JP2010213877A

JP2010213877A - 組織再生方法

Info

Publication number: JP2010213877A
Application number: JP2009063698A
Authority: JP
Inventors: Kunihei Chin; 国平陳; Naoteru Kawazoe; 直輝川添; Hiroaki Ro; 宏旭呂
Original assignee: National Institute for Materials Science
Current assignee: National Institute for Materials Science
Priority date: 2009-03-17
Filing date: 2009-03-17
Publication date: 2010-09-30
Anticipated expiration: 2029-03-17
Also published as: JP5557084B2

Abstract

【課題】
本発明は、適用部位においても免疫拒絶反応や炎症反応の要因となる材料を有さない再生組織を提供することを目的とする。
【解決手段】
対象生体自身の細胞、もしくはその生体に対して免疫拒絶反応や炎症反応を生じない同種の細胞に由来する細胞外マトリックス多孔質足場材を用いて、対象生体自身の細胞、もしくはその生体に対して拒絶反応を生じない同種の細胞を培養し、対象生体に免疫拒絶反応や炎症反応を生じない生体組織を再生することを特徴とする。
【選択図】なし

Description

本発明は、生体の欠損部位の組織を再生する組織再生方法に関する。

病気や事故、或いは先天性異常・欠損などにより、失った身体組織の一部を修復するために、人工的な多孔質足場材で生体細胞を培養し、生体組織を新たに再生して移植するという再生医工学的な治療法が盛んに行われている。
再生医工学的な手法により生体組織を再生するためには、その組織由来の細胞、或いはその組織の細胞に分化し得る幹細胞が接着して増殖するための足場として、また、形成される生体組織の支持体としての多孔質材料が必要である。このような多孔質材料には、多孔質性や生体親和性や生体吸収性などの性質が要求され、従来、ポリＬ‐乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）や乳酸とグリコール酸の共重合体（ＰＬＧＡ）などの生体吸収性合成高分子と、コラーゲンやヒアルロン酸などの生体吸収性天然高分子で調製した多孔質材料がよく用いられている。これらの多孔質材料は細胞の機能制御と組織再生の促進に関して一応の効果が得られたが、生体内で細胞を取り込む細胞外マトリックスと同様の構造と機能を与えることは困難であった。これに対して、組織や臓器を脱細胞化して得られるマトリックスは生体内と同様な細胞外マトリックスを保っているので、再生医工学への応用が注目されている。しかしながら、脱細胞化マトリックスはほとんど、同種、或いは異種の動物からの組織が使われて、強い免疫拒絶反応が起こり、失敗した例が多く見られる。従って、細胞外マトリックスの特長を活かしながら、免疫拒絶反応を避けられる自家由来のマトリックス材料の開発が強く求められている。
発明者は、特許文献２に示すように、動物由来のコラーゲンなどの天然高分子と生体吸収性の合成高分子材料からなるメッシュ体とを一体化した足場材を提案している。
しかし、この種の足場材に対して、基材となる材料に対する免疫拒絶反応や炎症反応は避けられず、その使用には限界があった。

本発明は、このような実情に鑑み、適用部位においても免疫拒絶反応や炎症反応の要因となる材料を有さない再生組織を提供することを目的とする。

発明１の組織再生方法は、対象生体由来の細胞により作製された細胞外マトリックス多孔質足場材を用いて、前記対象生体の細胞を培養して前記対象の生体由来の材料と細胞を構成する再生組織を生成することを特徴とする。

対象生体自身の細胞もしくはその生体に対して免疫拒絶反応や炎症反応を生じない同種の細胞に由来の細胞外マトリックス多孔質足場材のみを用いて組織を再生することができた。全自家再生を実現できたので、免疫拒絶反応や炎症反応を生じる恐れをなくすことができた。

実施例１のヒト間葉系幹細胞由来の細胞外マトリックス多孔質足場材の走査電子顕微鏡像（拡大率５０倍）実施例２の再生軟骨組織のトルイジンブルー染色の位相差顕微鏡写真（拡大率２００倍）実施例３のヒト軟骨細胞由来の細胞外マトリックス多孔質足場材の走査電子顕微鏡像（拡大率５０倍）実施例４の再生軟骨組織のトルイジンブルー染色の位相差顕微鏡写真（拡大率２００倍）実施例５のヒト線維芽細胞由来の細胞外マトリックス多孔質足場材の走査電子顕微鏡像（拡大率５０倍）実施例６の再生真皮組織のＨＥ染色の位相差顕微鏡写真（拡大率４０倍）

１．本発明の細胞外マトリックス多孔質足場材の作製に利用できる細胞としては、胚性幹細胞、体性幹細胞と分化した体細胞があり、培養しやすい体性幹細胞と体細胞が最も望ましい。生体細胞には間質細胞と実質細胞があり、間質細胞を用いることが最も好ましい。体性幹細胞には間葉系幹細胞や脂肪由来幹細胞、皮膚幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、上皮由来幹細胞などがある。体細胞には、上皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、表皮角化細胞、骨格筋細胞、羊膜細胞、角膜細胞、粘膜細胞などがある。これらの細胞を１種類以上用いる。

２．体性幹細胞と体細胞は体の様々な部位から採取することが可能である。例えば、間葉系幹細胞は骨髄以外では、末梢血や脂肪組織などからも採取することができる。線維芽細胞は皮膚や靭帯、腱などの組織から採取できる。軟骨細胞は硝子軟骨、弾性軟骨、肋軟骨と繊維軟骨から採取できる。何れの細胞も利用できるが、容易に採取でき、培養しやすく、しかも細胞外マトリックスを大量に産生できる細胞が最も好ましい。

３．細胞の種類によって、使用する培地の種類が異なる。細胞の活性を維持でき、大量の細胞外マトリックスの産生を促進する培地が最も好ましい。血清培地と無血清培地のどちらを用いてもよい。血清培地を用いる場合、動物（ウシ）由来の血清と患者（対象生体）自身の血清を利用できるが、望ましいのは患者（対象生体）の血清である。培地に細胞外マトリックスの産生を促進する因子を添加して培養することができる。促進因子として、例えば、アスコルビン酸リン酸、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インシュリン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、β型形質転換増殖因子（ＴＧＦ−β）、骨形成因子（ＢＭＰ）、デキサメタゾンなどが1種類あるいは2種類以上を組み合わせて利用することができる。

４．本発明の細胞外マトリックス多孔質足場材を作製するために、前記の細胞を培養する多孔質培養床は、細胞の一時的な足場材料として機能するので、生体吸収性合成高分子を素材とするメッシュ体やスポンジ体或いは紐状体などの多孔質体からなるものが利用できる。メッシュ体は、織布又は不織布等からなるものでよい。スポンジ体は、発泡剤を利用する発泡成形法、或いは多孔質化剤除去法等、その他公知の方法により得ることができる。また、紐状体は繊維状や組みヒモ等からなるものでよい。メッシュ体、スポンジ体、或いは紐状体の原料となる生体吸収性高分子としては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグリコール酸の共重合体、ポリリンゴ酸、ポリ−ε−カプロラクトンなどのポリエステル等を挙げることができる。望ましいのはポリグリコール酸と、乳酸とグリコール酸の共重合体である。

５．細胞を上記の多孔質培養床に播き、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下のインキュベーター中で培養を行う。細胞播種に用いた細胞液の密度と播いた細胞の数は、細胞が前記培養床に均一に分布でき、均一な細胞外マトリックスが産生できればよい。培養時間は、それが脱細胞化しても自ら保形性を有する程度になるまで十分な細胞外マトリックスを産生できればよい。通常は３０分間から２ヶ月までであり、望ましいのは３時間から４週間である。

６．上記前記培養床で培養した細胞により、脱細胞処理および多孔質培養床を除く処理を経て得られた細胞外マトリックスは、脱細胞化や洗浄などの処理に耐え得るものであり、これらの処理後も安定な多孔質構造を保持できるように培養される。しかし、多孔質構造の保形性をより高めるには、架橋処理が有用である。
７．架橋処理と脱細胞化の順序はどちらでもよい。すなわち、細胞を架橋処理した後に脱細胞化しても、脱細胞化した後に架橋処理してもよい。細胞外マトリックスのみで十分な保形性を有するのであれば、架橋処理を行わないのがより望ましい。
８．架橋処理の方法としては、従来公知のものが何れも使用できる。細胞外マトリックスを架橋処理する方法として、紫外線照射による光架橋や熱架橋などの物理的架橋法、ガス状或いは溶液状の架橋化剤を用いる化学的架橋法がある。細胞外マトリックスを壊さなければ、どの架橋処理方法でもよい。紫外線照射による架橋は、脱細胞化前のサンプル或いは脱細胞化したサンプルを凍結し、凍結乾燥した後、紫外線照射により架橋処理する。２４０ｎｍ〜２８０ｎｍの紫外線で１０分間から２４時間照射するが、望ましいのは２５０ｎｍ〜２６０ｎｍの紫外線で３０分間から１０時間照射する。熱架橋は脱細胞化前のサンプル或いは脱細胞化したサンプルを凍結し、凍結乾燥した後、０．０１Ｔｏｒｒから１Ｔｏｒｒまでの減圧条件下で１００℃から１４０度までの高温で４８時間から９６時間加熱することにより行う。溶液状或いはガス状の架橋化剤を用いる化学的架橋法の架橋化剤としては、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドのようなアルデヒド類や、エチレンプロピレンジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテルのようなグリシジルエーテル類や、ヘキサメチレンジイソシアネート、α−トリジンイソシアネート、トリレンジイソシアネート、ナフチレン１、５−ジイソシアネート、４、４−ジフェニルメタンジイソシアネート、トリフェニルメタン−４、４、４、−トリイソシアネートのようなイソシアネート類や、メタノールやエタノールのようなアルコール類、グルコン酸カルシウムなどが挙げられる。溶液状の架橋化剤での架橋処理は脱細胞化前のサンプル或いは脱細胞化したサンプルを上記の架橋化剤の溶液に３０分間から７２時間まで浸漬することにより行う。架橋処理温度は４℃から３７℃までである。望ましいのは４℃で１時間から４８時間、室温で３０分間から２４時間架橋処理する。ガス状の架橋化剤を用いる化学的架橋法による架橋処理は、上記の架橋化剤をガス状にして用いることができる。脱細胞化前のサンプル或いは脱細胞化したサンプルを凍結し、凍結乾燥した後、一定温度で一定濃度の架橋化剤水溶液で飽和した架橋化剤の蒸気の雰囲気下で一定時間架橋を行う。架橋温度は通常、２０℃〜４０℃に設定される。架橋時間は、１時間から１２時間である。
なお、ガス状或いは溶液状の架橋化剤を用いる化学的架橋法では、架橋処理の最終段階で、グリシン水溶液などにより架橋化剤を失活させる必要がある。

９．脱細胞化の方法としては、従来公知のものが何れも使用できる。凍結・解凍を繰り返す方法、凍結・解凍の繰り返しとアンモニア水処理を組み合わせた方法、超音波処理方法、界面活性剤を添加する方法、低張液に浸漬する方法などの少なくともひとつを用いるか、これらの方法を組み合わせることができる。望ましいのは凍結・解凍の繰り返しとアンモニア水処理を組み合わせた方法である。凍結・解凍を繰り返す方法は多孔質培養体で細胞を培養した後、サンプルをＭｉｌｌｉＱ水かリン酸緩衝液か低張液で３回洗浄し、−１０℃から−１９６℃で４時間凍結し、その後４℃から３７℃までの水浴で解凍し、ＭｉｌｌｉＱ水かリン酸緩衝液か低張液で３〜２０回洗浄する。この凍結・解凍のサイクルを３回から１０回まで繰り返す。リン酸緩衝液の濃度は０．０５Ｍから０．３Ｍまでである。低張液は１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、５ｍＭＥＤＴＡである。凍結・解凍の繰り返しの後、サンプルを1ｍＭから２５０ｍＭのアンモニア水に１分間から３００分間浸漬する。その後、ＭｉｌｌｉＱ水で３〜２０回洗浄する。

１０．細胞の一時的な足場材料である多孔質培養床を水溶液により抽出除去する方法として、生体吸収性高分子の骨格のみを溶かし、細胞由来の素材を溶かさない水溶液であれば、酸性水溶液、アルカリ性水溶液或いは中性水溶液の何れでもよい。使用される抽出液は、塩化水素、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、炭酸などの無機酸水溶液、酢酸、シュウ酸、クエン酸、コハク酸、アミノ酸、アスコルビン酸、などの有機酸水溶液、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムなどのアルカリ水溶液、塩化アンモニウム、硫酸銅、塩化鉄、硫酸水素ナトリウム、硫酸水素カリウムなどの酸性塩水溶液、酢酸ナトリウム、リン酸三ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、メタ珪酸ナトリウムなどのアルカリ性塩水溶液、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウムなどの中性塩水溶液が挙げられる。望ましくはリン酸ナトリウム、メタ珪酸ナトリウムである。水溶液のモル濃度は０．０１Ｍ〜２．０Ｍであるが、０．１〜０．８Ｍが好ましい。

１１．再生する組織は対象生体（身体）の一部であれば、どんな組織をも含む。例えば、軟骨、骨、真皮、表皮、皮膚、角膜、血管、心筋、筋肉、気管、食道、膀胱、乳房、肝臓、腎臓、膵臓、指などがある。
１２．生体組織再生に利用できる細胞外マトリックス多孔質足場材は再生する組織由来の細胞でもよいし、他の組織由来の細胞でもよいが、調製が容易で目的組織の再生に最も有効な細胞外マトリックス多孔質足場材が最も望ましい。
１３．生体組織の再生に利用できる細胞として、胚性幹細胞、体性幹細胞と分化した体細胞がある。体性幹細胞には、間葉系幹細胞や脂肪由来幹細胞、皮膚幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、上皮由来幹細胞などがある。体細胞には、上皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、表皮角化細胞、骨格筋細胞、羊膜細胞、角膜細胞、粘膜細胞などがある。再生組織由来の体細胞やその体細胞に分化し得る幹細胞を１種類以上用いる。

１４．再生する組織の種類によって、使用する培地の種類が異なる。細胞の活性を維持でき、大量の細胞培養ができ、組織形成を促進する培地が最も好ましい。血清培地と無血清培地のどちらを用いてもよい。血清培地を用いる場合、動物（ウシ）由来の血清と患者自身の血清を利用できるが、望ましいのは患者の血清である。本発明の軟骨組織を再生するための移植体は、軟骨細胞の場合、上記細胞外マトリックス多孔質足場材に軟骨細胞液を滴加した後、さらに、培地を添加し、該細胞外マトリックス多孔質足場材中の軟骨細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下のインキュベーターにおいて培養増殖させることにより、当該移植体を得る。本発明の真皮組織を再生するための移植体は、線維芽細胞の場合、上記の細胞外マトリックス多孔質足場材に線維芽細胞を滴加した後、さらに線維芽細胞培地を添加して該細胞外マトリックス多孔質足場材中の線維芽細胞を３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下のインキュベーターにおいて培養、増殖させることにより、該移植体を得る。細胞の増殖を促進し、幹細胞の分化を制御し、組織形成を促進するために生理活性物質を利用できる。例えば、アスコルビン酸、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インシュリン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、β型形質転換増殖因子（ＴＧＦ−β）、骨形成因子（ＢＭＰ）、デキサメタゾンなどが利用できる。

１５．細胞を本発明の細胞外マトリックス多孔質足場材に播き、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下のインキュベーター中で培養したり、バイオリアクターを利用して培養したりすることがある。バイオリアクターとして静水圧を加えながら培養するもの、ほかの力学刺激を加えながら培養できるバイオリアクター、酸素やＣＯ_２濃度を制御したバイオリアクター、培地を還流しながら培養するバイオリアクター、回転しながら培養するバイオリアクターなどを利用できる。組織再生に最も相応しいバイオリアクターを利用すればよい。

ヒト間葉系幹細胞由来の材細胞外マトリックス多孔質足場材の作製例
生体吸収性高分子である乳酸／グリコール酸の共重合体（ＰＬＧＡ）のメッシュ体（多孔質培養床）を用いてヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を培養した。つづいて、脱細胞化を行った後、ＰＬＧＡメッシュ体を溶出し、間葉系幹細胞由来の細胞外マトリックスからなる多孔質足場材を作製した。詳細を以下に示す。
＜細胞の播種と培養＞
まず、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ（ＣａｍｂｒｅｘＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅＷａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．）社より購入）を、増殖培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社より購入、間葉系幹細胞用基礎培地に、１０％ウシ胎児血清とペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンを添加した培地）中、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で継代培養を２回行った。この間葉系幹細胞を０．０２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）によって剥離・回収し、ＤＭＥＭ血清培地で３．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの間葉系幹細胞を調製した。
このＤＭＥＭ血清培地は１０％ウシ胎児血清，抗生物質、４５００ｍｇ／Ｌグルコース、５８４ｍｇ／Ｌグルタミン、０．４ｍＭプロリンおよび５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸、１５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸リン酸を含有する。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記ＰＬＧＡメッシュ体（直径１０．４ｍｍの円盤状、多孔質培養床）に、２００μＬの３．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの間葉系幹細胞を播種し、上記のＤＭＥＭ血清培地で３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で６時間培養した後、ＰＬＧＡメッシュ体を裏返して、裏面にも２００μＬの３．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの間葉系幹細胞を播種し、上記のＤＭＥＭ血清培地で３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で５日間培養した。
＜脱細胞＞
培養後の細胞をリン酸緩衝液で３回洗浄した後、ＭｉｌｌｉＱ水で３回洗浄した。洗浄したサンプルを凍結・解凍の繰り返しとアンモニア水を組み合わせた方法で脱細胞処理を行った。洗浄したサンプルをＭｉｌｌｉＱ水に浸漬し、−８０℃で４時間凍結した。凍結したサンプルを−８０℃のフリーザーから取り出し、室温で解凍し、ＭｉｌｌｉＱ水で３回洗浄した。各回の洗浄時間は１０分間であった。この凍結・解凍の繰り返しを６回行った。その後、サンプルを２５ｍＭのアンモニア水に３０分間浸漬しつづいて、ＭｉｌｌｉＱ水で６回洗浄した。
＜多孔質培養床の除去＞
ＰＬＧＡメッシュ体を除くために、サンプルを０．５Ｍのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、サンプルとリン酸三ナトリウム水溶液を室温で４８時間ゆっくり攪拌した。取り出したサンプルを、ＭｉｌｌｉＱ水で６回洗浄した。
ＰＬＧＡメッシュ体を除いた後の残留物を−８０℃で４時間凍結し、減圧条件下（７．７Ｐａ）で２４時間凍結乾燥した。得られた間葉系幹細胞由来材料の細胞外マトリックス多孔質体を白金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。電顕写真を図１に示す。
電顕写真より、間葉系幹細胞由来の細胞外マトリックスのみから構成されていて、前記多孔質培養床と同様な形状の多孔質足場材であることが分かった。

ヒト間葉系幹細胞由来の細胞外マトリックス多孔質足場材を用いて間葉系幹細胞を培養し、軟骨組織を再生した例
実施例１で継代培養した間葉系幹細胞を０．０２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）によって剥離・回収し、ＤＭＥＭ無血清培地で１回洗浄した後、ＤＭＥＭ無血清培地で１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの間葉系幹細胞を調製した。次に、酸化エチレンガスで滅菌した実施例１の間葉系幹細胞由来の細胞外マトリックス多孔質足場材に１００μＬの間葉系幹細胞を滴加し、細胞を播種した。その後、細胞を播種した多孔質足場材をポリプロピレンのチューブに移して、３ｍＬの軟骨分化誘導用の培地を加え、４週間培養した。培地は２日ごとに交換した。軟骨分化誘導培地は血清を含まない、抗生物質、４５００ｍｇ／Ｌグルコース、５８４ｍｇ／Ｌグルタミン、０．４ｍＭプロリンおよび５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸、１００ｎＭデキサメタゾン、１％ＩＴＳ＋１、１０ｎｇ／ｍＬＴＧＦβ３を含有するＤＭＥＭである。４週間培養後には、軟骨組織が再生されていた。
再生した組織をトルイジンブルー染色を行った結果の写真を示したものが図２である。丸みを帯びた細胞とトルイジンブルー染色性細胞外マトリックスが認められ、軟骨組織を再生したことが分かった。
得られた軟骨組織は、実施例５の線維芽細胞を得た生体又はこれと同様な組織適合性抗原（ＭＨＣ）を有する生体に適用した場合は、免疫拒絶反応や炎症反応を生じる恐れをなくすものとなる。

ヒト軟骨細胞由来の細胞外マトリックス多孔質足場材の作製例
生体吸収性高分子である乳酸／グリコール酸の共重合体（ＰＬＧＡ）のメッシュ体（多孔質培養床）を用いてヒト軟骨細胞を６日間培養した。つづいて、脱細胞化を行った後、ＰＬＧＡメッシュ体を溶出し、軟骨細胞由来の細胞外マトリックスからなる多孔質足場材を作製した。詳細を以下に示す。
＜細胞の播種と培養＞
まず、Ｃａｍｂｒｅｘ（ＣａｍｂｒｅｘＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅＷａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．）社から購入したヒト関節軟骨細胞を、１０％ウシ胎児血清，抗生物質、４５００ｍｇ／Ｌグルコース、５８４ｍｇ／Ｌグルタミン、０．４ｍＭプロリンおよび５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸を含有するＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で培養した。２回継代培養した軟骨細胞を０．０２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）で剥離・採集し、５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記ＰＬＧＡメッシュ体（直径１０．４ｍｍの円盤状、多孔質培養床）に、２００μＬの５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの軟骨細胞を播種し、上記のＤＭＥＭ血清培地で３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で６時間培養した後、ＰＬＧＡメッシュ体を裏返して、裏面にも２００μＬの５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの軟骨細胞を播種し、上記のＤＭＥＭ血清培地で３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で６日間培養した。
＜脱細胞＞
培養後の細胞をリン酸緩衝液で３回洗浄した後、ＭｉｌｌｉＱ水で３回洗浄した。洗浄したサンプルを凍結・解凍の繰り返しとアンモニア水を組み合わせた方法で脱細胞処理を行った。洗浄したサンプルをＭｉｌｌｉＱ水に浸漬し、−８０℃で４時間凍結した。凍結したサンプルを−８０℃のフリーザーから取り出し、室温で解凍し、ＭｉｌｌｉＱ水で３回洗浄した。各回の洗浄時間は１０分間であった。この凍結・解凍の繰り返しを６回行った。その後、サンプルを２５ｍＭのアンモニア水に３０分間浸漬した。さらに、取り出したサンプルをＭｉｌｌｉＱ水で６回洗浄した。
＜多孔質培養床の除去＞
多孔質培養床であるＰＬＧＡメッシュ体を除去するために、サンプルを０．５Ｍのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、サンプルとリン酸三ナトリウム水溶液を室温で４８時間ゆっくり攪拌した。その後、ＭｉｌｌｉＱ水で６回洗浄した。
ＰＬＧＡメッシュ体を除いた後の残留物を−８０℃で４時間凍結し、減圧条件下（７．７Ｐａ）で２４時間凍結乾燥した。得られた軟骨細胞由来材料の細胞外マトリックス多孔質体を白金でコーティングし、その構造を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。電顕写真を図３に示す。
電顕写真より、作製した軟骨細胞由来の細胞外マトリックスのみにより、前記多孔質培養床と同様な形状の多孔質足場材であることが分かった。

軟骨細胞由来の細胞外マトリックス多孔質足場材を用いて間葉系幹細胞を培養し、軟骨組織を再生した例
実施例１で継代培養した間葉系幹細胞を０．０２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）によって剥離・回収し、ＤＭＥＭ無血清培地で１回洗浄した後、ＤＭＥＭ無血清培地懸濁させて１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの間葉系幹細胞液を調製した。次に、酸化エチレンガスで滅菌した実施例３の細胞外マトリックス多孔質足場材に１００μＬの間葉系幹細胞を滴加し、細胞を播種した。その後、細胞を播種した多孔質材料をポリプロピレンのチューブに移して、３ｍＬの軟骨分化誘導培地を加え、４週間培養した。培地は、２日ごとに交換した。軟骨分化誘導培地は血清を含まない、抗生物質、４５００ｍｇ／Ｌグルコース、５８４ｍｇ／Ｌグルタミン、０．４ｍＭプロリンおよび５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸、１００ｎＭデキサメタゾン、１％ＩＴＳ＋１、１０ｎｇ／ｍＬＴＧＦβ３を含有するＤＭＥＭである。４週間培養後には、軟骨組織が再生された。
再生した組織のトルイジンブルー染色を行った結果の写真が図４である。丸みを帯びたとトルイジンブルー染色性細胞外マトリックスが認められ、軟骨組織が再生されたことが確認された。
実施例３の細胞を得た生体と、実施例４で用いた間葉系幹細胞を得た生体は同一生体であれば、得られた軟骨組織は、実施例3と4の細胞を得た生体又はこれと同様な組織適合性抗原（ＭＨＣ）を有する生体に適用した場合は、免疫拒絶反応や炎症反応を生じる恐れをなくすものとなる。

ヒト皮膚線維芽細胞由来の細胞外マトリックス多孔質足場材の作製例
生体吸収性高分子である乳酸とグリコール酸との共重合体（ＰＬＧＡ）メッシュ体（多孔質培養床）を用いてヒト皮膚線維芽細胞を培養し、脱細胞処理を行い、この多孔質培養床であるＰＬＧＡメッシュ体を溶出し、線維細胞由来の細胞外マトリックスからなる多孔質足場材を作製した。詳細を以下に示す。
＜細胞の播種と培養＞
まず、クラボウ社から購入した正常ヒト皮膚線維芽細胞をクラボウ社から購入したＭｅｄｉｕｍ１０６Ｓ（２％ウシ胎児血清を添加した）培地で３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で１回継代培養した。２回継代培養した皮膚線維芽細胞を０．０２５％トリプシンと０．０１％ＥＤＴＡを含有するＨＥＰＥＳバッファー剥離・採集し、５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ線維芽細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記ＰＬＧＡメッシュ体（直径１０．４ｍｍの円盤状、多孔質培養床）に、２００μＬの５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの線維芽細胞を播種し、上記のＤＭＥＭ血清培地で３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で６時間培養した後、ＰＬＧＡメッシュ体を裏返して、裏面にも２００μＬの５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの軟骨細胞を播種し、上記のＤＭＥＭ血清培地で３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で６日間培養した。
＜脱細胞＞
培養後の細胞をリン酸緩衝液で３回洗浄した後、ＭｉｌｌｉＱ水で３回洗浄した。洗浄したサンプルを凍結・解凍の繰り返しとアンモニア水を組み合わせた方法で脱細胞処理を行った。洗浄したサンプルをＭｉｌｌｉＱ水に浸漬し、−８０℃で４時間凍結した。凍結したサンプルを−８０℃のフリーザーから取り出し、室温で解凍し、ＭｉｌｌｉＱ水で３回洗浄した。各回の洗浄時間は１０分間であった。この凍結・解凍の繰り返しを６回行った。その後、サンプルを２５ｍＭのアンモニア水に３０分間浸漬した。その後、取り出したサンプルをＭｉｌｌｉＱ水で６回洗浄した。
＜多孔質培養床の除去＞
多孔質培養床であるＰＬＧＡメッシュ体を除くために、サンプルを０．５Ｍのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、サンプルとリン酸三ナトリウム水溶液を室温で４８時間ゆっくり攪拌した。この後、ＭｉｌｌｉＱ水で６回洗浄した。
ＰＬＧＡメッシュ体を除いた後の残留物を−８０℃で４時間凍結し、減圧条件下（７．７Ｐａ）で２４時間凍結乾燥した。得られた線維芽細胞由来材料の細胞外マトリックス多孔質体を白金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。電顕写真を図５に示す。
電顕写真より、作製した線維芽細胞由来の細胞外マトリックスのみにより、前記多孔質培養床と同様な形状の多孔質足場材であることが分かった。

線維芽細胞由来の細胞外マトリックス多孔質足場材を用いて線維芽細胞を培養し、真皮組織を再生した例
実施例５で継代培養した線維芽幹細胞を０．０２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）によって剥離・回収し、１０６Ｓ（２％ウシ胎児血清を添加した）培地で２．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの線維芽細胞の溶液を調製した。次に、酸化エチレンガスで滅菌した実施例５の線維芽由来の細胞外マトリックス多孔質足場材に１００μＬの線維芽細胞を滴加し、細胞を播種し、２週間培養した。３日間ごとに培地を交換した。
再生した組織のＨＥ（ヘマトオキシリンとエオシン）染色を行った結果の写真が図６である。図より、一定の厚みをもつ真皮組織が再生されたことが分かった。
得られた真皮組織は、実施例５の線維芽細胞を得た生体又はこれと同様な組織適合性抗原（ＭＨＣ）を有する生体に適用した場合は、免疫拒絶反応や炎症反応を生じる恐れをなくすものとなる。

特開２００５−１８５５０７特許第３５２１２２６号

Claims

生体組織の再生方法であって、対象生体由来の細胞により作成された細胞外マトリックス多孔質足場材を用いて、前記対象生体の細胞を培養して全自家の再生組織を再生することを特徴とする組織再生方法。