JP2010266461A - 走査型共焦点顕微鏡 - Google Patents

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Abstract

【課題】観察試料の表面形状を直感的で判りやすく表示することができ、3次元情報取得の操作性を格段に向上することが可能な走査型共焦点顕微鏡を提供すること。
【解決手段】対物レンズの集光位置と試料の相対的な位置を集束光の光軸方向に治って離散的に繰り返し往復動作させて光強度情報を取得し、抽出した光強度情報に適合する変化曲線上の最大値と相対位置を推定し、輝度情報と高さ情報として取得し、移動機構の反転動作から次の反転動作までの間に取得される各相対位置での試料からの光強度情報を光強度情報群として取り扱い、試料からの非共焦点画像情報を光強度情報とは別に取得し、移動機構の反転動作位置から次の反転動作位置の間に得られる試料の高さ情報を、取得した非共焦点画像情報とともに同一画面上に、移動機構が反転動作位置から次の反転動作位置に移動する毎に試料形状の3D画像、非共焦点画像を更新して表示する。
【選択図】図1

Description

本発明は、走査型共焦点顕微鏡に関し、特に、走査型共焦点顕微鏡を用いて試料の高さ方向に関する表面情報を測定して、試料の3次元的形状を視認し易いよう表示するための走査型共焦点顕微鏡に関する。
従来、走査型共焦点顕微鏡は、試料に点状照明し、試料からの透過光または反射光、蛍光を共焦点絞り上に集光させる。その後、この共焦点絞りを透過する光の強度を光検出器で検出することによって試料の表面情報を取得している。また、点状照明を種々の方法によって試料面上を走査することにより、試料の広い範囲の表面情報を取得することができる。
図30は、従来の走査型共焦点顕微鏡の概略的な構成を示す図である。
図30に示す走査型共焦点顕微鏡では、光源1から出射した光が、ビームスプリッター2を透過した後、2次元走査機構3に入射する。2次元走査機構3は、第1の光スキャナ3aと第2の光スキャナ3bとからなり、光束を2次元に走査し、対物レンズ7へと導く。対物レンズ7へ入射した光束は、集束光となって試料8の表面上を走査する。
試料8の表面で反射した光は、再び対物レンズ7から2次元走査機構3を介してビームスプリッター2に導入された後、ビームスプリッター2によって反射され結像レンズ9によってピンホール10上に集光する。ピンホール10により試料8の集光点以外からの反射光をカットし、ピンホール10を通過する光だけを光検出器11によって検出する。
試料8は、試料台13上に載置されており、ステージ14および光検出器11は、コンピュータ12によって制御されている。
ここで、対物レンズ7による集光位置は、ピンホール10と光学的に共役な位置にあり、試料8が対物レンズ7による集光位置にある場合は、試料8からの反射光がピンホール10上で集光してピンホール10を通過する。試料8が対物レンズ7による集光位置からずれた位置にある場合は、試料8からの反射光はピンホール10上では集光しておらず、ピンホール10を通過しない。
図31は、対物レンズ7と試料8の相対位置(Z)と光検出器11の出力(I)の関係を示す図である。
以下この関係をI−Zカーブと呼ぶ。
図31に示すように、試料8が対物レンズ7の集光位置Zにある場合、光検出器11の出力は最大となり、この位置から対物レンズ7と試料8の相対位置が離れるに従い光検出器11の出力は急激に低下する。
この特性により、2次元走査機構3によって集光点を2次元走査し、光検出器11の出力を2次元走査機構3に同期して画像化すれば、試料8のある特定の高さのみが画像化され、試料8を光学的にスライスした画像(共焦点画像)が得られる。さらに、ステージ14で試料8を光軸方向に離散的に移動させ、各位置で2次元走査機構3を走査して共焦点画像を取得し、試料8上の各点で光検出器11の出力が最大になるステージ14の位置を検出することにより試料8の高さ情報が得られる。また、試料各点における光検出器11の出力の最大値を重ねて表示することにより、全ての面にピントの合った画像(以降、エクステンド画像)を得ることが出来る。
ところで、このような構成によって試料8の高さを計測する際、測定精度を高めようとするとステージ14の1回当りの移動量を小さくすることが必要になり、計測に時間がかかる。そこで、ステージ14の1回当りの移動量を小さくすることなく、試料8の高さ計測の精度を高める高さ測定方法が提案されている(特許文献1参照。)。
この方法では、ステージ14をある移動量で動かしながら光検出器11の出力を順次取得し、それらの中でその値が最大になっているところのステージ14の位置、およびその前後の位置の計3点での光検出器11の出力に基づいてI−Zカーブを2次曲線で近似し、光検出器11の出力が本来最大となるステージ14の位置をステージ14の移動量以下の精度で求め、高さ情報を得ている。
また、高さ方向における試料の相対移動量を小さくすることなく、高分解能で試料の表面形状を計測することを目的として、試料の高さ方向において互いに異なる複数の高さ位置で共焦点画像をそれぞれ撮像し、これらの共焦点画像に基づき、画素ごとに以下のようにして当該画素に対応する試料の表面情報としての表面高さデータH(x,y)を求める技術が開示されている。(特許文献2参照。)
具体的には、高さ方向において光量が最大となる第1高さ位置D(m)を求めるとともに、第1高さ位置D(m)での第1光量Fm(x,y)と、第1高さ位置D(m)の上方側および下方側でそれぞれ近接する第2および第3高さ位置D(m−1),D(m+1)での第2および第3光量Fm−1(x,y),Fm+1(x,y)を求める。そして、これらに基づき、高さ位置に対する光量の変化を示す2次曲線を求め、この2次曲線から光量の極値を求める。さらに、この極値に対応する高さ位置Dmaxを表面高さデータH(x,y)とするものである。
また、光軸方向に走査することなく試料の光軸方向位置及び3次元形状を得ることが可能な走査型共焦点顕微鏡が開示されている。この走査型共焦点顕微鏡は、レーザ光源と、このレーザ光源の出力光を開孔に通過させて出射させる共焦点スキャナと、この共焦点スキャナからの出射光を試料に集光する光学顕微鏡と、試料からの戻り光のうち共焦点スキャナの開孔を通過した光を撮影して断面画像を得る撮影手段と、光軸方向位置−光量特性に基づき断面画像の光量から試料の光軸方向位置を求める制御手段とを設けるというものである(特許文献3参照。)。
特開平9−68413号公報 特開平9−113235号公報 特開平11−264933号公報
上述のように、走査型共焦点顕微鏡などの3次元測定装置では、これらの従来技術を実際に利用し試料の立体的な形状を得ることができている。
しかしながら、以下のような前提のもとに使用されていること、及びそのために3次元の情報を得るための事前操作において不便さを感じることが時々ある。
すなわち、本来、3次元(Z軸方向)の測定を行う場合、共焦点画像は試料のある特定の位置の高さのみの輝度情報を抽出した2次元(XY方向)画像であるので、Z軸方向にこの焦点面を移動させながら情報を取得し加工しなければならないという問題点がある。
このことは、試料の高さ情報を得るにはZ軸方向にある移動範囲を設定しておく必要があることを意味している。ところが、通常の走査では2次元画像しか得られないにもかかわらず、試料形状の微細なZ軸方向の位置関係をどのように捉えるかというと、使用者がステージ14を上下方向に移動させ、変化する共焦点画像を観察し、おおよその位置関係をつかんでから高さ情報を得るためのZ軸方向の移動範囲を決定している。これは初心者には非常にイメージしにくい概念であり、また慣れていても煩わしい作業である。また、共焦点画像は合焦位置の輝度情報しか得ていないので、試料の形状によっては全体が真っ暗に近い画像となるときがあり、ステージ14を移動させているうちにZ軸のどの辺りにいるのか見失ってしまい不必要に上下動を繰り返す羽目になることもある。
また、上記作業を1度行えば出来上がった高さ情報が果たして適切に得られているのかという点においても習熱度が要求され、初心者には難しい条件出しの1つになっているという問題点がある。
一連の高さ情報取得動作が完了して高さ情報が得られると、それを3D表示や解析に利用したりするのが一般的な使われ方であるが、仮に取得条件が不適切であった場合、ここまで作業を行ってから初めて得られたデータに不備があることが判明する。高さ情報の不備の原因として考えられるのは、ステージ14の移動中の共焦点画像に輝度飽和があること、ステージ14の移動範囲や移動量設定が不適切であること、試料8表面の反射率が低くS/Nが悪いこと、急斜面であり反射光が得られていないことなどが挙げられる。
2次元画像である共焦点画像は、2次元走査機構3の走査に同期して連続的に更新されており、そのZ軸位置において輝度飽和の有無や2次元走査範囲の設定が所望の範囲であるかなどは画像を見れば瞬時に判断がつき簡単に適切な設定に調整することができる。しかし、高さ情報になった途端にZ軸移動方向全体に渡って設定条件に不備がないかを見るには、使用者が試料8の範囲全体を移動させてみて目視で確認するか、一度高さ情報を取ってみて条件を適当に変え再度確認するというサイクルを繰り返さなくてはならない。
このように、高さ情報を得るための事前操作として、ステージ14を移動させながら2次元的な共焦点の画像を得つつ、これを見て試料8の3次元的な構造を使用者が推測し、あらかじめ欲しい範囲が含まれるようにステージ14の移動範囲を設定しなければならない。また、高さ情報が適切に得られているかは一連の工程の最後に出来上がった高さ情報を見て良否を判断しなくてはならず、取り直しをする必要がある場合など、時間的にも作業的にも2次元画像に比べて著しく不便さを伴ってしまう。
本発明は、上記従来技術の欠点に鑑みてなされたもので、観察試料の表面形状を直感的で判りやすく表示することができるとともに、 3次元情報取得の操作性を格段に向上することが可能な走査型共焦点顕微鏡を提供することを目的とする。
本発明は、上記課題を解決するため、下記のような構成を採用した。
すなわち、本発明の一態様によれば、本発明の走査型共焦点顕微鏡は、光源からの光を試料に対して集束させる対物レンズと、前記集束光の光軸方向に沿って、前記対物レンズの集光位置と前記試料の位置を相対的に移動させる移動機構と、前記対物レンズの集光位置と共役な位置に配置された共焦点絞りと、前記共焦点絞りを通過する光の強度を検出する光検出器とを備えた走査型共焦点顕微鏡であって、前記移動機構によって前記対物レンズの集光位置と前記試料の相対的な位置を前記集束光の光軸方向に治って離散的に繰り返し往復動作させる手段と、各相対位置での前記試料からの光強度情報をそれぞれ取得する手段と、それら光強度情報群から複数の光強度情報を抽出する手段と、前記抽出した複数の光強度情報に適合する変化曲線上の最大値と、それを与える前記相対位置を推定する手段と、その推定した光強度情報の最大値と相対位置をそれぞれ輝度情報と高さ情報として取得し、前記移動機構の反転動作から次の反転動作までの間に取得される各相対位置での前記試料からの光強度情報を前記光強度情報群として取り扱い、前記移動機構の往復動作に合わせて前記輝度情報と高さ情報とを連続的に取得する輝度及び高さ情報演算手段と、前記試料からの非共焦点画像情報を前記光強度情報とは別に取得する非共焦点画像情報取得手段と、前記移動機構の反転動作位置から次の反転動作位置の間に得られる前記試料の高さ情報に基づいて前記試料形状の3D画像を作成し、前記非共焦点画像情報取得手段によって取得した非共焦点画像情報とともに同一画面上に、連続的に更新しながら表示する表示手段とを備え、前記表示手段が、前記移動機構が反転動作位置から次の反転動作位置に移動する毎に前記試料形状の3D画像を1回更新して表示し、前記移動機構が前記各相対位置に移動する毎に前記非共焦点画像を更新して表示することを特徴とする。
また、本発明の一態様によれば、本発明の走査型共焦点顕微鏡は、光源からの光を試料に対して集束させる対物レンズと、前記集束光の光軸方向に沿って、前記対物レンズの集光位置と前記試料との相対的な位置を離散的に移動させる移動機構と、前記対物レンズの集光位置と共役な位置に配置された共焦点絞りと、各相対位置での前記共焦点絞りを通過する光強度情報を検出する光検出器とを備えた走査型共焦点顕微鏡であって、前記移動機構によって前記対物レンズの集光位置と前記試料の相対的な位置を前記集束光の光軸方向に治って離散的に繰り返し往復動作させる手段と、各相対位置での前記試料からの光強度情報をそれぞれ取得する手段と、それら光強度情報群から複数の光強度情報を抽出する手段と、前記抽出した複数の光強度情報に適合する変化曲線上の最大値と、それを与える前記相対位置を推定する手段と、その推定した光強度情報の最大値と相対位置をそれぞれ輝度情報と高さ情報として取得し、前記移動機構の反転動作から次の反転動作までの間に取得される各相対位置での前記試料からの光強度情報を前記光強度情報群として取り扱い、前記移動機構の往復動作に合わせて前記輝度情報と高さ情報とを連続的に取得する輝度及び高さ情報演算手段と、前記移動機構の反転動作位置から次の反転動作位置の間に得られる前記試料の高さ情報に基づいて、前記試料形状の3D画像を作成し、前記輝度情報とともに同一画面上に、連続的に更新しながら表示する表示手段とを備え、前記表示手段が、前記移動機構が反転動作位置から次の反転動作位置に移動する毎に前記試料形状の3D画像を1回更新して表示し、前記移動機構が前記各相対位置に移動する毎に前記輝度情報を更新して表示することを特徴とする。
また、本発明の走査型共焦点顕微鏡は、前記非共焦点画像情報取得手段が、前記対物レンズを通して前記光源とは異なる白色光源からの白色光が前記試料に入射され、前記試料からのカラー画像情報を取得するカラー画像情報取得手段であることが望ましい。
また、本発明の走査型共焦点顕微鏡は、前記表示手段が、前記輝度情報を用いて共焦点画像を作成し、前記3D画像情報と共に同一画面上に連続的に更新しながら表示することが望ましい。
また、本発明の走査型共焦点顕微鏡は、前記共焦点画像が、前記試料全面に焦点があったエクステンド画像であることが望ましい。
また、本発明の走査型共焦点顕微鏡は、前記表示手段が、前記画像の更新のタイミングに示す画像更新表示部を備えることが望ましい。
本発明によれば、試料の輝度及び高さ計測をステージの移動回数を少なくして高速で行うことが可能であり、しかもこれを繰り返し連続的に行うので、瞬時に試料の3次元構造を取得することができる。
また、本発明によれば、試料の3次元構造を取得するとともに、得られた輝度・高さ情報を同時に表示し、これを常に更新し続けるので一目で試料の3次元構造を理解したり、条件設定の修正をしたりすることが可能となる。
また、本発明によれば、試料の3次元構造を繰り返し連続的に取得して表示するとともに、同時に試料の2次元情報を表示するため、瞬時に試料の3次元構造を認識することができ、かつ容易に試料の位置合わせをすることができる。
本発明の第1の実施の形態を適用した走査型共焦点顕微鏡の構成を示す図である。 計測する試料の形状例を説明するための図である。 c面に焦点を合わせた場合の画像表示例を示す図である。 Z方向の走査範囲の設定を説明するための図である。 a面、b面、c面上の点の光強度群のI−Zカーブを示す図である。 Z(−2)乃至Z(2)の位置での光強度群を示す図である。 全面に渡って焦点が合った場合の画像表示例を示す図である。 第2の実施に形態にかかる表示例を示す図である。 指示された2点間の距離の表示例を示す図である。 任意の2点を指示する例を示す画像である。 指示された2点間のΔX、ΔY、ΔZの表示例を示す図である。 3D画像21とエクステンド画像22とをモニタ15上に表示させた例を示す図(その1)である。 3D画像21とエクステンド画像22とをモニタ15上に表示させた例を示す図(その2)である。 3D画像21とエクステンド画像22とをモニタ15上に表示させた例を示す図(その3)である。 3D画像21とエクステンド画像22とをモニタ15上に表示させた例を示す図(その4)である。 3D画像21とエクステンド画像22とをモニタ15上に表示させた例を示す図(その5)である。 3D画像21とエクステンド画像22とをモニタ15上に表示させた例を示す図(その6)である。 本発明の第5の実施の形態を適用した走査型共焦点顕微鏡の構成を示す図である。 3D画像31と非共焦点画像32とをモニタ15上に表示させた例を示す図(その1)である。 3D画像31と非共焦点画像32とをモニタ15上に表示させた例を示す図(その2)である。 3D画像31と非共焦点画像32とをモニタ15上に表示させた例を示す図(その3)である。 3D画像31と非共焦点画像32とをモニタ15上に表示させた例を示す図(その4)である。 3D画像31と共焦点画像33とをモニタ15上に表示させた例を示す図(その1)である。 3D画像31と共焦点画像33とをモニタ15上に表示させた例を示す図(その2)である。 3D画像31と共焦点画像33とをモニタ15上に表示させた例を示す図(その3)である。 本発明の第6の実施の形態を適用した走査型共焦点顕微鏡の構成を示す図である。 3D画像41とカラー画像42とをモニタ15上に表示させた例を示す図である。 試料情報計測処理の流れを示すフローチャートである。 3D画像21の繰り返し表示タイミングを示す3D画像更新表示灯の表示例を示す図である。 従来の走査型共焦点顕微鏡の概略的な構成を示す図である。 対物レンズ7と試料8の相対位置(Z)と光検出器11の出力(I)の関係を示す図である。
以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態について述べる。
図1は、本発明の第1の実施の形態を適用した走査型共焦点顕微鏡の構成を示す図である。
図1に示す走査型共焦点顕微鏡では、光源1から出射した光が、ビームスプリッター2を透過した後、2次元走査機構3に入射する。2次元走査機構3は、第1の光スキャナ3aと第2の光スキャナ3bとからなり、光束を2次元に走査し、対物レンズ7へと導く。対物レンズ7へ入射した光束は、集束光となって試料8の表面上を走査する。
試料8の表面で反射した光は、再び対物レンズ7から2次元走査機構3を介してビームスプリッター2に導入された後、ビームスプリッター2によって反射され結像レンズ9によってピンホール10上に集光する。ピンホール10により試料8の集光点以外からの反射光をカットし、ピンホール10を通過する光だけを光検出器11によって検出する。
Zレボルバ6は、複数の対物レンズ7を保有し、所望の倍率の対物レンズ7を2次元走査の光路中に挿入することができるとともに、Z軸方向に移動可能となっており、対物レンズ7の集光位置と試料8の相対位置とを変化させることができるようになっている。
試料8は、試料台13上に載置されており、ステージ14によってXY方向に移動可能となっている。2次元走査機構3、Zレボルバ6および光検出器11等は、コンピュータ12に記憶された顕微鏡制御プログラムよって制御され、使用者はモニタ15に表示される操作画面を通じて各部を操作することが出来る。
ここで、対物レンズ7による集光位置は、ピンホール10と光学的に共役な位置にあり、試料8が対物レンズ7による集光位置にある場合は、試料8からの反射光がピンホール10上で集光してピンホール10を通過する。試料8が対物レンズ7による集光位置からずれた位置にある場合は、試料8からの反射光はピンホール10上では集光しておらず、ピンホール10を通過しない。
このときの図31に示された対物レンズ7と試料8の相対位置(Z)と光検出器11の出力(I)の関係であるI−Zカーブのとおり、試料8が対物レンズ7の集光位置Zにある場合、光検出器11の出力は最大となり、この位置から対物レンズ7と試料8の相対位置が離れるに従い光検出器11の出力は急激に低下する。
この特性により、 2次元走査機構3によって集光点を2次元走査し、光検出器11の出力を2次元走査機構3に同期して画像化すれば、試料8のある特定の高さのみが画像化され、試料8を光学的にスライスした画像(共焦点画像)が得られる。そして、上記画像は、モニタ15に上記操作画面と合わせて表示される。
次に、図1に示した走査型共焦点顕微鏡を用いて、本発明を適用した試料情報測定方法について説明する。
図2は、計測する試料の形状例を説明するための図である。
上記走査型共焦点顕微鏡が計測する試料8として図2のような試料を考える。すなわち、試料8は、一方の端から他方の端へa面、b面、c面へと高さ(Z方向への厚さ)が異なり、かつ、厚い(高い)順にb面、c面、a面となる3面を有しているとする。
図3は、c面に焦点を合わせた場合の画像表示例を示す図である。
まず、走査型共焦点顕微鏡の2次元走査を開始し、試料8のc面に焦点を合わせる。このとき、モニタ15には、図3に示すような画像が表示される。具体的には、「走査開始/停止」ボタンにより走査型共焦点顕微鏡が画像取得を開始し、「対物」ボタンで所望の倍率の対物レンズ7を選択し、「ズーム」スクロールバーと合わせて観察部位が所望の大きさで表示されるように調節する。そして、「Z位置」スクロールバーでZレボルバ6を上下に移動させ、対物レンズ7の焦点面を試料8のc面に合わせる。
図4は、Z方向の走査範囲の設定を説明するための図である。
焦点面を試料8のc面に合わせた後に、Z方向の走査範囲を決定する。このZ方向の走査範囲を条件設定するのは図4に示した「Z走査範囲」で示された領域を対象とすることとしている。これまでの走査型共焦点顕微鏡は、焦点位置を上下に移動させてこの試料8のおおよその形状と「Z走査範囲」の領域を2次元画像を見ながら推測し決定していたが、本発明では以下に述べるプロセスの働きにより、モニタ15に直接表示される試料8の表示からZ走査範囲の設定が可能となる。イメージ的には、「対物」ボタンでXY方向の基準視野範囲を選択し、「Z位置」スクロールバーでZ方向の基準位置を選択している。そしてさらに、「ズーム」及び「Z範囲」スクロールバーによって3次元走査の範囲を設定している。
コンピュータ12には輝度及び高さ演算プログラムが記憶されており、この輝度及び高さ演算プログラムが実行されることにより、共焦点画像を利用した輝度及び高さ情報が得られる。
この輝度及び高さ測定プロセスについて説明する。
Z範囲のスクロールバーをゼロ以外の値に設定すると、図4のようにZレボルバ6は現在の焦点位置(c面)を中心にスクロールバーでの設定値に対応したZ走査範囲の間を上下にステップ移動し始める。使用者はモニタ15に表示される試料8の画像を見ながら、上記操作画面より希望するZ走査範囲を設定することとなる。設定されたZ走査範囲内をあらかじめ決められた移動ピッチΔZでZレボルバ6は移動し、Z相対位置毎に、共焦点画像が取得される。説明を簡単にするため共焦点画像取得は5枚、即ち、Zレボルバ6の移動回数が4回であるとし、それぞれZ(−2)、Z(−1) 、Z(0)、Z(1)、Z(2)の位置であるとする。この時の試料8の任意の点(例えば、a面、b面、c面上の点)の光強度情報を得る。
図5は、a面、b面、c面上の点の光強度群のI−Zカーブを示す図であり、図6は、Z(−2)乃至Z(2)の位置での光強度群を示す図である。
上記a面、b面、c面上の点の光強度群は、図5に示した各点のようにI−Zカーブ上の値となる。
次に、各点において上記光強度情報を比較し、最大強度となった(I(n)、Z(n))、その前後の値(I(n−1)、Z(n−1))、(I(n+1)、Z(n+1))を抽出する。図4の場合でa面について言えば、最大強度点は、(Ia(−1)、Za(−1))、その前後が(Ia(0)、Za(0))、(Ia(−2)、Za(−2))となる。そして、この3点を通る近似2次曲線を想定し、その極値を求めることで真の最大値Ia[max] と、それを与えるZレボルバ6の位置Za[max]を得ることができるので、試料8表面の輝度及び相対高さを移動ピッチΔZ以上の分解能で求めることが可能となる。b面、c面についても同様である。b面での最大強度点は(Ib(1)、Zb(1))、その前後が(Ib(0)、Zb(0))、(Ib(2)、Zb(2))となり、これらから(Ib[max]、Zb[max])が得られる。そして、c面での最大強度点は(Ic(0)、Zc(0))、その前後が(Ic(−1)、Zc(−1))、(Ic(1)、ZC(1))となり、これらから(Ic[max]、Zc[max])が得られる。
図7は、全面に渡って焦点が合った場合の画像表示例を示す図である。
この共焦点画像5枚で1回の輝度・高さ情報の抽出が可能であるので、 Zレボルバ6のステップ移動をZ(−2)→Z(−1)→Z(0)→Z(1)→Z(2)→Z(1)→Z(0)→Z(−1)→Z(−2)→・・・と繰り返し行えば、図7のように連続的に試料8のa面からb面までの構造を得ることができる。このとき、顕微鏡画像ウィンドウに表示されている高さ方向の位置が悪ければ、Z走査範囲の中心、即ち、「Z位置」を変えるか、幅の方が悪ければ、「Z範囲」そのものを変えることでエクステンド画像を確認しながら設定を最適に調節することもできる。これは、顕微鏡画像ウィンドウに全面に合焦した画像が全部映っていれば、その試料8の高さ方向に対して十分な領域で走査が行われていることが一目で判断できることを意味している。
一方、これらの処理がどのくらいの時間で行われるかと言うと、例えば、画像サイズを1024×768とし、Z走査範囲を5μm(ΔZ=1μm)程度とすると、1枚の共焦点画像を得るのに約200ms、Zレボルバ6のステップ移動に約200msであるので、5枚の画像を得るのに約1.8秒かかる。これに処理時間を付加しても約2秒あれば1回の輝度・高さ情報が更新されることになる。
但し、Zレボルバ6を上下にステップ移動させて連続的に画像取得している関係上、5枚目の画像は次回の輝度・高さ情報を得るための1枚目の共焦点画像として利用できるので、 2秒以内で1回の更新が期待できる。このくらいであれば十分実用的な更新速度であるといえる。更新速度に関しては、1枚の共焦点画像のライン数やZレボルバ6のステップ移動量、ステップ回数(範囲)によって組み合わせが様々に考えられるので、使用者があらかじめ決められた所望の組み合わせの中から自由に選択することができる。例えば更新を速くしたいのであれば、共焦点画像のライン数を制限し、Z走査範囲を必要最小限に狭くしておけば良い。また、ここでは5枚の画像を使って説明したが、原理的には光強度情報群から極大値を求めるのには3枚の画像があれば良く、、更新速度をより向上させることができる。
次に、第2の実施の形態について説明する。
本第2の実施の形態における走査型共焦点顕微鏡の構成は、図1を用いて説明した実施の形態と同様である。但し、モニタ15に表示される試料8の情報は3D表示化されている。
図8は、第2の実施に形態にかかる表示例を示す図である。
図8に示した表示例は、輝度及び高さ演算プログラムによって得られた高さ情報の表面部分に、試料8表面の実際の輝度情報を貼り合せて同時に表示させた例である。これが走査型共焦点顕微鏡のレーザ走査に同期して常に更新されるので、エクステンド画像による2次元的な表示に対して実際の試料8の様子をより忠実に立体的に表現したものとなる。このような表示により、 使用者は一目で試料8の詳細な立体情報を得ることが可能になる。一般的な3D表示ソフトが併せ持つ回転、拡大、縮小などが自在にできるようにし、使用者が所望の角度から観察できるようにしている。
次に、第3の実施の形態について説明する。
上述してきたように、連続的に試料8の3次元の情報が得られて更新されているので、これを利用して試料8の任意の各部の計測を連続的に行い続けることも可能である。
図9は、指示された2点間の距離の表示例を示す図である。
また、3D表示を用いてそのまま計測することももちろん可能である。3D表示されている試料8からラインカーソルなどで測定位置を指定し、プロファイルウィンドウで2点間の指定を行えば、画像の更新に合わせて測定結果が連続的に得られる。
なお、ラインカーソルを指示するものとして、例えばコンピュータ12に接続されているマウス等がある。
例えば、図10に示したように測定項目の「段差」を選択し、エクステンド画像中の注目点にラインカーソル(クロスカーソル1およびクロスカーソル2)を合わせる。そのラインでの断面プロファイルが得られているので、このプロファイル上で2点を指定すればその間の段差が連続的に測定され、測定値の表示が描画に同期して更新される。今までの走査型共焦点顕微鏡が計測のために3次元取り込みをするとそこで作業の流れが終わってしまい、別条件で初めからやり直しになるところを、この機能は「条件出し」→「測定による確認」→「条件修正」の間に連続性を持たせることを可能としている。
図11は、指示された2点間のΔX、ΔY、ΔZの表示例を示す図である。
3D表示された試料8に対しマウスなどで空間の1点を指定することは困難であるため、プロファイル表示されるクロスカーソルを3D画像に対して表示することで任意の1点が指定可能となる。これはある1ライン内のプロファイル計測であっても良いし、複数の異なるプロファイル間を指定できるようにしても良い。計測結果には、指定した2点間のΔX、ΔY、ΔZおよび2点間の距離などが走査に同期して連続的に計測され表示も更新される。
次に、第4の実施の形態について説明する。
第4の実施の形態を適用した走査型共焦点顕微鏡は、上述の第1乃至第3の実施の形態を適用した走査型共焦点顕微鏡と同様である。
すなわち、第4の実施の形態を適用した走査型共焦点顕微鏡は、試料8上のXY走査範囲にわたって取得した情報に基づいて、全面に焦点があったエクステンド画像と高さマップ画像とを作成する。高さマップ画像は、コンピュータ12により処理されモニタ15上に3次元的に表示させることができる。この3次元的に表示した高さマップ画像、すなわち3D画像は、その表面にエクステンド画像を貼り付けて表示することができる。
そして、第4の実施の形態を適用した走査型共焦点顕微鏡は、この3D画像とともにエクステンド画像も同一画面上に同時かつ連続的に更新しながら表示する。
図12乃至図17は、3D画像21とエクステンド画像22とをモニタ15上に表示させた例を示す図である。それぞれ、試料8の表面の3次元形状を示す3D画像21と全面にピントの合ったエクステンド画像22とが、モニタ15上に同時かつ連続的に更新しながら表示されている。
図12は、3次元の3D画像21と2次元のエクステンド画像22を同一の画面サイズで表示させた例であり、図13は、全画面表示した3次元の3D画像21上の一部分に2次元のエクステンド画像22を縮小表示させた例であるが、各々の表示サイズの割合は使用者が見やすいように自由に変えられるようになっていればさらによい。
また、図14乃至図16は、図13と同様に全画面表示した3次元の3D画像21上の一部分に2次元のエクステンド画像22を縮小表示させた例であるが、図14は、全画面表示した3次元の3D画像21として高さ情報を濃淡で表現した例であり、図15は、全画面表示した3次元の3D画像21として高さ情報をラインで表現した例であり、図16は、全画面表示した3次元の3D画像21として高さ情報をメッシュで表現した例である。
また、2次元画像として表示されるものは、エクステンド画像22に対して所定の画像処理を施したものであってもよい。例えば、エクステンド画像22に対してエッジ抽出フィルタをかけたものを表示させるようにすれば、3D画像21により3次元形状を観察できるとともにエクステンド画像22によりエッジ部を同時に観察することができる。画像処理としては、そのほかにも例えば2値化フィルタ、境界線抽出フィルタ等、一般的な画像処理手法として知られている種々のものを適用することができる。なお、この画像処理は、連続的に更新されその表示中に行えるようにしても良い。
さらに、2次元画像として表示されるエクステンド画像22としては、図17に示したように、高さマップ画像で表現したものであってもよいし、高さマップ画像を元にした等高線画像であってもよい。このようにして、3次元画像である3D画像21と2次元的な高さ情報を示すエクステンド画像22が同時に表示されて、時間の経過とともに連続的に更新されることによって、使用者は高さ方向の情報をより認識しやすくなる。
なお、3D画像21は、動作中にも回転、拡大、縮小などが自在にできる。また、Z範囲は、現在の焦点位置を下限として設定されたZ走査範囲を上下に移動する方式であってもよい。このようにすれば、設計値等からあらかじめ段差量が分かっている試料8に対して最初のZ走査範囲の指定がしやすくなる。
このように、試料8の3D画像21とエクステンド画像22とをモニタ15の同じ画面上に連続的に更新表示することで、使用者が試料8の立体的な情報と平面的な情報とを同時に観察することができるため、使用者は視覚的に試料8の表面状態が観察しやすくなる。
次に、第5の実施の形態について説明する。
図18は、本発明の第5の実施の形態を適用した走査型共焦点顕微鏡の構成を示す図である。
第5の実施の形態を適用した走査型共焦点顕微鏡は、図1に示した第1の実施の形態を適用した走査型共焦点顕微鏡と比較して、ハーフミラー16および光検出器17をさらに備えている。
すなわち、試料8の表面で反射した光は、再び対物レンズ7から2次元走査機構3を介してビームスプリッター2に導入された後、結像レンズ9によって集光され、ハーフミラー16で分割されてそれぞれピンホール10を介して光検出器11と光検出器17によって検出される。光検出器17によって検出された画像は非共焦点画像であり、焦点深度が広い。
そして、第5の実施の形態を適用した走査型共焦点顕微鏡は、この3D画像とともに非共焦点画像をも同時に表示する。
次に、図18に示した走査型共焦点顕微鏡による試料情報測定方法について説明する。なお、高さマップ画像を取得して、繰り返し3次元の画像を表示をさせる方法は、上述の各実施の形態と同様である。
図19乃至図22は、3D画像31と非共焦点画像32とをモニタ15上に表示させた例を示す図である。それぞれ、試料8の表面の3次元形状を示す3D画像31と非共焦点画像32とが、モニタ15上に同時かつ連続的に更新しながら表示されている。
この時、3D画像31の表示は1回の高さ情報の抽出毎に更新され、非共焦点画像32の表示は各位置Z毎に更新される。すなわち、図4で示したような動作をした場合、3D画像31の表示はZ(−2)からZ(2)まで移動したところで1回更新され、非共焦点画像32の表示はZ(−2)、Z(−1)、Z(0)、Z(1)、Z(2)の各Z位置毎に更新される。
図19は、Z(−1)における3D画像31と非共焦点画像32とをモニタ15上に表示させた例を示す図であり、図20は、Z(0)における3D画像31と非共焦点画像32とをモニタ15上に表示させた例を示す図であり、図21は、Z(1)における3D画像31と非共焦点画像32とをモニタ15上に表示させた例を示す図であり、図22は、Z(2)における3D画像31と非共焦点画像32とをモニタ15上に表示させた例を示す図である。
これらの図19乃至図22を見れば分かるように、3D画像31の表示は1回の高さ情報の抽出毎に更新されるので、図19乃至図21までは同じ画像が表示され、図22で初めて画像が更新されるのに対して、非共焦点画像32の表示は各位置Z毎に更新されるので、図19乃至図22のそれぞれにおいて画像が更新されている。なお、第4の実施の形態と同様に、この場合に表示される非共焦点画像32は縮小された表示方法であってもよい。
このように、Z走査範囲の各Z位置で取得した非共焦点画像32を3D画像31と同じモニタ15上の画面に同時かつ連続的に更新しながら表示させることにより、試料8をXY方向に移動させた時等に使用者が試料8の観察場所を見失ってしまうことを避けることができる。特に非共焦点画像32は焦点深度が深いため、どのZ位置であっても試料8の表面の情報を得やすく、使用者は非共焦点画像32と3D画像31とを同時に見ながら容易に試料8の位置調整を行うことができる。なお、光スキャナ3a、3bをZ範囲走査中ずっと連続的にXY走査させ、非共焦点画像32を1フレーム毎に更新するようにすればさらに操作性は良くなる。
また、2次元として表示させる画像は、非共焦点画像32の代わりに、各Z位置での共焦点画像であってもよい。この場合、焦点深度は浅くなるが、焦点が合った部分の変化推移を3次元形状と同時に観察することができる。
図23乃至図25は、3D画像31と共焦点画像33とをモニタ15上に表示させた例を示す図である。それぞれ、試料8の表面の3次元形状を示す3D画像31と共焦点画像33とが、モニタ15上に同時かつ連続的に更新しながら表示されている。
図23は、Z(−1)における3D画像31と共焦点画像33とをモニタ15上に表示させた例を示す図であり、図24は、Z(0)における3D画像31と共焦点画像33とをモニタ15上に表示させた例を示す図であり、図25は、Z(1)における3D画像31と共焦点画像33とをモニタ15上に表示させた例を示す図である。
次に、第6の実施の形態について説明する。
図26は、本発明の第6の実施の形態を適用した走査型共焦点顕微鏡の構成を示す図である。
第6の実施の形態を適用した走査型共焦点顕微鏡は、図1に示した第1の実施の形態を適用した走査型共焦点顕微鏡と比較して、白色光源19およびカラー検出器20をさらに備えている。
すなわち、白色光源19から対物レンズ7を介して試料8の表面で反射した光は、例えばカラーCCD等のカラー検出器20上に結像され、カラー検出器20で撮像された信号は、コンピュータ12内の不図示のカラー画像取込ボードにより取り込まれて、3D画像とともにカラー画像がモニタ15上に表示される。
次に、図26に示した走査型共焦点顕微鏡による試料情報測定方法について説明する。なお、高さマップ画像を取得して、繰り返し3次元の画像を表示をさせる方法は、上述の各実施の形態と同様である。
図27は、3D画像41とカラー画像42とをモニタ15上に表示させた例を示す図である。試料8の表面の3次元形状を示す3D画像41とカラー画像42とが、モニタ15上に同時かつ連続的に更新しながら表示されている。
この時、3D画像41の表示は1回の高さ情報の抽出毎に更新され、Z移動動作およびスキャナ走査とカラー画像42の撮像描画とは非同期に実行できるため、カラー画像42はほぼフレームレートで更新される。
このように、カラー検出器20により取得したカラー画像42を3D画像41と同じモニタ15上の画面に連続的に更新しながら表示させることにより、試料8をXY方向に移動させた時等に使用者が試料8の観察場所を見失ってしまうことを避けることができる。また、カラー画像42によりカラーの情報を得られるため、使用者は試料8の表面状態を認識しやすく、カラー画像42と3D画像41とを同時に見ながら容易に試料8の位置調整を行うことができる。
また、カラー画像42をフレームレートで表示更新する代わりに、カラー画像42の情報からコントラスト等の情報を使って全面にピントが合うように焦点合成したカラーエクステンド画像を、1回のZ走査毎に表示更新するようにもできる。このようにした場合、3D画像41の表面には、共焦点画像から構成されたエクステンド画像の代わりにカラーのエクステンド画像を貼り付けてもよい。
次に、上述の各実施の形態で共通する試料情報計測処理の流れを説明する。
図28は、試料情報計測処理の流れを示すフローチャートである。
まず、ステップS281において、使用者が走査型共焦点顕微鏡(LSM)による2次元画像で試料8を確認し、ステップS282において、3次元繰り返し表示を実行させるための開始ボタンを押す。
そして、ステップS283において、Z位置始動ボタンを操作して観察する試料8のZ方向の観察位置を調整するとともに、ステップS284において、3次元繰り返し表示のZ走査範囲(上端位置から下端位置までの幅)を調整する。
すると、上述の各実施の形態の走査型共焦点顕微鏡は、試料8をZ方向に繰り返し走査して3D画像21、31、41を表示する。
この際、例えば、図29に示すように、モニタ15上に3D画像21の繰り返し表示タイミングを示す3D画像更新表示灯23、24を表示すれば、3D画像21が更新されるタイミングを知ることができる。図29に示した表示例は、3D画像21が表示されるサイクル毎に3D画像更新表示灯23および24が交互に表示される例を示している。すなわち、1サイクル目は3D画像更新表示灯23が点灯し3D画像更新表示灯24が消灯し、2サイクル目は3D画像更新表示灯23が消灯し3D画像更新表示灯24が点灯し、3サイクル目はまた3D画像更新表示灯23が点灯し3D画像更新表示灯24が消灯するという具合である。
このように、3D画像21が表示されるサイクル毎に3D画像更新表示灯23および24が表示されることにより、使用者は3D画像21が更新されるタイミングを知ることができ、測定パラメータを変更するタイミングを図ることができる。なお、この繰り返し走査表示のタイミングを示す3D画像更新表示は、上記に限定されず、1つの表示灯でも良いし、様々な図形、又は棒状のレベルメータ等でも良い。
図28の説明に戻る。
ステップS285において、表示されている3D画像21、31、41が期待する3次元形状であるのか否かを使用者が判断し、期待する3次元形状でないと判断した場合(ステップS286:N)は、ステップS283以降を繰り返すことにより、観察する試料8のZ方向の観察位置の再調整(ステップS283)や、3次元繰り返し表示のZ走査範囲の再調整(ステップS284)を行う。
ステップS286で期待する3次元形状であると判断した場合(ステップS286:Y)は、ステップS287において、計測モードでの画像情報を取り込むための3次元画像取り込みボタンを押すことにより、3次元繰り返し表示を停止し、ステップS288において、ステップS285の3次元繰り返し表示で観察していた時と同じ走査範囲で、3次元繰り返し表示で観察していた際のZ走査ステップ又はXY走査ステップと比較して、同等又は小さく自動変換された高精度な3次元画像データを取得する。よって、連続的に更新し表示している画像上での測定より、高精度な測定が可能となる。
以上、本発明を適用した各実施の形態を説明してきたが、本発明を適用する走査型共焦点顕微鏡の構成は、図1、図18または図26に示す構成に限らず各種の走査型共焦点顕微鏡に適用することができる。
例えば、円盤上にスパイラル状に複数の微小開口を設けたニポウまたはニプコウ(Nipkow)ディスクを高速回転させる構成であっても良い。このとき、上記Nipkowディスクが対物レンズの集光位置と共役な位置に配置される微小開口を兼ね、光検出器としてCCDなどの2次元画像センサが用いられる。さらには2次元光走査機構に変えて、1次元光スキャナによって対物レンズの集束光を試料の1ライン上で走査し、試料の断面形状を測定する構成であっても良い。
また、対物レンズ7の集光位置と試料8の位置を相対的に移動させる移動機構として、対物レンズ7を移動するZレボルバ6に代えて試料8の位置を移動させるステージ機構を用いても良い。
その他、上記の構成に限らず、各種の走査型共焦点顕微鏡に本発明を適用することができる。すなわち、本発明が適用される走査型共焦点顕微鏡は、その機能が実行されるのであれば、上述の実施の形態に限定されることはなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内で種々の構成または形状を取ることができる。
1 光源
2 ビームスプリッター
3 2次元走査機構
3a 第1の光スキャナ
3b 第2の光スキャナ
6 Zレボルバ
7 対物レンズ
8 試料
9 結像レンズ
10 ピンホール
11 光検出器
12 コンピュータ
13 試料台
14 ステージ
15 モニタ
16 ハーフミラー
17 光検出器
19 白色光源
20 カラー検出器
21 3D画像
22 エクステンド画像
23 3D画像更新表示灯
24 3D画像更新表示灯
31 3D画像
32 非共焦点画像
33 共焦点画像
41 3D画像
42 カラー画像

Claims (6)

  1. 光源からの光を試料に対して集束させる対物レンズと、
    前記集束光の光軸方向に沿って、前記対物レンズの集光位置と前記試料の位置を相対的に移動させる移動機構と、
    前記対物レンズの集光位置と共役な位置に配置された共焦点絞りと、
    前記共焦点絞りを通過する光の強度を検出する光検出器とを備えた走査型共焦点顕微鏡であって、
    前記移動機構によって前記対物レンズの集光位置と前記試料の相対的な位置を前記集束光の光軸方向に治って離散的に繰り返し往復動作させる手段と、
    各相対位置での前記試料からの光強度情報をそれぞれ取得する手段と、
    それら光強度情報群から複数の光強度情報を抽出する手段と、
    前記抽出した複数の光強度情報に適合する変化曲線上の最大値と、それを与える前記相対位置を推定する手段と、
    その推定した光強度情報の最大値と相対位置をそれぞれ輝度情報と高さ情報として取得し、前記移動機構の反転動作から次の反転動作までの間に取得される各相対位置での前記試料からの光強度情報を前記光強度情報群として取り扱い、前記移動機構の往復動作に合わせて前記輝度情報と高さ情報とを連続的に取得する輝度及び高さ情報演算手段と、
    前記試料からの非共焦点画像情報を前記光強度情報とは別に取得する非共焦点画像情報取得手段と、
    前記移動機構の反転動作位置から次の反転動作位置の間に得られる前記試料の高さ情報に基づいて前記試料形状の3D画像を作成し、前記非共焦点画像情報取得手段によって取得した非共焦点画像情報とともに同一画面上に、連続的に更新しながら表示する表示手段とを備え、
    前記表示手段は、前記移動機構が反転動作位置から次の反転動作位置に移動する毎に前記試料形状の3D画像を1回更新して表示し、前記移動機構が前記各相対位置に移動する毎に前記非共焦点画像を更新して表示することを特徴とする走査型共焦点顕微鏡。
  2. 光源からの光を試料に対して集束させる対物レンズと、
    前記集束光の光軸方向に沿って、前記対物レンズの集光位置と前記試料との相対的な位置を離散的に移動させる移動機構と、
    前記対物レンズの集光位置と共役な位置に配置された共焦点絞りと、
    各相対位置での前記共焦点絞りを通過する光強度情報を検出する光検出器とを備えた走査型共焦点顕微鏡であって、
    前記移動機構によって前記対物レンズの集光位置と前記試料の相対的な位置を前記集束光の光軸方向に治って離散的に繰り返し往復動作させる手段と、
    各相対位置での前記試料からの光強度情報をそれぞれ取得する手段と、
    それら光強度情報群から複数の光強度情報を抽出する手段と、
    前記抽出した複数の光強度情報に適合する変化曲線上の最大値と、それを与える前記相対位置を推定する手段と、
    その推定した光強度情報の最大値と相対位置をそれぞれ輝度情報と高さ情報として取得し、前記移動機構の反転動作から次の反転動作までの間に取得される各相対位置での前記試料からの光強度情報を前記光強度情報群として取り扱い、前記移動機構の往復動作に合わせて前記輝度情報と高さ情報とを連続的に取得する輝度及び高さ情報演算手段と、
    前記移動機構の反転動作位置から次の反転動作位置の間に得られる前記試料の高さ情報に基づいて、前記試料形状の3D画像を作成し、前記輝度情報とともに同一画面上に、連続的に更新しながら表示する表示手段とを備え、
    前記表示手段は、前記移動機構が反転動作位置から次の反転動作位置に移動する毎に前記試料形状の3D画像を1回更新して表示し、前記移動機構が前記各相対位置に移動する毎に前記輝度情報を更新して表示することを特徴とする走査型共焦点顕微鏡。
  3. 前記非共焦点画像情報取得手段は、前記対物レンズを通して前記光源とは異なる白色光源からの白色光が前記試料に入射され、前記試料からのカラー画像情報を取得するカラー画像情報取得手段であることを特徴とする請求項1記載の走査型共焦点顕微鏡。
  4. 前記表示手段は、前記輝度情報を用いて共焦点画像を作成し、前記3D画像情報と共に同一画面上に連続的に更新しながら表示することを特徴とする請求項1乃至3の何れか1項に記載の走査型共焦点顕微鏡。
  5. 前記共焦点画像は、前記試料全面に焦点があったエクステンド画像であることを特徴とする請求項4記載の走査型共焦点顕微鏡。
  6. 前記表示手段は、前記画像の更新のタイミングに示す画像更新表示部を備えることを特徴とする請求項1乃至5の何れか1項に記載の走査型共焦点顕微鏡。
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