MX2012003883A - Analogos de (20s,22e)-2-metileno-19-nor-22-ene-1a,25-dihidroxovita mina d3. - Google Patents

Abstract

Esta invención divulga análogos de (205,22E)-2-metileno-19-nor-22- ene-1ª,25-dihidroxivitamina D3, y específicamente (20S,22E)-2-metileno-19-nor-22-ene-1ª,25-dihidroxivitamina D3 y sus usos farmacéuticos. Este compuesto muestra actividad enlazante de receptor de vitamina D y actividad de transcripción significativas, así como una actividad pronunciada en la detención de la proliferación de células no diferenciadas y la inducción de su diferenciación en el monocito, evidenciado así su uso como agente anti-cáncer, especialmente para el tratamiento o prevención de leucemia, cáncer de colon, cáncer de pecho, cáncer de piel o cáncer de próstata.

Description

ANÁLOGOS DE (20S , 22E) -2-METILENO-19-NOR-22-ENE-lcc , 25- DIHIDROXIVITAMINA D3 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con compuestos de vitamina D, y más particularmente con análogos de (20S-22E) -2-metileno-19-nor-22-ene-la, 25-dihidroxivitamina D3 y sus usos farmacéuticos.

La hormona natural, la, 25-dihidroxivitamina D2 y su análogo en las series de ergosteriol, ej . , la, 25-dihidroxivitamina D2, se conocen por ser reguladores altamente potentes de la homeostasis de calcio en animales y humanos, y su actividad en la diferenciación celular también ha sido establecida, Ostrem et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 84, 2610 (1987). Muchos análogos estructurales de estos metabolitos han sido preparados y probados, incluyendo ?a-hidroxi vitamina D3, la-hidroxi vitamina D2, varias vitaminas de cadenas laterales homologadas y análogos fluorados. Algunos de estos compuestos muestran una interesante separación de actividades en la diferenciación celular y la regulación de calcio. Esta diferencia en actividad puede ser útil en el tratamiento de una variedad de enfermedades tales como osteodistrofia renal, raquitismos resistentes a la vitamina D, osteoporosis , psoriasis y ciertos tumores malignos.

Otra clase de análogos de vitamina D, los tan llamados compuestos de 19-nor-vitamina D, se caracteriza por el reemplazo de grupo de metileno exocíclico de anillo A (carbono 19) , típico del sistema de vitamina D, por dos átomos de hidrógeno. La prueba biológica de dichos análogos de 19-nor (ej., la, 25-dihidroxi-19-nor-vitamina D3) reveló un perfil selectivo de actividad con alta potencia en la inducción de diferenciación celular, y actividad de movilización de calcio muy baja. Por lo tanto, estos compuestos son potencialmente útiles cómo agentes terapéuticos para el tratamiento de tumores malignos, o el tratamiento de varios trastornos de la piel. Dos métodps diferentes de síntesis de dichos análogos de 19-nor-vitamina D han sido descritos (Perlman et al., Tetrahedron Lett. 31¿_ 1823 (1990); Perlman et al., Tetrahedron Lett. 32, 7663 (1991), y DeLuca et al., Patente Estadounidense No. 5,086, 191) .

En la Patente Estadounidense No. 4,666,634, análogos de 2p-hidroxi y alcoxi (ej . , ED-71) de la, 25-dihidroxivitamina D3 han sido descritos y examinados por el grupo Chugai como fármacos potenciales para la osteoporosis y agentes antitumorales . Véase también Okano et al., Biochem, Biophys. Res. Commun. 163 1444 (1989). Otros análogos de anillo-A 2-sustituidos (con hidroxialquilo, ej . , ED-120, y grupos fluoroalquilos ) de la, 25-dihidroxivitamina D3 también se han preparado y probado / iyamoto et al., Chem. Pharm. Bull. 4_1, 1111 (1993); Nishii et al., Osteoporosis Int. Suppl. 1, 190 (1993); Posner et al., J. Org. Chem. 59, 7855 (1994), y J. Org. Chem. ^0, 4617 (1995)), como que tienen análogos con un grupo ciclopropilo en la cadena lateral (e . , MC-903 conocida como calcipotrieno y descrita en Nishii et al, Patente Estadounidense 5,063,221).

Los análogos 2-sustituidos de la, 25-dihidroxi-19-nor-vitamina D3 también han sido sintetizados, ej . , los compuestos sustituidos en la posición 2 con grupos hidroxi o alcoxi (De Luca et al., Patente Estadounidense No. 5,536,713), con grupos 2-alquilo (DeLuca et al., Patente Estadounidense No. 5,945,410), y con grupos 2-alquilideno (DeLuca et al., Patente Estadounidense No. 5,843,928) que muestra perfiles de actividades interesantes y selectivos. Todos estos estudios indican que los sitios enlazantes en los receptores de vitamina D pueden acomodar diferentes sustituyentes en C-2 en los análogos sintetizados de vitamina D.

En un esfuerzo continuo para explorar la clase 19-nor de compuestos farmacológicamente importantes de la vitamina D, análogos que se caracterizan por la presencia de un sustituyente de metileno en el carbono 2 (C-2) , un grupo hidroxilo en el carbono 1 (C-l) , y una cadena lateral acortada fijada al carbono 20 (C-20) también han sido sintetizadas y probada. El la-hidroxi-2-metileno-19-nor-pregnacalciferol se describe en la patente Estadounidense 6,566,352, mientras que lo¡-hidroxi-2-metileno-19-nor-homopregnacalciferol se describe en la Patente Estadounidense 6,579, 831 y la-hidroxi-2-metileno-19-nor-bishomopregnacalciferol se describe en la patente Estadounidense 6,627,622. Todos estos tres compuestos tienen actividad enlazante relativamente alta con los receptores de la vitamina D y actividad de diferenciación celular relativamente alta, pero poca, si es que la hay, actividad calcémica en comparación con la la, 25-dihidroxivitamina D3. Sus actividades biológicas hacen de estos compuestos excelentes candidatos para una variedad de usos farmacéuticos, como se establece en las patentes ?352, '861 y 622.

Los compuestos de 17-ene vitamina D, asi como los compuestos de vitamina D que tienen un doble enlace en la cadena lateral de los mismos, también son conocidos, y se han propuesto para varios usos farmacológicos. Las enfermedades de los huesos tales como osteoporosis, trastornos de la piel tales como psoriasis, cánceres tales como leucemia y condiciones cosméticas tales como arrugas, son sólo algunas de las aplicaciones propuestas para dichos compuestos. Los compuestos 17-ene se describen en las patentes Estadounidenses 5,545,633; 5,929,056 y 6,399,797, mientras que los compuestos 2-alquilideno que tienen una cadena lateral con un doble enlace, se describen en, por ejemplo, la patente Estadounidense 5,843,928.

Los compuestos de 19-nor vitamina D sustituidos en la posición de carbono 2 del anillo A con un grupo alquilo tal como metilo, o un grupo alquilideno tal como metileno, y que tienen una cadena lateral que carece de uno o más de los sustituyentes estándares de vitamina D3, también se conocen, y han sido propuestos para varios usos farmacológicos. Por ejemplo, numerosos análogos de 2a-metilo-19, 26, 27-trinor, se describen en la Patente Estadounidense No. 7,241,749 y en la Patente Estadounidense No. 7,241,909, y numerosos análogos de 2-metileno-19, 26, 27-trinor se describen en la Patente Estadounidense No. 7,244,719. Además, el 2a-metilo-19-nor- (20S) -la-hidroxi-bishomopregnacalciferol se describe en la solicitud Estadounidense publicada No. 2007/0254857, y numerosos análogos de 2-metileno-19, 26-dinor vitamina D se describen en la solicitud Estadounidense publicada No. 2007/0191317 y en la solicitud Estadounidense publicada No. 2007/0191316.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida hacia análogos de (20S, 22e) -2-metileno-19-nor-22-ene-lo¡, 25- dihidroxivitamina D3, su actividad biológica, y varios usos farmacéuticos para estos compuestos. Estos nuevos compuestos de vitamina D no conocidos son los análogos de la 19-nor-vitamina D que tienen un grupo metileno en la posición 2 (C-2), un sustituyente de hidroxilo fijado a la posición 25 (C-25) en la cadena lateral, el grupo metilo normalmente localizado en la posición 21 (C-21) en la cadena lateral en la configuración epi o S, y un doble enlace localizado entre los átomos de carbono 22 y 23 (C-22 y C-23) en la cadena lateral. El análogo preferido de vitamina D es (20S-22E) -2-metileno-19-nor-22-ene-la, 25- dihidroxivitamina D3 (en adelante referido como "N-23") .

Estructuralmente, estos análogos de (20S-22E)-2- metileno-19nor-22-ene-la, 25-dihidroxivitamina D3 se caracterizan por la fórmula I general mostrada en seguida: en donde Xi, X2 y X3, que pueden ser iguales o diferentes, son cada una seleccionadas de hidrógeno o un grupo protector de hidroxi. El análogo preferido es (20S, 22E)-2-metileno-19-nor-22-ene-la, 25-dihidroxivitamina D3 que tiene la siguiente fórmula la: Los anteriores compuestos I, particularmente la, muestran un patrón deseado, y altamente ventajoso, de actividad biológica. Estos compuestos se caracterizan por enlace relativamente alto al receptor de vitamina D, gue es casi el mismo que el de la hormona nativa la, 25-dihidroxivitamina D3. Estos compuestos son más potentes (un registro) en la provocación de la diferenciación celular y en el incremento de la expresión genética de 24-OHase en comparación con l,25(OH)2D3. Estos compuestos también tienen menor capacidad de promover el transporte de calcio intestinal in vivo que l,25(OH)2D3, especialmente en las dosis más bajas recomendadas. Serian clasificados como si tuvieran menor actividad, y por lo tanto, menor potencia in vivo al estimular la actividad del transporte de calcio intestinal, en comparación con la de la la, 25-dihidroxivitamina D3. Estos compuestos I, y particularmente la, también tienen una capacidad significativa para movilizar el calcio óseo, y serian clasificados como que son ligeramente más efectivos en la actividad de movilización del calcio en el hueso en comparación con la la, 25-dihidroxivitamina D3.

Los anteriores compuestos I, y particularmente la, se caracterizan por actividad de diferenciación celular relativamente alta, y en promover la transcripción del gen 24-hidroxilasa . Por lo tanto, debido a que estos compuestos son más potentes que la hormona nativa en la provocación de diferenciación celular y transcripción, y son menos potentes en provocar el transporte de calcio intestinal, tienen potencial como agente anti-cáncer, especialmente para la prevención o tratamiento de la leucemia, cáncer de colon, cáncer de pecho, cáncer de piel y cáncer de próstata .

Uno o más de los compuestos pueden estar presentes en una composición para tratar las enfermedades arriba notadas en una cantidad desde alrededor de 0.01pg/gm a alrededor de 1000 µg/gm de la composición, preferentemente desde alrededor de O.^g/gm a alrededor de 500 \iq/qm de la composición, y pueden ser administrados tópicamente, transdérmicamente, oralmente, rectalmente, nasalmente, sublingualmente o parenteralmente en dosis de desde alrededor de 0.01 g/dia a alrededor de 1000 µg/dia, preferentemente, desde alrededor de 0.1ug/dia a alrededor de 500µg/dia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS En los dibujos: Las Figuras 1-5 ilustran varias actividades biológicas de (20S, 22E) -2-metileno-19-nor-22-ene-la, 25-dihidroxivitamina D3, en adelante referida como "N-23", en comparación con la hormona nativa la, 25-dihidroxivitamina D3, en adelante referida "1, 25 (OH) 2D3" .

La Figura 1 es una gráfica que ilustra la actividad relativa de N-23 y l,25(OH)2D3 para competir para el enlace con [3H]- l,25(OH)2D3 a toda la extensión del receptor recombinante de rata de vitamina D.

La Figura 2 es una gráfica que ilustra el porcentaje de diferenciación celular HL-60 como una función de la concentración de N-23 y l,25(OH)2D3.

La Figura 3 es una gráfica que ilustra la actividad de transcripción in vitro de l,25(OH)2D3 en comparación con N-23; La Figura 4 es una gráfica que ilustra la actividad de movilización de calcio óseo de l,25(OH)2D3 en comparación con N-23 en un grupo de animales; y La Figura 5 es una gráfica que ilustra la actividad de transporte de calcio intestinal de l,25(OH)2D3 en comparación con N-23 en un grupo de animales.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN (20S, 22E) -2-metileno-19-nor-22-ene-lo¡, 25-dihidroxivitamina D3 (referida aquí como "N-23"), un análogo de 19-nor-vitamina D que se caracteriza por la presencia de un sustituyente de metileno en el carbono 2 (C-2) , un sustituyente de idroxilo fijado a la posición 25 (C-25) en la cadena lateral, el grupo metilo normalmente localizado en la posición 21 (C-21) en la cadena lateral en su configuración epi o S, y un doble enlace localizado entre los átomos de carbono 22 y 23 (C-22 y C-23) en las cadenas laterales, se sintetizó y probó. Dicho análogo de vitamina D parecía un objetivo interesante debido al grupo metileno relativamente pequeño en la posición de C-2 no debería interferir con el enlace al receptor de vitamina D. estructuralmente, este análogo de 19-nor se caracteriza por la fórmula general la previamente ilustrada aquí, y su profármaco (en forma de hidroxi protegido) se caracteriza por la fórmula general I previamente ilustrada.

La preparación de los análogos de (20S,22E)-2-metileno-19-nor-22-ene-l , 25-dihidroxivitamina D3 que tienen la estructura I puede lograrse mediante un método general común, ej . , la condensación de una cetona bicíclica II de tipo Windaus-Grundmann con el óxido de fosfina alílica II al análogo de 2-metileno-19-nor-vitamina D IV correspondiente, seguido por la desprotección en C-l, C-3 y C-25 en el último compuesto (ver Esquemas 1 y 2) : En las estructuras II, III y IV, los grupos Xi, X2 y X3, son grupos hidroxi-protectores, preferentemente t-butildimetilisilio, entendiéndose también que cualesquiera funcionalidades que puedan ser sensibles, o que interfieren con la reacción por condensación, sean apropiadamente protegidas como se conoce bien en la materia. El proceso arriba mostrado representa una aplicación del concepto de síntesis convergente, que ha sido aplicado efectivamente para la preparación de compuestos de vitamina D [ej. Lythgoe et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans . I., 590 (1978); Lythgoe, Chem. Soc. Rev. 9, 499 (1983); Toh et al., J. Org. Chem. 48, 1414 (1983); Baggiolini et al., J. Org. Chem. 51, 3098 (1986); Sardina et al., J. Org. Chem. 51, 1264 (1986); J. Org. Chem. 51, 1269 (1986); DeLuca et al., Patente Estadounidense No. 5,086,191; DeLuca et al., Patente Estadounidense No. 5,536,713).

La hidrindanona de la estructura general II no se conoce. Puede ser preparada por el método mostrado en los Esquemas 1 y 2 (ver la preparación del compuesto N-23).

Para la preparación de los óxidos de fosfina requeridos de la estructura general III, una vía sintética se ha desarrollado, empezando por un derivado de quinicato metilo que es fácilmente obtenido del ácido (IR, 3R, S, 5R) -(-)-quinico como lo describió Perlman et al., Tetrahedron Lett. 32, 7663 (1991) y DeLuca et al., Patente Estadounidense No. 5,086,191.

El proceso global de la síntesis de los compuestos I y la se ilustra y se describe más completamente en la Patente Estadounidense No. 5,843,928 titulada "Compuestos de 2-alquilideno-19-nor-vitamina D", cuya descripción se incorpora aquí específicamente mediante referencia .

Como se usa en la descripción y en las reivindicaciones, el término "grupo protector de hidroxi" significa cualquier grupo comúnmente usado para la protección temporal de funciones hidroxi, tal como, por ejemplo, grupos de alcoxicarbonilo, acilo, alquilsililo o alquilarilsililo. Los grupos protectores de alcoxicarbonilo son agrupaciones de alquilo-0-CO tal como metoxicarboniló, etoxicarbonilo, propoxicarbonilo, isopropoxicarbonilo, butoxicarbonilo, isobutoxicarbonilo, tert-butoxicarbonilo, benciloxicarbonilo o aliloxicarbonilo . El término "acilo" significa un grupo alcanoilo de 1 a 6 carbonos, en todas sus formas isoméricas, o un grupo carboxialcanoilo de 1 a 6 carbonos, tal como un grupo oxalilo, malonilo, succinilo, glutarilo, o un grupo acilo aromático tal como benzoilo, o un grupo benzoilo sustituido con halo, nitro o alquilo. La palabra "alquilo" como se usa en la descripción o las reivindicaciones, denota un radical de alquilo de cadena recta o ramificada de 1 a 10 carbonos, en todas sus formas isoméricas. "Alcoxi" se refiere a cualquier radical de alquilo que está fijado mediante oxigeno, e . , un grupo representado por "alquilo-O". Los grupos protectores de alcoxialquilo son agrupaciones tales como metoximetilo, etoximetilo, metoxietoximetilo, o tetrahidrofuranilo y tetrahidropiranilo . Los grupos protectores de sililo preferidos son trimetilsililo, trietilsililo, t-butildimetilsililo, dibutilmetilsililo, difenilmetilsililo, fenildimetilsililo, difenilo-t-butilsililo y radicales de sililo análogos alquilatados . El término "arilo" especifica un grupo fenilo, o alquilo, o nitro o halo sustituido.

Un grupo "hidroxi protegido" es un grupo hidroxi derivado o protegido por cualquiera de los grupos anteriores, comúnmente usado para la protección temporal o permanente de las funciones de hidroxi, ej . , los grupos sililo, alcoxialquilo, acilo o alcoxicarbonilo, como se definieron previamente. Los términos "hidroxialquilo", "deuteroalquilo" y "fluoroalquilo", se refieren a un radical de alquilo sustituido por uno o más grupos hidroxi, deuterio o flúor, respectivamente, un "alquilideno" se refiere a un radical que tiene la fórmula general ^k r en donde k es un entero.

Más específicamente, deberá hacerse referencia al siguiente ejemplo ilustrativo y su descripción, así como a los Esquemas 1 y 2 para una ilustración detallada de la preparación del compuesto N-23.

En este ejemplo, los productos específicos identificados por numerales Arábigos (1, 2, 3) se refieren a las estructuras específicas así identificadas en los Esquemas 1 y 2.

EJEMPLOS Química. Los espectros de absorción de ultravioleta (UV) se registraron con un espectrómetro Hitachi Modelo 60-100 UV-vis en el solvente notado. Los espectros de resonancia magnética nuclear H1 (NMR por sus siglas en inglés) se registraron a 500 MHz con un espectrómetro Bruker AM-500 FT en deuterocloroformo . Los cambios químicos (d) se reportan campo abajo del Me4Si interno (d 0.00). Los espectros de masa se registraron a 70 eV en un instrumento de Kratos DS-50 TC equipado con un sistema de datos Kratos MS-55. Se introdujeron las muestras en la fuente iónica mantenida a 120-250°C vía una sonda directa de inserción. Se llevó a cabo cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC por sus siglas en inglés) en un cromatógrafo líquido de Waters Associates equipado con un sistema de administración de solventes Modelo 6000a, un inyector Modelo 6 UK Universal, un detector ajustable de absorbancia Modelo 486, y un refractómetro diferencial R 401.

Ejemplo 1 Preparación de (8S,20S) -des-A, B-20- (hidroximetilo) -pregnano-8-ol (1) Se pasó ozono a través de una solución de vitamina D2 (3 g, 7.6 mmol) en metanol (250 mi) y piridina (2.44 g, 2.5 mi, 31 mmol) durante 50 minutos a -78°C. La mezcla de reacción fue después vaciada con un oxígeno durante 15 minutos para remover el ozono residual y la solución fue tratada con NaBH4 (0.75 g, 20 mmol). Después de 20 minutos, la segunda porción de NaBH (0.75 g, 20 mmol) fue agregada, y se le permitió a la mezcla calentarse a temperatura ambiente. La tercera porción de NaBH4 /0.75 g, 20 mmol) fue entonces añadida y la mezcla de reacción fue agitada durante 18 h. La reacción fue mitigada con agua (40 mi) y la solución fue concentrada bajo presión reducida. El residuo fue extraído con etil acetato y las fases orgánicas combinadas fueron lavadas con 1M de HC1 acuoso, NaHC03 acuoso saturado, secada (Na2S04) y concentrada bajo presión reducida. El residuo fue cromatografiado con gel de sílice con hexano/etil acetato (75:25) para arrojar el diolo 1 (1.21 g, 75% rendimiento) como cristales blancos. m.p. 106- 108°C; [a]D +30.2° (c 1.46, CHC13) ; XH NMR (400 MHz, CDC13) d 4.08 ( 1H, d, J = 2.0 Hz, 8a-H) , 3.63 (1H, dd, J = 10.5, 3.1 Hz, 22-H) , 3.38 ( 1 H, dd, J = 10.5, 6.8 Hz, 22-H), 1.99 (1 H, br.d, J = 13.2 Hz), 1.03 (3H, d, J = 6.6 Hz, 2I-H3) , 0.956 (3H, s, I8-H3) ; 13C NMR (100 MHz) d 69.16 (d, C-8) , 67.74 (t, C-22), 52.90 (d) , 52.33 (d), 41.83 (s, C- 13), 40.19 (t) , 38.20 (d) , 33.53 (t), 26.62 (t), 22.54 (t) , 17.36 (t) , 16.59 (q, C-21), 13.54 (q, C-18); MS (El) m/z 212 (2, M+) , 194 (34, M+ -H20) , 179 (33, M+ - H20 - CH3) , 163 ( 18, M+ - CH2OH - H20), 135 (36), 125 (54), 111 (100), 95 (63), 81 (67); masa exacta calculada para Ci3H220 (M+ - H20) 194.1671 , se encontró 194.1665.

Preparación de (8S,20S) -des-A, B-8-benzoliloxi-20- (hidroximetilo) -pregnano (2) Se añadió cloruro de benzoilo (2.4 g, 2 mi, 17 mmol) a una solución del diolo 1 (1.2 g, 5.7 mmol) y D AP (30 mg, 0.2 mmol) en piridina anhídrida (20 mi) a 0°C. la mezcla de reacción fue agitada a 4°C durante 24 h, diluida con cloruro de metileno (100 mi) , lavada con 5% de HC1 acuoso, agua, NaHC03 acuoso saturado, secada (Na2S04) y concentrada bajo presión reducida. El residuo (3.39 g) fue tratado con una solución de KOH (lg, 15.5 mmol) en etanol anhídrido (30 mi) a temperatura ambiente. Después de la agitación de la mezcla de reacción durante 3 horas, se añadieron hielo y 5% de HC1 acuoso hasta pH=6. La solución fue extraída con acetato etílico (3 x 50 mi) y las fases orgánicas combinadas se lavaron con NaHC03 saturada, se secaron (Na2S04) y se concentraron bajo presión reducida. El residuo fue cromatografiado con gel de sílice con hexano/etil acetato (75:25) para arrojar el alcohol 2 (1.67 g, 93% rendimiento) como un aceite incoloro.

[ ]D +56-° (c 0.48, CHCI3); 1 H NMR (400 MHz, CDCI3 + TMS) d 8.08-8.02 (2H, m, o-HBZ) , 7.59-7.53 (1 H, m, p-HBz) , 7.50-7.40 (2H, m, ra-HBZ) , 5.42 (1H, d, J = 2.4 Hz, 8a-?) , 3.65 (1 H, dd, J = 10.5, 3.2 Hz, 22-H) , 3.39 ( 1H, dd, J =10.5, 6.8 Hz, 22-H), 1.08 (3H, d, J = 5.3 Hz, 2 I -H3) , 1.07 (3H, s, I 8-H3) ; 13C NMR (125 MHz) d 166.70 (s, CO) , 132.93 (d, p-CBZ) , 130.04 (s, Í-CBZ) , 129.75 (d, o-CBZ) , 128.57 (d, m-CBZ) , 72.27 (d, C-8), 67.95 (t, C-22), 52.96 (d) , 51.60 (d) , 42.15 (s, C- 13), 39.98 (t), 38.61 (d) , 30.73 (t) , 26.81 (t), 22.91 (t), 18.20 (t), 16.87 (q, C-21 ), 13.81 (q, C-18); MS (EI) m/z 316 (5, M+) , 301 (3, M+ - Me) , 299 (1 , + - OH), 298 (2, M+ - H20) , 285 ( 10, M+ - CH2OH) , 257 (6), 230 (9), 194 (80), 135 (84), 105 ( 100); masa exacta calculada para C20H28O3 316.2038, se encontró 316.2019.

Preparación de (8S,20S) -des-A, B-8-benzoiloxi-20-formilo-pregnano (3) Se añadió complejo de piridina de trióxido de azufre (1,94 g, 12.2 mmol) a una solución del alcohol 2 (640 mg, 2.03 mmol), trietilamina (1.4. mi, 1.02 g, 10.1 mmol) en cloruro anhídrido de metileno (10 mi) y DIVISO anhídrido (2 mi) a 0°C. La mezcla de reacción fue agitada bajo argón a 0°C durante 1 hora, y después concentrada. El residuo fue diluido con etil acetato, lavado con salmuera, secado (Na2S0 ) y concentrado. El residuo fue purificado mediante cromatografía de columna en gel de sílice con hexano/etil acetato (95:5) para arrojar el aldehido 3 (529 mg, 83% rendimiento) como un aceite.

[ ]D +63. 1 (c 5.85, CHCIs^'H NMR (400 MHz, CDCI3+TMS) d 9.60 (1 H, d, J = 3.1 Hz, CHO) , 8.05 (2H, m, o-HBz) , 7.57 ( 1 H, m, p-HBz), 7.45 (2H, m, m-HEz) , 5.44 (1 H, s, 8a-?) , 2.39 (1 H, m, 20-H) , 2.03 (2H, dm, J = 11.5 Hz) , 1.15 (3H, d, J = 6.9 Hz, 21-H3), 1.10 (3H, s, I8-H3) ; 13C NMR (100 MHz) d 204.78 (d, CHO) , 166.70 (s, C=0) , 132.78 (d, p-Bz), 130.69 (s, i-Bz), 129.50 (d, o-Bz) , 128.38, (d, m-Bz) , 71.66 (d, C-8), 51.30 (d) , 50.95 (d) , 49.20 (d) , 42.38 (s, C-13), 39.62 (t), 30.47 (t), 25.99 (t) , 22.92 (t), 17.92 (t), 13.90 (q), 13.35 (q) ; MS (EI) m/z 314 (1 , M+) , 299 (0.5, M+ - e), 286 (1 , M+ - CO) , 285 (5, M+ - CHO) , 257 (1 , M+ - C3H5O) , 209 ( 10, M+ -PhCO), 192 (38), 134 (60), 105 (100), 77 (50); masa exacta calculada para C20H26O3 314.1 882, se encontró 314.1887.

Preparación de (8S,20R) -des-A, B-8-benzoiloxi-20-(hidroximetilo) -pregnano (4).

El aldehido 3 (364 mg, 1.12 mmol) se disolvió en cloruro de metileno (15 mi) y una solución acuosa de 40% de BU4NOH (1.47 mi, 1.45 g, 2.24 mmol) se añadió. La mezcla resultante fue agitada bajo argón a temperatura ambiente durante 16 horas, diluida con cloruro de metileno (20 mi) , lavada con agua, secada (Na2S04) y concentrada bajo presión reducida. Un residuo fue cromatografiado en gel de sílice con hexano/etil acetato (95:5) para arrojar una mezcla del aldehido 3 y su epímero 20 (292 mg, 80% rendimiento) en ca . Proporción 1:2 (por 1H NMR).

Esta mezcla de aldehidos (292 mg, 0.9 mmol) fue disuelta en THF (5 mi) y se añadió NaBH4 (64 mg, 1.7 mmol), seguida por una adición gota a gota de etanol (5 mi) . La mezcla de reacción fue agitada a temperatura ambiente durante 30 minutos y se mitigó con una solución acuosa saturada de NH4C1. La mezcla fue extraída con éter (3 x 20 mi) y la fase orgánica combinada fue lavada con agua, secada (Na2S04) y concentrada bajo presión reducida. El residuo fue croraatografiado con gel de sílice con hexano/etil acetato (63:4 -> 80:20) para arrojar el (20R)-alcohol 4 deseado, puro (160 mg, 55% rendimiento) como un aceite y una mezcla de 4 y su epímero 20 (126 mg, 43% rendimiento) en ca. Proporción 1:3 (por 1H NMR) . [a]D +50.1 (c 1.09, CHC13) ; 1H NMR (400 MHz, CDC13 + TMS) d 8.05 (2H, m, o-HBZ) , 7.55 ( 1 H, m, p-HBZ) , 7.44 (2H, m, ÍH-HBZ), 5.41 ( 1 H, s, 8a-?) , 3.77 ( 1 H, dd, J = 10.4, 3.3 Hz, 22-H), 3.45 (1 H, dd, J = 10.4, 7.4 Hz, 22-H) , 1.067 (3H, s, I8-H3) , 0.973 (3H, d, J = 6.6 Hz, 21 -H3) ; 13C NMR (100 MHz) d 166.36 (s, C=0) , 132.61 (d, p-CBZ) , 130.63 (s, Í-CBZ) , 129.39 (d, o-CBZ) , 128.23 (d, jn-CBZ) , 71.97 (d, C-8), 66.42 (t, C-22), 52.65 (d) , 51.38 (d) , 41.58 (s, C-13), 39. 16 (t) , 37.45 (d) , 30.38 (t) , 26.29 (t), 22.35 (t), 17.89 (t) , 16.42 (q, C-21), 13.78 (q, C-18); MS (El) m/z 316 ( 16, M+) , 301 (5, M+ - Me), 299 (2, M+ - OH), 298 (3, M+ - H20) , 285 (9, M+ -CH20H) , 257 (5), 242 (1 1), 230 (8), 194 (60), 147 (71 ), 105 (100); masa exacta calculada para C20H28O3 316.2038, se encontró 316.2050.

Preparación de (8S,20R) -des-A, B-8-benzoiloxi-20-formilo-pregnano (5) Se añadió complejo de piridina de tiróxido de azufre (258 mg, 1.62 mmol) a una solución del alcohol 4 (111 mg, 0.35 mmol), trietilamina (188 µ??,· 136 mg, 1.35 mmol) en cloruro anhídrido de metileno (5 mi) y DMSO anhídrido (1 mi) a 0°C. La mezcla de reacción fue agitada bajo argón a 0°C durante 1 hora y después concentrada. El residuo fue diluido con etil acetato, lavado con salmuera, secado (Na2S04) y concentrado. El residuo fue purificado mediante cromatografía de columna en gel de sílice con hexano/etil acetato (95:5) para arrojar el aldehido 5 /93 mg, 85% rendimiento) como un aceite: [ ]D +28.8 (c 0.88, CHCI3) ; ?? N R (500 MHz, CDCI3) d 9.55 (1H, d, J = 5.0 Hz, CHO) , 8.02 (2H, m, o-HB2) , 7.54 (1 H, m, p-UBz) , 7.43 (2H, m, m-HBz) , 5.42 (1H, s, 8a-H) , 2.35 (1 H, m, 20-H) , 2.07 (1 H, m) , 1.87 (1H, m) , 1.05 (3H, s, I8-H3) , 1.04 (3H, d, J = 7.8 Hz, 21 -H3) ; 13C NMR (125 MHz) d 205.51 (d, CHO), 166.34 (s, C=0), 132.76 (d, p-CBz), 130.62 (s, i-CBz) , 129.47 (d, o-CBz) , 128.35, (d, m-CBz), 71.52 (d, C-8), 52.08 (d) , 51.08 (d) , 48.40 (d) , 41.55 (s, C-13), 38.54 (t), 30.41 (t) , 25.28 (t) , 22.08 (t) , 17.68 (t), 14.49 (q) , 13.38 (q) ; S (EI) m/z 314 (2, M+) , 285 (3, M+ - CHO) , 209 (8, M+ - PhCO) , 192 (30, M+ -PhCOOH), 177 ( 14), 134 (45), 105 (100), 77 (50); masa exacta calculada para C19H25O2 (M+ - CHO) 285.1855, se encontró 285.1849.

Preparación de (8S, 20S) -des-A,B-8-benzoiloxi-20-[4 ' -hidroxi-4' -metilo-pent- (1 ?) -en-ilo] -pregnano (7) Se añadió n-butilitio (1.61 M, 1.38 mi., 2.22 mmol) a una suspensión agitada de la sal de fosfonio 6 (476 mg, 1.11 mmol) en THF anhídrido (6 mi) a -20°C. La solución se volvió naranja. Después de 1 h, una solución pre-enfriada (-20°C) del aldehido 5 (93 mg, 0.30 mmol) en THF anhídrido (1 + 0.5 mi) se añadió, y la mezcla de reacción fue agitada a -20 °C durante 3 horas y a temperatura ambiente durante 18 horas. La reacción fue mitigada con agua y la mezcla fue extraída con etil acetato. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron (Na2SC>4) y evaporaron. El residuo fue cromatografiado en gel de sílice con hexano/etil acetato (95:5, después 90:10) para arrojar el producto 7 (52 mg, 45% rendimiento) . [cf]D -25.1 (c 2.5, CHC13) ; ?? N R (500 MHz, CDCI3) d 8.04 (2H, m, o-HBZ) , 7.55 (1 H, m, p-HBZ) , 7.44 (2H, m, m-HBZ), 5.42 (3H, m, 8a-?, 22-H, 23-H) , 1.22 (6H, s, 26,27-H6) , 1.04 (3H, s, I8-H3) , 0.94 (3H, d, J = 6.6 Hz, 21 -H3) ; 13C NMR (125 MHz) d 166.41 (s, C=0) , 141.34 (d, C-22), 132.64 (d. P-CBZ) , 130.83 (s, i-CBZ) . 129.50 (d, o-CBZ) , 128.29 (d, ÍB-CBZ)/ 122.86 (d, C-23) , 72.06 (d, C-8), 70.68 (s, C-25), 56.30 (d), 51.46 (d) , 46.92 (t), 41.91 (s, C-13), 40.23 (d) , 39.33 (t) , 30.57 (t) , 29.12 y 29.1 1 (cada q, C-26 y C-27), 26.83 (t) , 22.49 (t) , 21.57 (q, C-21), 17.78 (t), 13.80 (q, C-18); MS (El) m/z no M+, 366 (5, M+ -H20), 326 (38, M+ - C3H60), 284 (38, M+ - C6Hi20), 204 (54), 162 (88), 135 (93), 121 (53), 105 ( 100); masa exacta calculada para C2sH3603Na (MNa+) 407.2562, se encontró 407.2561.

Preparación de (8s , 20S) -des-A, B-8-benzoiloxi-20-[4 ' - (tert-butildimetilisililoxi) -4 ' -metilo-pent- (l'E) -en-ilo] -pregnano (8) Se añadió trifluorometanesulfonato de tert-butildimetilxililio (32 L, 37 mg, 0.14 mmol) a una solución del alcohol 7 (52 mg, 0.14 mmol) y 2,6-lutidina (33 µ?, 30 mg, 0.28 mmol) en cloruro de metileno anhídrido (3 mi) a -20°C. La mezcla fue agitada bajo argón a temperatura ambiente durante 3 horas. La reacción fue mitigada con agua y extraída con cloruro de metileno. Las fases orgánicas combinadas fueron lavadas con salmuera, secadas (Na2S04) y concentradas bajo presión reducida. El residuo fue cromatografiado con gel de sílice con hexano y hexano/etil acetato (97:3) para arrojar el producto 8 (65 mg, 93%). [a]D -21.2 (c 4.95, CHCI3) ; ?? NMR (500 MHz, CDC13 +TMS) d 8.05 (2H, m, o-HBZ) , 7.54 (1H, m, p-HBZ) , 7.43 (2H, m, ÍTI-HBZ), 5.41 (2H, m, 8a-H y 23-H) , 5.29 (1 H, dd, J = 15.4, 9.1 Hz, 22-H), 1.18 (6H, d, J = 4.5 Hz, 26, 27-H6), 1.04 (3H, s, I 8-H3), 0.93 (3H, d, J = 6.6 Hz, 21 -H3) , 0.87 (9H, s, Si-Z-Bu), 0.08 (6H, s, SiMe2) ; 13C NMR (125 MHz) d 166.43 (s, C=0) , 139.10 (d, C-22), 132.62 (d, p-CBZ) , 130.91 (s, Í-CBZ) , 129.53 (d, o-CBZ) , 128.30 (d, m-CBZ) , 124.39 (d, C-23), 73.72 (s, C-25) , 72.14 (d, C-8), 56.44 (d) , 51.52 (d), 48.29 (t) , 41.94 (s, C- 13), 40.30 (d) , 39.28 (t), 30.63 (t) , 29.76 y 29.65 (cada q, C-26 y C-27), 26.88 (t), 25.83 (q, SiCMe3. 22.56 (t), 21.53 (q, C-21), 18.04 (s, SiCMe3), 17.82 (t) , 13.68 (q, C- 18), -2.04 (q, SiMe2 : MS (El) m/z no M+, 483 (5, M+ - CH3) , 441 (8, -C4H9), 359 (2), 339 (5), 245 (6), 237 (9), 173 (100), 163 (36), 135 (38), 105 (54); masa exacta calculada para C3iH5o03SiNa (MNa+) 521.3427, se encontró 521.3450.

Preparación de (8S, 20S) -des-A, B-20- [4 ' - (tert-butildimetilsililoxi) -4 'metilo-pent- (l'E) -en-ilo] -pregnano-8-ol (9) Una solución de hidróxido de sodio en etanol (2.5M, 8ml) se añadió a una solución agitada de benzoato 8 (65 mg, 131 mol) en etanol anhídrido (20 mi) y la mezcla de reacción fue refluida durante 21 horas. La mezcla fue enfriada a temperatura ambiente, neutralizada con 5% de HC1 acuoso y extraída con diclorometano . Las fases orgánicas combinadas se lavaron con NaHC03 acuoso saturado, secadas ( a2S04) y evaporadas. El residuo fue cromatografiado en gel de sílice con hexano/etil acetato (97:3) para arrojar el alcohol 9 (49 mg, 95% rendimiento) . [a]D +1 1 (c 3.6, CHCI3) ; lti NMR (500 MHz, CDCI3) d 5.38 (1H, ddd, J = 15.4, 7.9, 7.0 Hz, 23-H) , 5.25 (1H, dd, J = 15.4, 9.1 Hz, 22-H) , 4.07 (1H, s, 8a-?) , 2.10 (3H, m) , 1.16 (6H, d, J = 3.0 Hz, 26, 27-Hs), 0.92 (3H, s, 18-H3) , 0.89 (3H, d, J = 6.7 Hz, 21-H3) , 0.86 (9H, s, Si-t-Bu) , 0.07 (6H, s, SiMe2); 13C NMR (125 MHz ) d 139.15 (d, C-22), 124.27 (d, C-23), 73.73 (s, C-25) , 69.35 (d, C-8), 56.69 (d) , 52.53 (d) , 48.28 (t) , 41.86 (s, C-13) , 40.06 (d) , 39.71 (t), 33.66 (t), 29.77 y 29.61 (cada q, C-26 y C-27), 26.93 (t), 25.82 (q, SiCMe3, ) , 22.39 (t), 21.51 (q, C-21) , 18.04 (s, SiCMe3), 17.22 (t) , 13.68 (q, C-18), -2.05 (q, SiMe2) : MS (El) m/z no M+, 393 (0.5, M+ - H) , 379 (5, M+ -CH3), 337 (3, M+ - C4H9), 279 (6, M+ - -BuSiMe2) , 255 (9), 237 (96), 193 (42), 173 (100), 157 (43), 135 (40), 115 (37); masa exacta calculada para C24H4602SiNa (MNa+) 417.3165, se encontró 417.316 Preparación de (20S) -des-A, B-20- [4' - (tert-butildimetilsiloxi) -4 ' -metilo-pent- (l'E) -en-ilo] -pregnano-8-uno (10) Los tamices moleculares A4 (0.6 g) se añadieron en una solución de óxido de 4-metilmorfolina (55 mg, 0.47 mmol) en diclorometano (0.6 mi). La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 15 minutos y se añadió perrutenato de tetrapropilamonio (8 mg, 23 µ????) , seguido por una solución del alcohol 9 (28 mg, 71 µ????) en diclorometano (300 + 250 µ?) . La suspensión resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reacción fue filtrada mediante un cartucho Sep-Pak de sílice Waters (5 g) que fue lavado con diclorometano. Después de la eliminación del solvente la cetona 10 (27 mg, 97% rendimiento) se obtuvo como un aceite incoloro. [a]D -39.3 (c 1.35, CHCI3) ; 1 NMR (400 MHz, CDCI3) d 5.42 (1H, ddd, J = 15.4, 8.2, 7.0 Hz, 23-H) , 5.28 (1H, dd, J = 15.4, 9.1 Hz, 22-H) , 2.42 (1H, dd, J = 1 1 .4, 7.6 Hz), 1.17 (6H, s, 26,27-H6), 0.94 (3H, d, J = 6.6 Hz, 21-H3) , 0.86 (9H, s, Si-t-B ), 0.61 (3H, s, I 8-?3) , 0.069 y 0.065 (cada 3H, cada s, cada Si e2) ; 13C N R (100 ??) d 212.10 (s, C=0), 138.69 (d, C-22), 124.97 (d, C-23), 73.65 (s, C-25), 61.91 (d) , 56.57 (d) , 50.03 (s, C- 13), 48.23 (t), 41.03 (t), 40.44 (d) , 38.28 (t) ,¦ 29.79 y 29.62 (cada q, C-26 y C-27), 27.21 (t) , 25.79 (q, SiCMe3) , 23.93 (t), 21.52 (q, C-21), 18.97 (t), 18.03 (s, SiCMe3) , 12.49 (q, C-18), -2.06 (q, Si e2/ ) ; MS (El) m/z no M+, 377 (6, M+ -CH3), 335 (26, M+ - /-Bu), 253 (59), 209 (24), 173 (100), 161 (25), 133 (22); masa exacta calculada para C24H4402SiNa ( Na+) 415.3008, se encontró 415.3018.

Preparación de (20S, 22E) -2-metileno-19-nor-22-ene-la, 25-dihidroxivitamina D3 (13) A una solución de óxido de fosfina 11 (67 mg, 115 µ????) en THF anhídrido (500 L) a -20°C se agregó lentamente PhLi (1.83 M en di-n-butiléter, 75 \i , 137 µ?t???) bajo argón con agitación. La solución se volvió naranja oscuro. Después de 30 minutos, la mezcla fue enfriada a -78°C y una solución pre-enfriada (-78°C) de cetona 10 (26 mg, 66 pmol) en THF anhídrido (300 + 300 µL) se añadió lentamente. La mezcla fue agitada bajo argón a -78 °C durante 3 horas y a 0°C durante 18 horas. Se añadió etil acetato, y la fase orgánica fue lavada con salmuera, secada (Na2S04) y evaporada. El residuo fue disuelto en hexano y aplicado en un cartucho Sep-Pak de sílice de Waters (2 gj . El cartucho fue lavado con hexano y hexano/etil acetato (99.5:0.5) para arrojar un derivado 12 de 19-norvitamina (39.54 mg, 79% rendimiento).

UV (en hexano)A max 262.5, 253.0, 245.0 nm; 1 H NMR (400 MHz, CDCI3) d 6.21 y 5.83 (cada 1 H, cada d, J = 1 1.1 Hz, 6- y 7-H), 5.38 ( 1 H, ddd, J = 15.4, 8.4, 6.8 Hz, 23-H), 5.29 (1 H, dd, J = 15.4, 8.7 Hz, 22-H) , 4.97 y 4.92 (cada 1 H, cada s, =CH2), 4.42 (2H, m, 1 ß- y 3a-?) , 2.81 (1 H, dm, J = 13.1 Hz, 9ß-?) , 2.52 (1 H, dd, J = 13.2, 5.8 Hz, 10a-H), 2.46 (1 H, dd, J = 12.7, 4.3 Hz, 4a -H) , 2.33 (1 H, dd, J = 13.2, 2.4 Hz, 10ß-?) , 2.17 (1 H, dd, J = 12.7, 8.4 Hz, 4ß-?) , 1.16 (6H, s, 26,27-H6), 0.93 (3H, d, J = 6.4 Hz, 21 -H3), 0.895 (9H, s, Si-t-Bu) , 0.865 (9H, s, Si-t-Bu), 0.855 (9H, s, Si-t-Bu), 0.518 (3H, s, 18-H3) , 0.077 (3H, s, SiMe), 0.066 (9H, s, 3 x SiMe) , 0.047 (3H, s, SiMe), 0.025 (3H, s, SiMe); 13C NMR (100 MHz) d 152.99 (s, C-2), 141.32 (s, C-8), 139.40 (d, C-22), 132.63 (s, C-5), 124.25 (d, C-23), 122.42 (d, C-6) , 1 16.00 (d, C-7), 106.24 (t, =CH2), 73.78 (s, C-25), 72.53 y 71.63 (cada d, C- 1 y C-3), 56.67 (d), 56.20 (d) , 48.29 (t) , 47.61 (t) , 45.76 (s, C-l 3), 40.91 (d), 39.86 (t), 38.55 (t) , 29.83 y 29.62 (cada q, C-26 y C-27), 28.77 (t) , 27.41 (t) , 25.84 (q, 2, x SiCMe3) , 25.78 (q, SiCMe3, 23.23 (t), 22.1 1 (t), 21.57 (q, C-21), 18.25 (s, SiCMe3), 18.16 (s, SiCMe3) , 18.07 (s, SiC e3), 12.1 1 (q, C- 1 8), -2.04 (q, 2 x Si e) , -4.86 (q, 2 x SiMe) , -4.90 (q, SiMe) , -5.10 (q, SiMe) ; masa exacta calculada para C45H8403Si3Na (MNa+) 779.5626, se encontró 779.5651.

La vitamina 12 protegida (39.44 mg, 52 µp???) se disolvió en THF (5 mi) y acetonitrilo (3 mi) . Una solución de 48% de HF en acetonitrilo (proporción 1:9, 5 mi) se añadió a 0°C y la mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 11 horas. Una solución acuosa saturada de NaHC03 se añadió, y la mezcla de reacción fue extraída con etil acetato. Las fases orgánicas combinadas fueron lavadas con salmuera, secadas (Na2S04) y concentradas bajo presión reducida. El residuo fue diluido con 2 mi de hexano/etil acetato (8:2) y aplicado a un cartucho Sep Pak de sílice de Waters (2 g) . una elusión con hexano/etil acetato (75:25) arrojó el producto crudo 13 (18 mg) . La vitamina 13 fue aún más purificada mediante HPLC de fase recta [columna de 9.4 x 250 mm de Zorbax Sil, 5 ml/min, sistema de solvente 2-propanol/hexano (15:85), Rt=6.43 min] y después por HPLC de fase inversa [columna de 9.4 x 250 mm de Zorbax RX-C18, 3 ml/min, sistema de solvente metanol/agua (85:15), Rt=10.19 min] para arrojar un aceite incoloro (12.745 mg, 59% rendimiento).

UV (en EtOH) Amax 261.0, 252.0, 244.5 nm; XH NMR (400 MHz, CDC13) d 6.35 y 5.88 (1 H y 1 H, cada d, J = 1 1.2 Hz, 6- y 7-H), 5.44 (2H, m, 22-H y 23-H) , 5.1 1 y 5.09 (cada 1 H, cada s, =CH2), 4.48 (2H, m, 1 ß- y 3 -?) , 2.84 ( 1 ?, dd, J = 13.3, 4.4 Hz, 10ß-?) , 2.80 (1 ?, br d, J = 14.2 Hz, 9ß-?) , 2.56 (1H, dd, J = 13.4, 3.6 Hz, 4a -H) , 2.32 ( 1H, dd, J = 13.4, 6.0 Hz, 4ß-?) , 2.28 (1H, dd, J = 13.3, 8.4 Hz, lOa-H), 1.20 (6H, d, J = 1.2 Hz, 26,27-H6), 0.95 (3H, d, J = 6.6 Hz, 21- H3) , 0.528 (3H, s, I8-H3) ; 13C NMR ( 100 MHz) d 151.96 (s, C-2), 143.27 (s, C-8), 141 .71 (d, C-22), 130.45 (s, C-5) , 124.14 (d, C-6) , 122.64 (d, C 23), 1 15.26 (d, C-7), 107.69 (t, =CH2) , 71.76 (d, C- 1), 70.75 (s, C-25), 70.60 (d, C-3) , 56.54 (d) , 56.13 (d) , 46.90 (t), 45.80 (s, C- 13), 45.74 (t) , 40.72 (d) , 39.80 (t), 38.1 1 (t), 29.1 1 y 29.05 (cada q, C-26 y C-27), 28.91 (t), 27.26 (t), 23.24 (t), 22.09 (t), 21.61 (q, C-21), 12.28 (q, C-18); MS (El) m/z 414 (37, M+) , 396 (4, M+ -H20), 381 (1 , M+ - H20 - CH3), 378 (1, M+ - 2H20) , 356 (2), 31 1 (4), 287 (12), 269 (21), 251 (26), 194 (42), 147 (41), 135 (100); masa exacta calculada para C27H42O3 (M+) 414.3134, se encontró 414.3142.

Esquema 1 Esquema 2 25 ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE ANÁLOGOS DE (20S , 22E) -2- ETILENQ-19- NOR-22-???-?a, 25-DIHIDROXIVITAMINA D3 La introducción de un grupo metileno a la posición 2, asi como un sustituyente de hidroxilo fijado a la posición 25 (C-25) en la cadena lateral, y teniendo el grupo metilo normalmente localizado en la posición 21 (C-21) en la cadena lateral en su configuración epi o S, y la introducción de un doble enlace localizado entre los átomos de carbono 22 y 23 (C-22 y C-23) en la cadena lateral, tuvo muy poco efecto en el enlace de N-23 a toda la longitud del receptor recombinante de rata de vitamina D, en comparación con la la, 25-dihidroxivitamina D3. El enlace del compuesto N-23 con la misma afinidad al receptor nuclear de vitamina D en comparación con el l,25-(OH)2D3 estándar (Figura 1). Puede esperarse de estos resultados que el compuesto N-23 tendría actividad biológica equivalente. Sorprendentemente, sin embargo, el compuesto N-23 es un análogo altamente selectivo con actividad biológica única.

La Figura 5 muestra que el N-23 tiene relativamente baja habilidad para incrementar la actividad del transporte de calcio intestinal in vivo a dosis bajas. Claramente, tiene potencial más bajo in vivo en comparación con la de la, 25-dihidroxivitamina D3 ( 1, 25- (OH) 2D3) , la hormona natural, para la estimulación del transporte de calcio intestinal del hueso, en comparación con (1,25-(OH)2D3) .

La Figura 4 demuestra que N-3 tiene actividad significativa de movilización del calcio óseo, en comparación con 1, 25- (OH) 2D3. N-23 demostró ligeramente más actividad de movilización del calcio óseo, en comparación con 1, 25- (OH) 2D3, (6.8 mg/dL de N-23 contra 6.1 mg/dL de l,25-(OH)2D3 a una dosis de 260 pmol) . Por lo tanto, N-23 es claramente un poco más efectiva en la movilización del calcio óseo en comparación con 1 , 25- (OH) 2D3.

Las Figuras 4 y 5, por lo tanto, ilustran que el N-23 puede caracterizarse como que es menos potente que el l,25-(OH)2D3 para promover la actividad de transporte del calcio intestinal, pero ligeramente más potente que el l,25-(OH)2D3 para promover la actividad de movilización de calcio óseo.

La Figura 2 ilustra que el N-23 es alrededor de 10 veces más potente que el l,25-(OH)2D3 en diferenciación celular HL-60, ej . , provocando la diferenciación de células HL-60 en monocitos. Por lo tanto, el N-23 puede ser un excelente candidato para el tratamiento de un cáncer, especialmente contra la leucemia, cáncer de colon, cáncer de pecho, cáncer de piel y cáncer de próstata.

La Figura 3 ilustra que en las células óseas, el compuesto N-23 es alrededor de 10 veces más potente que el l,25-(OH)2D3 en el incremento de la transcripción del gen 24-hidroxilasa . Este resultado, junto con la actividad de diferenciación celular de la Figura 2, sugiere que el N-23 será muy efectivo en el tratamiento de los cánceres arriba referidos, ya que tiene actividad celular directa en la provocación de diferenciación celular, transcripción genética y en suprimir el crecimiento celular.

MÉTODOS EXPERIMENTALES Enlace de Receptor de Vitamina D Material de Prueba Fuente de Proteínas El receptor recombinante de total longitud de rata fue expresado en células de E. coli BL21(DE23) Codon Plus RIL y purificado hasta homogeneidad usando dos diferentes sistemas de cromatografía de columna. El primer sistema era una resina de afinidad de níquel que usa el marbete de histidina de terminal C en esta proteína. La proteína que fue eludida de esta resina fue aún más purificada usando cromatografía de intercambio de iones (Flujo Rápido de S-Sefarosa) . Las alícuotas de la proteína purificada fueron rápidamente congeladas en nitrógeno líquido y almacenadas a 80°C hasta su uso. Para su uso en ensayos de enlace, la proteína fue diluida en TEDK50 (50 mm Tris, 1.5 mm EDTA, pH 7.4, 5 mm DTT, 150 mm KC1) con 0.1% de detergente Chaps. La proteína receptora y la concentración de ligandos fueron optimizados de tal forma que no más de un 20% del ligando radiomarbetado añadido fuera enlazado al receptor.

Fármacos de Estudio Los ligandos no marbetados fueron disueltos en etanol y las concentraciones determinadas usando espectrofotometría de UV (1, 25- (OH) 2D3; coeficiente de extinción molar = 18, 200 y Amax=265 nm; Análogos: coeficiente de extinción molar 42000 y Xmax = 252 nm) . El ligando radiomarbetado (3H-1, 25- (OH) 2D3 - 159 Ci/mmol) se añadió en etanol a una concentración final de 1 nM.

Condiciones de Ensayo Los ligandos radiomarbetados y no marbetados se añadieron a 100 mcl de la proteina diluida a una concentración final de etanol de =10%, mezcladas e incubadas durante la noche en hielo para lograr un equilibrio de enlace. El siguiente día, 100 mcl de tinte de hidroxilapáptita (50%) fueron añadidos a cada tubo y mezclados en intervalos de 10 minutos durante 30 minutos. La hidroxilapáptita fue recolectada por centrifugación y después lavada tres veces con tampón de Tris-EDTA (50 mM Tris, 1.5 mM EDTA, pH 7.4), conteniendo 0.5% de Titrón X-100. Después de la última lavada, los comprimidos fueron transferidos a ampolletas de centelleo que contenían 4 mi de cóctel de centelleo Biosafe II, mezclados y colocados en un contador de comprimidos. El enlace total se determinó de los tubos que contiene sólo ligandos radiomarbetados.

Diferenciación HL-60 Material de Prueba Fármacos de Estudio Los fármacos de estudio fueron disueltos en etanol, y las concentraciones determinadas usando espectrofotometría UV. Las diluciones seriales se prepararon para que un rango de concentraciones de fármacos pudiera ser probado sin cambiar la concentración final de etanol (=0.2%) presente en los cultivos celulares.

Células Células humanas de leucemia promielocítica (HL60) se cultivaron en medio RPMI-1640 conteniendo 10% de suero fetal bovino. Las células fueron incubadas a 37°C en la presencia de 5% de C02.

Condiciones de Ensayo Las células HL60 fueron emplacadas a 1.2 x 105 células/ml. Dieciocho horas después del emplacado, las células duplicadas fueron tratadas con fármaco. Cuatro días después, las células fueron cosechadas y se llevó a cabo un ensayo de reducción de tetrazolio nitro azul (Collins et al., 1979; J. Exp. MEd. 149:969-974). El porcentaje de células diferenciadas fue determinado contando un total de 200 células y registrando el número que contenia depósitos de formazán negro-azul intracelulares . La verificación de la diferenciación a las células monociticas se determinó midiendo la actividad fagocitica (datos no mostrados) .

Ensayo de Transcripción In vitro La actividad de transcripción se midió en células ROS 17/2.8 (hueso) que fueron establemente transíectadas con un promotor genético de 24-hidroxilasa (24 OHase) corriente arriba de un gen reportador de luciferasa (Arbour et al., 1998). A las células se les dio un rango de dosis. Dieciséis horas después de la dosificación, las células fueron cosechadas y las actividades de luciferasa se midieron usando un luminómetro.

RLU = unidades relativas de luciferasa Movilización de Transporte de Calcio Intestinal y Calcio óseo Ratas macho, en destete, de Sprague-Dawley, fueron puestas en dieta Dieta 11 (0.47% Ca) + aceite AEK durante' una semana, seguidas por la Dieta 11 (0.02 % Ca) + aceite AEK durante tres semanas. Las ratas fueron entonces cambiadas a una dieta que contiene 0.02 % de Ca. La administración de la dosis inició durante la última semana en una dieta de 0.02 % de calcio. A cuatro dosis consecutivas de ip se les alejó durante aproximadamente 24 horas. Veinticuatro horas después de la última dosis, se recolectó sangre de cuello cortado y la concentración de calcio de suero fue determinada como una medida de movilización de calcio de hueso. Los primeros 10 cm del intestino fueron también recolectados para análisis de transporte de calcio intestinal usando el método de bolsa intestinal invertida.

INTERPRETACIÓN DE DATOS Resumen de Descubrimientos Biológicos Este compuesto N-23 enlaza el VDR con la misma afinidad que la hormona nativa, y se puede considerar como igualmente potente que el l,25(OH)2D3 en esta actividad. N-23 también despliega aproximadamente 10 veces más actividad de diferenciación celular y alrededor de 10 veces más actividad de transcripción genética in vitro en comparación con l,25(OH)2D3. Mientras que este compuesto es más potente en comparación con l,25(OH)2D3 in vitro, muestra ligeramente más actividad in vivo en la movilización de calcio de hueso en comparación con la hormona nativa, y ligeramente menor actividad in vivo en la promoción de transporte de calcio intestinal en comparación con la hormona nativa. El N-23 es un compuesto potencialmente valioso para el desarrollo terapéutico ya que tiene mayor potencia en la movilización del calcio de almacenamiento de huesos y menor potencia en la estimulación de transporte de calcio activo en el intestino, pero mayor potencia en la diferenciación celular potencialmente resultando en un compuesto con una mayor ventana de seguridad del que se había generado previamente. Debido a que este compuesto muestra diferenciación celular y actividad transcripcional relativamente significativas, pero relativamente baja actividad calcémica en el hueso, puede ser útil para el tratamiento de los pacientes con varios tipos de cánceres, especialmente para el tratamiento de la leucemia, cáncer de colon, cáncer de pecho, cáncer de piel y cáncer de próstata. La N-23 puede no ser útil únicamente para el tratamiento de los cánceres listados anteriormente, sino también en la prevención de los cánceres arriba listados.

Enlace de VDR, diferenciación celular de HL60, y actividad de transcripción.

La N-23 (Ki=6xlO_11M) tiene alrededor de la misma actividad que la hormona natural la, 25-dihidroxivitamina D3 (??=4?10"??) en su capacidad para competir con [3H]-l,25(OH)2D3 para enlazar el receptor recombinante de longitud total de rata de vitamina D (Figura 1) . La N-23 despliega alrededor de 10 veces más actividad (EC5o=lxlO"10M) en su habilidad (eficacia o potencia) para promover la diferenciación celular de HL60 en comparación con la, 25-dihidroxivitamina D3 (EC5o=2xlO~9M) (Ver Figura 2) . También, el compuesto N-23 (EC5o=2xlO_1lM) tiene alrededor de 10 veces más actividad transcripcional en las células óseas que la la, 25-dihidroxivitamina D3 (EC5o=2xlO~10 ) (Ver Figura 3) . Estos resultados sugieren que la N-23 tendrá actividad significativa como un agente anti-cáncer y será muy efectiva debido a que tiene actividad celular directa al provocar diferenciación celular, transcripción genética, y al suprimir el crecimiento celular.

Movilización de calcio de huesos y absorción de calcio intestinal en los animales con deficiencia de vitamina D Usando ratas con deficiencia de vitamina D en una dieta baja en calcio (0.02%), se probaron las actividades de la N-23 y l,25(OH)2D3 en el intestino y los huesos. Como se esperaba, la hormona nativa ( 1, 25 (OH) 2D3) incrementó los niveles de suero de calcio en todas las dosis (Figura 4). El estudio reportado en la Figura 4 muestra que la N-23 tiene actividad significativa en la movilización del calcio de los huesos. La administración de 260 pmol/dia de N-23 durante 4 días consecutivos, provocó la movilización de calcio óseo (6.8 mg/dL) y la hormona nativa l,25(OH)2D3 tuvo actividad significativa a 260 pmol/dia en donde un efecto sustancial fue visto (6.1 mg/dL).

El transporte del calcio intestinal fue evaluado en el mismo grupo de animales usando el método de bolsa intestinal invertida (Figura 5) . El estudio reportado en la Figura 5 muestra que la N-23 tiene menor actividad de transporte de calcio intestinal que l,25(OH)2D3 . La administración de 32 pmol/dia de N-23 durante 4 días consecutivos resultó en menor actividad en comparación con l,25(OH)2D3 a la misma dosis de 32 pmol/dia.

Estos resultados muestran que el compuesto N-23 promueve el transporte de calcio intestinal en una manera dependiente de la dosis. Por lo tanto, puede concluirse que la N-23 tiene menor actividad de transporte de calcio intestinal que la de l,25(OH)2D3 en dosis menores recomendadas .

Estos resultados ilustran, además, que la N-23 es un excelente candidato para numerosas terapias humanas como se describe aquí. La N-23 es un excelente candidato para el tratamiento de un cáncer debido a que: (1) tiene enlace de VDR, actividad de transcripción y actividad de diferenciación celular significativas: (2) tiene menor riesgo de responsabilidad hipercalcémica, a diferencia de 1 , 25 (OH) 2D3; y (3) se sintetiza fácilmente.

Para fines de prevención y/o tratamiento, los compuestos de esta invención definidos por la fórmula I, particularmente la N-23, pueden ser formulados para aplicaciones farmacéuticas como una solución en solventes innocuos, o como una emulsión, suspensión o dispersión n solventes o transportadores apropiados, o como pildoras, tabletas o cápsulas, junto con transportadores sólidos, de acuerdo con métodos convencionales conocidos en la materia. Cualquiera de dichas formulaciones puede también contener otros excipientes farmacéuticamente aceptables y no tóxicos tales como estabilizadores, anti-oxidantes, enlazantes, agentes colorantes o emulsificantes o agentes modificadores de sabor.

Los compuestos de la fórmula I y particularmente la N-23, pueden ser administrados oralmente, tópicamente, parenteralmente, rectalmente, nasalmente, sublingualmente o transdérmicamente . El compuesto es ventajosamente administrado por inyección o por infusión intravenosa o soluciones estériles apropiadas, o en la forma de dosis líquidas o sólidas vía el canal alimenticio, o en la forma de cremas, ungüentos, parches, o vehículos similares, apropiados para aplicaciones transdérmicas . Una dosis de ?.??µ? a alrededor de 500 g por día, es apropiada para fines de tratamiento y/o prevención, dicha dosis siendo ajustada de acuerdo con la enfermedad a ser tratada, su severidad, y la respuesta del sujeto como está bien entendido en la materia. Debido a que el compuesto muestra especificidad de acción, cada uno puede ser administrado solo, o junto con dosis graduadas de otro compuesto activo de la vitamina D — ej . , la-hidroxivitamina D2 o D3, ! o la, 25-dihidroxivitamina D3 — en situaciones en donde distintos grados de movilización de mineral óseo y estimulación de transporte de calcio resulte ventajoso.

Las composiciones para su uso en los tratamientos arriba mencionados, comprenden una cantidad efectiva de los compuestos I, particularmente de N-23, como se define por las anteriores fórmulas I y la como el ingrediente activo, y un transportador apropiado. Una cantidad efectiva de dicho compuesto para su uso de acuerdo con esta invención, es de alrededor de 0.01 µg a alrededor de 1000 µg por gramo de composición, preferentemente de alrededor de 0.1 µg a alrededor de 500 ug por gramo de composición, y puede ser administrada tópicamente, transdérmicamente, oralmente, rectalmente, nasalmente, sublingualmente, o parenteralmente en dosis de desde alrededor de 0.01 µ?/ ?3 a alrededor de 1000 µ?/día, y preferentemente desde alrededor de 0.1 µ? ?3 a alrededor de 500 µ?^?3.

Los compuestos I, particularmente N-23, pueden ser formulados como cremas, lociones, ungüentos, parches tópicos, pildoras, cápsulas o tabletas, supositorios, aerosoles o en formas liquidas como soluciones, emulsiones, dispersiones o suspensiones en solventes o aceites farmacéuticamente innocuas y aceptables, y dichas preparaciones pueden contener, además, otros componentes farmacéuticamente innocuos o benéficos, tales como estabilizadores, antioxidantes, emulsificantes, agentes colorantes, enlazantes o agentes modificadores del sabor.

Los compuestos I, particularmente N-23, pueden ser ventajosamente administrados en cantidades suficientes para efectuar la diferenciación de promielocitos a macrófagos normales. Las dosis como se describen arriba son apropiadas, entendiéndose que las cantidades dadas deben ser ajustadas de conformidad con la severidad de la enfermedad, y la condición y respuesta del sujeto como se entiende bien en la materia.

La formulación de la presente invención comprende un ingrediente activo en asociación con un transportador farmacéuticamente aceptable del mismo, y opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos. El transportador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con otros ingredientes de las formulaciones, y no perjudiciales a su recipiente .

Las formulaciones de la presente invención apropiadas para su administración oral, pueden ser en la forma de unidades discretas tales como cápsulas, sobrecitos, tabletas o pastillas, cada una conteniendo una cantidad predeterminada del ingrediente activo; en la forma de un polvo o gránulos; en la forma de una solución o una suspensión en un liquido acuoso o liquido no acuoso; o en la forma de una emulsión aceite-en-agua o una emulsión agua-en-aceite .

Las formulaciones para administración rectal pueden ser en la forma de un supositorio incorporando él ingrediente activo y el transportador tal como manteca de cacao, o en la forma de un enema.

Las formulaciones apropiadas para administración parenteral, comprenden convenientemente una preparación aceitosa o acuosa estéril del ingrediente activo que es preferentemente isotónica con la sangre del recipiente.

Las formulaciones apropiadas para la administración tópica incluyen preparaciones liquidas o semi-liquidas tales como linimentos, lociones, aplicaciones, emulsiones aceite-en-agua o agua-en-aceite tales como cremas, ungüentos o pastas; o soluciones o suspensiones tales como gotas; o como aerosoles.

Para la administración nasal, inhalación de polvo, atomizaciones o formulaciones de aerosol, dispensados con una lata de aerosol, un nebulizador o un atomizador pueden ser usados. Las formulaciones, cuando son dispensadas, preferentemente tienen un tamaño de partículas en el rango de 10 a 100µ.

Las formulaciones pueden ser presentadas convenientemente en forma de unidad de dosis y se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos conocidos en la materia de la farmacia. Por el término "unidad de dosis" se entiende una dosis unitaria, e . , dosis única, que es capaz de ser administrada a un paciente como una unidad de dosis física y químicamente estable, que comprende ya sea el ingrediente activo como tal o una mezcla del mismo, con diluyentes o transportadores farmacéuticos sólidos o líquidos .

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES compuesto que tiene la fórmu en donde Xi, X2 y X3, que pueden ser iguales o diferentes, son cada una seleccionadas de hidrógeno o un grupo protector de hidroxi. 2. El compuesto de la reivindicación 1, caracterizado porque X3 es hidrógeno. 3. El compuesto de la reivindicación 1, caracterizado porque i es hidrógeno. 4. El compuesto de la reivindicación 1, caracterizado porque Xi, X2 y X3 son todas t-butildimetilsililo . 5. Una composición farmacéutica que contiene una cantidad efectiva de al menos un compuesto según la reivindicación 1, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable . 6. La composición farmacéutica de la reivindicación 5, caracterizada porque dicha cantidad efectiva comprende desde alrededor de 0.01 pg a alrededor de 1000 ]iq por gramo de composición. 7. La composición farmacéutica de la reivindicación 5, caracterizada porque dicha cantidad efectiva comprende desde alrededor de 0.1 µg a alrededor de 500 pg por gramo de composición. 9. Una composición farmacéutica que contiene una cantidad efectiva de (20S, 22E) -2-metileno-19 nor-22-ene-lot, 25-dihidroxivitamina D3, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable. 10. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, caracterizada porque dicha cantidad efectiva comprende desde alrededor de 0.01 \ig a alrededor de 1000 ]iq por gramo de composición. 11. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, caracterizada porque dicha cantidad efectiva comprende desde alrededor de 0.1 \ig a alrededor de 500 µ? por gramo de composición. 12. Un método para el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de leucemia, cáncer de colon, cáncer de pecho, cáncer de piel o cáncer de próstata, comprendiendo la administración a un sujeto con dicha enfermedad de una cantidad efectiva de un compuesto que tiene la fórmula: en donde Xi, X2 y X3, que pueden ser iguales o diferentes, son cada una seleccionadas de hidrógeno o un grupo protector de hidroxi. 13. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el compuesto es administrado oralmente . 14. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el compuesto es administrado parenteralmente . 15. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el compuesto es administrado transdérmicamente . 16. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el compuesto es administrado rectalmente . 17. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el compuesto es administrado nasalmente . 18. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el compuesto es administrado sublingualmente. 19. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el compuesto es administrado en una forma de dosis de alrededor de 0.01 pg/dia a alrededor de 1000 µ?/??ß. 20. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el compuesto es (20S, 22E) -2-metileno-19-nor-22-ene-la, 25-dihidroxivitamina D3, teniendo la fórmula : compuesto que tiene la formule en donde X3 se selecciona de hidrógeno o un grupo protector de hidroxi. 22. El compuesto de la reivindicación caracterizado porque X3 es hidrógeno. 23. El compuesto de la reivindicación caracterizado porque X3 es t-butildimetilsililo .