JP2010504994A - 2−メチレン−(20s,25s)−19,27−ジノル−(22e)−ビタミンd類縁体 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2006年9月28日に出願された米国特許仮出願第60/848,805号による優先権およびその恩典を主張する。
本発明はビタミンD化合物に関し、より詳細には、2-メチレン-(20S,25S)-19,27-ジノル-(22E)-ビタミンD類縁体およびその薬学的使用に関する。
式中、X1、X2、およびX3は同じでも異なっていてもよく、それぞれが水素またはヒドロキシ保護基より選択される。好ましい類縁体は、以下の式Iaを有する2-メチレン-(20S,25S)-19,27-ジノル-(22E)-1α,25-ジヒドロキシビタミンD3である。
2-メチレン-(20S,25S)-19,27-ジノル-(22E)-1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(本明細書において「SS-22」と称する)、すなわち、2位(C-2)炭素におけるメチレン置換基、そのS配置で20位(C-20)におけるメチル基、17位(C-17)に付随した側鎖の22位と23位(C-22とC-23)の間の二重結合、および、側鎖の典型的には27位(C-27)に位置するメチル基と水素原子との置換の存在を特徴とする19-ノルビタミンDが合成され、試験された。C-2位の比較的小さなメチレン基はビタミンD受容体への結合を妨げないので、そのようなビタミンD類縁体は、興味深い標的と考えられる。構造的には、この19-ノル類縁体は本明細書において上述した一般式Iaにより特徴付けられ、そのプロドラッグ(保護ヒドロキシ型の)は、本明細書において上述した一般式Iにより特徴付けられる。
構造II、III、およびIVにおいて、X1基、X2基、およびX3基はヒドロキシ保護基、好ましくはt-ブチルジメチルシリルであり、また当技術分野で周知のように、縮合反応に感受性でありうるか縮合反応を妨げる全ての官能性が適切に保護されることも理解されよう。上述のプロセスは、ビタミンD化合物の調製に関して有効に適用されている収束的合成の概念の適用を表している。(例えばLythgoe et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 590 (1978); Lythgoe, Chem. Soc. Rev. 9, 449 (1983); Toh et al., J. Org. Chem. 48, 1414 (1983); Baggiolini et al., J. Org. Chem. 51, 3098 (1986); Sardina et al., J. Org. Chem. 51, 1264 (1986); J. Org. Chem. 51, 1269 (1986); DeLuca et al., 米国特許第5,086,191号; DeLuca et al., 米国特許第5,536,713号)。
化学的性質
記載した溶媒中で、Hitachi Model 60-100 UV-vis分光計を用いて、紫外線(UV)吸収スペクトルを記録した。1H核磁気共鳴(NMR)スペクトルは、ジュウテリオクロロホルム(deuteriochloroform)中で、Bruker AM-500 FT分光計を用いて500 MHzで記録した。化学シフト(δ)は、内部Me4Si(δ 0.00)から低磁場で報告される。質量スペクトルは、Kratos MS-55データシステムを備えたKratos DS-50 TC機器において70 eVで記録した。試料は、直接挿入プローブを介して、120〜250℃で維持したイオン源へと導入した。Model 6000A溶媒送達システム、Model 6 UK Universalインジェクタ、Model 486チューナブル(tunable)吸光度検出器、および示差R 401屈折計を備えたWaters Associates液体クロマトグラフにおいて、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を実施した。
(3S)-1-p-トルエンスルホニルオキシ-3-トリエチルシリルオキシ-ブタン (2) の調製
無水塩化メチレン(20 mL)中の、(S)-(+)-1,3-ブタンジオール1(1 g、11.1 mmol)、DMAP(30 mg、0.25 mmol)、およびEt3N(4.6 mL、3.33 g、33 mmol)の撹拌溶液に、p-トルエンスルホニルクロリド(2.54 g、13.3 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を4℃で22時間撹拌した。塩化メチレンを加えて、混合物を水で洗浄し、乾燥(Na2SO4)させ、減圧下で濃縮した。残渣を、ヘキサン/酢酸エチル(8:2、次いで1:1)を用いたシリカゲルでのクロマトグラフィーに供し、トシレート(2.31 g、収率85%)を無色油状物として得た。
C15H25O4SSi (M+ - C2H5) の正確な質量計算値329.1243、測定値329.1239。
無水アセトン(50 mL)中のトシレート2(2.71 g、7.6 mmol)の撹拌溶液にヨウ化カリウム(8 g、48 mmol)を添加し、反応混合物を10時間還流した。水(30 mL)を加え、溶液を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相を乾燥(Na2SO4)させ、減圧下で濃縮した。残渣を、ヘキサン/酢酸エチル(97:3)を用いたシリカゲルでのクロマトグラフィーに供し、アルコール3(2.26 g、収率95%)を無色油状物として得た:
C8H18OISi (M+ - C2H5) の正確な質量計算値285.0172、測定値285.0169。
アセトニトリル(50 mL)中のヨウ化物3(1.67 g、5.3 mmol)の撹拌溶液にトリフェニルホスフィン(4.2 g、16 mmol)を添加し、反応混合物を2日間還流した。アセトニトリルを減圧下で蒸発させ、酢酸エチル(50 mL)を添加し、混合物を室温で4時間撹拌した。濾過により溶媒を除去した後、固体を酢酸エチルで洗浄し、濾去して(filtered off)、乾燥させた。純粋なホスホニウム塩4(1.77 g、収率87%)を白色結晶として得た。
メタノール(250 mL)およびピリジン(2.44 g、2.5 mL、31 mmol)中のビタミンD2(3g、7.6 mmol)の溶液にオゾンを-78℃で50分間通気した。次いで、反応混合物に酸素を15分間流して残留オゾンを除去し、溶液をNaBH4(0.75 g、20 mmol)で処理した。20分後、第二のNaBH4(0.75 g、20 mmol)を添加し、混合物を室温まで温めた。次いで、第三のNaBH4(0.75 g、20 mmol)を添加し、反応混合物を18時間撹拌した。水(40 mL)で反応停止させ、溶液を減圧下で濃縮した。残渣を酢酸エチルで抽出し、合わせた有機相を1M HCl水溶液、飽和NaHCO3水溶液で洗浄し、乾燥(Na2SO4)させ、減圧下で濃縮した。残渣を、ヘキサン/酢酸エチル(75:25)を用いたシリカゲルでのクロマトグラフィーに供し、ジオール5(1.21 g、収率75%)を白色結晶として得た:
C13H22O (M+ - H2O) の正確な質量計算値194.1671、測定値194.1665。
無水ピリジン(20 mL)中のジオール5(1.2 g、5.7 mmol)およびDMAP(30 mg、0.2 mmol)の溶液に、塩化ベンゾイル(2.4 g、2 mL、17 mmol)を0℃で添加した。反応混合物を4℃で24時間撹拌し、塩化メチレン(100 mL)で希釈し、5%HCl水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液で洗浄し、乾燥(Na2SO4)させて、減圧下で濃縮した。残渣(3.39 g)を、室温にて無水エタノール(30 mL)中のKOH(1g、15.5 mmol)の溶液で処理した。反応混合物を3時間撹拌した後、pH=6になるまで氷および5%HCl水溶液を添加した。溶液を酢酸エチル(3×50 mL)で抽出し、合わせた有機相を飽和NaHCO3水溶液で洗浄し、乾燥(Na2SO4)させ、減圧下で濃縮した。残渣を、ヘキサン/酢酸エチル(75:25)を用いたシリカゲルでのクロマトグラフィーに供し、アルコール6(1.67 g、収率93%)を無色油状物として得た:
C20H28O3の正確な質量計算値316.2038、測定値316.2019。
無水塩化メチレン(10 mL)および無水DMSO(2 mL)中の、アルコール6(640 mg、2.03 mmol)、トリエチルアミン(1.41 mL、1.02 g、10.1 mmol)の溶液に、三酸化硫黄ピリジン錯体(1.94 g, 12.2 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を0℃、アルゴン雰囲気下で1時間撹拌した後、濃縮した。残渣を酢酸エチルで希釈し、ブラインで洗浄し、乾燥(Na2SO4)させて、濃縮した。残渣を、ヘキサン/酢酸エチル(95:5)を用いたシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製し、アルデヒド7(529 mg、収率83%)を油状物として得た:
C20H26O3の正確な質量計算値314.1882、測定値314.1887。
アルデヒド7(1.36g、4.3 mmol)をCH2Cl2(15 mL)中に溶解し、40% N-Bu4NOH水溶液(5.6 mL、5.57 g、8.6mmol)を添加した。得られた混合物を室温で16時間撹拌し、塩化メチレン(30 mL)で希釈し、水で洗浄し、乾燥(Na2SO4)させ、減圧下で濃縮した。残渣を、ヘキサン/酢酸エチル(95:5)を用いたシリカゲルでのクロマトグラフィーに供し、比率約1:1.7の(1H NMRによる)アルデヒド7とそのエピマー(730 mg、収率53%)との混合物を得た。
C20H28O3の正確な質量計算値316.2038、測定値316.2050。
無水塩化メチレン(10 mL)および無水DMSO(2 mL)中の、アルコール8(640 mg、2.03 mmol)、トリエチルアミン(1.41 mL、1.02 g、10.1 mmol)の溶液に、三酸化硫黄ピリジン錯体(1.94 g, 12.2 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を0℃、アルゴン雰囲気下で1時間撹拌した後、濃縮した。残渣を酢酸エチルで希釈し、ブラインで洗浄し、乾燥(Na2SO4)させて、濃縮した。残渣を、ヘキサン/酢酸エチル(95:5)を用いたシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製し、アルデヒド9(529 mg、収率83%)を油状物として得た:
C20H26O3の正確な質量計算値314.1882、測定値314.1887。
無水THF(5 mL)中のホスホニウム塩4(310 mg、0.67 mmol)の撹拌懸濁物に、ブチルリチウム(1.6 M、840 μL、1.34 mmol)を-20℃で加えた。溶液は暗橙色に変わった。1時間後に、無水THF(2 mL)中のアルデヒド9(70 mg、0.22 mmol)の予め冷却(-20℃)した溶液を添加し、反応混合物を-20℃で3時間および室温で18時間撹拌した。水で反応停止させ、混合物を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、乾燥(Na2SO4)させ、蒸発させた。残渣を、ヘキサン/酢酸エチル(95:5)を用いたシリカゲルでのクロマトグラフィーに供し、生成物10(42 mg、収率52%)を得た:
C24H34O3 (M+) の正確な質量計算値370.2508、測定値370.2498。
無水塩化メチレン(3 mL)中のアルコール10(30 mg、0.08 mmol)および2,6-ルチジン(33 μL、30 mg、0.28 mmol)の溶液に、tert-ブチルジメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート(33 μL、37 mg、0.14 mmol)を-20℃で加えた。混合物を0℃、アルゴン雰囲気下で1時間撹拌した。水で反応停止させ、塩化メチレンで抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、乾燥(Na2SO4)させ、減圧下で濃縮した。残渣を、ヘキサンおよびヘキサン/酢酸エチル(97:3)を用いたシリカゲルでのクロマトグラフィーに供し、生成物11(35 mg、89%)を得た。
水酸化ナトリウムのエタノール溶液(2.5M、2 mL)を、無水エタノール(10 mL)中のベンゾエート11(30 mg、62 μmol)の撹拌溶液に加え、反応混合物を18時間還流した。混合物を室温まで冷却し、5%HCl水溶液で中和して、ジクロロメタンで抽出した。合わせた有機相を飽和NaHCO3水溶液で洗浄し、乾燥(Na2SO4)させ、蒸発させた。残渣を、ヘキサン/酢酸エチル(95:5)を用いたシリカゲルでのクロマトグラフィーに供し、アルコール12(17 mg、収率72%)を得た。
無水塩化メチレン(5 mL)中のアルコール12(15 mg、39 μmol)およびピリジニウムp-トルエンスルホネート(3 mg、12 μmol)の溶液に、重クロム酸ピリジニウム(77 mg、207 μmol)を加えた。得られた懸濁物を室温で3時間撹拌した。反応混合物を、WatersシリカSep-Pakカートリッジ(5 g)を通してろ過し、これをヘキサン/酢酸エチル(8:2)でさらに洗浄した。溶媒除去後、ケトン13(10 mg、収率67%)を無色油状物として得た:
C23H42O2Si Na (MNa)+ の正確な質量計算値401.2852、測定値401.2848。
-20℃の無水THF(400 μL)中のホスフィンオキシド12(52 mg、89 μmol)の溶液に、PhLi(ジ-n-ブチルエーテル中で1.8 M、61 μL、110 μmol)をアルゴン雰囲気下で撹拌しながらゆっくりと加えた。溶液は暗橙色に変わった。30分後、混合物を-78℃まで冷却し、無水THF(200 + 100 μL)中のケトン13(9 mg、24 μmol)の予め冷却(-78℃)した溶液をゆっくりと加えた。混合物をアルゴン雰囲気下、-78℃で3時間および0℃で18時間撹拌した。酢酸エチルを加え、有機相をブラインで洗浄し、乾燥(Na2SO4)させ、蒸発させた。残渣をヘキサンに溶解して、WatersシリカSep-Pakカートリッジ(2 g)に加えた。カートリッジをヘキサンおよびヘキサン/酢酸エチル(99.5:0.5)で洗浄して、19-ノルビタミン誘導体14(10 mg、収率46%)を得た。その後Sep-Pakを酢酸エチルで洗浄して、ジフェニルホスフィンオキシド12(22 mg)を回収した。分析目的で、保護ビタミン14の試料を、HPLC(9.4×250 mm Zorbax Silカラム、4 mL/min、ヘキサン/2-プロパノール(99.9:0.1)溶媒系、Rt= 3.80 min)でさらに精製した:
UV(ヘキサン中)lmax 263.1, 253.2, 244.3 nm;
C44H84O3Si3Na (MNa+) の正確な質量計算値767.5626、測定値767.5646。
UV(EtOH中)lmax 262.1, 252.6, 244.1 nm;
C26H40O3Na+ (MNa+) の正確な質量計算値423.2875、測定値402.2870。
2位へのメチレン基の導入、そのS配置で20位(C-20)におけるメチル基の導入、17位(C-17)に付随した側鎖の22位と23位(C-22とC-23)の間の二重結合の導入、および、側鎖の典型的には27位(C-27)に位置するメチル基と水素原子との置換は、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3と比べて、全長組換えラットビタミンD受容体へのSS-22の結合に対してほとんど影響が無かった。化合物SS-22は、標準1,25-(OH)2D3と同等に受容体に結合した(図1)。これらの結果から、化合物SS-22は同等の生物活性を有しうるということが予測される。しかし驚くべきことに、化合物SS-22は独特の生物活性を有する高度に選択的な類縁体である。
ビタミンD受容体結合
試験物質
タンパク質供給源
全長組換えラット受容体を大腸菌(E. coli)BL21 (DE3) Codon Plus RIL細胞中で発現させ、2つの異なるカラムクロマトグラフィー系を用いて均一になるまで精製した。第一の系は、このタンパク質上のC末端ヒスチジンタグを用いるニッケルアフィニティ樹脂であった。この樹脂から溶出したタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィー(S-Sepharose Fast Flow)を用いてさらに精製した。精製したタンパク質のアリコートを液体窒素中で急速凍結し、使用時まで-80℃で保存した。結合分析に用いるために、0.1%Chaps界面活性剤を含むTEDK50(50 mM Tris、1.5 mM EDTA、pH7.4、5 mM DTT、150 mM KCl)でタンパク質を希釈した。加えた放射性標識リガンドの20%以下が受容体に結合するように、受容体タンパク質およびリガンドの濃度を最適化した。
非標識リガンドをエタノールに溶解し、UV分光光度法を用いて濃度を測定した(1,25(OH)2D3:モル吸光係数=18,200およびλmax=265 nm;類縁体:モル吸光係数=42,000およびλmax=252 nm)。放射性標識リガンド(3H-1,25(OH)2D3、約159Ci/mmol)を、最終濃度1 nMでエタノールに加えた。
放射性標識リガンドおよび非標識リガンドを100 mclの希釈タンパク質に最終エタノール濃度≦10%で加え、混合し、氷上で一晩インキュベーションして、結合平衡に到達させた。翌日、100 mclのヒドロキシルアパタイトスラリー(50%)を各チューブに加え、10分間隔で30分間混合した。ヒドロキシルアパタイトを遠心分離により回収し、次いで、0.5%Triton X-100を含むTris-EDTA緩衝液(50 mM Tris、1.5 mM EDTA、pH7.4)で3回洗浄した。最終洗浄後、Biosafe IIシンチレーションカクテル4 mlを含むシンチレーションバイアルにペレットを移し、混合して、シンチレーション計数器に入れた。放射性標識リガンドのみを含むチューブから全結合を定量した。
試験物質
調査薬物
調査薬物をエタノールに溶解し、UV分光光度法を用いて濃度を測定した。細胞培養液中に存在するエタノールの最終濃度(≦0.2%)を変えることなく一定範囲の薬物濃度を試験できるように、連続希釈液を調製した。
ヒト前骨髄球性白血病(HL60)細胞を、10%ウシ胎児血清を含むRPMI-1640培地中で増殖させた。細胞を5%CO2存在下、37℃でインキュベーションした。
HL60細胞を1.2×105細胞/mlで播種した。播種の18時間後、細胞を二つ組で、薬物により処理した。4日後に細胞を回収し、ニトロブルーテトラゾリウム還元アッセイ法を実施した(Collins et al., 1979; J. Exp. Med. 149:969-974)。計200個の細胞を計数して、細胞内に黒-青のホルマザン沈着物を含む数を記録することによって、分化した細胞のパーセンテージを決定した。単核細胞への分化の確認は、食細胞活性を測定することにより行った(データは示していない)。
ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流の24-ヒドロキシラーゼ(24Ohase)遺伝子プロモーターが安定にトランスフェクションされたROS 17/2.8(骨)細胞において、転写活性を測定した(Arbour et al., 1998)。細胞に一定範囲の用量を投与した。投与の16時間後、細胞を回収し、ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
RLU=相対ルシフェラーゼ単位。
雄の離乳Sprague-Dawleyラットを、Diet 11(0.47% Ca)飼料+AEKで1週間、続いてDiet 11(0.02% Ca)+AEKで3週間飼育した。次いでラットを、0.47% Caを含む飼料に切り換えて1週間、続いて0.02% Caを含む飼料に切り換えて2週間飼育した。0.02% カルシウム飼料の最終週の間に、用量投与を開始した。4回の連続したip投与を約24時間おきに行った。最後の投与から24時間後、切断頸部から採血し、骨カルシウム動員の尺度として血清カルシウム濃度を測定した。反転腸管法(everted gut sac method)を用いた腸管カルシウム輸送分析のために腸の起始部10 cmも採取した。
VDR結合、HL60細胞分化、および転写活性
全長組換えラットビタミンD受容体への結合に関して[3H]-1,25(OH)2D3と競合する能力について、SS-22(Ki=3×10-10M)は、天然ホルモン1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(Ki=1×10-10M)と同じくらいの活性を有する(図1)。HL-60細胞分化を促進する能力(有効性または効力)についても、SS-22(EC50=1×10-9M)と1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(EC50=2×10-9M)との間にはほとんど違いがない(図2を参照されたい)。また、骨細胞における化合物SS-22(EC50=1×10-10M)の転写活性も、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(EC50=2×10-10M)と類似している(図3を参照されたい)。SS-22は、細胞分化および遺伝子転写を引き起こす際ならびに細胞増殖を抑制する際の直接的な細胞活性を有するため、乾癬に非常に有効であり得ることが、これらの結果により示唆される。またこれらのデータにより、SS-22が特に白血病、結腸癌、乳癌、皮膚癌、および前立腺癌に対する抗癌剤として、ならびに、乾燥皮膚(皮膚水分の欠如)、過度の皮膚のたるみ(不十分な皮膚弾力)、不十分な皮脂分泌、およびしわなどの皮膚状態に対して、有意な活性を有しうることも示されている。またこれは、続発性副甲状腺機能亢進症の抑制において非常に活性であることも予想される。
低カルシウム飼料(0.02%)で飼育したビタミンD欠乏ラットを用いて、腸管および骨におけるSS-22および1,25(OH)2D3の活性を試験した。予想通り、天然ホルモン(1,25(OH)2D3)は全投与量において血清カルシウムレベルを上昇させた(図4)。図4は、SS-22が骨からのカルシウム動員における活性をほとんど有さないことを示している。SS-22を260 pmol/日で連続4日間投与しても骨カルシウムの動員は起こらず、SS-22の量を7020 pmol/日まで増加させても実質的な効果は全くなかった。
Claims (79)
- X3が水素である、請求項1記載の化合物。
- X1が水素である、請求項1記載の化合物。
- X1、X2、およびX3が全てt-ブチルジメチルシリルである、請求項1記載の化合物。
- 薬学的に許容される賦形剤と共に、少なくとも1種類の請求項1記載の化合物の有効量を含む、薬学的組成物。
- 有効量が、組成物1グラムあたり約0.01μg〜約1000μgを含む、請求項5記載の薬学的組成物。
- 有効量が、組成物1グラムあたり約0.1μg〜約500μgを含む、請求項5記載の薬学的組成物。
- 薬学的に許容される賦形剤と共に、有効量の2-メチレン-(20S,25S)-19,27-ジノル-(22E)-1α,25-ジヒドロキシビタミンD3を含む、薬学的組成物。
- 有効量が、組成物1グラムあたり約0.01μg〜約1000μgを含む、請求項9記載の薬学的組成物。
- 有効量が、組成物1グラムあたり約0.1μg〜約500μgを含む、請求項9記載の薬学的組成物。
- 化合物が経口投与される、請求項12記載の方法。
- 化合物が非経口投与される、請求項12記載の方法。
- 化合物が経皮投与される、請求項12記載の方法。
- 化合物が局所投与される、請求項12記載の方法。
- 化合物が直腸投与される、請求項12記載の方法。
- 化合物が経鼻投与される、請求項12記載の方法。
- 化合物が舌下投与される、請求項12記載の方法。
- 化合物が約0.01μg/日〜約1000μg/日の投与量で投与される、請求項12記載の方法。
- 化合物が経口投与される、請求項22記載の方法。
- 化合物が非経口投与される、請求項22記載の方法。
- 化合物が経皮投与される、請求項22記載の方法。
- 化合物が直腸投与される、請求項22記載の方法。
- 化合物が経鼻投与される、請求項22記載の方法。
- 化合物が舌下投与される、請求項22記載の方法。
- 化合物が約0.01μg/日〜約1000μg/日の投与量で投与される、請求項22記載の方法。
- 化合物が経口投与される、請求項31記載の方法。
- 化合物が非経口投与される、請求項31記載の方法。
- 化合物が経皮投与される、請求項31記載の方法。
- 化合物が直腸投与される、請求項31記載の方法。
- 化合物が経鼻投与される、請求項31記載の方法。
- 化合物が舌下投与される、請求項31記載の方法。
- 化合物が約0.01μg/日〜約1000μg/日の投与量で投与される、請求項31記載の方法。
- 化合物が経口投与される、請求項40記載の方法。
- 化合物が非経口投与される、請求項40記載の方法。
- 化合物が経皮投与される、請求項40記載の方法。
- 化合物が直腸投与される、請求項40記載の方法。
- 化合物が経鼻投与される、請求項40記載の方法。
- 化合物が舌下投与される、請求項40記載の方法。
- 化合物が約0.01μg/日〜約1000μg/日の投与量で投与される、請求項40記載の方法。
- 化合物が経口投与される、請求項49記載の方法。
- 化合物が非経口投与される、請求項49記載の方法。
- 化合物が経皮投与される、請求項49記載の方法。
- 化合物が局所投与される、請求項49記載の方法。
- 化合物が直腸投与される、請求項49記載の方法。
- 化合物が経鼻投与される、請求項49記載の方法。
- 化合物が舌下投与される、請求項49記載の方法。
- 化合物が約0.01μg/日〜約1000μg/日の投与量で投与される、請求項49記載の方法。
- 化合物が経口投与される、請求項59記載の方法。
- 化合物が非経口投与される、請求項59記載の方法。
- 化合物が経皮投与される、請求項59記載の方法。
- 化合物が直腸投与される、請求項59記載の方法。
- 化合物が経鼻投与される、請求項59記載の方法。
- 化合物が舌下投与される、請求項59記載の方法。
- 化合物が約0.01μg/日〜約1000μg/日の投与量で投与される、請求項59記載の方法。
- 化合物が経口投与される、請求項68記載の方法。
- 化合物が非経口投与される、請求項68記載の方法。
- 化合物が経皮投与される、請求項68記載の方法。
- 化合物が直腸投与される、請求項68記載の方法。
- 化合物が経鼻投与される、請求項68記載の方法。
- 化合物が舌下投与される、請求項68記載の方法。
- 化合物が、約0.01μg/日〜約1000μg/日の投与量で投与される、請求項68記載の方法。
- 動物がヒトである、請求項68記載の方法。
- 動物がペットである、請求項68記載の方法。
- 動物が家畜である、請求項68記載の方法。
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