MX2007009726A

MX2007009726A - 2-metilen-19-nor-(20s-24s)-1a, 25-dihidroxivitamina-d2.

Info

Publication number: MX2007009726A
Application number: MX2007009726A
Authority: MX
Inventors: Margaret Clagett-Dame; Lori A Plum; Hector F Deluca
Original assignee: Wisconsin Alumni Res Found
Priority date: 2005-02-11
Filing date: 2006-02-10
Publication date: 2007-09-26
Also published as: CA2597624C; WO2006086613A2; EP1853274B1; JP5036566B2; ES2404061T3; US7563783B2; JP2008530110A; EP1853274A2; EP1853274A4; US20060183716A1; AU2006213727A1; WO2006086613A3; AU2006213727B2; CA2597624A1

Abstract

La presente invencion se refiere a compuestos de formula I, en donde X1, X2 y X3, son seleccionados independientemente de II o grupos hidroxi protectores. Tales compuestos pueden ser usados en la preparacion de composiciones farmaceuticas y son empleados en el tratamiento de una variedad de condiciones biologicas.

Description

2-METILEN-19-NOR- (20S-24S) -la,25-DIHIDROXIVITAMINA-D2 CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a compuestos de vitamina D y más particularmente a 2-metilen-19-nor- (20S-24S) -la, 25-dihidroxivitamina D2 y a formulaciones farmacéuticas que incluyen este compuesto. La invención también se refiere al uso de 2-metilen-19-nor- (20S-24S) -la, 25-hidroxivitamina D2 o sales del mismo, en la preparación de medicamentos para uso en el tratamiento de varias enfermedades.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La hormona natural la, 25-dihidroxivitamina D2 (también referida como la, 25-dihidroxicolecalciferol y calcitrol) y sus análogos en las series de ergosterol, es decir, la, 25-dihidroxivitamina D2, se conocen por ser reguladores muy potentes de homeostasis de calcio en animales y humanos, y también se ha establecido su actividad en diferenciación celular, Ostrem et al., Proc.

Nati. Acad. Sci. USA, 84, 2610 (1987). Se han preparado y probado muchos análogos estructurales de estos metabolitos, incluyendo la-hidroxivitamina D3, la-hidroxivitamina D2, varias vitaminas homologadas de cadena lateral, y análogos fluorados. Algunos de estos compuestos exhiben una separación interesante de actividades en diferenciación celular y regulación de calcio. Esta diferencia en actividad, puede ser útil en el tratamiento de una variedad de enfermedades como osteodistrofia renal, raquitismo resistente a vitamina D, osteoporosis, psoriasis y ciertas malignidades. Se muestra abajo, la estructura de la,25-dihidroxivitamina D3 y el sistema numérico usado para indicar los átomos de carbono en este compuesto. la, 25-Dihidroxivitamina D3 = la, 25-Dihidroxicolecalciferol = Calcitrol Otra clase de análogos de vitamina D, es decir, el así llamado compuesto 19-nor-vitamina D, se caracteriza por el reemplazo del grupo metileno de exocíclico de anillo A (carbono 19) , típicamente del sistema de vitamina D, por dos átomos de hidrógeno. La prueba biológica de tales análogos 19-nor (por ejemplo, la, 25-dihidroxi-19-nor- vitamina D3) , reveló un perfil de actividad selectiva con alta potencia, induciendo diferenciación celular, y actividad de movilización muy baja de calcio. Así, estos compuestos son potencialmente útiles como agentes terapéuticos para el tratamiento de malignidades, o el tratamiento de varios trastornos de la piel. Se han descrito dos métodos diferentes de la síntesis de tales análogos de 19-nor-vitamina D (Perlman et al., Tetrahedron Lett. 31, 1823 (1990); Perlman et al., Tetrahedron Lett. 32, 7663 (1991) y DeLucas et al., Patente Estadounidense No. 5, 086, 191) . En la Patente Estadounidense No. 4,666,634, se han descrito y examinado análogos 2ß-hidroxi y alcoxi (por ejemplo, ED-71) de la, 25-dihidroxivitamina D3 por el grupo Chugai como fármacos potenciales para osteoporosis y como agentes antitumorales. Véase también Okano et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 163, 1444 (1989) . También se han preparado y probado otros análogos del anillo A 2-sustituido (con hidroxialquilo, por ejemplo, ED-120 y grupos fluoroalquilo) de la, 25-dihidroxivitamina D3 (Miyamoto et al., Chem. Pharm. Bull. 41, 1111 (1993); Nishii et al., Osteoporosis Int. Suppl. 1, 190 (1993); Posner et al., J. Org. Chem. 59, 7855 (1994) y J. Org.

Chem. 60, 4617 (1995) ) . También se han sintetizado varios análogos 2- sustituidos de la, 25-dihidroxi-19-nor-vitamina D3 es decir, compuestos sustituidos en la posición 2 con grupos hidroxi o alcoxi (DeLuca et al., Patente Estadounidense No. 5,536,713), con grupos 2-alquilo (DeLuca et al., Patente Estadounidense No. 5,945,410) y con grupos 2-alquilideno (DeLuca et al., Patente Estadounidense No. 5,843,928), los cuales exhiben perfiles de actividad interesantes y selectivas. Todos estos estudios indican que sitios de enlace en receptores de vitamina D, pueden acomodar diferentes sustituyentes en C-2, en los análogos de vitamina D sintetizados. En un esfuerzo continuo por explorar la clase 19-nor de compuestos de vitamina D farmacológicamente importantes, también se han sintetizado y probado análogos los cuales se caracterizan por la presencia de un sustituyente de metileno en carbono 2 (C-2), un grupo hidroxilo en carbono 1 (C-1), y una cadena lateral más corta, unida al carbono 20 (C-20) . Se describe la-hidroxi-2-metilen-19-nor-pregnacalciferol en la Patente Estadounidense No. 6,566,352, mientras se describe la-hidroxi-2-metilen-19-nor- (20S) -homopregnacalciferol en la Patente Estadounidense No. 6,579,861 y se describe la-hidroxi-2-metilen-19-nor-bishomopregnacalciferol en la Patente Estadounidense No. 6,627,622. Los tres compuestos tienen actividad de enlace relativamente alta para receptores de vitamina D y actividad de diferenciación celular relativamente alta, pero poca actividad calcémica comparada con la, 25-dihidroxivitamina D3. Sus actividades biológicas, hacen de estos compuestos excelentes candidatos para una variedad de usos farmacéuticos, como se muestra en las patentes "352, "861 y "622.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona 2-metilen-19-nor- (20S-24S) -la, 25-dihidroxivitamina D2 y compuestos relacionados, formulaciones farmacéuticas que incluyen 2-metilen-19-nor- (20S-24S) -la, 25-dihidroxivitamina D2, y el uso de este compuesto en la preparación de medicamentos para uso en el tratamiento de varios estados de enfermedad. Por lo tanto, en un aspecto, la invención proporciona un compuesto que tiene la fórmula I mostrada abajo. en donde X1, X2 y X3 pueden ser el mismo o diferente, y son independientemente seleccionados de H o grupos hidroxi protectores. En algunas modalidades, X1 y X2 ambos son grupos hidroxi protectores, tales como grupos sililo. En algunas modalidades, X1 y X2 ambos son grupos t-butildi etilsililo. En otras modalidades, X1, X2 y X3 todos son H, de forma tal que el compuesto es 2-metilen-19-nor- (20S-24S) -la, 25-dihidroxivitamina D2, que tiene la fórmula IA como se muestra abajo: IA En algunas modalidades, el compuesto de fórmula IA es un compuesto de fórmula IB y tiene la estructura mostrada abajo: tß El compuesto anterior exhibe un patrón deseable y altamente ventajoso de actividad biológica. Este compuesto se caracteriza por enlace relativamente alto a los receptores de vitamina D, comparado con la,25-dihidroxivitamina D3, y la actividad de transporte de calcio intestinal similar. El compuesto anterior es más activo que la, 25-dihidroxivitamina D3 en su capacidad para movilizar calcio del hueso. Por lo tanto, este compuesto puede ser caracterizado por tener fuerte actividad calcémica. Así, puede ser empleado como una terapia para supresión de hiperparatiroidismo secundario de osteodistrofia renal y para el tratamiento de otros trastornos del desequilibrio de calcio, tal como osteopenia. El compuesto de la invención, es también especialmente adecuado para el tratamiento y profilaxis de trastornos humanos, los cuales se caracterizan por un desequilibrio en el sistema inmune, por ejemplo, en enfermedades autoinmunes, que incluyen esclerosis múltiple, lupus, diabetes mellitus, reacción a injerto contra el hospedante y rechazo a transplante de órgano; y adicionalmente, para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, tales como artritis reumatoide, asma y enfermedad del intestino inflamatorio, tal como enfermedad celiaca, colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn. Acné, alopecia e hipertensión son otras condiciones, las cuales pueden ser tratadas con el compuesto de la invención. El compuesto anterior, también se caracteriza por actividad de diferenciación celular relativamente alta. Así, este compuesto también proporciona un agente terapéutico para el tratamiento de psoriasis, o como un agente anti-cancerígeno, especialmente contra leucemia, cáncer de colon, cáncer de mama y cáncer de próstata. Además, debido a su actividad de diferenciación celular relativamente alta, este compuesto proporciona un agente terapéutico para el tratamiento de varias condiciones de la piel, que incluyen arrugas, carencia de hidratación dérmica adecuada, es decir, piel seca, carencia de firmeza adecuada de la piel, es decir, piel floja, e insuficiente secreción de sebo. El uso de este compuesto, de este modo, no solo resulta en humectación de la piel, sino también mejora la función de barrera de la piel. Los compuestos de la invención, pueden ser usados para preparar formulaciones o medicamentos farmacéuticos, que incluyen un compuesto de la invención en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Tales formulaciones y medicamentos farmacéuticos, pueden ser usados para tratar varios trastornos biológicos, tales como aquellos descritos en este documento. Métodos para tratar tales trastornos, típicamente incluyen administrar una cantidad efectiva del compuesto o una cantidad apropiada de una formulación farmacéutica o un medicamento que incluye el compuesto, a un sujeto que sufre del trastorno biológico. En algunas modalidades, el sujeto es un mamífero. En algunas modalidades, el mamífero se selecciona a partir de un roedor, un primate, un bovino, un equino, un canino, un felino, un ursino, un porcino, un conejo o un cobayo. En algunas modalidades, el mamífero es una rata o es un ratón. En algunas modalidades, el sujeto es un primate tal como en algunas modalidades, un humano. El compuesto puede estar presente en una composición para tratar las enfermedades y trastornos anteriormente indicados, en una cantidad de aproximadamente 0.01 µg/gm hasta aproximadamente 1 mg/gm de la composición, preferiblemente de aproximadamente 0.1 µg/gm hasta aproximadamente 500 µg/gm de la composición, y puede ser administrada tópicamente, transdérmicamente, oralmente o parenteralmente en dosificaciones de aproximadamente 0.01 µg/día hasta aproximadamente 1 mg/día, preferiblemente de aproximadamente 0.1 µg/día hasta aproximadamente 500 µg/día. Objetivos, características y ventajas adicionales de la invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada y dibujos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras 1-5 ilustran varias actividades biológicas de 2-metilen-19-nor- (20S-24S) -la, 25-dihidroxivitamina D2 (referida como "(20S/24S) 2-MD2" en las figuras) , comparadas con aquellas de la hormona nativa la, 25-dihidroxivitamina D3 (referida como "1, 25 (OH) 2D3" en las Figuras) . La figura 1 es una gráfica que compara la actividad relativa de (20S/24S) 2-MD2 y l,25(OH)2D3 para competir por enlace con [3H] -1, 25- (OH) 2-D3 al receptor de vitamina D de rata recombinante de longitud completa. La figura 2 es una gráfica que compara el porcentaje de diferenciación de la célula HL-60 como una función de la concentración de (20S/24S) 2-MD2, con aquella de l,25(OH)2D3. La figura 3 es una gráfica que compara la actividad de transcripción in vi tro de (20S/24S) 2-MD2 con aquella de l,25(OH)2D3. La figura 4 es una gráfica de barras que compara la actividad de movilización de calcio en hueso de (20S/24S) 2-MD2 con aquella de l,25(OH)2D3. La figura 5 es una gráfica de barras que compara la actividad de trasporte de calcio intestinal de (20S/24S) 2-MD2 con aquella de l,25(OH)2D3.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se sintetizó 2-metilen-19-nor- (20S-24S) -la, 25-dihidroxivitamina D2/ y se probó, y se encontró ser útil en el tratamiento de una variedad de condiciones biológicas como se describen en este documento. Estructuralmente, este compuesto tiene la fórmula IA como se muestra abajo: ÍA Se puede realizar la preparación de 2-metilen-19-nor- (20S-24S) -la, 25-dihidroxivitamina D2, condensando una cetona (II) tipo Windaus-Grundmann bicíclica apropiada con el óxido de fosfina alílica III, seguida por desprotección (remoción de los grupos Yi y Y) .

Sfl En óxido de fosfina III, Yi y Y2 son preferiblemente grupos hidroxi protectores, tales como grupos sililo protectores. El grupo t-butildimetilsilo (TBDMS) es un ejemplo de un grupo hidroxi protector particularmente útil. El proceso descrito anteriormente, representa una aplicación del concepto de síntesis convergente, el cual se ha aplicado efectivamente a la preparación de numerosos compuestos de vitamina D (véase Lythgoe et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 590 (1978); Lythgoe, Chem. Soc. Rev. 9, 449 (1983); Toh et al., J. Org. Chem. 48, 1414 (1983); Baggiolini et al., J. Org. Chem. 51, 3098 (1986); Sardina et al., J. Org. Chem. 51, 1264 (1986); J. Org. Chem. 51, 1269 (1986); DeLuca et al., Patente Estadounidense No. 5,086,191; DeLuca et al., Patente Estadounidense No. 5,536,713; y DeLuca et al, Patente Estadounidense No. 5,843,928 todas la cuales se incorporan por referencia en su totalidad y para todos los propósitos como se observa completamente en este documento) . El óxido de fosfina III es un reactivo conveniente, que puede ser usado para preparar un número amplio de compuestos de 19-nor vitamina D y pueden ser preparados de conformidad con los procedimientos descritos por Sicinski et al., J. Med. Chem., 41, 4662 (1998), DeLuca et al., Patente Estadounidense No. 5,843,928; Perlman et al., Tetrahedron Lett. 32, 7663 (1991); y DeLuca et al., Patente Estadounidense No. 5,086,191. El esquema de reacción I muestra el procedimiento general para sintetizar óxido de fosfina III como se resume en la Patente Estadounidense No. 5,843,928, la cual se incorpora aquí por referencia en su totalidad, como se observa completamente en este documento. Se pueden usar modificaciones del método mostrado en el Esquema de Reacción I para producir un número amplio de análogos de vitamina D, como será aparente para aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden usar una amplia variedad de compuestos de fosfonio en lugar de MePh3P+ Br" usado para convertir cetona B a alqueno C. Ejemplos de tales compuestos incluyen EtPh3P+ Br", PrPh3P+ Br", y compuestos en general preparados por reacción de trifenilfosfina con un haluro de alquilo, un haluro de alquenilo, un haluro de hidroxialquilo protegido, y un haluro de hidroxialquenilo protegido. Alquenos preparados usando este procedimiento, pueden después ser llevados a cabo para preparar un óxido de fosfina en una manera análoga a la usada para preparar óxido de fosfina H en el Esquema de Reacción I. Alternativamente, se puede reducir un análogo de alqueno a compuesto C del Esquema de Reacción I con (Ph3P)3RhCl y H2 para proporcionar otros análogos de vitamina D. Véase la Patente Estadounidense No. 5,945,410 y Sicinski, R. R. et al., J. Med. Chem., 41, 4662-4674 (1998), ambos son incorporados por referencia en su totalidad y para todos los propósitos. Por lo tanto, se puede usar el procedimiento para formar el óxido de fosfina mostrado en el Esquema de Reacción I, para preparar una amplia variedad de análogos de vitamina D además del compuesto de la presente invención.

ESQUEMA DE REACCIÓN I Se pueden preparar hidraindanonas de estructura II por métodos conocidos o métodos adaptados, como será aparente a un experto en la técnica y se describe en este documento. Ejemplos específicos de cetonas bicíclicas de alguna importancia, usadas para sintetizar análogos de vitamina D, son aquellos descritos en Mincione et al, Synth. Commun 19, 723, (1989); y Peterson et al., J. Org. Chem. 51, 1948, (1986) . Se ilustra y describe un proceso total para sintetizar compuestos 2-alquiliden-19-nor-vitamina D, en la Patente Estadounidense No. 5,843,928 la cual es incorporada por referencia en su totalidad y para todos los propósitos como se muestra completamente en este documento. Como se usa en este documento, el término "grupo hidroxi protector", significa cualquier grupo comúnmente usado para la protección temporal del grupo funcional hidroxi (-OH) , tal como, pero no limitado a, grupos alcoxicarbonilo, acilo, alquilsililo o alquilarilsililo (referidos aquí anteriormente simplemente como grupos "sililo"), y grupos alcoxialquilo. Grupos alcoxicarbonilo protectores son grupos alquil-O-CO, tales como metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, propoxicarbonilo, isopropoxicarbonilo, butoxicarbonilo, isobutoxicarbonilo, terc-butoxicarbonilo, benciloxicarbonilo o aliloxicarbonilo. El término "acilo" significa un grupo alcanoilo de 1 a 6 átomos de carbono, en todas sus formas isoméricas, o un grupo carboxialcanoilo de 1 a 6 átomos de carbono, tal como un grupo oxalilo, malonilo, succinilo, glutarilo, o un grupo acilo aromático tal como grupo benzoilo, o un halo, nitro o benzoilo alquilo sustituido. Grupos alcoxialquilo protectores son grupos tales como metoximetilo, etoximetilo, metoxietoximetilo o tetrahidrofuranilo y tetrahidropiranilo. Grupos sililo protectores preferidos son trimetilsililo, trietilsililo, t-butildimetilsililo, dibutilmetilsililo, difenilmetilsililo, fenildimetilsililo, difenil-t-butilsililo y radicales sililo alquilados análogos. El término "arilo" específica un grupo fenilo, fenilo- o un alquilo-, nitro- o halo-sustituido. Se puede encontrar una lista extensiva de grupos protectores para la funcionalidad hidroxi, en Protective Groups in Organic Synthesis, Greene, T.W.; Wutus, P.G.M., John Wiley & Sons, New York, NY, (3ra. Edición, 1999), la cual se puede agregar o remover usando los procedimientos mostrados en este documento y los cuales se incorporan por referencia en su totalidad y para todos los propósitos como se muestra completamente en este documento. Un grupo "hidroxi protegido", es un grupo hidroxi derivado o protegido por cualquiera de los grupos anteriores comúnmente usaos para la protección temporal o permanente de grupos hidroxi funcionales, por ejemplo, los grupos sililo, alcoxialquilo, acilo o alcoxicarbonilo, como se define previamente.

EJEMPLOS Síntesis de 2-metilen-19-nor- (20S-24S) -l ,25- dihidroxivitamina D2 Se describe la síntesis y características de varios análogos de 19-nor vitamina D en numerosas Patentes de Estados Unidos, que incluyen Patente Estadounidense No. 5,843,928, Patente Estadounidense No. 6,627,622, Patente Estadounidense No. 6,579,861, Patente Estadounidense No. 5,086,191, Patente Estadounidense No. 5,585,369, y Patente Estadounidense No. 6,537,981. Cada una de las referencias descritas anteriormente se incorpora por referencia en su totalidad y para todos por propósitos como se muestran completamente en este documento. Se prepararon compuestos de fórmula I, fórmula IA y fórmula IB, usando los métodos mostrados en los Esquemas de Reacción I, IIA y IIB. Se obtuvo el compuesto 1 por ozonólisis de ergocalciferol o vitamina D2, como se describe por Sicinski et al., (J. Med. Chem. 41, 4662-4672, 1998) . Se redujo el compuesto 1 con borohidruro para producir el compuesto de dihidroxi 2. Estas reacciones se pueden seguir por cromatografía de capa delgada (CCD) , usando un sistema de solvente de acetato de etilo al 10% en hexano. Tratamiento del 2 con anhídrido acético en piridina, proporciona el compuesto de acetato 3. Después se trató el compuesto 3 trietilsilil trifluorometan sulfonato seguido por hidrólisis base (calentado con KOH en metanol) para producir el compuesto 4. Nuevamente, estas reacciones se siguieron por el mismo sistema CCD anterior. Se oxidó el compuesto 4 con trióxido de azufre en piridina, dimetiisulfóxido y trimetilamina para proporcionar el 5. La reacción se siguió por CCD, usando 10% en ácido acético. El tratamiento de 5 con bicarbonato de sodio para epimerizar el compuesto, seguido por reducción con borohidruro de sodio en metanol, proporciona alcohol 6 y es detectado por CCD con acetato de etilo en hexano al 20%. Después se oxidó el compuesto 6, usando los reactivos mostrados en el Esquema de Reacción IIA para producir el compuesto 7, el cual en cambio se hizo reaccionar con la sulfona estereoespecífica (compuesto 8) en la presencia de n-BuLi (Esquema de Reacción IIB) . Se preparó la sulfona 8, usando los materiales de partida obtenidos de Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wisconsin) usando los procedimientos descritos en la Patente Estadounidense No. 5,750,746, la cual se emitió por DeLuca et al., el 12 de Mayo de 1998. Se realizó la acetilación de este compuesto usando anhídrido acético y piridina, resultando en el compuesto 9, el cual se confirmó por CCD (acetato de etilo en hexano al 10%) . El compuesto 9 después se convirtió al compuesto 10, reaccionando con una amalgama de sodio. Se conformó la presencia del compuesto 10, usando CCD (acetato de etilo en hexano al 10%) . Se realizó la desprotección del compuesto 10, usando p-toluen sulfonato de piridinio, y la reacción se siguió por CCD con acetato de etilo al 35% en hexano. Se terminó la oxidación del compuesto 11 por reacción con clorocromato de piridinio. Después se agregó un grupo de trimetilsililo en la presencia de imidazol, para proporcionar el compuesto protegido 13. Se detectaron los productos 12 y 13 por CCD con acetato de etilo en hexano al 35%. Se realizó una condensación Wittig-Horner de la cetona de Grundmann protegida (Compuesto 13) con el óxido de fosfina (Compuesto 14) en la presencia de n-BuLi . El producto resultante (Compuesto 15) se confirmó por CCD (acetato de etilo al 20%) . Finalmente, se generó el compuesto objetivo (Compuesto 16) por desprotección en la presencia de fluoruro de tetrabutil amonio. La reacción se siguió por CCD con metano el cloroformo al 10%. Se describe abajo la confirmación adicional del producto final: ESQUEMA DE REACCIÓN IIA 7; PM * 324 ESQUEMA DE REACCIÓN I IB 7: PM * 324 0; PM » 722 Na(Hg) 2-metilen-19-nor-(20S-24S) -la,25-dihidroxivitamina D2 *H RMN (300 MHz, CDC13) d 0.527 (3H, s, 18-H3) , 0.949 (3H, d, J = 6.6 Hz, 21-H3) , 1.002 (3H, d, J = 7.2 Hz, 28-H3), 1.129 y 1.172 (3H y 3H, cada s, 26- y 27-H3) , 1.8-2.2 (5H, br m) , 2.29 (ÍH, dd, J = 13.0, 8.4 Hz, 10a- H) , 2.33 (ÍH, dd, J = 13.2, 6.3 Hz, 4ß-H) , 2.58 (ÍH, dd, J = 13.2, 3.9 Hz, 4a-H) , 2.81 (lHi m, 9ß-H) , 2.86 (1 H, dd, J = 13.0, 4.2 Hz, lOß-H), 4.49 (2H, , lß- y 3 -H) , 5.10 y 5.12 (ÍH y ÍH, cada s, =CH2) , 5.24 y 5.41 (ÍH y ÍH, cada m, 22-y 23-H), 5.88 y 6.36 (1 H y 1 H, cada d, J = 11.2 Hz, 7- y 6-H) . EM (APCI) m/z 411 [ (M + H]+ - H20] .

ACTIVIDAD BIOLÓGICA Enlace del Receptor de Vitamina D Material de Prueba Fuente de proteína Se expresó el receptor de rata recombinante de longitud completa en células BL21(DE3) Codón Plus RIL de E. coli y se purificaron a homogeneidad, usando dos diferentes sistemas de cromatografía en columna. El primer sistema es una resina de afinidad de níquel, que utiliza el extremo de histidina C-terminal en esta proteína. La proteína que se eluyó a partir de esta resina, se purificó adicionalmente usando cromatografía de intercambio iónico (S-Sefarosa de Flujo Rápido) . Se congelaron rápidamente alícuotas de la proteína purificada en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C hasta el uso. Para uso en los ensayos de enlace, la proteína se diluyó en TEDK50 (50 mM de Tris, 1.5 mM de EDTA, pH 7.4, 5 mM de DTT, pH 7.4 , 5 mM de DTT, 150 mM de KCl) con detergente CHAPS al 0.1%. Se optimizó la proteína receptora y la concentración del ligando, de forma tal que no más del 20% de ligando radioetiquetado agregado se unió al receptor.

Fármacos de Estudio Se disolvieron en etanol ligandos no etiquetados y se determinaron las concentraciones usando espectrometría UV (1, 25 (OH) 2D3: coeficiente de extinción molar = 18,200 y ?ma? = 265 nm; Análogos: coeficiente de extinción molar = 42,000 y ?ma? = 252 nm) . Se agregó el ligando radioetiquetado (3H-1, 25 (OH) 2D3, -159 Ci/mmole) en etanol a una concentración final de 1 nM.

Condiciones de Ensayo Se agregaron ligandos radioetiquetados y no etiquetados a 100 mcl de la proteína diluida a una concentración de etanol final de = 10%, mezclada e inoculada durante la noche en hielo, para alcanzar equilibrio de enlace. Al siguiente día, se agregó 100 mcl de suspensión de hidroxilapatito (50%) a cada tubo y se mezcló en intervalos de 10 minutos por 30 minutos. Se colectó hidroxilapatito por centrifugación, y después se lavó tres veces con amortiguador Tris-EDTA (50 nM de Tris, 1.5 mM de EDTA, pH 7.4) que contiene Tritón X-100 al 0.5%. Después del lavado final, las pelotillas se transfirieron a viales de escintilación que contiene 4 ml de cóctel de escintilación Biosafe II, se mezcló y colocó en un contador de escintilación. Se determinó en enlace total de los tubos que contienen únicamente ligando radioetiquetado.

Diferenciación HL-60 Material de Prueba Fármacos de Estudio Se disolvieron fármacos de estudio en etanol, y se determinaron las concentraciones usando espectrofotometría UV. Se prepararon diluciones en serie, para que un intervalo de concentraciones de fármaco pueda ser probado, sin cambiar la concentración final de etanol (=0.2%) presente en los cultivos celulares.

Células Se hicieron crecer células de leucemia promielocíticas humanas (HL60) en medio RPMI-1640, que contiene suero de bovino fetal al 10%. Las células se incubaron a 37°C en la presencia de C02 al 5%.

Condiciones de Ensayo Se colocaron células HL60 a 1.2 x 105 células/ml. Después de dieciocho horas de la colocación, las células se trataron en duplicado con fármaco. Cuatro días después, las células se colectaron y se realizó un ensayo de reducción de tetrazolio azul nitro (Collins et al., 1979; J. Exp. Med. 149:969-974). Se determinó el porcentaje de células diferenciadas, contando un total de 200 células y registrando el número que contiene depósitos de formazan negro-azul intracelular. Se determinó la verificación de diferenciación para células monocíticas, midiendo la actividad fagocítica (datos no mostrados) .

Ensayo de Transcripción in vitro Se midió la actividad de transcripción en células ROS 17/2.8 (hueso) que son establemente transfectadas con un promotor del gen 24-hidroxilasa (240hase) del extremo 5' de un gen reportero de luciferasa (Arbour et al., 1998). Las células dan un intervalo de dosis. Dieciséis horas después de la dosificación, las células se colectaron y se midieron las actividades de luciferasa, usando un luminómetro. Unidades de luciferasa relativa = RLU.

Transporte de Calcio Intestinal y Movilización de Calcio del Hueso Se sometieron ratas Sprague-Dawley animales destetados, machos a Dieta 11 (Suda et al. J. Nutr. 100:1049, 1970) (Ca al 0.47%) dieta + vitaminas 7?EK por una semana, seguida por la Dieta 11 (Ca al 0.02%) + AEK por 3 semanas. Las ratas después se cambiaron a una dieta que contiene Ca al 0.47% por una semana, seguida por dos semanas a una dieta que contiene Ca al 0.02%. La administración de dosis inició durante la última semana en dieta de calcio al 0.02%. Se dan cuatro dosis ip consecutivas, aproximadamente 24 horas aparte. Veinticuatro horas después de la última dosis, se colectó sangre del cuello roto y se determinó la concentración de calcio en suero como una medida de movilización de calcio en hueso. También se colectaron los primeros 10 cm del intestino para análisis de transporte de calcio intestinal, usando el método de saco intestinal Everted. 2-Metilen-19-nor- (20S-24S) -la, 25-dihidroxivitamina D2 es al menos, igual a la hormona nativa en enlace al receptor de vitamina D, como se muestra en la Figura 1. 2-Metilen-19-nor- (20S-24S) -la, 25-dihidroxivitamina D2 es casi igual a la hormona nativa en la inducción de diferenciación de células HL-60 (Figura 2), y también es ligeramente más efectivo que l,25-(OH)2D3 causando transcripción, como se muestra en la Figura 3. 2-Metilen-19-nor- (20S-24S) -la, 25-dihidroxivitamina D2 tiene actividad de movilización de calcio en hueso comparable a l,25-(OH)2D3 (figura 4), y el compuesto retiene algo de capacidad para el transporte de calcio intestinal elevado (figura 5) . Este compuesto encontró uso como una terapia efectiva para hiperparatiroidismo secundario en pacientes de diálisis o en el tratamiento de trastornos de pérdida de hueso, tal como pero no limitada a, osteoporosis y similares. También puede ser usado para el tratamiento de malignidad de colon, próstata y mama, y puede ser usado en la terapia de enfermedades autoinmunes, tales como esclerosis múltiple, diabetes tipo 1 y diabetes tipo 2, enfermedades del intestino inflamatorio, lupus, artritis reumatoide y Enfermedad de Lou Gehrig. Los compuestos de la invención también son útiles en la prevención o para tratar obesidad, inhibiendo la diferenciación de adipocitos, inhibiendo la transcripción del gen SCD-1, y/o reduciendo la grasa corporal en sujetos animales. Por lo tanto, en algunas modalidades, un método para prevenir o tratar obesidad, inhibiendo diferenciaciones de adipocitos, inhibiendo la transcripción del gen SCD-1, y/o reduciendo la grasa corporal en un sujeto animal, incluye administrar al sujeto animal, una cantidad efectiva del compuesto o una composición farmacéutica que incluye el compuesto. La administración del compuesto a la composición farmacéutica al sujeto, inhibe la diferenciación de adipocito, inhibe la transcripción del gen y/o reduce la grasa corporal en el sujeto animal. Para propósitos de tratamiento, los compuestos definidos por la fórmula I, fórmula IA y fórmula IB, pueden ser formulados para aplicaciones farmacéuticas como una solución en solventes inocuos, o como una emulsión, suspensión o dispersión en solventes o portadores adecuados, o como pildoras, tabletas o cápsulas, junto con portadores sólidos, de conformidad con métodos convencionales conocidos en la técnica. Cualquier formulación puede también contener otros excipientes farmacéuticamente aceptables y no tóxicos, tales como agentes estabilizadores, anti-oxidantes, aglutinantes y colorantes o agentes emulsificantes o modificadores del sabor. Excipientes y portadores farmacéuticamente aceptables, son generalmente conocidos por aquellos expertos en la técnica y son así incluidos en la presente invención. Se describen tales excipientes y portadores, por ejemplo en "Remington Pharmaceutical Sciences" Mack Pub. Co., New Jersey (1991), el cual es incorporado por referencia en su totalidad y para todos los propósitos como se muestra completamente en este documento.

Los compuestos pueden ser administrados oralmente, tópicamente, parenteralmente o transdérmicamente. Los compuestos son ventajosamente administrados por inyección o por infusión intravenosa o soluciones estériles adecuadas, o en la forma de dosis líquidas o sólidas, vía el canal alimenticio, o en la forma de cremas, ungüentos, parches o vehículos similares adecuados para aplicaciones transdérmicas. En algunas modalidades, son apropiadas las dosis de 0.001 µg hasta aproximadamente 1 mg por día del compuesto, para propósitos de tratamiento. En algunas modalidades, una dosis apropiada y efectiva puede variar de 0.01 µg hasta 1 mg por día del compuesto. En otras modalidades, una dosis apropiada y efectiva puede variar de 0.1 µg hasta 500 µg por día del compuesto. Tales dosis serán ajustadas de conformidad al tipo de enfermedad o condición a ser tratada, la severidad de la enfermedad o condición, y la respuesta del sujeto como es bien entendido en la técnica. El compuesto puede ser adecuadamente administrado solo, o junto con otro compuesto de vitamina D activo. Las composiciones para uso en la invención, incluyen una cantidad efectiva de 2-metilen-19-nor- (20S-24S) -la, 25-dihidroxivitamina D2 como el ingrediente activo, y un portador adecuado. Una cantidad efectiva del compuesto para uso de conformidad con algunas modalidades de la invención, será generalmente una cantidad de dosificación como aquella descrita en este documento, y puede ser administrada tópicamente, transdérmicamente, oralmente, nasalmente, rectalmente o parenteralmente. El compuesto de fórmula IA y fórmula IB, puede ser ventajosamente administrado en cantidades suficientes para provocar la diferenciación de promielocitos a macrófagos normales. Son adecuadas dosificaciones como se describen anteriormente, se entenderá que las cantidades proporcionadas son ajustadas de conformidad con la severidad de la enfermedad, y la condición y respuesta del sujeto, como se entenderá en la técnica. El compuesto puede ser formulado como cremas, lociones, ungüentos, aerosoles, supositorios, parches tópicos, pildoras, cápsulas o tabletas, o en forma líquida como soluciones, emulsiones, dispersiones o suspensiones en solventes o aceites farmacéuticamente inocuos y aceptables, y tales preparaciones pueden contener, además, otros componentes farmacéuticamente inocuos o benéficos, tales como agentes estabilizadores, antioxidantes, emulsificadores, colorantes, aglutinantes o agentes que modificadores del sabor. Las formulaciones de la presente invención, comprenden un ingrediente activo en asociación con un portador farmacéuticamente aceptable, por lo tanto y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos. El portador puede ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de las formulaciones y no perjudicial al receptor del mismo. Formulaciones de la presente invención, adecuadas para administración oral, pueden estar en la forma de unidades discretas como cápsulas, saquillos, tabletas o grageas, cada una contiene una cantidad predeterminada del ingrediente activo; en la forma de un polvo o granulos; en la forma de una solución o una suspensión, en un líquido acuoso o líquido no acuoso; o en la forma de una emulsión aceite en agua o una emulsión agua en aceite. Formulaciones para administración rectal, pueden estar en la forma de un supositorio, que incorpora el ingrediente activo y el portador tal como manteca de cacao, o en la forma de un enema. Formulaciones adecuadas para administración parenteral, convenientemente comprenden un aceite estéril o preparación acuosa del ingrediente activo, el cual es preferiblemente isotónico con la sangre del recipiente. Formulaciones adecuadas para administración tópica, incluyen preparaciones líquidas o semi-líquidas tales como linimentos, lociones, aplicadores, emulsiones aceite en agua o agua en aceite, tales como cremas, ungüentos o pastas; o soluciones o suspensiones tales como gotas; o como atomizadores. Para administración nasal, inhalación de polvo, pueden ser usadas formulaciones de auto-propulsión o atomizadas, dispersadas con una lata atomizada, un nebulizador o un atomizador. Las formulaciones, cuando se dispersan, preferiblemente tiene un tamaño de partícula en el intervalo de 10 hasta 100 micrones. Las formulaciones pueden convenientemente ser representadas en forma de unidad de dosificación y pueden ser preparadas por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. El término "unidad de dosificación" significa una unitaria, es decir, una dosis única, la cual es capaz de ser administrada a un paciente como una dosis unitaria físicamente y químicamente estable, que comprende ya sea el ingrediente activo, tal como o una mezcla de este con diluyentes o portadores farmacéuticos líquidos o sólidos. Todas las referencias citadas en este documento, son específicamente incorporadas por referencia en su totalidad y para todos los propósitos como se muestra completamente en este documento. Se entenderá que la invención no se limita a las modalidades mostradas en este documento para ilustración, pero abarca todas las formas de esta, aquí dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN
Habiéndose descrito la presente se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.
REIVINDICACIONES 1. Un compuesto que tiene la fórmula I caracterizado porque X1, X2 y X3 son independientemente seleccionados de H o grupos hidroxi protectores. 2. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque X1 y X2 ambos son grupos hidroxi protectores. 3. El compuesto de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque X1 y X2 ambos son grupos t-butildimetilsililo.
4. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque X1, X2 y X3 todos son H y el compuesto tiene la fórmula IA IA
5. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una cantidad efectiva del compuesto de la reivindicación 4, y un portador farmacéuticamente aceptable.
6. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la cantidad efectiva comprende desde aproximadamente 0.01 µg hasta aproximadamente 1 mg del compuesto por gramo de la composición.
7. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la cantidad efectiva comprende de aproximadamente 0.1 µg hasta aproximadamente 500 µg del compuesto por gramo de la composición.
8. Un método para tratar a un sujeto que sufre de una condición biológica, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva del compuesto de conformidad con la reivindicación 4 al sujeto, en donde la condición biológica se selecciona de psoriasis; leucemia; cáncer de colon, cáncer de mama; cáncer de próstata; esclerosis múltiple; lupus; diabetes mellitus; reacción a injerto contra el hospedante; rechazo de transplante de órgano; una enfermedad inflamatoria seleccionada de artritis reumatoide, asma o enfermedades del intestino inflamatorio; una condición de la piel seleccionada de arrugas, carencia firmeza adecuada de la piel, carencia de hidratación dérmica adecuada o secreción de sebo insuficiente; osteodistrofia renal; u osteoporosis.
9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la condición biológica es psoriasis .
10. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la condición biológica se selecciona de leucemia, cáncer de colon, cáncer de mama o cáncer de próstata.
11. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la condición biológica se selecciona de esclerosis múltiple, lupus, diabetes mellitus, rechazo de injerto contra hospedero, o rechazo de órganos transplantados.
12. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la condición biológica se selecciona de artritis reumatoide, asma o enfermedad del intestino inflamatorio, seleccionada de enfermedad celiaca, colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn.
13. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la condición biológica se selecciona de arrugas, carencia de firmeza adecuada de piel, carencia de hidratación dérmica adecuada o secreción de sebo insuficiente.
14. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el compuesto es administrado oralmente al sujeto.
15. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el compuesto se administra parenteralmente al sujeto.
16. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el compuesto se administra transdérmicamente al sujeto.
17. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el compuesto se administra tópicamente al sujeto.
18. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el compuesto se administra en una forma de dosificación desde 0.01 µg por día hasta 1 mg por día.
19. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque X1, X2, y X3, son todos H y el compuesto tiene la fórmula IB IB
20. El uso del compuesto de conformidad con la reivindicación 4 o reivindicación 19, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una condición biológica seleccionada de psoriasis; leucemia; cáncer de colon, cáncer de mama; cáncer de próstata; esclerosis múltiple; lupus; diabetes mellitus; reacción a injerto contra el hospedante; rechazo de transplantes de órganos; una enfermedad inflamatoria seleccionada de artritis reumatoide, asma o enfermedades del intestino inflamatorio; una condición de la piel seleccionada de arrugas, carencia firmeza adecuada de la piel, carencia de hidratación dérmica adecuada o secreción de sebo insuficiente; osteodistrofia renal; u osteoporosis.