをコントロールの細胞溶解物の存在下に移した。標識したＡＲＥプローブを示すバンドをコントロールの細胞溶解物の存在下に移し、これにより、ＡＲＥに対する内因性転写因子の結合が示された。ＮＥＰＰ１１（１μＭ）への曝露後に調製した溶解物は、このバンドの明度の著しい増加を示す。対照的に、バンドは、過剰の標識していないプローブの存在下において完全に消えた。重要なことに、抗Ｎｒｆ２抗体の添加は、スーパーシフトされたバンドを生成し、これは、これらの条件下でＡＲＥに結合する転写因子の１つが、Ｎｒｆ２を示すという概念と一致する。
ニューロン細胞株におけるＮＥＰＰ化合物によるＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路の活性化。
次に、本発明者らは、トランスフェクトされたＨＴ２２細胞におけるＮｒｆ２−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）融合タンパク質（Ｎｕｍａｚａｗａら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８５：Ｃ３３４−Ｃ３４２，２００３）の局在化を試験した。ｐＮｒｆ２−ＧＦＰでトランスフェクトされたＨＴ２２細胞を、２４時間、ビヒクルまたはＮＥＰＰ１１（２μＭ）で処理して、落射蛍光顕微鏡下で観察した。基本条件下で、Ｎｒｆ２−ＧＦＰ融合タンパク質は、大部分、細胞質に局在化したが、２μＭ ＮＥＰＰ１１への曝露の際に核に転座した。一般に、Ｎｒｆ２は急速にユビキチン化し、細胞質におけるプロテアソーム経路により分解するが、核内に転座した場合、安定化する（Ｉｔｏｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３６−４５，２００４；Ｇｏｎｇら、Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ ４：２４９−２５７，２００２）。従って、本発明者らは、細胞が、核転座を促進するＮＥＰＰのような求電子剤に曝露される場合、Ｎｒｆ２タンパク質の核レベルが増加するはずであるという仮説を立てた。この仮説を試験するために、２４時間、ビヒクルまたは２μＭ ＮＥＰＰ１１で処理した細胞由来の細胞質および核画分（２００μｇタンパク質）を沈殿させて、抗Ｎｒｆ２抗体および抗ＮｅｕＮでニューロン特異的な核タンパク質をプローブした。実際に、本発明者らはこの仮説を確認した。
これに関する求電子剤作用の機構を解明するために、本発明者らは、ＮＥＰＰ化合物がＫｅａｐ１に結合するかどうか試験した。ＮＥＰＰ６−ビオチンによるＨＯ−１タンパク質の誘発を試験するために、種々の濃度のＮＥＰＰ５−ビオチンで処理したＨＴ２２細胞の溶解物（１レーンあたり１０μｇ）を、抗ＨＯ−１または抗β−アクチンでプローブした。ＮＥＰＰ６およびＮＥＰＰ１１と同様に、本発明者らは、ＮＥＰＰ６とビオチンとの接合生成物（ＮＥＰＰ６−ビオチン）が、神経防護作用があることを見出した（Ｓａｔｏｈら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７：５０−６２，２００１）。さらに、１−１０μＭの濃度で、ＮＥＰＰ６−ビオチンは、ＨＯ−１タンパク質の発現を誘発し、ＮＥＰＰ６−ビオチンが、その生物学的効果を保持することを確認した。次いで、本発明者らは、免疫沈降実験を実施して、ＮＥＰＰ化合物とＫｅａｐ１との付加物形成の直接的な証拠を得た。ＨＴ２２細胞を、ビヒクルまたは１０μＭ ＮＥＰＰ６−ビオチンで処理し、２４時間、インキュベーションした。続いて、溶解物を調製し、抗Ｋｅａｐ１またはストレプトアビジンのいずれかで沈降に供した。沈殿物を電気泳動してプローブした。ＮＥＰＰ６−ビオチンに結合したＫｅａｐ１に対応する７３ｋＤａタンパク質を、ＮＥＰＰ６−ビオチンで処理した細胞において観察したが、ビヒクルでは観察しなかった。沈殿物をまた、抗Ｋｅａｐ１でプローブして、沈殿したＫｅａｐ１の量が、ビヒクル−ビオチン処理した細胞とＮＥＰＰ６−ビオチン処理した細胞との間で同じであることを確認した。次に、溶解物を逆の方法で処理した。すなわち、ストレプトアビジンで沈殿させて、次いで、抗Ｋｅａｐ１抗体でプローブした。再び、ＮＥＰＰ６−ビオチンに結合したＫｅａｐ１に対応する沈殿したタンパク質を、ＮＥＰＰ６−ビオチンで処理した細胞においてのみ検出したが、ビヒクルでは検出しなかった。総合すれば、これらの結果は、ＮＥＰＰ化合物が、細胞中のＫｅａｐ１に結合するという概念と一致する。
Ｋｅａｐ１タンパク質に対するＮＥＰＰ化合物の結合が、ＮＥＰＰの生物学的作用に関与することを示すために、本発明者らは、Ｋｅａｐ１システイン変異（Ｃ１５１Ｓ、これは、システイン残基＃１５１が、求電子剤によるＮｒｆ２−媒介性転写の活性化に必須であると報告されている（ＺｈａｎｇおよびＨａｎｎｉｎｋ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２３：８１３７−８１５１，２００３））の効果を試験した。この変異の過剰発現は、Ｋｅａｐ１とＮｒｆ２タンパク質との間の機能的連結を無効にするはずであり、それによって、ＮＥＰＰ１１のような求電子剤に対する感度を減少させる。これらの方針にそって、本発明者らは、ＮＥＰＰ１１によるＨＯ−１プロモーター（ｐＨＯ１５ｌｕｃ）の活性化が、ｐＫｅａｐ１（Ｃ１５１Ｓ）の同時トランスフェクションによって著しく低下することを見出したが、野生型ｐＫｅａｐ１では見出さなかった。
一次皮質培養におけるＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路の活性化。
一次大脳皮質ニューロンに対するＮＥＰＰ化合物の効果を試験し始めるために、本発明者らは、混合したニューロン／膠細胞皮質培養物をＮＥＰＰ６−ビオチンで処理し、次いで固定し、ストレプトアビジンと接合したローダミンで染色して、ＮＥＰＰ蓄積の部位を決定した。ＮＥＰＰ６−ビオチン（１０μＭ）で処理した皮質培養物を、抗ＭＡＰ−２モノクローナルおよびローダミン接合ストレプトアビジン抗体ならびにＨｏｅｃｈｓｔ３３，２５８染色で染色した。本発明者らは、ＮＥＰＰ６−ビオチン−ストレプトアビジンについて強く染色したＭＡＰ−２−陽性ニューロンにより、ＮＥＰＰ化合物がニューロンに蓄積することが示唆されていると見出した。ビオチンそれ自体によるインキュベーションは、ビオチン−ストレプトアビジンのニューロンの蓄積を生じず、ＮＥＰＰ６−ビオチンと過剰な遊離ビオチン（４ｍＭ）とにおけるインキュベーションは、ニューロン蓄積の程度に影響を与えず、ＮＥＰＰ６−ビオチン蓄積が、ＮＥＰＰそれ自体よりむしろビオチンの存在により促進しなかったことを示した。
本発明者らは、他の求電子剤（Ｋｒａｆｔら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１１０１−１１１２，２００４）と違って、ＮＥＰＰが、大部分ニューロンにおいて蓄積する場合、ＨＯ−１が、この細胞型において優先的に誘発する可能性があると理由付けた。この可能性を調べるために、本発明者らは、強力なＮＥＰＰ化合物への曝露後、抗ＨＯ−１抗体で免疫蛍光研究を実施した。ビヒクルまたはＮＥＰＰ１１（０．７μＭ）で処理した皮質培養物（Ｅ１７およびＤＩＶ１４−２１）を、抗ＭＡＰ−２および抗ＨＯ−１ならびにＨｏｅｃｈｓｔ染色で染色した。コントロール培養物において、非ニューロン細胞は、ニューロンよりベースラインでのＨＯ−１を比較的よく発現した。ＮＥＰＰ１１の添加後、ＨＯ−１免疫蛍光は、細胞質および核の両方において、ニューロンで主に増加した。ＮＥＰＰに対する曝露後のＨＯ−１タンパク質の誘発を試験するために、２４時間、ビヒクルまたはＮＥＰＰ１１で処理した一次皮質培養物の溶解物（１レーンあたり１０μｇ）を、免疫ブロット法において抗ＨＯ−１または抗β−アクチンでプローブした。ＮＥＰＰ１１はまた、培養物において全ＨＯ−１タンパク質を増加させた。ＮＥＰＰ１１によるＨＯ−１の折り畳み誘発は、濃度測定によって評価した場合、２．２±０．２５（０．５μＭ ＮＥＰＰ１１について）および３．５±０．２５（１．０μＭ ＮＥＰＰ１１について）であった。
次に、ＮＥＰＰによるＨＯ−１プロモーターの転写活性を、一次ニューロンにおけるレポーター遺伝子アッセイによって試験した。皮質培養物を、レポーターｃＤＮＡ（ウェルあたり１μｇ）でトランスフェクトし、０．７μＭ ＮＥＰＰ１１を培養物に添加した。２４時間のインキュベーション後、細胞溶解物を、ルシフェラーゼレポーターアッセイに供した。これらのトランスフェクトした皮質培養物において、ＮＥＰＰ１１（０．７μＭ）は、ＨＯ−１プロモーターおよびＡＲＥ核心要素の活性を著しく増加させ、その効果は、ＨＯ−１エンハンサー部位またはＡＲＥ部位のそれぞれの変異によって無効にされた。これらの結果により、ＮＥＰＰ１１は、ＨＯ−１プロモーターにおけるＡＲＥ要素の活性化を介して一次皮質ニューロンにおいてＨＯ−１タンパク質を誘発することが示唆される。実際に、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路が、ＮＥＰＰ１１によってＨＯ−１プロモーターの活性化を媒介する場合、変異Ｎｒｆ２タンパク質が、この活性化を阻害するはずである。この目的のために、本発明者らは、変異した構築物のｐＮｒｆ２（Ｓ４０Ａ）−ＧＦＰ（＃４０位のセリン残基がアラニンによって置換されている）を使用した。コードされたタンパク質はＡＲＥを活性化しない。なぜなら、核の中に転座できないからである（Ｎｕｍａｚａｗａら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８５：Ｃ３３４−Ｃ３４２，２００３）。ＮＥＰＰ１１は、ＨＯ−１プロモーターを著しく活性化させ、ｐＮｒｆ−ＧＦＰでの同時トランスフェクションは、活性化に影響を及ぼさなかった。対照的に、ｐＮｒｆ２（Ｓ４０Ａ）−ＧＦＰでの同時トランスフェクションは、ほとんど完全にＮＥＰＰ１１による活性化をノックダウンした（さらに、ＨＯ−１プロモーター活性の基礎レベルは減少した）。総合すれば、本発明者らの結果により、ＮＥＰＰ１１は、ニューロンにおいてＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路を選択的に活性化させることが示唆される。さらに、ニューロンにおける選択的活性化により、比較的小振幅の全ＨＯ−１活性化が、膠細胞優位である混合されたニューロン／膠細胞培養系において見られることが説明されるかもしれない。
ＮＥＰＰ１１による神経防護作用。
ＮＥＰＰ化合物によるＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２／Ｈｏ−１経路のニューロン選択的活性化は、神経防護作用を与えるはずである。ここで、興奮毒性パラダイムにおいて、本発明者らは、インビトロおよびインビボの両方におけるＮＥＰＰ１１の作用を、まず、ＮＭＤＡ−レポーター媒介性損傷からの防護剤として培養物において、次に、マウスにおける一過性局所的虚血／再潅流の腔内繊維モデルを用いることによって中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）後に試験した。
短期間（１５分）の低濃度のＮＭＤＡ（５０μＭ）のような比較的軽度の損傷に対する一次皮質培養物の曝露は、遅発性および大部分のアポトーシスニューロン細胞死を引き起こすことが公知である（Ｂｏｎｆｏｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７１６２−７１６６，１９９５）。本発明者らは、抗ＭＡＰ−２および抗ＮｅｕＮモノクローナロ抗体の両方で培養物を染色して、ニューロンの樹状突起および核のそれぞれを標識した。ビヒクルまたはＮＥＰＰ１１（０．７μＭ）を、１５分間のＮＭＤＡ（５０μＭ）での処置の６０分前に大脳皮質培養物（Ｅ１７およびＤＩＶ１４−２１）に添加した。次いで、培養物を、２０時間、インキュベーションし、続いて、抗ＭＡＰ−２および抗ＮｅｕＮならびにＨｏｅｃｈｓｅ染色で染色した。アポトーシスニューロンを、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色で見られる形態学的変化によって同定した。このシステムにおいて、ＮＥＰＰ１１は、アポトーシス核の数を著しく減少させ、これにより、ＮＥＰＰ１１は、インビトロにおける興奮毒性に対してニューロンを防護することが示唆される。本発明者らはまた、亜鉛プロトポルフィン（ＺｎＰＰ、１０μＭ）を、ＮＥＰＰ１１と同時に比較的特異的なＨＯ−１拮抗薬に添加した。アポトーシスニューロンの数を、Ｂｏｎｆｏｃｏら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７１６２−７１６６，１９９５）によって報告されているような、アポトーシス指標［（ＭＡＰ−２における縮合核またはＮｅｕＮ−陽性細胞の数）／（全ＭＡＰ−２またはＮｅｕＮ−陽性細胞の数）×１００％］を測定することによって評価した。ＺｎＰＰは、これらの大脳皮質培養物におけるＮＥＰＰ１１の神経防護的効果を無効にした。この結果は、ＮＥＰＰ１１が、ＨＯ−１の誘発を介して少なくとも部分的に興奮毒性に対する一次皮質ニューロンを防護するという概念と一致する。この抗酸化経路がＮＥＰＰ作用に重要である場合、下流の事象もまた、影響を受けるはずである。これらの方針にそって、本発明者らは、ＮＥＰＰ１１（１μＭ）が、ＮＭＤＡ誘発性カスパーゼ３活性化を阻害することを見出した。対照的に、これが主要な経路である場合、他の公知の抗アポトーシス遺伝子、例えば、ｂｃｌ−ｘＬおよびｂｃｌ−２は、ＮＥＰＰ化合物によって誘発されない可能性がある。実際に、本発明者らは、その場合にこれを見出した。
ＨＯ−１転写を誘発するためのＫｅａｐ１のレベルで作用するＮＥＰＰおよび他の求電子剤化合物の機構に対する１つの警告は、ＮＥＰＰが、細胞中の他のチオール含有化合物と見境なく潜在的に反応できることである。この問題にアプローチするために、本発明者らは、細胞グルタチオン（ＧＳＨ）レベルを評価して、ＮＥＰＰ１１が、この十分な抗酸化チオールに影響を与えるかどうかを決定した。Ｎｅｐｐ１１またはＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）をｔ＝０で添加して、全ＧＳＨのレベルを指示した時間で測定した。コントロールの皮質培養物のＧＳＨ含有量（１００％で任意にセット）は、４６．８±４．５ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質であった。ＮＥＰＰ１１と異なって、ＮＥＭは、これらの培養物において神経防護作用を生成せず、実際には、２４時間後にニューロン死を生じた。この効果を有する多くの他の求電子剤（例えば、ＮＥＭ）と異なって、ＮＥＰＰ１１は、皮質培養物におけるＧＳＨレベルを枯渇させなかった。実際に、ＧＳＨレベルは、ＮＥＰＰ１１に対する曝露後に一時的に増加した。ＧＳＨにおけるこの増加は、γ−ＧＣＬ（Ｓａｇａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３６２０４−３６２１５，２００２）、ＧＳＨ生合成における律速酵素の誘発により発生したかもしれず、細胞防護作用にも寄与することができる。実際に、この状況は起こりそうである。なぜなら、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路は、ＨＯ−１に加えてγ−ＧＣＬの発現を調節するからである（Ｉｔｏｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３６−４５，２００４）。ＧＳＨ以外に、細胞は、チオレドキシン−グルタレドキシン系を示す別の主要な還元経路を有する。しかしながら、本発明者らは、ＮＥＰＰ１１（１μＭ）が、本発明者らの条件下でチオレドキシンまたはグルタレドキシンの発現に著しい影響を与えなかったことを見出した（実施例２）。
次に、本発明者らは、ＮＥＰＰ１１が、ＭＣＡＯ／再潅流障害後に脳梗塞の部位を減少できるかどうかを試験した。ＮＥＰＰ１１またはビヒクルを、ＭＣＡＯの１時間前および４時間後に腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射した。脳梗塞の領域（可能な浮腫を補正した）を、再潅流の発症２４時間後に２．５％ ２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリドで染色したビヒクル処理およびＮＥＰＰ１１処理したマウス由来の冠状断面で評価した。本発明者らは、動脈圧、血液ガスおよびグルコース、中核体温、および局所脳血流を含めた生理学的変数をモニターした。これらのパラメータは、コントロールとＮＥＰＰ１１処理した群との間で同じであった。ＮＥＰＰ１１は、冠状断面における梗塞領域を著しく減少させ、これにより、ＮＥＰＰ１１が、インビボにおいて神経防護作用があることが示唆される。本発明者らは、この研究において梗塞後に投与されたＮＥＰＰ１１の効果を試験しなかった。なぜなら、この薬物は、転写活性化によってその神経防護的効果を与えるのに数時間必要とし、従って、前処置を必要とするからである（Ｓａｔｏｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：２２４９−２２５５，２００３；Ｓａｔｏｈら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７：５０−６２，２００１）。
脳虚血に対するＮＥＰＰ防護が、ＨＯ−１発現に関連するという仮説を試験するために、本発明者らは、ウェスタンブロッティングおよび免疫染色によってＨＯ−１誘発を試験した。ＮＥＰＰ１１またはビヒクルを、動物を殺傷する１２時間前に腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射した。脳溶解物（１レーンあたり１０μｇ）を抽出し、抗ＨＯ−１および抗β−アクチン抗体を用いてウェスタンブロッティングに供した。免疫染色のために、マウスの脳の冠状断面を、抗ＭＡＰ−２および抗ＨＯ−１抗体で染色した。本発明者らは、脳虚血の間にニューロン細胞死を防護した同じ濃度のＮＥＰＰ１１が、脳におけるＨＯ−１タンパク質のレベルを増加させることを見出した。ＨＯ−１タンパク質の誘発を、ニューロン細胞体および樹状突起において観察した。
考察
この研究は、求電子剤薬物が、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路の活性化、ならびにその結果として起こるＨＯ−１および場合によっては他のＩＩ類酵素の上流制御を介して神経防護作用に影響を及ぼすことができるという証拠を与える。ＨＯ−１の上流制御が、ＨＯ−１トランスジェニックマウスにおいて評価した場合、脳梗塞部位を減少させることは、公知であった（ＭａｉｎｅｓおよびＰａｎａｈｉａｎ，「Ｈｙｐｏｘｉａ：Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｂｅｄｓｉｄｅ」，Ｒｏａｃｈら編（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｋｌｕｗｅｒ），２００１，ｐｐ．２４９−２７２）。ここで、本発明者らは、ニューロンにおけるＨＯ−１転写を活性化させる低分子の求電子剤のセットを開発し、特徴付け、この経路が、脳における新薬の開発につながるような標的物を表すことを示した。ＮＥＰＰ化合物による首尾よい神経防護作用は、非毒性濃度でのＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路の活性化に関与する。多くの他の求電子剤分子は、全身性副作用を引き起こし、神経防護作用性ではない。なぜなら、おそらく、それらはまた、ＧＳＨのような細胞における重要な還元物質を枯渇させるが、これは、ＮＥＰＰ薬物では起こらないからである。
ＮＥＰＰ化合物は、標識されたＮＥＰＰ（ＮＥＰＰ−ビオチン）を用いてこの研究で示されているように、親油性であり、ニューロンにおけるそれらの蓄積に重要な特徴である。しかしながら、Ｋｒａｆｔら（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１１０１−１１１２，２００４）は、別の求電子剤であるｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）が、星状膠細胞におけるＡＲＥを活性化させることを報告した。この事実は、本発明者らの観察と矛盾するように思われるかもしれない。それにもかかわらず、ＮＥＰＰおよびＴＢＨＱのような求電子剤の化学構造が変化に富み、それらの細胞取り込みに影響を与えるかもしれないことは留意されるべきである（Ｋｒａｆｔら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１１０１−１１１２，２００４）。従って、１つの求電子剤は、星状膠細胞に非常によく局在化することができるが、一方、別のものは、ＮＥＰＰ化合物についてここで観察されるようにニューロンにおいて顕著である。ＮＥＰＰ化合物（Δ7−プロスタグランジンＡ1類似体）は、Δ12−プロスタグランジンＪ2の化学構造に基づいて分子的に設計されており、これらの分子は、多くの化学および生物学的特性を共有する（Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄｓ３：１８９−１９９，１９９０）。Δ12−プロスタグランジンＪ2は、報告されているところによれば、細胞膜を通る能動輸送によって細胞中に輸送される（Ｎａｒｕｍｉｙａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２３９：５０６−５１１，１９８６）。従って、ニューロンは、膠細胞よりＮＥＰＰ化合物についての能動輸送系を有することができる。なぜなら、本発明者らは、ＮＥＰＰ化合物が、ニューロンに優先的に蓄積することを観察したからである。対照的に、求電子剤ＴＢＨＱは、細胞内に簡単に拡散することができ、それによって、ニューロンより非常に数が多い膠細胞に影響を与える。
本発明者らの発見により、ＮＥＰＰ作用の神経防護作用機構が示唆される。細胞内で、これらの薬物は、細胞質調節タンパク質Ｋｅａｐ１に結合し、次いで、Ｎｒｆ２を解放する。次いで、Ｎｒｆ２が核内に転座し、ＨＯ−１プロモーターにおいてＡＲＥを活性化させる（Ｉｔｏｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３６−４５，２００４；Ｇｏｎｇら、Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．４：２４９−２５７，２００２）。従って、ＨＯ−１の転写は、ニューロンにおいて活性化され、ＨＯ−１タンパク質の増加は、ビリベルジンおよびビリルビンを生成する、ヘム分子の分解を引き起こす（Ｉｔｏｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３６−４５，２００４；Ｇｏｎｇら、Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．４：２４９−２５７，２００２）。強力な抗酸化分子である、ビリルビンの蓄積は、少なくとも部分的に、ＨＯ−１、およびそれによってＮＥＰＰ化合物の神経防護的効果に関与する（Ｓａｔｏｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：２２４９−２２５５，２００３；Ｓａｇａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３６２０４−３６２１５，２００２）。さらに、本発明者らは、亜鉛プロトポルフィンによるＨＯ−１の阻害が、ＮＥＰＰの防護効果を防ぐことを見出し、これは、これらの薬物の治療効果が、この経路によって主に媒介されるという概念と一致する。
最近、減少したＮｒｆ２転写活性はまた、ＧＳＨ合成の加齢による喪失を引き起こすことが報告された（Ｓｕｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：３３８１−３３８６，２００４）。低分子量化合物は、ＡＲＥの活性化を介してγ−ＧＣＬを誘発し、ＧＳＨレベルを増加させることができる。従って、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路を調節する化合物は、γ−ＧＣＬおよびＨＯ−１（その両方は、活性酸素種の蓄積を防止するのに役立つ）の誘発を介するフリーラジカルストレスに対する神経防護作用についての有望な候補である可能性がある。
要約すれば、本発明者らは、ＮＥＰＰ化合物によるＫｅａｐ１−Ｎｒｆ２経路の調節が、Ｎｒｆ２によるＨＯ−１プロモーターの活性化を引き起こすことを見出した。ＨＯ−１タンパク質の誘発は、興奮毒性および脳虚血に対して重要な神経防護作用の役割を果たすことが公知である（ＭａｉｎｅｓおよびＰａｎａｈｉａｎ，「Ｈｙｐｏｘｉａ：Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｂｅｄｓｉｄｅ」，Ｒｏａｃｈら編（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｋｌｕｗｅｒ），２００１，ｐｐ．２４９−２７２；Ｓｔｏｃｋｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３５：１０４３−１０４６，１９８７；Ｄｏｒｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：２４４５−２４５０，１９９９；ＰｏｓｓおよびＴａｎｅｇａｗａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１０９２５−１０９３０，１９９７；Ｓａｔｏｈら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：２２４９−２２５５，２００３；Ｓａｔｏｈら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７：５０−６２，２００１）。どのようにして臨床的に有用な薬物が、ＮＥＰＰのようなシクロペンテノンプロスタグラジンの化学構造に基づいて開発できるのか。１つのアプローチは、必須の還元要素を分け与えるＮＥＰＰのような神経防護作用求電子剤薬物を合成することである。強力な求電子化合物は、ＧＳＨのような重要なチオール含有化合物をもつ細胞を枯渇させ、それによって、細胞死の原因となることが公知である。対照的に、ＮＥＰＰ化合物およびそれらの同種は、ＧＳＨを枯渇させずにＫｅａｐ１と相互作用する。Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路の選択的活性化因子は、ＨＯ−１を含めた第２相遺伝子の誘発を介して作用する神経防護作用剤である。
（実施例２）
（方法および物質）
局所的脳虚血および再潅流。ＮＥＰＰ１１を、７．５％ ＤＭＳＯのＰＢＳ溶液において１００ｍｇ／ｍｌで注射した。コントロールを希釈剤単独で与えた。治験責任医師を、処置群に対して盲目にした。注射量は、１ｍｇ／ｋｇに対応する体重の１０ｍｌ／ｇであった。中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）／再潅流の腔内−繊維モデルを使用した（Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：１１８６−１１９０，２０００）。６−８週齢および２０−３０ｇ重量の雄性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を、１２時間明／１２時間暗サイクルに収容し、食物および水を自由に摂取させた。この動物を、鼻の錐体（ｎｏｓｅ ｃｏｎｅ）を通して送達されたイソフルレンおよび７０％亜酸化窒素／３０％酸素混合物で麻酔した。中核体温を３７±１℃に維持した。全身血圧、グルコース、ならびに動脈血ガスおよびｐＨを含めた他の生理的パラメータをモニターした。マウスに２時間のＭＣＡＯ、続いて、２４時間の再潅流期間を受けさせた。血流の閉塞および再潅流を、レーザードップラー血流計によってモニターした。麻酔を手術処置の間、維持し、典型的には、本発明者らの手において１０分かけた。
再潅流期間の後、動物を殺傷した。脳を取り出し、次いで、２ｍｍ厚の断面にスライスした。各スライスを、３７℃で、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリドの２．５％溶液において１０分間、インキュベーションし、４％の緩衝化したホルムアルデヒド溶液に固定した。梗塞領域は、各脳スライスの右中大脳動脈領域に発生し、記載されるようなコンピュータ化された画像解析システム（ＮＩＨイメージ１．６２）で定量化した（Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：１１８６−１１９０，２０００）。
細胞培養物、トランスフェクション、およびグルタチオン（ＧＳＨ）測定。ＨＴ２２細胞を、記載されるように培養した（Ｓａｔｏｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：２２４９−２２５５，２００３；Ｓａｔｏｈら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７：５０−６２，２００１；Ｓａｇａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３６２０４−３６２１５，２００２）。大脳皮質培養物を、記載されるように、１７日齢の胎児のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから調製し、インビトロで１４−２１日（ＤＩＶ１４−２１）に使用した（Ｂｏｎｆｏｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７１６２−７１６６，１９９５）。（壊死よりもむしろ）大部分のニューロンアポトーシスを誘発するために、本発明者らは、皮質培養物を５０ｍＭ ＮＭＤＡと、名目上は、ＭＧ2+を含まないアール平衡塩溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中の５ｍＭ グリシン／１．８ｍＭ ＣａＣｌ2とに１５分間、曝露した（Ｂｏｎｆｏｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７１６２−７１６６，１９９５）。ＮＭＤＡに対する曝露後、培養物をビヒクルまたはＮＥＰＰ１１を含む通常の培地に戻し、２０時間インキュベーションして、細胞生存を解析した。ＮＭＤＡ誘発性ニューロンアポトーシスをブロックするＮＥＰＰ化合物の能力を評価するために、本発明者らは、特異的にニューロンを標識するための抗ＮｅｕＮおよび抗ＭＡＰ−２、ならびにアポトーシスを検出するための核形態学についてのＨｏｅｃｈｓｔ染色を用いて二重免疫蛍光によってアポトーシスニューロンを同定した。本発明者らの培養物におけるニューロンおよび非ニューロン細胞の割合は、それぞれ、３３．６±４．９％および６６．４±４．４％（ｎ＝４）であった。
トランスフェクションを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施し、細胞溶解物における蛍ルシフェラーゼ活性を、レポーター遺伝子アッセイにおける照度計（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。（還元および酸化された）全ＧＳＨを、記載されるように測定した（Ｓａｇａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３６２０４−３６２１５，２００２）。
（結果）
ＴｒｘおよびＧｒｘ遺伝子の発現に対するＮＥＰＰ化合物の効果の欠如。Ｔｒｘ１／２およびＧｒｘ１／２の発現を、以下のプライマー（Ｊｕｒａｄｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４５５４６−４５５５４，２００３）：Ｔｒｘ１、フォワード：５’−ＣＧＴ ＧＧＴ ＧＧＡ ＣＴＴ ＣＴＣ ＴＧＣ ＴＡＣ ＧＴＧ ＧＴＧ−３’；リバース：５’−ＧＧＴ ＣＧＧ ＣＡＴ ＧＣＡ ＴＴＴ ＧＡＣ ＴＴＣ ＡＣＡ ＧＴＣ−３’；Ｔｒｘ２ｍ、フォワード：５’−ＧＣＴ ＡＧＡ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＧＴ ＣＧＣ ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＣＡ−３’；リバース：５’−ＴＣＣ ＴＣＧ ＴＣＣ ＴＴＧ ＡＴＣ ＣＣＣ ＡＣＡ ＡＡＣ ＴＴＧ−３’；Ｇｒｘ−１、フォワード：５’−ＴＧＣ ＡＧＡ ＡＡＧ ＡＣＣ ＣＡＡ ＧＡＡ ＡＴＣ ＣＴＣ ＡＧＴ ＣＡ−３’；リバース：５’−ＴＧＧ ＡＧＡ ＴＴＡ ＧＡＴ ＣＡＣ ＴＧＣ ＡＴＣ ＣＧＣ ＣＴＡ ＴＧ−３’；Ｇｒｘ−２、フォワード：５’−ＣＡＴ ＣＣＴ ＧＣＴ ＣＴＴ ＡＣＴ ＧＴＴ ＣＣＡ ＴＧＧ ＣＣＡ Ａ−３’；リバース：５’−ＴＣＡ ＴＣＴ ＴＧＴ ＧＡＡ ＧＣＧ ＣＡＴ ＣＴＴ ＧＡＡ ＡＣＴ ＧＧ−３’を用いてＲＴ−ＰＣＲを使用することによって、ＮＥＰＰ１１（１ｍＭ）で２４時間、インキュベーションした皮質培養物において試験した。本発明者らは、ＮＥＰＰ１１（１ｍＭ）が、本発明者らのアッセイの条件下でＴｒｘおよびＧｒｘ遺伝子の発現に有意な影響を及ぼさなかったことを見出した。
（実施例３）
脳中の主要興奮性アミノ酸であるグルタメートは、ニューロンに種々の作用を及ぼし、発育、可塑性、および生存に影響を及ぼす（ナカニシ（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２８：９３−１００頁，２００５年；バーコ（Ｂａｒｃｏ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９７：１５２０−１５３３頁、２００６年）。病的条件下、グルタメートは、ＮＭＤＡ受容体媒介経路を介して学習および記憶の一部において主要な役割を果たす（ナカニシ（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２８：９３−１００頁、２００５年；バーコ（Ｂａｒｃｏ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９７：１５２０−１５３３頁、２００６年）。しかしながら、生理的条件下、グルタメートは、主としてＮＭＤＡ受容体の過度の活性化により（チョイ（Ｃｈｏｉ）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：１２６１−１２７６頁、１９９２年；アンカークローナ（Ａｎｋａｒｃｒｏｎａ）ら、Ｎｅｕｒｏｎ １５：９６１−９７３頁、１９９５年；ハラおよびスナイダー（Ｈａｒａ ａｎｄ Ｓｎｙｄｅｒ）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．４７：１１７−１４１年、２００７年）また、ある程度は酸化窒素（ＮＯ）ならびに反応性酸素種（ＲＯＳ）などのフリーラジカルの引き続く発生により「興奮毒性」と称される神経細胞死を誘導することができる。機能性ＮＭＤＡ受容体をまだ発現していない未成熟ニューロンにおいて、高濃度のグルタメートは、「酸化的グルタメート毒性」と称される還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の枯渇により媒介される新規なタイプの神経細胞死を誘導する（マーフィ（Ｍｕｒｐｈｙ）ら、Ｎｅｕｒｏｎ ２：１５４７−１５５８頁、１９８９年；マーフィ（Ｍｕｒｐｈｙ）ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．４：１６２４−１６３３頁、１９９０年；ダルグッシュおよびシューベルト（Ｄａｒｇｕｓｃｈ ａｎｄ Ｓｃｈｕｂｅｒｔ）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８１：１３９４−１４００頁、２００２年）。グルタメートにより誘導されたこれら２つのタイプの神経細胞死は、互いに異なっているが、酸化的ストレスは、両方のタイプに関与している（マーフィ（Ｍｕｒｐｈｙ）ら、Ｎｅｕｒｏｎ ２：１５４７−１５５８頁、１９８９年；コイルおよびプットファルケン（Ｃｏｙｌｅ ａｎｄ Ｐｕｔｔｆａｒｃｋｅｎ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：６８９−６９５、１９９３年；デュガン（Ｄｕｇａｎ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：６３７７−６３８８頁、１９９５年）。この理由から、興奮毒性および酸化的グルタメート毒性双方に対してニューロンを保護するために、幾つかの抗酸化剤分子が報告されている（マーフィ（Ｍｕｒｐｈｙ）ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．４：１６２４−１６３３頁、１９９０年；アンカークローナ（Ａｎｋａｒｃｒｏｎａ）ら、Ｎｅｕｒｏｎ １５：９６１−９７３年、１９９５年；ダルグッシュおよびシューベルト（Ｄａｒｇｕｓｃｈ ａｎｄ Ｓｃｈｕｂｅｒｔ）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８１：１３９４−１４００頁、２００２年）。したがって、神経保護薬物の開発のための戦略の１つは、レドックス状態を調節することができる低分子量化合物を探索し、それによって酸化的損傷に対抗することである（サトウおよびリプトン（Ｓａｔｏｈ ａｎｄ Ｌｉｐｔｏｎ）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７５：１０９２−１１０２頁、２００７年）。
ジョンソンおよびマーフィ（Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｍｕｒｐｈｙ）のものに加えて，最近、一連の化合物が、それら自体必ずしも抗酸化活性を有さないにもかかわらず、転写的に抗酸化性酵素を誘導して神経保護をもたらし得ることを、我々のグループにより報告された（サトウ（Ｓａｔｏｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：７６８−７７３頁、２００６年；クラフト（Ｋｒａｆｔ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１１０１−１１１２頁、２００４年；シー（Ｓｈｉｈ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：１０３２１−１０３３５頁、２００５年）。このような求電子性化合物は、それらの作用が、転写媒介シグナル伝達経路によりさらに保持され、増幅されることから、抗酸化分子に勝る利点がある（サトウおよびリプトン（Ｓａｔｏｈ ａｎｄ Ｌｉｐｔｏｎ）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３０：３８−４５頁、２００７年）。求電子体は、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、ＮＡＤＰＨキノンオキシドレダクターゼ １（ＮＱＯ１）、およびγ−グルタミルシステインリガーゼ（γ−ＧＣＬ）など、「第二相酵素」と呼ばれる一組の抗酸化酵素の発現を誘導し、これら全ての酵素が、細胞内レドックス状態を調節することによって効率的な細胞保護作用を提供する（タラレイ（Ｔａｌａｌａｙ）、Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ １２：５−１１頁、２０００年；パドマナバーン（Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２１：６８９−７００頁、２００６年；イトウ（Ｉｔｏｈ）ら、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．３６：１２０８−１２１３頁、２００４年）。第二相酵素をコードする遺伝子の５’上流プロモーター領域に位置する特異的な転写要素に相当する抗酸化応答要素（ＡＲＥ）は、このような酵素の誘導において中心的な役割を果たす（タラレイ（Ｔａｌａｌａｙ）、Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ １２：５−１１頁、２０００年；パドマナバーン（Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２１：６８９−７００頁、２００６年；イトウ（Ｉｔｏｈ）ら、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．３６：１２０８−１２１３頁、２００４年）。関与する重要なカスケードは、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路と称され、それは、調節タンパク質であるＫｅａｐ１、およびＡＲＲに結合する転写因子であるＮｒｆ２を含んでなる。Ｋｅａｐ１は、Ｎｒｆ２のユビキチン結合を促進し、したがって、この転写因子の構成的分解を駆動するアダプタータンパク質である。付加体を形成するために、求電子体が、Ｋｅａｐ１タンパク質上の重要なシステイン残基と反応すると、それらはこの系を乱し、それによってＮｒｆ２を安定化させ、それを細胞質から核へと移動させ、そこでＡＲＥｓに結合し、第二相遺伝子の転写を刺激させる（タラレイ（Ｔａｌａｌａｙ）、Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ １２：５−１１頁、２０００年；Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２１：６８９−７００頁、２００６年；イトウ（Ｉｔｏｈ）ら、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．３６：１２０８−１２１３頁、２００４年）。
以前に報告された神経保護求電子性化合物は、図２に示された２つの主要グループ、カテコール型およびエノン型に分けることができる（クラフト（Ｋｒａｆｔ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１１０１−１１１２頁、２００４年；サトウ（Ｓａｔｏｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：７６８−７７３頁、２００６年；サトウおよびリプトン（Ｓａｔｏｈ ａｎｄ Ｌｉｐｔｏｎ）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３０：３８−４５頁、２００７年）。これら２つの化合物型は、異なった特徴を示す。違いの１つは、求電子性の程度にある。エノン型のクルクミン（ヤザワ（Ｙａｚａｗａ）ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５８０：６６２３−６６２８頁、２００６年）およびジエノン型のＮＥＰＰ１１（サトウ（Ｓａｔｏｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：７６８−７７３頁、２００６年）などのエノン型求電子性化合物は、それら自体が求電子性である。対照的に、カテコール型の化合物は、それら自体が求電子性ではなくて、キノンへの酸化的変換によって求電子性になる（ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５：４３００−４３０９頁、２００３年）。したがって、これらカテコールタイプの化合物は、神経保護効果を発揮するために、カテコールからキノンへの変換を必要とするプロドラッグとして機能する（サトウおよびリプトン（Ｓａｔｏｈ ａｎｄ Ｌｉｐｔｏｎ）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３０：３８−４５頁、２００７年）。カテコール型とエノン型との間の別の異なった特徴は、神経細胞培養物における分布である。カテコール型の神経保護求電子性化合物であるｔ−ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）は、星状細胞において優先的に作用し、パラクリン機序によってニューロンを保護することが報告されている（アールグレン−ベッケンドルフ（Ａｈｌｇｒｅｎ−Ｂｅｃｋｅｎｄｏｒｆ）ら、Ｇｌｉａ １５：１３１−１４２頁、１９９９年；リー（Ｌｅｅ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１２０２９−１２０３８頁、２００３年；クラフト（Ｋｒａｆｔ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１１０１−１１１２頁、２００４年）。対照的に、エノン型の神経保護求電子性化合物であるＮＥＰＰ１１は、ニューロンに蓄積してＨＯ−１を誘導し、それによってニューロンに対して直接的保護作用を発揮する（サトウ（Ｓａｔｏｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：７６８−７７３頁、２００６年）。
植物は、種々の求電子性化合物を産生するので、転写活性化によりニューロンを保護し得るカテコール型の植物中の天然求電子性化合物を、我々は探索した。カルノシン酸は、ローズマリー（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）（ｒｏｓｅｍａｒｙ）から得られた天然カテコール型のポリフェノール性ジテルペンであり、ローズマリー葉の乾燥重量に約５％含まれている（コサカおよびヨコイ（Ｋｏｓａｋａ ａｎｄ Ｙｏｋｏｉ）、Ｂｉｏ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２６：１６２０−１６２２頁、２００３年）。ＣＡは、恐らくホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：８９１９−８９２９頁、２００４年）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）（ラウ（Ｒａｕ）ら、Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ．７２：８８１−８８７頁、２００６年）、シクリンＡ／Ｂ１（ビサンジ（Ｖｉｓａｎｊｉ）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．２３７：１３０−１３６頁、２００６年）、およびフリーラジカル−スカベンジング活性（アルオーマ（Ａｒｕｏｍａ）ら、Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ ２２：２５７−２６８頁、１９９２年）を介してもたらされる種々の生物学的作用を有することが報告されている。
求電子性化合物は、チオール（Ｓ−）アルキル化を介して標的タンパク質上の特定のシステイン残基と反応する電子不足求電子性炭素中心を有するレドックス活性神経保護化合物の新たに認識されたクラスである。植物は、種々の生理活性求電子性化合物を産生するが、これら化合物の詳細な作用機序は依然として不明である。カテコール環含有化合物類は、それら自体求電子性ではないが、酸化の際に求電子性キノンになることから注目されている。ＣＡが、特定のＫｅａｐ１システイン残基に結合することによってＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２転写経路を活性化し、したがってニューロンを酸化的ストレスおよび興奮毒性から保護することを我々は見出した。大脳皮質培養物において、ＣＡ−ビオチンは、非神経細胞においては低濃度で、ニューロンにおいては高濃度で蓄積する。ＣＡの神経細胞および非神経細胞双方の分布は、その神経保護効果に寄与すると言える。さらに、ＣＡは、脳内に転位し、インビボで還元型グルタチオンのレベルを増加させ、中大脳動脈虚血／再灌流に対して脳を保護する。
材料および方法
化学薬品。フラクションＶウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、フルオレセインジアセテート（ＦＤＡ）、グルタメート、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３，２５８、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、ＧＳＳＧ、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、およびロテノン、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）を、和光ケミカルズ（ＷＡＫＯ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社（東京、日本国）またはシグマ（Ｓｉｇｍａ）（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。
ＣＡおよびＣＡ−ビオチン（ＣＡＢ）。以前に記載されたように（コサカおよびヨコイ（Ｋｏｓａｋａ ａｎｄ Ｙｏｋｏｉ）、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２６：１６２０−１６２２頁、２００３年）、ＣＡを、ローズマリー葉から抽出した。 ＣＡ−ビオチン（ＣＡＢ）は、以下の方法によりコサカおよびヨコイ（Ｋｏｓａｋａ ａｎｄ Ｙｏｋｏｉ）（Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２６：１６２０−１６２２頁、２００３年）に従って合成した：カルノシン酸（９０ｍｇ）、アセトニトリル（２ｍｌ）、およびジシクロヘキシルカルボジイミド（６７ｍｇ；東京化成工業（Ｔｏｋｙｏ Ｋａｓｅｉ Ｋｙｏｇｙｏ）社、東京、日本国）を、氷上で３分間混合した。次いで、８０％のアセトニトリル中に溶解した５−（ビオチンアミド）ペンチルアミン（４１ ｍｇ；ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）、ロックフォード、イリノイ州）を、この混合物に加え、引き続き氷上で１０分間インキュベートした。その後、塩酸を加えて反応を終了させた。反応生成物は、溶媒としてアセトニトリルと塩酸を用いて分取液体クロマトグラフィー（ＯＤＳ−Ｓ−５０ｃ（丸善）（Ｍａｒｕｚｅｎ）社、東京、日本国からなるＯＤＳカラム）により分離した。Ｂｏｔｈ ＣＡおよびＣＡＢの双方を、ＤＭＳＯ中１０ｍＭのストック液として調製した。
ＣＡＢに関するウェスタンブロット。ＣＡＢ有無のＢＳＡを、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離してから、電気泳動的にニトロセルロース膜（アマーシャム・ライフサイエンス、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）に移した。次に、この膜を、０．１％ツイーン２０（ＰＢＳ−Ｔ）および５％の脱脂ドライミルクを含有するＣａ2+、Ｍｇ２+（−）−リン酸緩衝生理食塩水中、室温で１時間ブロックし、次いで西洋わさびペルオキシダーゼ複合化ストレプトアビジンと共に１時間インキュベートした。この膜をＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、ＥＣＬウェスタンブロット検出剤（アマーシャム・ファルマシアバイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を用いて、シグナルを検出した。
抗体。抗Ｎｒｆ２および抗Ｋｅａｐ１モノクローナルマウスの複数ＩｇＧは、ケン・イトウ（Ｋｅｎ Ｉｔｏｈ）（弘前大学）により作出された。使用した他の抗体は、ＦＩＴＣ複合化抗マウスＩｇＧ、ローダミン複合化抗ウサギＩｇＧ、ペルオキシダーゼ複合化抗ウサギＩｇＧ、ローダミン複合化ストレプトアビジン（ジャクソン・イムノリサーチラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ウェストグローブ、ペンシルバニア州）、抗Ｓ１００βモノクローナル抗体、ペルオキシダーゼ複合化ストレプトアビジン、４％ビードアガロースに固定化されたストレプトアビジン（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）、ロックフォード、イリノイ州）、抗ＨＡモノクローナル抗体、および抗ＭＡＰ−２、および抗ＮｅｕＮモノクローナルマウスの複数ＩｇＧ、およびセファロースＣＬ−４Ｂに固定化されたタンパク質Ａ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス、ミズーリ州）であった。
プラスミド構成物
（１）ｐＧＬ３−ＧＳＴＹａ ＡＲＥコアルシフェラーゼベクター。我々は、ＧＳＴＹａ ＡＲＥコア配列を含有する一本鎖オリゴヌクレオチド（ワッサーマンおよびファール（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｆａｈｌ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：５３６１−５３６６頁、１９９７年）を用いた：センス、５’−ＣＧＣ ＧＴＴ ＡＧＣ ＴＴＧ ＧＡＡ ＡＴＧ ＡＣＡ ＴＴＧ ＣＴＡ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＣＡ ＡＡＧ ＣＡＡ ＣＴＴ ＴＡ−３’、およびアンチセンス、５’−ＧＡＴ ＣＴＡ ＡＡＧ ＴＴＧ ＣＴＴ ＴＧＴ ＣＡＣ ＣＡＴ ＴＡＧ ＣＡＡ ＴＧＴ ＣＡＴ ＴＴＣ ＣＡＡ ＧＣＴ ＡＡ−３’。このように得られたｄｓＤＮＡを、ｐＧＬ３−プロモーターベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社、マジソン、ウィスコンシン州）のＭｌｕ Ｉおよび Ｂｇｌ ＩＩ部位に挿入した。
（２）ｐＥＦ６−Ｎｒｆ２［野生型（Ｎｒｆ２ＷＴ）］、ｐＥＦ６−Ｎｒｆ２ ［ドミナントネガティブ（Ｎｒｆ２ＤＮ）］、およびｐＥＦ６−Ｋｅａｐ１ベクター。
Ｎｒｆ２ＷＴ、およびＮｒｆ２ＤＮを、マウスｃＤＮＡと以下のオリゴヌクレオチドとのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により作出した：Ｎｒｆ２ＷＴに関してセンス５’−ＧＣＣ ＡＴＧ ＡＴＧ ＧＡＣ ＴＴＧ ＧＡＧ ＴＴＧ ＣＣＡ ＣＣＧ ＣＣＡ−３’、Ｎｒｆ２ＤＮに関してセンス５’−ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＧＴ ＧＡＡ ＴＣＣ ＣＡＡ ＴＧＴ ＧＡＡ ＡＡＴ ＡＣＡ−３’、および通常のアンチセンス５’−ＧＴＴ ＴＴＴ ＣＴＴ ＴＧＴ ＡＴＣ ＴＧＧ ＣＴＴ ＣＴＴ ＧＣＴ ＴＴＴ−３’（アラム（Ａｌａｍ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２６０７１−２６０７７頁、１９９９年）。Ｋｅａｐ１発現ベクターを得るために、センス５’−ＣＣＡ ＣＣＡ ＴＧＣ ＡＧＣ ＣＣＧ ＡＡＣ ＣＣＡ ＡＧＣ ＴＴＡ ＧＣ−３’およびアンチセンス５’−ＡＡＧ ＣＡＡ ＡＴＴ ＧＡＴ ＣＡＡ ＣＡＡ ＡＡＣ ＴＧＴ ＡＣＣ ＴＧＣ−３’を用いてＫｅａｐ１ ｃＤＮＡを作出した。増幅産物を、ｐＥＦ６ベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバッド、カリフォルニア州）にクローン化した。
（３）ＨＡ−タグ化Ｋｅａｐ１およびＫｅａｐ１欠失変異体に関する発現ベクター。
これらの構成物を、東北大学のアキラ・コバヤシ（Ａｋｉｒａ Ｋｏｂａｙａｓｈｉ）博士（ホソヤ（Ｈｏｓｏｙａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９：２７２４４−２７２５０頁、２００６年；コバヤシ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２６：２２１−２２９頁、２００６年）から入手した。
ＰＣ１２ｈおよびＣＯＳ７細胞培養物。細胞系を培養し、以前に記載されたとおり、細胞死アッセイにより分析した（サトウ（Ｓａｔｏｈ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７５：１０９２−１１０２頁、２０００；サトウ（Ｓａｔｏｈ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７：５０−６２頁、２００１年；サトウ（Ｓａｔｏｈ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：２２４９−２２５５頁、２００３年）。安定な形質移入体の作出のために、ＰＣ１２ｈ細胞を、８％のウシ胎児血清および８％のウマ血清（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバッド、カリフォルニア州）で補足されたダルベッコー修飾イーグル培地の入っている１００−ｍｍペトリ皿上に接種した。次にこの細胞に、トランスファスト（ＴｒａｎｓＦａｓｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社、マジソン、ウィスコンシン州）を用いてｐＥＦ６−Ｎｒｆ２ＷＴまたはｐＥＦ６−Ｎｒｆ２ＤＮを形質移入した。翌日この培地を、３０μｇ／ｍｌのブラストシジン（ｂｌａｓｔｃｉｄｉｎｅ）を含有する新鮮な培地に置き換えた。２週後、各タイプの形質移入体の５つのコロニーを単離した。ＲＴ−ＰＣＲにより高（ＰＣ１２ｈＷ１Ｂ）および低（ＰＣ１２ｈＤ５Ｄ）発現γ−ＧＣＬクローンをスクリーンした。我々は、ＡＲＥ活性が、ＰＣ１２ｈＷ１Ｂ細胞において高く、ＰＣ１２ｈＤ５Ｄ細胞において低く、γ−ＧＣＬおよびＡＲＥ活性のレベルがよく相関することを示唆していることを見出した。Ｎｒｆ２ＷＴおよびＮｒｆ２ＤＮの構成物の発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより確認した。
ＲＴ−ＰＣＲ。ＰＣ１２ｈ細胞および脳溶解産物中のＣＡによる第二相誘導を調べるために、皮質培養物からの総ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを、以下のプライマー対を用いて実施した（ホソヤ（Ｈｏｓｏｙａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９：２７２４４−２７２５０頁、２００５年； コバヤシ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２６：２２１−２２９頁、２００６年）：ＣｙｐＡ（８９ｂｐ）、５’−ＡＣＡ ＧＧＴ ＣＣＴ ＧＧＣ ＡＴＣ ＴＴＧ ＴＣ−３’（センス） ａｎｄ ５’−ＡＧＣＣＡＣＴＣＡＧＴＣＴＴＧＧＣＡＧＴ−３’（アンチセンス）；ＨＯ−１（２８４ｂｐ）、５’−ＣＡＧ ＴＣＧ ＣＣＴ ＣＣＡ ＧＡＧ ＴＴＴ ＣＣ −３’（センス）および５’− ＴＡＣ ＡＡＧ ＧＡＧ ＧＣＣ ＡＴＣ ＡＣＣ ＡＧＣ−３’（アンチセンス）；ＧＣＬ−Ｍ（２８０ｂｐ）、５’− ＣＴＧ ＣＴＡ ＡＡＣ ＴＧＴ ＴＣＡ ＴＴＧ ＴＡＧ Ｇ−３’（センス）および５’− ＣＴＡ ＴＴＧ ＧＧＴ ＴＴＴ ＡＣＣ ＴＧＴ Ｇ−３’（アンチセンス）；ＧＣＬ−Ｃ（２１３ｂｐ）、５’− ＧＴＣ ＴＴＣ ＡＧＧ ＴＧＡ ＡＣＡ ＴＴＣ ＣＡＡ ＧＣ−３’（センス）および５’− ＴＧＴ ＴＣＴ ＴＣＡ ＧＧＧ ＧＣＴ ＣＣＡ ＧＴＣ−３’（アンチセンス）；およびＮＱＯ１（２１２ｂｐ）、５’− ＧＴＧ ＴＡＣ ＡＧＣ ＡＴＴ ＧＧＣ ＣＡＣ ＡＣ−３’（センス）および５’−ＡＡＡ ＴＧＡ ＴＧＧ ＣＣＣ ＡＣＡ ＧＡＡ ＡＧ−３’（アンチセンス）。
一次皮質培養物および２つのタイプのグルタメート毒性に関するアッセイ。グルタメートにより引き起こされる神経細胞死の細胞機序を調査するために、大脳皮質のニューロンをインビトロ系として用いた。機能性ＮＭＤＡ受容体の発現レベルは、興奮毒性が優勢かそれとも酸化的グルタメート毒性が優勢かを判定するために重要である。インビトロでの日数（ＤＩＶ）が増すとともに、皮質培養物中のこれら受容体の発現レベルが増加する。機能性ＮＭＤＡ受容体を未だ発現していないこれら未成熟皮質培養物においては、酸化的グルタメート毒性が優勢であり；高濃度（２ｍＭ）のグルタメートは、酸化的ストレスを介して細胞死を誘導する（マーフィ（Ｍｕｒｐｈｙ）ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．４：１６２４−１６３３頁、１９９０年；リー（Ｌｅｅ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３７９４８−３７９５６頁、２００３年）。当該研究におけるこの背景情報に鑑みて、我々は胎性１７日目（Ｅ１７）のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから大脳皮質培養物を調製し、酸化的グルタメート毒性に関する実験系としてＤＩＶ２にてそれらを調べた（マーフィ（Ｍｕｒｐｈｙ）ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．４：１６２４−１６３３頁、１９９０年；リー（Ｌｅｅ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３７９４８−３７９５６頁、２００３年）。ミトコンドリアの電子輸送鎖の複合体Ｉ阻害剤であるロテノンもまた、未成熟皮質培養物において酸化的ストレスを誘導する（マーフィ（Ｍｕｒｐｈｙ）ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．４：１６２４−１６３３頁、１９９０年；リー（Ｌｅｅ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３７９４８−３７９５６頁、２００３年）。
さらに、機能性ＮＭＤＡ受容体が、これらのニューロン上で発現することから、我々は、成熟皮質培養物（Ｅ１７、ＤＩＶ２１）を用いて興奮毒性を評価した。短時間（１５分）の低濃度（５０μＭ）ＮＭＤＡなどの比較的軽い傷害に対する成熟皮質培養物の暴露では、この系において遅延性で主としてアポトーシスの神経細胞死を引き起こすことが示され；対照的に、より高濃度ＮＭＤＡの長時間暴露は、壊死をもたらす（ボンフォコ（Ｂｏｎｆｏｃｏ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７１６２−７１６６頁、１９９５年；バッド（Ｂｕｄｄ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：６１６１−６１６６頁、２０００年）。主として神経細胞アポトーシス（壊死ではなく）を誘導するために、我々は、皮質培養物を５０μＭのＮＭＤＡ（ＮＭＤＡ受容体操作チャンネルのマグネシウム媒介ブロックを防止するために１．８ｍＭのＣａＣｌ2、名目上Ｍｇ2+の無いアール（Ｅａｒｌｅ）の平衡塩類溶液（ＥＢＳＳ）中、プラス共アゴニスト５μＭのグリシン）（ボンフォコ（Ｂｏｎｆｏｃｏ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７１６２−７１６６頁、１９９５年）に１５分間暴露させた。ＮＭＤＡへの暴露後、この培養物を、媒体またはＣＡを含有する通常の培地に戻し、次いで２０時間インキュベートしてから、それらを細胞生存に関して分析した。ＣＡまたは媒体は、ＮＭＤＡの添加１時間前に存在させ、この実験を通して残存した。ＣＡが、ＮＭＤＡ誘導ニューロンアポトーシスをブロックする能力を評価するために、ニューロンを特異的に標識する抗ＮｅｕＮおよび抗ＭＡＰ−２による二重免疫蛍光標識、およびアポトーシスを検出するための核形態に関するヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）染色によりアポトーシスのニューロンを我々は確認した。これらの成熟皮質培養物（Ｅ１７、ＤＩＶ２１）中のニューロンおよび非神経細胞のパーセンテージは、特異的マーカーの使用によって判定した際に、それぞれ３３．６±４．９％および６６．４±４．４％であった。（サトウ（Ｓａｔｏｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：７６８−７７３頁、２００６年）。未成熟皮質培養物（Ｅ１７、ＤＩＶ２）において、神経細胞のパーセンテージは、９０％超であった（サトウ（Ｓａｔｏｈ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７：５０−６２頁、２００１年）。
免疫細胞化学。培養物を、３％パラホルムルデヒドにより室温で２０分間固定した。ＰＢＳ中で３回洗浄後、細胞を０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で５分間透過させた。ＰＢＳ中でさらに３回洗浄後、細胞を、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。次に細胞を０．２％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）中で３回洗浄し、次に二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。その後、細胞を再度洗浄し、それらの核を、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３，２５８（５μｇ／ｍｌ）またはＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ）により５分間染色した。染色された調製物を据付けて、エピ蛍光顕微鏡により調べた。以下の一次抗体を用いた：ニューロン（それぞれ樹状突起および核）を確認するために抗Ｎｒｆ２抗体、抗ＭＡＰ２および抗ＮｅｕＮ抗体、および星状細胞を確認するために抗Ｓ１００β抗体。二次抗体として、我々は、ＦＩＴＣ複合化抗マウスＩｇＧ、ローダミン複合化抗マウスＩｇＧ、またはローダミン複合化抗マウスＩｇＧ、またはローダミン複合化ストレプトアビジンを用いた。
一過性トランスフェクションおよびルシフェラーゼ活性の測定。ＰＣ１２ｈ細胞または大脳皮質培養物（Ｅ１７、ＤＩＶ２１）を、１μｇのプラスミドＤＮＡプラスリポフェクタミン２０００（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）カールスバッド、カリフォルニア州）を含有するＥＢＳＳ中で５時間インキュベートした。トランスフェクションの効率性は、ｐＳＶ−β−ｇａｌ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））との共トランスフェクションにより発現されたβ−ガラクトシダーゼ活性に正規化された。レポーター遺伝子アッセイに関して、細胞に、１μｇのレポーター構成物［ＡＲＥ（ＧＳＴＹａ）−ルシフェラーゼ］および０．２μｇのｐＳＶ−β−ｇａｌを１時間トランスフェクトした。次いで細胞を、ＰＢＳ単独中で洗浄し、ＣＡの有無下の培養培地中、さらに２４時間インキュベートした。細胞溶解物中のホタルルシフェラーゼ活性およびβ−ガラクトシダーゼ活性を、それぞれルシフェラーゼ系およびβ−ガラクトシダーゼ酵素アッセイ系を用いて測定した。（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）。
アガロース固定化ストレプトアビジンまたは抗体による免疫沈降。ＰＣ１２ｈ細胞（ＣＡＢ処理または媒体処理）を、プロテアーゼ阻害剤カクテルで補足されたＲＩＰＡ緩衝液中で溶解した。この溶解物を、４℃、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その後、上澄液を、アガロース固定化ストレプトアビジンと共に４°Ｃで１時間インキュベートした。あるいは、抗Ｋｅａｐ１による免疫沈降に関して、細胞溶解物を、該抗体と共に４°Ｃで一晩インキュベートし、その後、セファロースＣＬ−４Ｂ上に固定化されたタンパク質Ａを添加し、インキュベーションを４°Ｃで１時間継続した。次に、この複合体をリンス用緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、０ｍＭのトリス-ＨＣｌ［ｐＨ ７．５］、０．１％ ＮＰ−４０、１ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０２％のＮａＮ３）で３回洗浄した。ＳＤＳサンプル緩衝液を添加し、この混合物を５分間沸騰させ、上澄液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。次に免疫ブロットを、上記のとおり実施した。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により検出されたＣＡの脳内への転位。ＣＮＳへの薬物の浸透を試験する実験に関して、我々は、２２〜２６ｇの体重の成体オスＣ５７ＢＬ／６マウス（チャールズリバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ））を用いた。このマウスをケージ内で、標準的な飼育条件（自然の明暗サイクル、２３±３℃の温度、５０±１０％の相対湿度）下、飼料と水に自由に摂取させた。実験条件に対して７日の順応後、マウスを各実験群（各々、ｎ＝１０のマウス）に無作為に割り当てた。１８時間固定された４匹のＣ５７ ＢＬ／６マウスの各々に、０．３ｍｌのオリーブ油中３ｍｇのＣＡを経口投与した。注入１時間後と３時間後に、エーテル麻酔下で血清および脳を、化学分析のために単離した。組織からアセトニトリルおよびエタノールによりＣＡを抽出した。ＣＡ濃度は、ＨＰＬＣ（カラム、μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８；温度、４０℃；ＨＰＬＣシステム、島津（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）［京都、日本国］ＬＣ１０Ａｖｐ；検出器、ＵＶ ２３０ｎｍ；流出溶媒、２％酢酸またはアセトニトリル、１ｍｌ／分での３０％Ｂの定組成）により得られた。
脳ＧＳＨの測定。エーテル麻酔下、心臓穿刺による放血後、マウスの脳を取り出し、液体窒素中で素早く凍結させた。脳溶解物中の血液成分のＨＰＬＣ分析により血管からの不純物としてＧＳＨを除いた。これらのラインに沿って、我々は、ＣＡ注入マウスの血清中に主要な未知のピーク（保持時間１２．５分、恐らくＣＡの分解産物を示す）を我々は観察した；しかしながら、このピークは、脳溶解物中には検出されず、血液からの不純物は我々の条件下で生じないことを示した。
凍結脳を、氷上で１％のスルホサリチル酸により１０分間溶解し、総グルタチオン（還元型および酸化型）を、以前に記載されたとおりに測定した（サガラ（Ｓａｇａｒａ）ら、２００２年）。手短に言うと、この溶解物を、氷上で１０分間インキュベートした後、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）微量遠心管中での遠心分離後に上澄液を採取した。各上澄液をトリエタノールアミンで中和したら、総グルタチオン（還元型および酸化型）濃度を測定した。純粋なＧＳＨを用いて検量線を得た。酸化型ＧＳＨの測定に関しては、２−ビニルピリジンを用いるグリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ）の方法を用いて還元型ＧＳＨを除去した。
限局性大脳虚血および再灌流。ＣＡ（１ｍｇ／ｋｇ）を、ＰＢＳ中１０％のＤＭＳＯ（１０μｌ／ｇ体重）の媒体中で腹腔内に注入し；対照は、媒体単独を注入した。本研究者は、処置群に対して盲検した。以前に記載されたとおり、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）／再灌流の腔内フィラメントモデルを利用した（ワング（Ｗａｎｇ）ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：２２８−２３１頁、１９９８年；グ（Ｇｕ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：１１８６−１１９０頁、２００２年；グ（Ｇｕ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：６４０１−６４０８頁、２００５年；サトウ（Ｓａｔｏｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：７６８−７７３頁、２００６年）。６〜８週齢の２０〜３０ｇ体重のオスＣ５７／ＢＬ／６マウスを、１２時間の明／１２時間の暗サイクルのケージに入れ、飼料と水を自由に摂取させた。一晩絶食させた後、動物をイソフルランで麻酔にかけ、７０％の酸化窒素／３０％の酸素混合物をノーズコーンを通して送達された。麻酔は、外科手法の継続時間に維持され、我々の管理下で典型的に１０分間持続した。閉塞およびその後の再灌流のために腔内縫合位置の成功を確保するために、全ての動物において右中大脳動脈の領域で局所大脳血流（ｒＣＢＦ）をモニターした。以前に記載されたとおり、頭蓋骨表面（正中線に対して３ｍｍ側方および十字縫合に対して２ｍｍ後方）に固定され、中大脳動脈の遠位動脈供給に位置決めされたプローブを有するレーザドップラー血流計（ペリムド（Ｐｅｒｉｍｅｄ）、ノースロイヤルトン、オハイオ州）により、ｒＣＢＦを測定した（ワング（Ｗａｎｇ）ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：２２８−２３１頁、１９９８年；グ（Ｇｕ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：１１８６−１１９０頁、２００２年；グ（Ｇｕ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：６４０１−６４０８頁、２００５年）。２時間の右ＭＣＡＯに供された全てのマウスは、ｒＣＢＦが虚血時のベースラインの＜２５％に減じた評価基準に合致し、再灌流の開始後２時間以内にベースラインの＞５０％に回復した。核心温度は、サーボ制御加熱ブランケットにより３７±１°Ｃに維持した。我々は、動脈血圧、血中ガスおよびグルコースなど他の生理学的変数をモニターし、これらのパラメータは、媒体処置とＣＡ処置との間で有意差はなかった。右大腿動脈には、カニューレを挿入して血圧およびサンプルの動脈血中ガスならびにグルコースをモニターした。虚血前、虚血時、再灌流時に、血圧トランスデューサ、ブリッジ増幅器、およびコンピュータ化データ獲得システム（ＭａｃＬａｂｓ ８ｓ；ＡＤインスツルメンツ（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、キャッスルヒル、ニューサウスウェールズ、豪州国）により血圧を継続して記録した。動脈血中ガスは、虚血前および再灌流１５分後に血中ガスおよびグルコースの分析装置（Ｓｔａｔ Ｐｒｏｆｉｌｅ Ｕｌｔｒａ Ｃ；ノババイオメディカル、ワルサム、マサチューセッツ州）により測定した。
マウスが、２時間のＭＣＡＯに次いで２４時間の再灌流を受けた後、殺処理し、脳を１−ｍｍ厚さの切片にスライスした。各スライスを、ＴＴＣの２．５％溶液中、３７°Ｃで１０分間インキュベートし、次いで保存のために４％緩衝ホルムアルデヒド溶液中に固定化した。脳浮腫の作用を最少にするために、同側性半球（右）から対側性非梗塞半球（左）の容量を差し引くことによって梗塞容量を測定した。梗塞は右ＭＣＡ領域で生じ、以前に記載されているコンピュータ化画像分析システム（ＮＩＨ画像、バージョン１．６２）により定量化した（ワング（Ｗａｎｇ）ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：２２８−２３１頁、１９９８年；グ（Ｇｕ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：１１８６−１１９０頁、２００２年；グ（Ｇｕ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：６４０１−６４０８頁、２００５年）。
統計解析。各実験を、四通り中少なくとも３回繰り返した。データは、平均±ＳＥＭとして表した。統計的有意は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）に次いでポストホックシェッフェ（ｐｏｓｔ ｈｏｃ Ｓｃｈｅｆｆｅ）の検定により判定した。
結果
ＣＡはＧＳＨおよびタンパク質チオールに結合する。
ＣＡは、ＴＢＨＱの場合に示唆されたように、酸素および他の酸素ラジカルにプロトンおよび電子を供与すると提案されている（ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５：４３００−４３０９頁、２００３年）。同時に、ＣＡはキノンへと酸化される。核磁気共鳴（ＮＭＲ）を用い、我々は、ＣＡの炭素（１４）がＧＳＨチオールによる求核的攻撃の単一の標的であると結論づけた。ＣＡのカテコール環の容易な酸化により、そのキノン誘導体への変換がもたらされる。ＧＳＨなどのチオール含有化合物は、求電子性炭素上に求核的攻撃を誘導することができ、したがって、ＧＳ−ＣＡ付加体を形成することができる。
次に我々は、ＧＳ−ＣＡ付加体形成の速度を評価した。ＧＳ−ＣＡ付加体は安定性が高いため、カテコールからキノンへの酸化は、これら化学反応の律速段階であると提案されていた。該反応液は過剰モルのＣＡおよびＧＳＨを含有していたが、ＧＳ−ＣＡ付加体はきわめてゆっくりと現れた。１８時間のインキュベーション後であっても、反応して付加体を形成したＣＡは、わずか１７．５％であった。この結果により、ＣＡのカテコールからキノン体への変換（酸化）は、無細胞系においてきわめてゆっくりした過程であることが示唆される。
次に、他のチオール、この場合はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対するＣＡの結合を評価した。システイン３４上の単一の遊離チオール基のため、ＢＳＡは求電子性化合物との付加体形成のインビトロ証明に使用されてきた（サトー（Ｓａｔｏｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：７６８−７７３頁、２００６年）。この反応をモニターするために、ビオチンが化学リンカーによってＣＡのカルボン酸部位に結合しているＣＡ−ビオチン（ＣＡＢ）を合成した。ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンをプローブとして用い、ＢＳＡとＣＡＢの付加体形成を検出することができた。この目的のため、ＢＳＡを、ＰＢＳ中、媒体またはＣＡＢと、室温で５時間混合し、電気泳動させ、次いでストレプトアビジンにより探索した。ＣＡＢに曝露した後、ＢＳＡとＣＡＢの複合体に相当する単一バンド（６８ｋＤａ）を検出した。この様式で我々は、ＣＡＢが用量依存的な様式でＢＳＡと付加体を形成できることを実証した。
さらに、システインチオールが該複合体の形成にとって必須であるかどうかを調べた。もしＣＡの炭素＃１４がＢＳＡの遊離システインに結合するならば、不可逆的なチオールアルキル化剤であるＮＥＭによる前処理により、この結合はなくなるはずであると考えた。我々は、ゲルのクーマシーブリリアントブルー染色から判断して、ＮＥＭによる前処理により、用量依存的な様式でストレプトアビジンのシグナルが低下した一方、総タンパク質は事実上同じままであったことを見出した。これらの結果は、システインチオールがＣＡの標的であることを示唆している。
ＣＡは、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２／ＡＲＥ経路を活性化する。
求電子性化合物の神経保護効果は、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路の活性化を介して、現れることが多い（サトー（Ｓａｔｏｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：７６８−７７３頁、２００６年；クラフト（Ｋｒａｆｔ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１１０１−１１１２頁、２００４年；シー（Ｓｉｅ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０３２１−１０３３５頁、２００５年）。この活性化カスケードにおける最初の反応は、Ｋｅａｐ１タンパク質上の特定のシステインに対する求電子性化合物の結合である（ホング（Ｈｏｎｇ）ら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１８：１９１７−１９２６頁、２００５年；エグラー（Ｅｇｇｌｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１００７０−１００７５頁、２００５年；ツァング（Ｚｈａｎｇ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０９４１−１０９５３頁、２００４年）。このような結合により、細胞の転写経路が開始され、第二相酵素の誘導に至る（タラレイ（Ｔａｌａｌａｙ）、Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ １２：５−１１頁、２０００年；パドマナブハム（Ｐａｄｍａｎａｂｈａｍ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２１：６８９−７００頁、２００６年；イトー（Ｉｔｏｈ）ら、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．３６：１２０８−１２１３頁、２００４年）。したがって、ＣＡに対する結合にとって不可欠な要素を判定するために、Ｋｅａｐ１のドメイン（ＢＴＢ、ＩＶＲ、およびＤＧＲと称される）を調べた。したがって、免疫共沈降実験のために、ＣＯＳ７細胞に、ＨＡタグ化野生型Ｋｅａｐ１タンパク質（ＨＡ−ＷＴ Ｋｅａｐ１）またはタグ化Ｋｅａｐ１タンパク質の種々の欠失変異体（ＨＡ−ΔＢＴＢ Ｋｅａｐ１、ＨＡ−ΔＩＶＲ Ｋｅａｐ１、およびＨＡ−ΔＤＧＲ Ｋｅａｐ１）を発現するＤＮＡをトランスフェクトした。次いで、トランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を、媒体または１０μＭのＣＡＢによって処理し、溶解させた。我々は、抗ＨＡ抗体により、総細胞ライセート中のＫｅａｐ１タンパク質の発現レベルを定量化した。各々のＫｅａｐ１変異タンパク質は、予想分子量（ＨＡ−ΔＢＴＢ Ｋｅａｐ１は５７ｋＤａ、ＨＡ−ΔＩＶＲ Ｋｅａｐ１は５３ｋＤａ、およびＨＡ−ΔＤＧＲ Ｋｅａｐ１は３７ｋＤａ）の同様なレベルで発現した。次に、Ｋｅａｐ１／ＣＡＢ複合体を検出するために、細胞ライセートをストレプトアビジンにより免疫沈降させ、抗ＨＡ抗体によって探索した。ＣＡＢに結合したＫｅａｐ１−ＷＴに相当する７３ｋＤａのタンパク質が、ＣＡＢによって処理した細胞内に見られた。ΔＤＧＲ Ｋｅａｐ１もまた、ＣＡＢに対する強い結合を顕した。対照的に、ΔＩＶＲ Ｋｅａｐ１は、ＣＡＢに対してきわめてわずかな結合しか示さず、一方、ΔＢＴＢ Ｋｅａｐ１は、全く結合を示さなかった。まとめると、これらの結果は、最高のＣＡ結合には、Ｋｅａｐ１タンパク質のＢＴＢドメインおよびＩＶＲドメインが必要であるという考えと一致する（ホソヤ（Ｈｏｓｏｙａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９：２７２４４−２７２５０頁、２００５年；コバヤシ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２６：２２１−２２９頁、２００６年）。ＣＡ結合に関するＢＴＢドメインの要件は、以前の結果と一致する（ホング（Ｈｏｎｇ）ら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１８：１９１７−１９２６頁、２００５年；エグラー（Ｅｇｇｌｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１００７０−１００７５頁、２００５年；ツァング（Ｚｈａｎｇ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２４：１０９４１−１０９５３頁、２００４年）。
Ｋｅａｐ１タンパク質に対するＣＡの求電子性キノン体の結合後、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路の活性化には、Ｎｒｆ２の核転位が必要である（タラレイ（Ｔａｌａｌａｙ）、Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ １２：５−１１頁、２０００年；パドマナブハム（Ｐａｄｍａｎａｂｈａｍ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２１：６８９−７００頁、２００６年；イトー（Ｉｔｏｈ）ら、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．３６：１２０８−１２１３頁、２００４年）。したがって、次に我々は、免疫蛍光法により、ＣＯＳ７細胞内のＮｒｆ２タンパク質の細胞内分布を調べた。基礎的条件下で、Ｎｒｆ２タンパク質は、細胞質に主に局在化していたが、１０μＭのＣＡに曝露させると核内に転位したことは、Ｎｒｆ２が、Ｋｅａｐ１タンパク質に対するＣＡの結合に応じて核内に転位することを示唆している。ＣＯＳ７細胞と同様に、Ｋｅａｐ１（非ＨＡタグ化）発現ベクターをトランスフェクトし、ＣＡに曝露した神経ＰＣ１２ｈ細胞は、ＣＡ／Ｋｅａｐ１複合体を形成した。
第二相酵素は、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路の求電子性誘導により活性化される重要なエフェクターである。第二相酵素のγ−ＧＣＬ軽鎖（ＧＣＬ−Ｌ）、γ−ＧＣＬ重鎖（ＧＣＬ−Ｈ）、ＨＯ−１、およびＮＱＯ１の誘導を検出するために、１０μＭのＣＡで前処理したＰＣ１２ｈ細胞のｍＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。内部陽性対照として、シクロフィリンＡ（ＣＹＰＡ）遺伝子を用いた。６〜２４時間のインキュベーション後、ＣＡにより、全ての第二相遺伝子が誘導された。これらの結果は、以前、他の求電子体に関して示された、ＣＡが恐らくＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路の活性化を介して、１組の第二相遺伝子を誘導したという考えに一致する。
次に我々は、ＡＲＥの活性化を試験することによって、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路の関与をより正確に調べた。この転写要素は、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路に応答するため、我々は、Ｎｒｆ２のドミナントネガティブ（ＤＮ）またはＫｅａｐ１発現ベクターの存在下または非存在下、ＡＲＥ（ＧＳＴＹａ）−ルシフェラーゼをトランスフェクトしたＰＣ１２ｈ細胞を用いて、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを実施することにより、ＡＲＥの活性化をモニターした（アラム（Ａｌａｍ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２６０７１−２６０７７頁、１９９９年）。ルシフェラーゼ活性に基づくと、ＣＡ（１０μＭ）は、ＡＲＥベースの転写発現を＞１０倍刺激した。対照的に、ＡＲＥのＣＡ刺激活性化は、Ｎｒｆ２−ＤＮまたはＫｅａｐ１の同時トランスフェクションによって有意に抑えられた。この連続実験により、ＣＡが、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路を介してＡＲＥを活性化することが示唆される。
ＣＡＢもまた、ＡＲＥを有意に活性化したが、その効力は、ＣＡよりも実質的に低かった。例えば、２０μＭのＣＡＢがＡＲＥを活性化したのは、１０μＭのＣＡよりもはるかに低い程度だった。同様に、酸化的なグルターメート毒性に対してＰＣ１２ｈ細胞を保護するのに、ＣＡよりも高いレベルのＣＡＢが必要であった。このように、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路を活性化するために、ＣＡよりも数倍の用量のＣＡＢが必要であると考えられる。ＣＡは、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路の活性化によってＰＣ１２ｈ細胞を保護する。
多数の第二相酵素が、細胞のレドックス調節に関与しているため、これらの酵素の誘導はしばしば、酸化的ストレスに対する抵抗性をもたらす（タラレイ（Ｔａｌａｌａｙ）、Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ １２：５−１１頁２０００年；パドマナブハム（Ｐａｄｍａｎａｂｈａｍ）ら、Ｍｏｌｌ．Ｃｅｌｌ ２１：６８９−７００頁、２００６年；イトー（Ｉｔｏｈ）ら、Ｆｒｅｅ Ｒａｄ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．３６：１２０８−１２１３頁、２００４年）。したがって、ＣＡがこのような傷害からＰＣ１２ｈ細胞を保護できるかどうかを調べた。我々は、未処置のＰＣ１２ｈ細胞、Ｎｒｆ２ＷＴを発現するＰＣ１２ｈ細胞（ＰＣ１２ｈＷ１Ｂ）、およびＮｒｆ２ＤＮを発現するＰＣ１２ｈ細胞（ＰＣ１２ｈＤ５Ｄ）を調製した。酸化的ストレスに遭遇した細胞の生存に及ぼすＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路効果を調べるために、該細胞を高濃度のグルタメートに曝露した。ＰＣ１２ｈ細胞においては、高（ミリモル）濃度のグルタメートにより、主にシスチン流入阻害による細胞内ＧＳＨの欠失によって、酸化的細胞死が誘導される（ペレイラおよびオリベイラ（Ｐｅｒｅｉｒａ ａｎｄ Ｏｌｉｖｅｉｒａ）、Ｆｒｅｅ Ｒａｄ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２３：６３７−６４７頁、１９９７年）。生存細胞と死細胞を視覚化するために、培養物をそれぞれ、フルオレセインジアセテート（ＦＤＡ）とヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。また、細胞の生存率を３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）アッセイによって定量化した（図４Ａ）。グルタメート（１〜１０ｍＭ）は２０時間以内にＰＣ１２ｈ細胞の死を誘導し、他方、Ｎｒｆ２ＷＴを過剰発現しているＰＣ１２ｈＷ１Ｂ細胞は、この形態の酸化的ストレスに対して抵抗性が高いことを我々は見出した。Ｎｒｆ２ＤＮを過剰発現しているＰＣ１２ｈＤ５Ｄ細胞は、細胞死に対する感受性の増大を示した。これらの結果は、Ｎｒｆ２タンパク質が、細胞を保護することができることを示唆しているのみならず、内因性のＮｒｆ２が酸化的ストレスに対する細胞保護的な応答に関与していることを示唆している。
次に、植物によって産生され、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路を強力に活性化することが以前示されている（クラフト（Ｋｒａｆｔ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１１０１〜１１１２頁、２００４年；ホング（Ｈｏｎｇ）ら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１８：１９１７−１９２６頁、２００５年）求電子性化合物であるスルホラファンに比較して、ＣＡによるＡＲＥの活性化を調べた。驚くべきことに、等モルベースで、ＣＡは、スルホラファンよりはるかに高い程度までＡＲＥを活性化した（図４Ｂ）。我々のアッセイにおいて、スルホラファンは、酸化的グルタメート毒性に対して、ＰＣ１２ｈ細胞を保護しなかったため、ＡＲＥ活性化におけるこの違いは重要であると考えられる。この結果は、ＡＲＥを活性化するＣＡの能力が下記に見られるその神経保護効果と一致するという考えにも一致する。
次に我々は、ＣＡ誘導神経保護が、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路によって媒介されているという仮説を試験した。０．１〜１μＭのＣＡが、酸化的グルタメート毒性に対して、ＰＣ１２ｈ細胞を用量依存的に保護したことを我々は見出した（図４Ｃ）。対照的に、ＰＣ１２ｈＷＩＢは、酸化的グルタメート傷害後、より少ない細胞死を顕した。これらの結果は、ＣＡが、酸化的ストレスに対して、Ｎｒｆ２依存的様式でＰＣ１２ｈ細胞を保護したことを示唆している。
ＣＡは、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路の活性化を介して皮質ニューロンを保護する。
我々はまた、ＣＡが、一次培養物における未成熟の皮質ニューロンを、酸化的グルタメート傷害から保護できたかどうかを評価した。これらの細胞は、機能的グルタメート／ＮＭＤＡ受容体をまだ発現しておらず、その結果、ＰＣ１２ｈ細胞と同様に、シスチン流入の阻害による非受容体媒介酸化的細胞死を受ける。ＣＡが、グルタメートまたはロテノンへの曝露からこれらの皮質ニューロンを保護したことを我々は見出した。グルタメート（２ｍＭ）およびロテノン（３００ｎＭ）は、ＭＡＰ２およびＮｅｕＮ陽性細胞の数をそれぞれ、対照値の３０．８±２．５％と２５．８±１．９％に減少させた。対照的に、ＣＡ（３μＭ）は、これらの傷害に遭遇した細胞の生存率を、それぞれ、７３．８±３．７％と８０．４±３．４％に増加させた。これらの結果は、ＣＡが、酸化的ストレスに対して、初期のＣＮＳニューロンを保護することを示唆している。
次に、興奮毒性（ＮＭＤＡ受容体媒介）神経細胞死に及ぼすＣＡの作用を調べた。この場合、ＮＭＤＡ受容体を発現する一次培養物中のより多くの成熟大脳皮質ニューロンを用いた。ＮＭＤＡは、生存細胞数を１５±１．６％に減少させたが、３μＭのＣＡは、生存率を３６±２．３％に増加させた。まとめると、これらの結果により、ＣＡが、非受容体媒介酸化的ストレスに対するのと同様に、ＮＭＤＡ受容体媒介興奮毒性からも培養初期ニューロンを保護したことが示唆される。
これらの皮質培養物中で、ＣＡがＡＲＥを活性化したかどうかを確認するために、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを実施した。ＡＲＥ媒介転写は、３μＭのＣＡの存在下で２．３倍増加し、この効果がＮｒｆ２−ＤＮによって消失したことにより、ＣＡがＮｒｆ２依存的様式でＡＲＥを活性化したことが示唆された。ＣＡは、ニューロンと非ニューロン細胞との双方に蓄積する（図５）。
ＣＡの作用部位を判定するために、混合ニューロン／グリア皮質培養物（Ｅ１７、ＤＩＶ２１）を、ＣＡＢで処理し、次いで、それらを固定後にローダミン結合ストレプトアビジンで染色した。同時に該培養物を、ニューロンマーカーであるＭＡＰ２または非神経細胞マーカーであるＳ１００βに対する抗体によって染色した。低濃度のＣＡＢ（例えば３μＭ）では、ニューロンは、強く標識化されなかったが、非神経細胞はＣＡＢ−ストレプトアビジンに対して強い陽性であり、ＣＡＢがニューロンではなく、非神経細胞に蓄積したことを示した。高濃度のＣＡＢ（例えば１０μＭ）では、ニューロンも標識化された。これらの結果は、ＣＡが、低濃度では非神経細胞に蓄積するが、高濃度ではニューロンにも蓄積することを示唆している。
脳内のＣＡ蓄積
神経変性疾患に対する保護剤としてのＣＡの開発に関して、脳内への通過が必須要件である。この態様を調べるために、ＣＡをマウスに経口投与し（２５ｇのマウス当たり３ｍｇ）血清および脳実質におけるＣＡ（カテコール体）のレベルを、ＨＰＬＣによって測定した。１時間以内に、ＣＡは脳内で有意なレベルに達し、ＣＡが血液−脳関門を通過できたことを示唆した。
次に、ＣＡが脳内で活性を示すかどうかを調べた。マウスに０．０３％のＣＡを含有した食餌を１週間自由に取らせた。次いで該マウスの脳を取り出し、抽出物を調製し、ＧＳＨおよびＧＳＳＧのレベルを測定した。これらの条件下、ＣＡは、総ＧＳＨ＋ＧＳＳＧとＧＳＨ／ＧＳＳＧの比率の双方を増加させた（図６）。これらの実験の間に、総ＲＮＡもまた脳から抽出し、ＲＴ−ＰＣＲに供し、第二相酵素であるＨＯ−１およびγ−ＧＣＳの有意な誘導を見出したが、これはＣＡがＡＲＥを活性化し、したがって、第二相酵素を誘導し、ＧＳＨレベルを増加させるという考えに一致する。したがって、経口投与されたＣＡは、脳に到達できただけでなく、神経保護的になり得る経路の活性化にも有効であったと我々は結論づけた。また、ＣＡの投与によって脳内の第二相酵素の誘導がもたらされたため、通常カテコールまたは「プロドラッグ」形態で求電子性ではないＣＡを、求電子性（キノン）化合物へと変換するインビボでの化学反応が生じることが、これらの実験によって示唆される。
この機序の解明によって、この求電子性の前駆体化合物によるインビボでの神経保護的有効性試験のための研究の舞台が設定されることは最も重要なことである。
ＣＡはインビボでＭＣＡＯ／再潅流傷害から脳を保護する。
次に、ＭＣＡＯ／再潅流傷害後に、ＣＡが脳梗塞の体積を減少させることができたかどうかを試験した。ＭＣＡＯの１時間前に、ＣＡまたは媒体（ＰＢＳ中１０％のＤＭＳＯ）を腹腔内注射した。再潅流の開始２４時間後に、冠状切片のＴＴＣ染色によって脳梗塞の体積（可能な浮腫に関して補正）を評価した。媒体を注射したマウスでは、ＭＣＡＯは重篤な脳損傷を誘導し、脳梗塞の体積は、以前の報告（グー（Ｇｕ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：１１８６−１１９０頁、２００２年；（グー（Ｇｕ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：６４０１−６４０８頁、２００５年；サトー（Ｓａｔｏｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：７６８−７７３頁、２００６年）と同様に、同側半球の５１．２±２．４％であった。対照的に、ＣＡは、脳梗塞の体積を有意に減少させ（３４．５±３．６％に）（図７）、ＣＡがインビボで神経保護的であるという考えと一致する。
考察
本実験において、ＣＡが、インビトロとインビボの双方で、グルタメート／酸化的ストレスおよび脳虚血から神経保護的であることを我々は見出した。この保護を可能にする化学物質に関して、真のエフェクターはＣＡのカテコール型であるのか、それともキノン型であるのかという疑問が生じる。もし、カテコール型のＣＡがエフェクターであるならば、それは抗酸化活性によってニューロンを保護するはずである。対照的に、キノン型がエフェクターであるならば、それはＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路の活性化によってニューロンを保護すると考えられる。本試験において我々は、エフェクターは、キノン型分子であって、カテコール型分子ではないことを見出した。この結論は、以下の結果に基づいている：（１）カテコール型ではなく、キノン型のＣＡがＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路を活性化させた；（２）ＷＴ Ｎｒｆ２の安定な発現によるＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路の活性化によって、酸化的ストレスに対してＰＣ１２ｈ細胞が保護された；（３）ＤＮ Ｎｒｆ２の安定な発現によるＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路の阻害によって、酸化的ストレスに誘導された細胞死が増加し、ＣＡによる保護が減少した。したがって、カテコール型ＣＡは、酸素ラジカルへの電子対供与によって抗酸化活性を発揮する可能性はあり得るが、この機序は、ここで見られた神経保護においては限られた役割しか果たしていないと思われる。
我々が用いた無細胞系において、カテコールＣＡからキノンＣＡへの変換の時間経過はかなり遅かった。次に、ＣＡのキノン型はいかにして神経保護的であり得るのだろうか。１つの妥当な説明は、ここで用いられた無細胞実験と細胞培養実験との間の違いにある。細胞は、例えば、ＧＳＨおよびシステイン担持のタンパク質上に多くのチオールを有するため、キノンはこれらのチオールと速やかに反応して、付加体を形成し；付加体形成によるキノン型ＣＡの除去によって、遊離カテコールと遊離キノンとの間の平衡が、キノンの方へシフトする。したがって、無細胞系よりも細胞ベースでの変換がはるかに速いはずである。また、ＧＳＨとタンパク質における種々のシステイン残基との間のチオール反応性の違いがある。例えば、いくつかのタンパク質は、塩基性アミノ酸のモチーフに位置している場合にチオレートアニオンへと容易に変換され得る反応性となり得るシステインを有する。システイン（１５１）は、そのような活性システインの典型的な一例である。このシステインは、求電子性化合物のセンサーと考えられる。したがって、Ｋｅａｐ１のシステイン（１５１）は、求電子性化合物との反応性がＧＳＨよりも高い。したがって、持続的に存在する低濃度のキノン型ＣＡは、ＧＳＨではなくてＫｅａｐ１と優先的に反応し、それによって、細胞防御系の活性化に寄与し得る。これが、それ自体求電子性化合物であるＮＥＰＰ１１よりもＣＡがはるかに毒性が低い理由の１つであり得ると推測される。
当該の連続インビトロ実験において、酸化的ストレスに対してＣＡがニューロンを保護した化学的および分子的機序を示した。ＣＡは、求電子性前駆体（またはプロ求電子性）化合物から求電子性形態へと変換され、それによって、神経保護的なＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路を活性化する（図８）。その化学的機序は、キノン型へと酸化されるカテコール型ＣＡを含み、１４位の炭素［Ｃ（１４）］が求電子性となる。このキノン型ＣＡが、ＧＳＨまたは種々の他のタンパク質のシステインチオールによる求核性攻撃に供されて、付加体を形成する。この化学反応によって、Ｋｅａｐ１タンパク質のシステインチオールがＫｅａｐ１−ＣＡ付加体を形成し、その結果、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２複合体からＮｒｆ２タンパク質の遊離をもたらすことは重要である。次いで、Ｎｒｆ２が核内に転位でき、そこで、ＡＲＥ転写要素を介して第二相酵素の転写を活性化する。これらの第二相酵素はニューロンのレドックス状態を改善し、抗酸化防御系に寄与する。
求電子性化合物はｓｈ受容体の化学構造を有し得るが、エノン型（例えばＮＥＰＰ１１）およびカテコール型（例えば、ＣＡおよびＴＢＨＱ）が主要な群である。我々の以前の発見および他のグループの発見（サトー（Ｓａｔｏｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：７６８−７７３頁、２００６年；クラフト（Ｋｒａｆｔ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１１０１−１１１２頁、２００４年；シー（Ｓｈｉｈ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：１０３２１−１０３３５頁、２００５年）から、エノン型およびキノン型の求電子性化合物の脳内細胞分布が異なっている可能性があることを我々は提案する。ＮＥＰＰ１１が、星状細胞とは対照的に、ニューロンに蓄積し、その結果、ニューロンＨＯ−１を誘導するという我々の以前の発見（サトー（Ｓａｔｏｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：７６８−７７３頁、２００６年）に基づくと、ＮＥＰＰ１１などのジエノンを含むエノン型の求電子体は、ニューロンにおいて優先的に作用すると思われる。対照的に、ＴＢＨＱなどのカテコール型求電子体は、ＴＢＨＱがニューロンではなく星状細胞におけるＡＲＥを活性化するという事実から証明されるように、星状細胞に優先的に作用する（クラフト（Ｋｒａｆｔ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１１０１−１１１２頁、２００４年；シー（Ｓｈｉｈ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：１０３２１−１０３３５頁、２００５年）。これらの発見を鑑みて、エノン型の求電子性ＮＥＰＰ１１は直接的な神経保護作用を及ぼし、一方、カテコール型のＴＢＨＱはパラクリン型の神経保護作用を及ぼすと我々は提案する（サトーおよびリプトン（Ｓａｔｏｈ ａｎｄ Ｌｉｐｔｏｎ）Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３０：３８−４５頁、２００７年）。興味深いことにＣＡは、以下に考察するように、直接的およびパラクリン双方の（したがって、「混合された」）神経保護作用をもたらすと思われる。
ＣＡＢを用いて我々が行なった免疫組織化学的実験において、ＣＡのこの標識形態は、低濃度（３μＭ）では非神経細胞に、より高濃度（１０μＭ）ではニューロンに蓄積した。しかし、ＣＡＢによってもたらされたＡＲＥ活性化およびその結果の神経保護は、ＣＡによるものよりもはるかに弱かった。この違いは、ＣＡＢに対する細胞膜のより低い透過性、またはＫｅａｐ１タンパク質に対するＣＡＢのより低い結合親和性によるものであったと言える。この違いに鑑みて、＜１０μＭのＣＡが、非神経細胞と神経細胞双方に蓄積すると我々は予想する。したがって、ＣＡは、ＴＢＨＱに関して以前見られた星状細胞媒介の神経保護作用およびＮＥＰＰ１に関して以前見られたニューロン媒介神経保護と同様の双方の細胞型に作用を及ぼすことを提案するのは妥当である。
ＮＥＰＰ１１およびＣＡなどの求電子体の神経保護化合物としての重要な利点は、抗酸化的第二相酵素の転写活性化である。このタイプの神経保護は、パーキンソン病およびアルツハイマー病などの慢性神経変性疾患において有益である可能性があり得る。ＮＥＰＰ１１は以前、求電子性の化学反応によってニューロンを保護することが示されている（サトー（Ｓａｔｏｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：７６８−７７３頁、２００６年；サトーおよびリプトン（Ｓａｔｏｈ ａｎｄ Ｌｉｐｔｏｎ）Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３０：３８−４５頁、２００７年）。しかし、全身投与が、脳内の意図された標的に到達する前にチオール基質との反応をもたらし得るため、ＮＥＰＰ１１は可能な治療薬として重大な問題を有する。意図された作用の病的部位における酸化的傷害によって求電子体へと返還されるまでは非反応性のまま留まるプロ求電子性化合物を有することがはるかに良いと考えられる。このような薬剤が「病的活性化治療薬」と称されていたもの（リプトン（Ｌｉｐｔｏｎ）、Ｎａｔｕｒｅ ４２８：４７３頁、２００４年）と思われ、ＣＡはこのような薬剤を構成できると考えられる。ＣＡは、ＮＥＰＰ１１および類似化合物よりも２つの明白な利点を有すると思われる：（ｉ）病的部位における酸化的傷害によってプロドラッグから求電子体へ変換されることによる潜在毒性の低さ、および（ｉｉ）脳組織への効果的な浸透。これらの特徴はＣＡの化学的構造から生じる。したがって、カテコールがキノンへ酸化されると、それはより疎水性となり、傷害組織に留まる傾向となる。
さらに、ＣＡは、インビトロでＮＥＰＰ１１よりも毒性が少ない。ＣＡは高い治療指数を顕す。すなわち、１００μＭのＣＡは神経細胞に対して毒性でない一方、１〜３μＭという少ないＣＡが神経保護的である。ＣＡの低毒性はまた、ＣＡが、ＮＥＰＰ１１とは異なり、傷害の近辺でのみ求電子性になるという事実によっても説明できる。酸化的ストレスは、神経変性疾患の進行において重要な役割を果たしている（コイレおよびパットファーケン（Ｃｏｙｌｅ ａｎｄ Ｐｕｔｔｆａｒｃｈｅｎ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：６８９−６９５頁、１９９３年）。標的部位においてプロ求電子性化合物を活性化し、必要な場所に神経保護を提供するためにこの病的酸化レベルを用いることができることを、本明細書において我々は実証した。したがって、闘うべき病的活性そのものを介して神経保護的プロ求電子性薬剤を活性化することにより、このアプローチは神経変性障害に対して新規な戦略となる。さらに我々の知見では、この研究は、チオール（Ｓ−）アルキル化によりニューロンを保護し、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路の活性化をもたらす天然産物の最初の実証である。したがって、植物によって産生される天然プロ求電子性化合物は、神経変性疾患治療のための神経保護的薬剤候補である。
（参照）
全ての刊行物、特許および特許出願は、参照として本明細書中に援用される。上述の明細書において、本発明は、その特定の好ましい実施形態に関して記載され、多くの詳細が、例示の目的のために示されているが、本発明がさらなる実施形態を許容することができ、本明細書中の特定の詳細が本発明の基本原理から逸脱せずに相当に変更できることは、当業者には明らかであろう。

Claims (76)

  1. 化学式ＩＶ
    Figure 2010505958
     ［式中、
    Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、Ｘ26およびＸ27はそれぞれ独立してＨ、ＯＨ、オキソ、またはＹであり、
    ＹはＢ−Ｃ−ＤまたはＣ−Ｂ−ＤまたはＣ−Ｂ−Ｃ−Ｄであり、そのうちいずれかは環炭素に結合して縮合環を形成してもよく、
    Ｂは不存在、カルボニル、カルボキシ、エーテル、スルファニル、アミノ、−ＮＨＣ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−より成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、
    Ｃは不存在、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アリール、アリールアルキル、およびアリールアルケニルより成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、かつ縮合環を形成するために環炭素に結合されてもよく、
    Ｄは不存在、カルボキシ、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3、ＮＯ3、ＮＯ2、ＮＯ、アミノ、ヒドロキシル、並びにそのエーテルおよびエステル誘導体より成る群から選択される］
    で表される化合物、又はその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩または溶媒和物。
  2. Ｂが不存在である、請求項１に記載の化合物。
  3. Ｘ21およびＸ24がそれぞれ独立してメチル、カルボキシ、−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ3、ＣＨ2ＯＨ、またはＣＨ2ＯＣ（Ｏ）ＣＨ3である、請求項１に記載の化合物。
  4. Ｘ22およびＸ23がそれぞれ独立してＨ、ＯＨ、オキソ、または−ＯＣＨ3である、請求項１に記載の化合物。
  5. Ｘ25もしくはＸ27またはその両方がメチルである、請求項１に記載の化合物。
  6. Ｘ21、Ｘ26またはＸ27の少なくとも１つがカルボキシである、請求項１に記載の化合物。
  7. Ｘ21またはＸ24の１つがＣＨ3であり、かつもう１つがカルボキシ、−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、および−ＣＨ2ＯＣ（Ｏ）ＣＨ3より成る群から選択される、請求項１に記載の化合物。
  8. Ｘ22およびＸ23の少なくとも１つがヒドロキシまたはオキソである、請求項７に記載の化合物。
  9. 前記求電子化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩または溶媒和物がＸ26のＲエナンチオマーを含んでなる、請求項１に記載の化合物。
  10. （ａ）請求項１に記載の化合物、パラカルノシン酸、パラＬ−ドーパ、パラカフェ酸、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩または溶媒より成る群の一員から選択される神経保護的量の化合物と、（ｂ）薬学的に許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
  11. 神経保護的量の求電子化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩または溶媒を含んでなる組成物であって、前記求電子化合物が哺乳動物の細胞におけるＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２からＮｒｆ２の解離をもたらす組成物。
  12. 前記求電子化合物がＫｅａｐ１に結合し、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２複合体からＮｒｆ２の解離をもたらす請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記求電子化合物が細胞における第二相酵素の発現を増大させる、請求項１１に記載の組成物。
  14. 前記第二相酵素がＨＯ−１である、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記求電子化合物がニューロンもしくは星状細胞またはその両方において蓄積する、請求項１１に記載の組成物。
  16. 前記求電子化合物がニューロンもしくは星状細胞またはその両方へ活発に輸送される、請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記求電子化合物が親油性である、請求項１１に記載の組成物。
  18. 前記求電子化合物が、細胞におけるＧＳＨレベルを実質的に削減することなくＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２複合体からＮｒｆ２の解離をもたらす請求項１１に記載の組成物。
  19. 前記求電子化合物がエノンまたはジエノン化合物である、請求項１１に記載の組成物。
  20. 前記求電子化合物がクルクミンまたはＮＥＰＰである、請求項１９に記載の組成物。
  21. 前記求電子化合物がＮＥＰＰ６またはＮＥＰＰ１１である、請求項２０に記載の組成物。
  22. 前記求電子化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩又は溶媒和物が、コアベンゼン環を有する化学式Ｉ
    Figure 2010505958
     ［式中、
    Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5およびＸ6は、それぞれ独立して、Ｘ1−Ｘ6の少なくとも２つがＯＨであり、かつＸ1−Ｘ6の少なくとも１つがＹであるという条件で、Ｈ、ＯＨ、アルキルまたはＹであり、
    ＹはＢ−Ｃ−ＤもしくはＣ−Ｂ−ＤまたはＣ−Ｂ−Ｃ−Ｄであり、そのいずれかはコアベンゼン環に結合し、縮合環を形成してもよく、
    Ｂは不存在、カルボニル、カルボキシ、エーテル、スルファニル、アミノ、−ＮＨＣ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−より成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、
    Ｃは不存在、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アリール、アリールアルキル、およびアリールアルケニルより成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、かつ縮合環を形成するためにコアベンゼン環に結合されてもよく、そして
    Ｄは不存在、カルボキシ、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3、ＮＯ3、ＮＯ2、ＮＯ、アミノ、ヒドロキシル、及びそのエーテルおよびエステル誘導体より成る群から選択される］
    で表される化合物である、請求項１１に記載の組成物。
  23. 前記求電子化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩または溶媒和物が化学式Ｉの化合物であり、かつＸ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5およびＸ6が、それぞれ独立して、Ｘ1−Ｘ6の２つがＯＨであり、かつＸ1−Ｘ6の１つがＹであるという条件で、Ｈ、ＯＨ、アルキルまたはＹである、請求項２２に記載の組成物。
  24. 前記求電子化合物、もしくは薬学的に許容されるプロドラッグ、塩又は溶媒和物が化学式Ｉの化合物であり、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5およびＸ6が、それぞれ独立して、Ｘ1−Ｘ6２つがパラまたはオルト配置でＯＨであり、かつＸ1−Ｘ6の１つがＹであるという条件で、Ｈ、ＯＨ、アルキルまたはＹである、請求項２３に記載の組成物。
  25. 前記求電子化合物、もしくは薬学的に許容されるプロドラッグ、塩又は溶媒和物が化学式Ｉの化合物であり、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5およびＸ6が、それぞれ独立して、Ｘ1−Ｘ6２つがパラ配置でＯＨであるという条件でＨ、ＯＨ、アルキルまたはＹであり、そしてＤがカルボキシ、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3、ＮＯ3、ＮＯ2、ＮＯ、アミノ、ヒドロキシル、かつそのエーテルおよびエステル誘導体である、請求項２４に記載の組成物。
  26. Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5およびＸ6が、それぞれ独立して、Ｘ1−Ｘ6少なくとも２つがＯＨであり、かつＸ1−Ｘ6の少なくとも１つがＹであるという条件で、Ｈ、ＯＨ、アルキルまたはＹである、請求項２２に記載の組成物。
  27. Ｄが前記求電子化合物のカルボキシまたはエステル誘導体である、請求項２２に記載の組成物。
  28. Ｂが不存在またはカルボニルである、請求項２２に記載の組成物。
  29. ＹがＢ−Ｃ−Ｄである、請求項２２に記載の組成物。
  30. 前記求電子化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩又は溶媒和物が、環Ｅ、環Ｆおよび環Ｇを含んでなる化学式ＩＩまたは化学式ＩＩＩ
    Figure 2010505958
     ［式中、
    Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、およびＸ20は、それぞれ独立して、Ｘ11−Ｘ20の少なくとも２つがＯＨであるという条件でＨ、ＯＨ、またはＹであり、ＹはＢ−Ｃ−ＤもしくはＣ−Ｂ−ＤまたはＣ−Ｂ−Ｃ−Ｄであり、そのいずれかは環炭素に付着されて縮合環を形成することができ、
    Ｂは不存在、カルボニル、カルボキシ、エーテル、スルファニル、アミノ、−ＮＨＣ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−より成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、
    Ｃは不存在、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アリール、アリールアルキル、およびアリールアルケニルより成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、かつ縮合環を形成するために環炭素に付着されうるとともに、
    Ｄは不存在、カルボキシ、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3、ＮＯ3、ＮＯ2、ＮＯ、アミノ、ヒドロキシル、及びそのエーテルおよびエステル誘導体より成る群から選択される］
    で表される化合物である、請求項１１に記載の組成物。
  31. Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、およびＸ20が、それぞれ独立して、Ｘ11−Ｘ15の２つがＯＨであり、またはＸ16−Ｘ19の２つがＯＨであり、またはＸ11−Ｘ15の２つがＯＨであり、かつＸ16−Ｘ19の２つがＯＨであるという条件でＨ、ＯＨ、またはＹである、請求項３０に記載の組成物。
  32. Ｘ11−Ｘ20の少なくとも１つがＹである、請求項３０に記載の組成物。
  33. Ｙが親水性または不存在である、請求項３２に記載の組成物。
  34. Ｙが親水性である、請求項３３に記載の組成物。
  35. 化学式ＩＩまたは化学式ＩＩＩの前記化合物がパラまたはオルト配置で２つのＯＨ基を含んでなるＥ環を含んでなる、請求項３０に記載の組成物。
  36. 化学式ＩＩまたは化学式ＩＩＩの前記化合物がパラ配置で２つのＯＨ基を含んでなるＥ環を含んでなる、請求項３５に記載の組成物。
  37. 化学式ＩＩまたは化学式ＩＩＩの前記化合物がパラまたはオルト配置で２つのＯＨ基を含んでなるＧ環を含んでなる、請求項３０に記載の組成物。
  38. 化学式ＩＩまたは化学式ＩＩＩの前記化合物がパラ配置で２つのＯＨ基を含んでなるＧ環を含んでなる、請求項３７に記載の組成物。
  39. 前記求電子化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩又は溶媒和物が、化学式ＩＶ、化学式Ｖまたは化学式ＶＩ
    Figure 2010505958
     ［式中、
    Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、Ｘ26およびＸ27は、それぞれ独立してＨ、ＯＨ、オキソ、またはＹであり、
    ＹはＢ−Ｃ−ＤもしくはＣ−Ｂ−ＤまたはＣ−Ｂ−Ｃ−Ｄであり、そのいずれかは環炭素に結合して縮合環を形成してもよく、
    Ｂは不存在、カルボニル、カルボキシ、エーテル、スルファニル、アミノ、−ＮＨＣ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−より成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、
    Ｃは不存在、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アリール、アリールアルキル、およびアリールアルケニルより成る群から選択され、そのいずれかは場合により置換され、かつ縮合環を形成するために環炭素に結合されうるとともに、
    Ｄは不存在、カルボキシ、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3、ＮＯ3、ＮＯ2、ＮＯ、アミノ、ヒドロキシル、かつ
    そのエーテルおよびエステル誘導体より成る群から選択される］の化合物である、請求項１１に記載の組成物。
  40. Ｂが不存在である、請求項３９に記載の組成物。
  41. 前記求電子化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩又は溶媒和物が化学式ＩＶまたは化学式Ｖの化合物である、請求項３９に記載の組成物。
  42. 前記求電子化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩又は溶媒和物が化学式ＩＶの化合物である、請求項３９に記載の組成物。
  43. Ｘ21およびＸ24が、それぞれ独立してメチル、カルボキシ、−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ3、ＣＨ2ＯＨ、またはＣＨ2ＯＣ（Ｏ）ＣＨ3である、請求項３９に記載の組成物。
  44. Ｘ22およびＸ23が、それぞれ独立してＨ、ＯＨ、オキソ、または−ＯＣＨ3である、請求項３９に記載の組成物。
  45. Ｘ25もしくはＸ27またはその両方がメチルである、請求項３９に記載の組成物。
  46. Ｘ21、Ｘ26またはＸ27の少なくとも１つがカルボキシである、請求項３９に記載の組成物。
  47. Ｘ21またはＸ24の１つがＣＨ3であり、かつもう１つがカルボキシ、−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、および−ＣＨ2ＯＣ（Ｏ）ＣＨ3より成る群から選択される、請求項３９に記載の組成物。
  48. Ｘ22およびＸ23の少なくとも１つがヒドロキシまたはオキソである、請求項４７に記載の組成物。
  49. 前記求電子化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩又は溶媒和物がＸ26のＲエナンチオマーを含んでなる、請求項３９に記載の組成物。
  50. 前記求電子化合物が、ＴＢＨＱ；ＮＥＰＰ；パラＬ−ドーパ；ベンゼン酢酸、２,５-ジヒドロキシ−α−オクチリデン−、（Ｚ）−（９ＣＩ）；ベンゼンデカン酸、２,５-ジヒドロキシ−ι−オキソ−（９ＣＩ）；ベンゼンウンデカン酸、２,５-ジヒドロキシ−（９ＣＩ）；ベンゼンブタン酸、２,５-ジヒドロキシ−γ−オキソ−β−フェニル−（９ＣＩ）；ベンゼンブタン酸、２,５-ジヒドロキシ−β−（４−メチルフェニル）−γ−オキソ−（９ＣＩ）；安息香酸、２−［２−（２,５-ジヒドロキシフェニル）エチル］−６−ヒドロキシ−（９ＣＩ）；安息香酸、５−［２−（２,５-ジヒドロキシフェニル）エチル］−２−ヒドロキシ−（９ＣＩ）；安息香酸、４−［２−（２,５-ジヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル］−（９ＣＩ）；安息香酸、３−［［（２,５-ジヒドロキシフェニル）メチル］アミノ］−（９ＣＩ）；［１、１’−ビフェニル］−４−カルボン酸、２’、５’−ジヒドロキシ−（９ＣＩ）；ペンタン酸、５−（２,５-ジヒドロキシフェノキシ）−２,２−ジメチル−（９ＣＩ）；オクタン酸、８−［（２,５-ジヒドロキシベンゾイル）アミノ］−（９ＣＩ）；ベンゼンブタン酸、２,５-ジヒドロキシ−γ−フェニル−（９ＣＩ）；５,９−ウンデカジエン酸、２−［２−（２,５-ジヒドロキシフェニル）エチリデン］−１１−ヒドロキシ−６,１０−ジメチル−、（２Ｚ,５Ｅ,９Ｅ）−（９ＣＩ）；５,９−ウンデカジエン酸、２−［２−（２,５-ジヒドロキシフェニル）エチリデン］−６,１０−ジメチル−、（２Ｚ,５Ｅ）−（９ＣＩ）；ベンゼンブタン酸、α−［（３Ｅ）−４,８−ジメチル−３,７−ノナジエニル］−２,５-ジヒドロキシ−γ−オキソ−、（＋）−（９ＣＩ）；２,６−オクタジエン酸、８−（２,５-ジヒドロキシフェニル）−２,６−ジメチル−８−オキソ−、（２Ｅ,６Ｅ）−（９ＣＩ）；３−（３,４）−ジヒドロキシフェニル］−２−プロペン酸のエステル；および３−（２,５）−ジヒドロキシフェニル］−２−プロペン酸のエステルより成る群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
  51. 前記組成物が前記求電子化合物の前記プロドラッグを含んでなることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
  52. 前記細胞が酸化的ストレス下にあり、かつ前記プロドラッグが細胞において酸化され、求電子化合物を産生する、請求項５１に記載の組成物。
  53. 哺乳動物における神経学的障害、眼科学的障害、およびその組合せより成る群の一員を治療するために有効である量の前記求電子化合物、そのプロドラッグ、塩または溶媒を含んでなる、請求項１１に記載の組成物。
  54. 前記哺乳動物がヒトである、請求項５３に記載の組成物。
  55. 前記神経学的障害、眼科学的障害、またはその組合せが、精神的外傷、虚血、および低酸素症より成る群の少なくとも一員に起因する、請求項５３に記載の組成物。
  56. 前記神経学的障害、眼科学的障害、またはその組合せが、疼痛を伴う神経障害、神経障害痛、糖尿病性神経障害、薬物依存、薬物添加、薬物離脱症状、ニコチン離脱症状、アヘン耐性、アヘン離脱症状、うつ病、不安神経症、運動障害、遅発性ジスキネジー、血液−脳関門を中断させる脳感染、髄膜炎、髄膜脳炎、発作、低血糖症、心停止、脊髄傷害、頭部傷害、周産期低酸素症、心停止、低血糖神経傷害、緑内障、網膜虚血、虚血性視神経障害、黄斑変性症、多発性硬化症、高ホモシステイン血症の続発症、けいれん、疼痛、統合失調症、筋けいれん、片頭痛、尿失禁、嘔吐、脳浮腫、遅発性ジスキネジー、ＡＩＤＳ−誘発（または関連）認知症、眼傷害、網膜症、認知障害、およびＨＩＶ感染と関連した神経傷害より成る群から選択される、請求項５３に記載の組成物。
  57. 前記神経学的障害、眼科学的障害、またはその組合せが、てんかん、アルツハイマー病、血管（多発梗塞性）認知症、ハンチントン病、パーキンソニズム、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、および最小認知障害より成る群から選択される、請求項５３に記載の組成物。
  58. 哺乳動物における老化または症状を削減または減速させるために有効である量の前記求電子化合物、そのプロドラッグ、塩または溶媒を含んでなる、請求項１１に記載の組成物。
  59. 薬学的に許容される担体をさらに含んでなる、請求項１１に記載の組成物。
  60. 神経保護的量の求電子化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩または溶媒を含んでなる組成物であって、前記求電子化合物が哺乳動物の細胞におけるＫｅａｐ１に結合し、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２複合体からのＮｒｆ２の解離をもたらし、かつ細胞におけるＧＳＨレベルを実質的に削減することなく細胞における第二相酵素の発現を増大させる化合物。
  61. 請求項１１の組成物を細胞に投与するステップを含んでなる哺乳動物の細胞の傷害、損傷または死を予防または遅延させる方法。
  62. 前記組成物を細胞にインビトロで投与するステップを含んでなる、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記組成物を哺乳動物に投与するステップを含んでなる、請求項６１に記載の方法。
  64. かかる治療を必要とする哺乳動物における神経学的障害、眼科学的障害、またはその組合せを治療する方法であって、前記方法が請求項１１に記載の組成物を哺乳動物に投与するステップを含んでなる方法。
  65. 神経保護求電子化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩または溶媒を特定する方法であって、前記方法が前記求電子化合物、そのプロドラッグ、塩または溶媒を含んでなる組成物を細胞に投与するステップと、前記組成物の投与が細胞におけるＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２複合体からのＮｒｆ２の解離をもたらすかを判定するステップとを含んでなる方法。
  66. 前記組成物をインビトロで細胞に投与するステップを含んでなる、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記組成物をインビボで細胞に投与するステップを含んでなる、請求項６５に記載の方法。
  68. 前記求電子化合物がＫｅａｐ１に結合するかを判定するステップを含んでなる、請求項６５に記載の方法。
  69. 前記組成物の投与が細胞におけるＮｒｆ２によって転写活性化をもたらすかを判定するステップを含んでなる、請求項６５に記載の方法。
  70. 前記組成物の投与が細胞における第二相酵素の発現の増大をもたらすかを判定するステップを含んでなる、請求項６５に記載の方法。
  71. 前記第二相酵素がＨＯ−１である、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記組成物の投与が細胞のストレス誘発死を低下または遅延させるかを判定するステップを含んでなる、請求項６５に記載の方法。
  73. 前記組成物の投与が適切なインビボアッセイにおける脳虚血／再灌流傷害に対して細胞を含んでなる実験動物を保護するかを判定するステップを含んでなる、請求項６５に記載の方法。
  74. 前記求電子化合物がニューロンもしくは星状細胞またはその両方に蓄積するかを判定するステップを含んでなる、請求項６５に記載の方法。
  75. 前記組成物の投与が、細胞におけるＧＳＨレベルを実質的に削減することなくＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２複合体からのＮｒｆ２の解離をもたらすかを判定するステップを含んでなる、請求項６５に記載の方法。
  76. 神経学的障害、眼科学的障害、またはその組合せを治療する薬剤を調製する、患者の細胞におけるＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２複合体からのＮｒｆ２の解離をもたらす求電子化合物、もしくはその薬学的に許容されるプロドラッグ、塩または溶媒の使用。
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