JP2009532458A - 2−メチレン−1α−ヒドロキシ−19,21−ジノルビタミンD3類縁体およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はビタミンD化合物に関し、より詳細には2-メチレン-1α-ヒドロキシ-19,21-ジノルビタミンD3(SY-44)およびこの化合物を含む薬学的製剤に関する。また本発明は、様々な疾患を治療する際に用いるための薬剤の調製における2-メチレン-1α-ヒドロキシ-19,21-ジノルビタミンD3またはその塩の使用にも関する。
天然ホルモンである1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(1α,25-ジヒドロキシコレカルシフェロールおよびカルシトリオールとも呼ばれる)およびエルゴステロール系のその類縁体、すなわち1α,25-ジヒドロキシビタミンD2は動物およびヒトにおけるカルシウム恒常性の非常に強力な調節物質であることが公知であり、細胞分化におけるそれらの活性も確立されている(Ostrem et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2610 (1987))。1α-ヒドロキシビタミンD3、1α-ヒドロキシビタミンD2、様々な側鎖同族体化ビタミン、およびフッ化類縁体を含む、これらの代謝産物の多くの構造類縁体が調製され、試験されている。これらの化合物のいくつかは細胞分化とカルシウム調節とにおける活性の興味深い分離を示す。活性におけるこの相違は、腎性骨形成異常、ビタミンD抵抗性くる病、骨粗しょう症、乾癬、および特定の悪性病変などの、当技術分野において確立されている様々な疾患の治療において有用である(例えば、Zemplar、Calcipotriol、MC-903、Dovonex、22-オキサ-1α,25-(OH)2D3参照)。
これらすべての引用文献はあらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は概して、2-メチレン-1α-ヒドロキシ-19,21-ジノルビタミンD3(SY-44)および関連化合物、SY-44を含む薬学的製剤、ならびに様々な疾患状態の治療において用いるための薬剤の調製における本化合物の使用を提供する。
式中、X1およびX2は同じまたは異なり、Hまたはヒドロキシ保護基から独立に選択される。一部の態様において、X1およびX2はシリルエーテル基、アルキルエーテル基、アルコキシアルキルエーテル基、アセタール基、およびエステル基などのヒドロキシ保護基である。一部のそのような態様において、X1およびX2は、t-ブチルジメチルシリルエーテル基(TBDMS)、トリメチルシリルエーテル基(TMS)、トリエチルシリルエーテル基(TES)、トリイソプロピルシリルエーテル基(TIPS)、t-ブチルジフェニルシリルエーテル基(TBDPS)、テトラヒドロピラン基(THP)、メトキシエトキシメチル基(MEM)、メトキシメチル基(MOM)、ベンジルエーテル基、t-ブチルエーテル基、N-フタルイミドアセタール基(Nphth)、イソプロピリデン、トリメトキシブタン、2,4-ジメチルペンタン-3-イルオキシカルボニル基(Doc)である。様々な他のヒドロキシ保護基は当業者には公知であり、例えば、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れられるJarowicki et al, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1998, 4005-4037を参照されたい。
本発明は概して、以下に示す式Iを有する化合物を提供する:
式中、X1およびX2は同じまたは異なり、Hまたはヒドロキシ保護基から独立に選択される。一部の態様において、X1およびX2は、シリルエーテル基、アルキルエーテル基、アルコキシアルキルエーテル基、アセタール基、およびエステル基などのヒドロキシ保護基である。一部のそのような態様において、X1およびX2はt-ブチルジメチルシリルエーテル基(TBDMS)、トリメチルシリルエーテル基(TMS)、トリエチルシリルエーテル基(TES)、トリイソプロピルシリルエーテル基(TIPS)、t-ブチルジフェニルシリルエーテル基(TBDPS)、テトラヒドロピラン基(THP)、メトキシエトキシメチル基(MEM)、メトキシメチル基(MOM)、ベンジルエーテル基、t-ブチルエーテル基、N-フタルイミドアセタール基(Nphth)、イソプロピリデン、トリメトキシブタン、2,4-ジメチルペンタン-3-イルオキシカルボニル基(Doc)である。様々な他のヒドロキシ保護基が当業者には公知であり、例えば、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れられるJarowicki et al, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1998, 4005-4037を参照されたい。
デス-A,B-23,24-ジノルコラン-8β,22-ジオール(1)
メタノール(400mL)とピリジン(5mL)中のビタミンD2(5g、12.7mmol)の溶液をアルゴンでパージしながら-78℃に冷却した。アルゴン気流を停止し、青色が現れるまでオゾンの気流を通気した。青色が消えるまで溶液を酸素でパージし、NaBH4(1.2g、32mmol)で処理した。20分後、次のNaBH4(1.2g、32mmol)を加え、反応混合物を室温まで温めた。次のNaBH4(1.2g、32mmol)を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。水(70mL)で反応停止し、真空下で濃縮した。残渣を塩化メチレン(3×100 mL)で抽出した。有機相を1M HCl水溶液(2×100mL)、飽和NaHCO3水溶液(100mL)で洗浄し、無水MgSO4で乾燥させ、真空下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(25%酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、白色結晶として2.05g(9.69mmol;収率76%)のジオール1を得た。
トリエチルアミン(3.00mL、1.67g、21.6mmol)と塩化メチレン(300mL)中の1(3.50g、16.5mmol)とDMAP(100mg)の撹拌溶液に、無水酢酸(1.54mL、2.18g、16.5mmol)を0℃で滴下した。反応混合物を4℃で一晩維持した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を塩化メチレン(200mL)に再度溶解し、10%HCl水溶液(50mL)、飽和NaHCO3水溶液(50mL)、および水(50mL)で洗浄した。有機相を無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮して、白色結晶として4.06g(16.0mmol;収率97%)の2を得た。
塩化メチレン(40mL)と2,6-ルチジン(2.67mL、2.46g、23.0mmol)中の2(4.00g、16.6mmol)の撹拌溶液に、トリフルオロメタンスルホン酸トリエチルシリル(4.52mL、5.28g、20.0mmol)をアルゴン雰囲気下、-50℃で滴下した。30分後、湿塩化メチレン(5mL)および水(80mL)を加えた。反応混合物を塩化メチレン(3×120mL)で抽出し、有機相を飽和CuSO4水溶液(50mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮して、油状物として粗製3を得た。
粗製3のメタノール(100mL)撹拌溶液に、10%ナトリウムメトキシドのメタノール溶液(20mL)を滴下した。2時間後、飽和NH4Cl水溶液(20mL)および水(60mL)を加え、混合物をCH2Cl2(5×100mL)で抽出した。有機相を無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲルカラム(10〜20%酢酸エチル/ヘキサン)で精製して、5.25g(16.1mmol;2からの収率97%)の4を得た。
三酸化硫黄ピリジン複合体(7.42g、46.5mmol)を、トリエチルアミン(5.46mL、3.94g、39.0mmol)と無水DMSO(8.0mL)と無水CH2Cl2(40mL)中の4(2.32g、7.02mmol)の撹拌溶液にアルゴン雰囲気下、0℃で加えた。20分後、塩化メチレン(150mL)を加え、反応混合物を飽和CuSO4水溶液(40mL)および水(40mL)で洗浄した。有機相を無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲル(0.5〜2%酢酸エチル/ヘキサン)で精製して、1.80mg(5.56mmol;収率78%)の5を得た。
カリウムtert-ブタノラート(3.7g、33mmol)のtert-ブタノール(90mL)溶液に酸素を15分間通気した。次いで、酸素パージしながら5のtert-ブタノール(45mL)溶液を滴下した。飽和NH4Cl水溶液(80mL)および水(50mL)を加え、反応生成物をEt2O(5×150mL)で抽出した。有機相を無水MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー(3〜6%酢酸エチル/ヘキサン)で精製して、1.14g(3.68mmol;収率67%)の6を得た。
6のシクロヘキサン(50mL)撹拌溶液にメタクロロ過安息香酸(最大77%、1.5g)を0℃で加えた。次いで、反応混合物を室温まで加温し、5日間撹拌した。1日、2日、および4日後にそれぞれ次のメタクロロ過安息香酸(1.0g、0.8g、および0.6g)を追加した。懸濁液をろ過し、ろ液を飽和NaHCO3水溶液(20mL)で洗浄した。有機相を無水MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー(1〜3%酢酸エチル/ヘキサン)で精製して、0.89g(2.73mmol;収率58%)の7を得た。
7(972mg、2.98mmol)をメタノール(25mL)に溶解し、10%ナトリウムメトキシドのメタノール溶液(5mL)で2.5時間処理した。飽和NH4Cl水溶液(10mL)および水(15mL)を加え、生成物を二塩化メチレン(5×75mL)で抽出した。有機相を無水MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー(5〜15%酢酸エチル/ヘキサン)で精製して、764mg(2.69mmol;収率90%)の8を得た。
8(760mg、2.68mmol)とPPTS(30mg、0.12mmol)の二塩化メチレン(90mL)撹拌溶液に、PDC(2.25g、5.98mmol)を0℃で加えた。冷却浴を取り外し、反応混合物を9時間撹拌した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、残渣をカラムクロマトグラフィー(5〜10%酢酸エチル/ヘキサン)で精製して、642mg(2.28mmol;収率85%)の9を得た。
THF(13.5mL)中の10(4.10g、9.35mmol)の撹拌懸濁液に、1Mカリウムtert-ブトキシドのTHF溶液(8.90mL、8.90mmol)を-10℃で滴下した。懸濁液を撹拌し、30分かけて0℃まで加温した。次いで、9(716mg、2.53mmol)のTHF(3.0mL)溶液をカニューレを介して加え、得られた混合物を45℃で4日間撹拌した。次いで、飽和NH4Cl水溶液(20mL)および水(30mL)を加え、混合物をジエチルエーテル(3×100mL)で抽出した。有機相を無水MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー(ヘキサン-5%酢酸エチル/ヘキサン)で精製して、572mg(1.60mmol;収率63%)の11(Z/E比5:1)を得た。
酢酸エチル(20mL)中の11(552mg、1.52mmol)と5%Pd/C(160mg)の撹拌混合物を、水素で一晩処理した。触媒をろ去し、ろ液を減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルSep-Packカートリッジ(ヘキサン)で精製して、515mg(1.41mmol;収率93%)の12を得た。
12(485mg、1.33mmol)のn-ブタノール(25mL)撹拌溶液に、(1S)-(+)-10-カンファースルホン酸(330mg、1.42mmol)。1日後、溶媒を減圧下で除去し、残渣をカラムクロマトグラフィー(5〜15%酢酸エチル/ヘキサン)で精製して、328mg(1.30mmol;収率98%)の13を得た。
13(10mg、35μmol)とPPTS(結晶2個)の二塩化メチレン(3mL)撹拌溶液に、PDC(55mg、145μmol)を0℃で加えた。冷却浴を取り外し、混合物を3時間撹拌した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、残渣をシリカゲルSep-Packカートリッジ(2〜5%酢酸エチル/ヘキサン)で精製して、8mg(32μmol;収率80%)の14を得た。
15(20mg、35μmol)のTHF(300μ)撹拌溶液に、溶液が深橙色になるまで1.2M PhLiのシクロヘキサン/エーテル(7/3)溶液10μLを-20℃で加えた。次いで、PhLi溶液27μL(32μmol)を滴下した。20分後、反応混合物を-78℃まで冷却し、14(7mg、28μmol)のTHF(150μL)溶液をカニューレを介して加えた。3時間後、冷却浴を取り外し、反応混合物を4℃で一晩撹拌した。次いで、酢酸エチル(10mL)を加え、有機相をブライン(2mL)で洗浄し、無水MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルSep-Packカートリッジ(ヘキサン÷2%酢酸エチル/ヘキサン)で精製して、5mg(8μmol)の粗製16を得た。
5-メチル-1-ヘキサノール(3.65mL、3.00g、25.7mmol)とトリエチルアミン(5.00mL、3.64g、36.0mmol)とDMAP(200mg、1.64mmol)の二塩化メチレン(120mL)撹拌溶液に、塩化トシル(5.72g、30.0mmol)を0℃で加えた。次いで、冷却浴を取り外し、混合物を一晩放置した。飽和NH4Cl水溶液(30mL)および水(30mL)を加え、混合物を二塩化メチレン(3×150mL)で抽出した。混合した有機相を無水MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー(5〜10%酢酸エチル/ヘキサン)で精製して、6.66g(24.7mmol;収率96%)の22を得た。
LiBr(6.26g、72.0mmol)のDMF(40mL)撹拌溶液に、18(6.60g、24.4mmol)のDMF(6mL)溶液を加えた。得られた混合物を45℃で3時間撹拌した。次いで、水(100mL)を加え、反応生成物をジエチルエーテル(5×250mL)で抽出した。溶媒を除去して、2.40g(13.4mmol;55%)の19を得た。
19(2.30g、12.8mmol)とトリフェニルホスフィン(3.70g、14.1mmol)の溶液をトルエン(12mL)中で20時間還流した。次いで、溶媒を除去し、得られた結晶をトルエン(3mL)およびジエチルエーテル(3mL)で洗浄して、4.57g(10.4mmol;収率81%)の10を得た。融点227〜228℃。
(A)ビタミンD受容体結合
試験材料
タンパク質供給源
全長組換えラット受容体を大腸菌(E. coli)BL21(DE3) Codon Plus RIL細胞中で発現させ、2つの異なるカラムクロマトグラフィー系を用いて均質に精製した。第一の系は、このタンパク質のC末端ヒスチジンタグを用いるニッケルアフィニティ樹脂であった。この樹脂から溶出したタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィー(S-Sepharose Fast Flow)を用いてさらに精製した。精製したタンパク質のアリコートを液体窒素中で急速凍結し、使用時まで-80℃で保存した。結合アッセイで用いるために、タンパク質を、0.1%Chaps界面活性剤を含むTEDK50(50mMトリス、1.5mM EDTA、pH7.4、5mM DTT、150mM KCl)で希釈した。受容体タンパク質およびリガンド濃度を、加えた放射性標識リガンドの20%以下が受容体に結合するように最適化した。
非標識リガンドをエタノールに溶解し、UV分光光度法を用いて濃度を定量した(1,25(OH)2D3:モル吸光係数=18,200およびλmax=265nm;類縁体:モル吸光係数=42,000およびλmax=252nm)。放射性標識リガンド(3H-1,25(OH)2D3、約159Ci/mmol)は、最終濃度1nMでエタノール中に加えた。
放射性標識および非標識リガンドを希釈タンパク質100mclに最終エタノール濃度≦10%で加え、混合し、氷上で一晩インキュベーションして結合平衡に到達させた。翌日、ヒドロキシルアパタイトスラリー(50%)(100mcl)を各チューブに加え、10分間隔で30分間混合した。ヒドロキシルアパタイトを遠沈により回収し、次いで0.5%Triton X-100を含むトリス-EDTA緩衝液(50mMトリス、1.5mM EDTA、pH7.4)で3回洗浄した。最終洗浄後、ペレットを、Biosafe IIシンチレーションカクテル4mLを含むシンチレーションバイアルに移し、混合し、シンチレーション計数器に置いた。全結合を、放射性標識リガンドのみを含むチューブから定量した。
試験材料
試験薬
試験薬をエタノールに溶解し、UV分光光度法を用いて濃度を定量した。細胞培養液中に存在するエタノールの最終濃度(≦0.2%)を変えることなく一定範囲の薬物濃度を試験できるように、連続希釈液を調製した。
ヒト前骨髄球性白血病(HL60)細胞を、10%ウシ胎仔血清を含むRPMI-1640培地中で増殖させた。細胞を5%CO2存在下、37℃でインキュベートした。
HL60細胞を1.2×105細胞/mlで播種した。播種の18時間後、細胞を二つ組で、薬物により処理した。4日後、細胞を回収し、ニトロブルーテトラゾリウム還元アッセイを実施した(Collins et al., 1979; J. Exp. Med. 149:969-974)。細胞計200個を計数し、細胞内に黒-青のホルマザン沈着物を含む数を記録することによって、分化した細胞のパーセンテージを決定した。単核細胞への分化の実証は、食細胞活性を測定することにより行った(データは示していない)。
転写活性を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流の24-ヒドロキシラーゼ(24Ohase)遺伝子プロモーターが安定にトランスフェクションされたROS 17/2.8(骨)細胞で測定した(Arbour et al., 1998)。細胞に一定範囲の用量を投与した。投与の16時間後、細胞を回収し、光度計を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。RLU=相対ルシフェラーゼ単位。
雄の離乳Sprague-Dawleyラットを、Diet 11(Suda et al., Purified Rodent Diet-Diet 11、0.47%および0.3%リンを含み、脂溶性ビタミンA、D、EおよびKを適宜供給する)(0.47%Ca)飼料+AEKで1週間、続いてDiet 11(0.02%Ca)+AEKで3週間飼育した。次いでラットを、0.47%Caを含む飼料で1週間、続いて0.02%Caを含む飼料で2週間へと切り換えた。用量投与を0.02%カルシウム飼料の最終週の間に開始した。4回の連続したip投与を約24時間おきに行った。最後の投与から24時間後、切断頸部から採血し、血清カルシウム濃度を骨カルシウム動員の尺度として定量した。反転腸管法(everted gut sac method)を用いた腸管カルシウム輸送アッセイのために腸の起始部10cmも採取した。本明細書において完全に示されたのと同じように参照により本明細書に組み入れられるMartin and Deluca, Am. J. Physiol. 216, 1351 (1969);(DeLuca et al.、米国特許第4,188,345号)により以前に記載されたとおりに、反転腸管アッセイを実施した。
対照材料
A. 陰性対照材料
陰性対照材料を、エタノール(<5%)およびプロピレングリコールを容積(volumetrically)測定し、混合し、次いで2〜8℃で保存することによって調製する。
1,25(OH)2D3を、UV分光光度法(吸光係数=18,200;λmax=265nm)を用いてエタノール保存溶液の濃度を定量することによって調製する。最終溶液中のエタノールが5%未満となるように、1,25(OH)2D3の必要量を容積測定してプロピレングリコールに加える。溶液を混合し、次いで2〜8℃で保存する。
類縁体を、まずUV分光光度法(吸光係数=42,000;λmax=252nm)を用いてエタノール保存溶液の濃度を定量することによって調製する。次いで、最終溶液中のエタノールが5%未満となるように、類縁体溶液を容積測定してプロピレングリコールに加える。溶液を混合し、2〜8℃で保存する。
最終投与の24時間後、各実験動物の尾動脈から約1mLを採血する。血液を室温で凝固させ、次いで3000×gで15分間遠心分離する。血清をポリプロピレンチューブに移し、-20℃で凍結保存する。血清を0.1%塩化ランタン中で希釈し、原子吸光光度計(Perkin Elmer Model 3110, Shelton, CT)で吸光度を測定することにより、カルシウムレベルを測定する。
Claims (28)
- X1およびX2がヒドロキシ保護基である、請求項1記載の化合物。
- X1およびX2がトリエチルシリル基またはt-ブチルジメチルシリル基である、請求項2記載の化合物。
- 請求項1記載の化合物の有効量と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
- 有効量が組成物1グラムあたり約0.01μg〜約1mgの化合物を含む、請求項5記載の薬学的組成物。
- 有効量が組成物1グラムあたり約0.1μg〜約500μgの化合物を含む、請求項5記載の薬学的組成物。
- 生物学的状態を患う被験体に請求項1記載の化合物の有効量を投与する段階を含む、被験体を治療する方法であって、生物学的状態が、代謝性骨疾患;乾癬;白血病;大腸癌;乳癌;前立腺癌;皮膚癌;肺癌;多発性硬化症;狼瘡;真性糖尿病;宿主対移植片反応;臓器移植の拒絶反応;関節リウマチ、喘息、もしくは炎症性腸疾患から選択される炎症性疾患;しわ、十分な皮膚弾力の欠如、十分な皮膚水分の欠如、もしくは不十分な皮脂分泌から選択される皮膚状態;腎性骨形成異常;骨減少症;または骨粗しょう症から選択される、方法。
- 生物学的状態が腎性骨形成異常、ビタミンD抵抗性くる病、骨粗しょう症、または乾癬性関節炎である、請求項8記載の方法。
- 生物学的状態が白血病、大腸癌、乳癌、皮膚癌、肺癌、または前立腺癌から選択される、請求項8記載の方法。
- 生物学的状態が多発性硬化症、狼瘡、真性糖尿病、宿主対移植片反応、または臓器移植の拒絶反応から選択される、請求項8記載の方法。
- 生物学的状態が関節リウマチ、喘息、または、セリアック病、潰瘍性大腸炎、およびクローン病から選択される炎症性腸疾患から選択される、請求項8記載の方法。
- 生物学的状態がしわ、十分な皮膚弾力の欠如、十分な皮膚水分の欠如、または不十分な皮脂分泌から選択される、請求項8記載の方法。
- 生物学的状態が代謝性骨疾患である、請求項8記載の方法。
- 化合物を被験体に経口的に、非経口的に、経鼻的に、直腸に、舌下に、経皮的に、または局所的に投与する、請求項8記載の方法。
- 化合物を腹腔内投与する、請求項8記載の方法。
- 化合物を0.01μg/日〜1mg/日の用量で投与する、請求項8記載の方法。
- 請求項18記載の化合物の有効量と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
- 有効量が組成物1グラムあたり約0.01μg〜約1mgの化合物を含む、請求項19記載の薬学的組成物。
- 有効量が組成物1グラムあたり約0.1μg〜約500μgの化合物を含む、請求項19記載の薬学的組成物。
- 化合物を動物に経口的に、非経口的に、経鼻的に、直腸に、舌下に、経皮的に、または局所的に投与する、請求項22記載の方法。
- 化合物を0.01μg/日〜1mg/日の用量で投与する、請求項22記載の方法。
- 動物がヒトである、請求項22記載の方法。
- 動物が家畜である、請求項22記載の方法。
- 動物が農業動物である、請求項22記載の方法。
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